Thăm dò khả năng phòng và chữa ung thư của hoạt chất scuterbarbalactone VN từ cây bách chi liên trên chuột gây ung thư thực nghiệm

G.Don [61], Taxol chiết xuất từ cây Thông đỏ Taxus brevifolia [62], v.v… Nổi bật là năm 2006, Đỗ thị Thảo - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phát hiên ra

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ung thư là căn bệnh nan y, một trong những gánh nặng của bệnh tật toàncầu gây ra tỉ lệ tử vong cao Theo báo cáo mới nhất của Hiệp hội Quốc tếchống ung thư (UICC) cho thấy căn bệnh ung thư là nguyên nhân gây tử vongcho gần 7 triệu người chỉ trong năm 2004 chiếm 12,5% tổng số người chết dobệnh tật Con số người mắc bệnh ung thư sẽ tăng nhanh và đạt tới con số 16triệu người vào năm 2020 như dự đoán của Tổ chức Y tế thế giới WHO [1]

Do vậy, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnhnan y đặc biệt bệnh ung thư là tất yếu và cần thiết, qua đó góp phần vào việcchăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng của mọi quốc gia trên thế giới

Hiện nay, một trong những hướng chính tìm kiếm các thuốc phòng chữatrị ung thư có hiệu lực được các nhà khoa học quan tâm là hướng sự tập trungvào hợp chất thiên nhiên có nguồn ngốc từ thực vật Theo đánh giá của Tổchức Y tế thế giới, 80% dân số trên thế giới vẫn tin dùng các loại thảo dượccho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn 60% các tác nhân hoá trịliệu khác dùng trong điều trị ung thư có nguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên[54], [55], [56] Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới giómùa với khoảng 3/4 diên tích của cả nước là rừng núi trùng điệp vì thế thảmthực vật rất phong phú và đa dạng Đây là điều kiên thuận lợi để hướng sựnghiên cứu phát triển thuốc phòng và chữa trị ung thư đi từ thực vật là hoàntoàn có thể Theo hướng nghiên cứu này, Viên nghiên cứu ung thư quốc giacủa Hoa kỳ (National cancer Institute - NCI) đã hợp tác với nhiều quốc gianhư Bangladesh, Viêt Nam, Brazil, Costa Rica, Lào, Mêxicô, v.v… để nghiêncứu tìm kiếm các hoạt chất từ thực vật có khả năng phòng chống và chữa trịung thư [33], [58], [59] Đến nay, một số hợp chất có nguồn gốc từ thiên

nhiên đã chích thức được sử dụng cho bệnh nhân ung thư như Camptothecine

chiết xuất từ cây Hạnh phúc (Camptotheca acuminata) [60], hai hoạt chất Vinblastine và Vincristine chiết xuất từ cây Dừa cạn (Catharan thus roseus L G.Don) [61], Taxol chiết xuất từ cây Thông đỏ ( Taxus brevifolia) [62], v.v…

Nổi bật là năm 2006, Đỗ thị Thảo - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã phát hiên ra hoạt chất Scuterbarbalactone VN

(SBVN) một hoạt chất mới lần đầu tiên được phân lập, tách chiết từ cây Bán

chi liên (Scutellaria barbata D.Don) đã chứng minh cấu trúc hoá học có khả năng diệt và ức chế nhiều loại tế bào ung thư phát triển ở điều kiện in-vitro,

hoạt chất này có hoạt tính mạnh diệt và ức chế tế bào ung thư phát triểnnhưng ít gây độc với tế bào thường Dù bất kỳ hoạt chất nào để phát triển

thành thuốc chữa bệnh, sau khi được chứng minh ở điều kiện in-vitro cũng phải được thử nghiêm ở mức độ in-vivo để tạo cơ sở cho nghiên cứu tiền lâm

sàng (Preclincal) và thử nghiệm lâm sàng (Clinical trial)

Vì thế, chúng tôi muốn tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa khả năng phòngchữa ung thư của hoạt chất SBVN ở mức in-vivo Qua đó, sẽ tạo cơ sở chocác nghiên cứu khoa học thử nghiêm tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm

đi đến đích cuối cùng làm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư có hiệuquả kinh tế và an toàn cho nhân dân góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức

khoẻ cho cộng đồng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài ''Thăm dò khả

năng phòng và chữa ung thư của hoạt chất Scuterbarbalactone VN từ cây bán chi liên trên chuột gây ung thư thực nghiệm''.

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

• Gây u thực nghiệm trên chuột BALB/c bằng tế bào LLC (Lewis LungCarcinoma) để tạo mô hình cho nghiên cứu khả năng phòng và chữa ung thưcủa hoạt chất SBVN

• Tìm hiểu và chứng minh khả năng phòng và chữa ung thư của hoạt

chất SBVN ở mức in-vivo

• Thiết lập tiền đề cho các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng đối vớihoạt chất tiềm năng SBVN

3 Nội dung nghiên cứu của đề tài

• Gây ung thư thực nghiệm trên chuột nhắt trắng dòng BALB/c bằnghoá chất 7,12- dimethyl[a]anthracene (DMBA) và bằng dòng tế bào ung thư

nuôi cấy in-vitro là LLC.

• Kiểm tra và xác định liều độc cấp tính gây chết 50% động vật thínghiệm LC50 (lethal dose) của hoạt chất SBVN

• Dựa vào kết quả nghiên cứu độc tính in-vitro đã có và liều độc cấp

LC50, tiến hành xác định nồng độ SBVN sử dụng cho bước thử nghiệm

in-vivo trên chuột.

• Thực hiện việc sử dụng hoạt chất SBVN làm chất bảo vệ để ngăn chặn

sự phát triển và diệt các khối u ung thư thực nghiệm

• Thu nhận kết quả, tiến hành xử lí số liệu thống kê bằng hệ thống đểphân tích dữ liệu, thiết lập các hình và bảng minh hoạ, từ đó rút ra kết luậnnghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 TÌNH HÌNH UNG THƯ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Ung thư là căn bệnh nan y, gây ra tỉ lệ tử vong cao Theo báo cáo mớinhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) bệnh ung thư đang dần vượt qua bệnhtim mạch để trở thành căn bệnh gây tử vong cao nhất trên thế giới Trong 5năm từ 1998-2002, có 24,6 triệu người chết vì ung thư, riêng năm 2004 có 7triệu bệnh nhân ung thư tử vong và thêm 11 triệu người mới mắc căn bệnhnày [52], [53] Trong tổng số 58 triệu người chết trên toàn thế giới năm 2005,bệnh ung thư là nguyên nhân gây tử vong cho 7,6 triệu (hay 13% trên tổng số)người Các ca tử vong do ung thư sẽ không ngừng tăng, với mức ước tínhkhoảng 9 triệu người chết do ung thư vào năm 2015 và 11,4 triệu người chếtvào năm 2030 (http://www.benhungthu.net.vn) Các loại bệnh ung thư chínhdẫn đến tỷ lên tử vong chung như:

Bệnh ung thư Phổi khiến 1,3 triệu người chết mỗi năm

Bệnh ung thư Dạ Dày khiến 1 triệu người chết mỗi năm

Bệnh ung thư Gan khiến 662.000 người chết mỗi năm

Bệmh ung thư Đại Tràng khiến 655.000 người chết mỗi năm

Bệnh ung thư Vú khiến 502.000 người chết mỗi năm

Số người chết do bệnh ung thư thường rơi vào các quốc gia có thu nhậpbình quân trung bình và thấp (http://www.benhungthu.net.vn)

Ung thư đang là một trong những gánh nặng của bệnh tật toàn cầu ỞViệt Nam, mặc dù chưa có những thống kê đầy đủ nhưng theo thông tin từbệnh viện K Trung ương, mỗi năm cả nước có thêm khoảng 150.000 ca mắcung thư mới và 75.000 ca tử vong do căn bệnh ung thư (theo báowww.ungthu.net.vn) Theo dự báo của Bộ Y tế tại Hội nghị sơ kết về phòng

chống ung thư tháng 7/2009, năm 2010 Việt Nam sẽ có khoảng 200.000trường hợp mắc ung thư mới và 100.000 người tử vong Tuy nhiên, điều đáng

lo ngại là số bệnh nhân mắc bệnh ngày càng trẻ hoá, tế bào ung thư có xuhướng ác tính thường cao hơn và thời gian để khối u có kích thước nhân 2cũng ngắn hơn (http://www.ungthu.net.vn)

Như vậy, ung thư vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở ViệtNam Ung thư xảy ra ở cả nam và nữ, đối với nam giới, các bệnh ung thưthường gặp như: phổi, gan, vòm họng còn ở nữ là ung thư vú, ung thư cổ tưcung Đặc biệt, ung thư ở nữ thường xuất hiện ở độ tuổi 40-50, ngoài ra ungthư còn là mối đe dọa với mọi người già Ung thư có khả năng điều trị khỏinếu phát hiện ở giai đoạn sớm Để hạn chế sự gia tăng của căn bệnh này, việctìm ra phương cách phòng và chữa trị ung thư là mối quan tâm thực sự là rấtcấp thiết Phương hướng tìm kiếm các thảo dược lấy từ tự nhiên, để phòng vàchữa trị ung thư là một ưu sách

1.2 UNG THƯ HỌC, ĐẶC TÍNH CƠ BẢN, NGUYÊN NHÂN VÀ CÁC PHƯƠNHG PHÁP PHÒNG TRÁNH, CHỮA TRỊ.

Ung thư là tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khácnhau về nguồn gốc tế bào phát sinh, khả năng di căn, tiên lượng và cách thứcđiều trị nhưng đều có chung một đặc điểm nổi bật là sự tăng sinh vô hạn, vô

tổ chức không tuân theo cơ chế kiểm soát về phát triển của của cơ thể, có thể

di căn, tồn tại, xâm lấn và phát triển của tế bào ưng thư [3], [4], [32]

Ung thư là căn bênh của tế bào, ung thư thường xuất phát từ một tế bào banđầu của một tổ chức nào đó trong cơ thể và vượt qua cơ chế kiểm soát của cơ thể,phát triển, sinh sôi không ngừng, hình thành một đám tế bào có chung một đặcđiểm là phát sinh, phát triển vô tổ chức xâm lấn chèn ép vào các mô, các cơ quan

tổ chức xung quanh Như vậy ung thư là một bệnh lý ''ác tính'' của tế bào và rất đadạng về căn nguyên, cách phòng bệnh, chẩn đoán và điều trị

Hippocrate, một nhà y học Hy Lạp cổ đại được xem là người đầu tiênnhận dạng căn bệnh ung thư khi ông đặt tên cho căn bệnh là ''karkino'' theotiếng Hy lạp có nghĩa là con cua bởi sự xâm lấn, phát triển của khối u ác tínhnhắc ông nhớ tới hình ảnh ''con cua có các càng tua tủa'' Ngày nay ung thưhọc được thế giới biết đến với từ ''cancer'' theo tiếng anh và cũng có nghĩa làcon cua trong tiếng la tinh [5], [17].

1.2.1 Các đặc tính của bệnh ung thư

 Ung thư là căn bệnh của tế bào.

Ung thư bắt đầu từ một tế bào và phải mất một thời gian nhiều năm khi

có một khích thước đủ lớn mới xuất hiện các dấu hiệu nhận biết được Thôngthường, các tế bào có một tuổi thọ nhất định và tuân thủ chặt chẽ theo một quiluật chung là ''phát triển - già - chết'' Các tế bào chết đi lại được thay thế bằngcác tế bào mới Cơ thể có một cơ chế kiểm soát qui luật này rất nghiêm gặt vàduy trì số lượng tế bào của mỗi cơ quan, mỗi tổ chức ở mức ổn định Bệnhung thư bắt đầu khi có một tế bào vượt qua cơ chế kiểm soát này của cơ thể,phát triển, sinh sôi không ngừng, hình thành một đám tế bào (khối u) cóchung một đặc điểm là phát triển vô tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơquan, tổ chức xung quanh gây tử vong cho người bệnh [12], [21]

 Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn

Quá trình phát triển từ một tế bào ung thư ban đầu thành một khối uung thư và đe dọa tính mạng người bệnh trải qua nhiều giai đoạn [32]

Giai đoạn đầu là quá trình hình thành tế bào ung thư khởi phát do ảnhhưởng của các tác nhân nội bào hay ngoại bào Tiếp theo đó là quá trình phânchia liên tục không ngừng của tế bào ung thư này để thành một khối u đượcgọi là quá trình phát triển bệnh Các tế bào ung thư trong khối u sẽ tiếp tụctăng sinh, tự mất đi các phụ cảm nhận biết giới hạn với các tế bào lân cận sảnxuất ồ ạt các cytokine (cell signals) và các enzym protease dẫn tới phá huỷ

màng đệm lót và môi trường ngoại bào bao quanh, khiến chúng chỉ liên kếtlỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết

di chuyển tới các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vô tổchức Quá trình này gọi là sự di căn (metastatic process) Các tế bào ung thưchèn ép hay di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống trong cơ thể như não,tim, phổi, gan, thận v.v khiến bệnh nhân tử vong [1], [21], [57]

Như vậy, quá trình hình thành và phát triển căn bệmh ung thư được tómtắt như hình 1

 Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào

Theo nguồn gốc phát sinh, ung thư được các nhà khoa học phân chiagồm [27], [32], [57]

- Carcinoma (nguồn gốc biểu bì): đây là dạng ung thư phổ biến nhất,

phát sinh từ những tế bào có nguồn gốc từ lá phôi trong và lá phôi ngoài Nhưung thư phổi, ung thư vú, ung thư trực tràng, v.v…

- Sarcoma (ung thư liên kết): là dạng ung thư ít gặp, phát sinh từ

những tế bào có nguồn gốc lá phôi giữa và là những tế bào thuộc vào hệ thốngchống đỡ cho cơ thể như xương, sụn, mỡ, mô liên kết

Tế bào ung thư

Tế bào

bình

thường

Tử vong

U ác tính

Sống sót

Tác nhân nội bào hoặc ngoại bào

Quá trình tăng sinh

và phát triển

Chữa trị

Di căn xâm lấn

- Lymphoma (ung thư hạch): là dạng ung thư hiếm gặp phát sinh từ các

hạch bạch huyết và các mô thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể như ung thưLymphoma Burkitt

- Leukemia (ung thư máu - bệnh bạch cầu): là dạng ung thư nguy hiểm

và biểu hiện bệnh rất sớm, cả ở trẻ em và người trẻ tuổi, phát sinh từ các môtạo máu, các tế bào máu non thuộc tuỷ xương có xu hướng tích tụ thành sốlượng lớn trong hệ máu như trường hợp ung thư bạch cầu cấp tính (HumanAcute Leukemia)

 Các đặc tính của tế bào ung thư

Nhìn chung, tế bào ung thư kém biệt hoá hơn so với tế bào bình thường

do sự phân chia của nó quá nhanh chóng và diễn ra liên tục [21] Trong quátrình phân chia, các đặc tính tiềm ẩn của chúng cũng thay đổi bất thường vàrất nhanh theo thời gian Ví dụ, tế bào ung thư gan có thể mất đi khả năng sảnxuất một vài loại enzym đặc trưng so với tế bào gan bình thường khác và quanhiều lần phân chia bất thường, chúng thậm chí mất hẳn những chức năng đặctrưng của tế bào gan Kiểu bất thường này là do sự biến đổi nhanh chóng của

hệ gien trong tế bào ung thư

Các tế bào ung thư thường có rất nhiều nhiễm sắc thể bất thường vàkhông ổn định Hình thái, các tế bào ung thư có tỉ lệ nhân/tế bào chất cao,nhân to, bờ nét không rõ, xuất hiện nhiều sợi phân bào so với tế bào bìnhthường khác [17], [21], [32]

Do đó, tế bào ung thư có đặc tính riêng như:

- Khả năng xâm lấn và di căn của tế bào ung thư

Đây là tính đặc trưng và nguy hiểm nhất của tế bào ung thư và chỉ riêng tếbào ung thư mới có Các tế bào ung thư không khu trú tại chỗ mà chúng tăngcường xâm lấn vào các cơ quan, tổ chức sống lân cận, xâm nhập vào cả hệ thốngtuần hoàn và bạch huyết để di chuyển tới những vị trí cách xa nơi tế bào ung thư

phát sinh Tại vị trí mới, các tế bào ung thư lại tiếp tục tăng sinh tạo khối u mới,chèn ép vào các tổ chức mang chức năng sống của cơ thể và gây tử vong cho bệnhnhân Hiện nay, đặc thù này của tế bào ung thư vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ trên

cơ sở khoa học [17], [21], [57]

Khả năng di căn của tế bào ung thư cũng phụ thuộc vào tiềm năng pháttriển của chúng tại vị trí mới khi bị bao quanh bởi những tế bào hoàn toànkhác biệt về mặt chức năng và hình thái Tiềm năng này có được là nhờ xuấthiện một số protein mới ở tế bào ung thư Ví dụ, một số enzym được tế bàoung thư tiết ra sẽ làm thoái hoá phân tử collagen hay một số protêin màngđệm lót khác như proteolycan, glycosaminoglycan để chúng xâm nhập, tồn tại

và phát triển ở các tổ chức, cơ quan mới mà chúng vừa di chuyển tới [21],[50], [57]

- Khả năng sinh sản không thể kiểm soát của tế bào ung thư

Trong cơ thể con người, mỗi phút có tới 10 triệu tế bào sinh sôi Quátrình phân chia này diễn ra theo một trình tự khuôn mẫu và được kiểm soátchặt chẽ Khi một tế bào bình thường trở thành tế bào ung thư, nó sẽ phânchia bất thường Quá trình phân chia bất thường này diễn ra nhanh hơn bìnhthường và các tế bào con cháu được sinh ra sẽ không trưởng thành và chết đinhư các tế bào bình thường khác Ngược lại, chúng tiếp tục quá trình phânchia vô tổ chức và ngày càng trở nên khác biệt di truyền với tế bào mẹ banđầu [11], [50], [57]

-Khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch của tế bào ung thư

Tế bào ung thư có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch đểtồn tại và phát triển Trong hệ máu của cơ thể có những tế bào “giết tự nhiên”(Natural Killer Cell) có thể ngay lập tức nhận dạng và tiêu diệt các tế bào lạxâm nhập hay xuất hiện trong cơ thể Tuy nhiên, điều đáng ngạc nhiên là các

tế bào ung thư có những thay đổi đáng kể khác lạ với tế bào bình thườngnhưng lại thoát khỏi sự phát hiện và tiêu diệt của hệ miễn dịch [65]

Có lẽ các tế bào ung thư đã che dấu được mình để vượt qua sự nhậnbiết của các tế bào Lympho Kết quả hệ miễn dịch của cơ thể không thể pháthiện được tế bào ung thư và tiêu diệt chúng Tế bào ung thư là tế bào củachính cơ thể bệnh nhân nhưng bị biến chất, thoái hoá nguy hiếm làm hệ miễndịch không nhận biết được [21]

1.2.3 Nguyên nhân gây bệnh ung thư

Đến nay, chưa thể xác định rõ một loại nguyên nhân chung nào cho cácloại ung thư, mỗi loại ung thư có những nguyên nhân riêng biệt, tác động theonhiều cơ chế khác nhau nhưng hiện tại có thể chia làm 2 nhóm tác nhân lớn:Tác nhân môi trường và tác nhân sinh học [3], [4]

 Tác nhân môi trường: gồm tác nhân hoá học, vật lý.

Tác nhân hoá học gây ung thư như khói thuốc lá, các thành phần hoáhọc trong thuốc trừ sâu, các sản phẩm phụ gia dùng cho bảo quản thực phẩm,tạo mầu không đạt tiêu chuẩn, chất A-mi-ăng Trong đó khói thuốc lá đượcxem là mối nguy hại tiềm ẩn lớn nhất cho sức khoẻ cộng đồng với hơn 20chất hoá học có khả năng gây ra các bệnh ung thư như: ung thư phổi, thanhquản, thực quản, v.v… Ngoài ra các khí đốt xăng dầu, động cơ, khí thải nhàmáy công nghiệp, v.v… cũng được xem là độc hại và gây ôi nhiễm môitrường là nguyên nhân gây bệnh ung thư cao cho con người [4], [21], [36],[57]

Tác nhân hoá học gây ung thư theo 2 cách:

* Tác động trực tiếp đến hệ gen gọi là nhóm carcinogen như các dẫnxuất của nitrosamin có nhiều trong thành phần thuốc lá, các alcohol trongrượu, các polycyclic hydrocarbon (PAH), polyvinyl chloride (PVC), thuốc trừsâu chứa DDT, aflatoxin trong nấm mốc v.v… [4], [21]

Cơ chế hoạt động của nhóm hoá chất này là thông qua trung tâm ái lựcđiện tử electrophilics để phản ứng với các trung tâm mang điên tích âm củacác phân tử protein, ADN, ARN của tế bào, từ đó gây ra những thay đổi vềmặt cấu trúc của các phân tử này dẫn tới thay đổi về mặt chức năng Do tácđộng trực tiếp vào các phân tử ADN, nhóm hoá chất này đã làm biến đổi cácgen tiền ung thư Proto-oncogene trở thành gen ung thư oncogene dễn tới hìnhthành tế bào ung thư nguyên phát [4], [61], [62], [47].

* Nhóm hoá chất gây ung thư tác động gián tiếp gọi là các promoter,chúng cũng chứa đựng các trung tâm ái lực điện tử electrophilic nhưng khôngtác động trực tiếp đến phân tử ADN, ARN mà thông qua việc kích hoạt cácenzym kinase nội bào (nhóm enzyn này chịu trách nhiệm trong quá trình phânchia mitosis của tế bào), làm thay đổi cấu trúc và chức năng các phân tửADN, ARN của tế bào, qua đó biến đổi gen tiền ung Proto-oncogene trởthành gen ung thư oncogene dẫn tới hình thành tế bào ung thư Đại diện điểnhình của nhóm này là phorbol ester [2], [47]

Các yếu tố phóng xạ như tia X, tia gamma, các đồng vị phóng xạ 3H,

14C, 32P dùng trong quân sự, y học, nghiên cứu khoa học hay nguồn phóng

xạ tự nhiên từ vũ trụ, từ các đồng vị phóng xạ trong không khí, đất, nước như:các hạt anpha và proton cũng là một trong số những tác nhân gây ung thư caocho con người trên toàn cầu [3], [4], [17], [21]

Cơ chế gây ung thư của các tia phóng xạ cũng giống như một số hoáchất gây ung thư, tác nhân phóng xạ thường tác động đến cơ thể thông quaviệc tạo rất nhiều gốc tự do như: O , HO-, NO- [48] Chính các gốc tự donày đi vào nhân gây ra phản ứng oxi hoá làm thay đổi cấu trúc của phân tửADN dưới sự xúc tác bởi các ion sắt, đồng, định vị gần phân tử ADN Sự thayđổi cấu trúc ADN rất nghiêm trọng, đây là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh

di truyền và cả bệnh ung thư [4], [21], [37]

Ngoài ra, một số tác nhân cũng có là nguyên nhân gây ung thư như tia

tử ngoại mặt trời, tia cực tím UV, sóng điện từ, chế độ ăn uống giàu lipit,đạm [3], [4], [5]

 Tác nhân sinh học

Tác nhân sinh học chủ yếu là một số loại virus và vi khuẩn có khả năngkhởi động châm ngòi cho sự phát triển ung thư khi nó lây nhiễm sang tế bàobình thường [4], [21], [49], [63]

Virus gây ung thư gồm 2 loại: virus ADN và virus ARN Cơ chế gâyung thư của các virus này tương đối phức tạp và chưa được hiểu hết Tuynhiên, có thể xem như chúng làm biến đổi các tính đặc thù của tế bào chủ(hình thái, sinh lý, sinh hoá) bằng cách hợp nhất một số gen của mình vào hệgien của tế bào bị chúng lây nhiễm khiến cho một số gien hoạt động bấtthường, các proto - oncogene biến đổi thành oncogen mở đầu cho sự hìnhthành căn bệnh ung thư [21], [64] Oncogene chính là gen dẫn đến sinh ungthư mới (neoplasma), nó đóng vai trò chủ yếu trong sinh ung thư [4].Oncogene được thừa nhận đầu tiên ở virus ung thư gây ra biến hình tế bàoviral oncogene [4]

* Virus ADN gây ung thư có nhiều loại, đặc trưng nhất là các papovavirusvới hai đại diện thường gặp là SV40 và polyma Trên lý thuyết, ADN của virus cóthể hợp nhất vào ADN của tế bào chủ tại vị trí đặc trưng hoặc những vị trí ngẫunhiên khác Do vậy, sau khi bị lây nhiễm, tế bào chủ thường bị kích hoạt để đi vàoquá trình sinh sôi vô tổ chức không thể kiểm soát hình thành bệnh ung thư [21]

* Đối với các virus ARN gây bệnh ung thư thường gặp nhất làRetrovirus Đây là một trong những virus gây ung thư đầu tiên được ReytonRous tìm ra 1911 và đặt tên là RSV, một Retrovirus (đảo ngược) mang gienARN [17] Cơ chế hoạt động của các virus ARN phức tạp hơn so với cácvirus ADN Các Retrovirus gây bệnh ung thư theo 2 cách:

a Trong phương thức hoạt động thứ nhất, các Retrovirus chứa phân tửARN như vật liệu di truyền và sử dụng enzyme sao chép ngược (reversetrascriptase) để tạo ra một phiên bản ADN nội bào mới có khả năng gắn kết

và sát nhập vào hệ ADN của tế bào chủ Các gien của virus gắn kết trực tiếpvào các proto - oncogene của tế bào chủ nên đã biến chúng thành dạngoncogene gây ung thư

Thông thường một tế bào bình thường để chuyển sang tế bào ung thưphải trải qua một hoặc một vài đột biến ở gen nhất định Quá trình này liênquan đến hệ thống gien tiền ung thư (proto - oncogene) và gen át chế ung thư(tumor - suppressor gene), gen tiền ung thư mã hoá cho nhóm protein thamgia vào quá trình hình thành những chất truyền tin (messennger) trong quátrình dẫn truyền tín hiệu tế bào Các chất truyền tin này sẽ truyền tín hiệu

"tiến hành phân bào" tới chính tế bào đó hay những tế bào khác Do vậy khi bịđột biến, các gen tiền ung thư sẽ biểu hiện quá mức (overexpression) các tínhiệu phân chia tế bào và làm các tế bào tăng sinh thừa thải, lúc này trở thànhcác gen ung thư (oncogene) Tuy nhiên, những các gen ung thư thực chất làcác gen cần thiết đối với quá trình phát triển, sửa chữa và hằng định nội môicủa cơ thể Do đó, kháng thể loại bỏ những gen này khỏi hệ gen tế bào chủnhằm làm giảm khả năng ung thư

b Trong phương thức hoạt động thứ 2, thì vị trí gắn kết và hợp nhấtkhông phải trực tiếp vào các proto - oncogene mà chỉ ở gần đó nhưng cũngkích hoạt chúng hoạt động như một oncogene thực sự [21]

Trong các Retrovirus phải kể đến virus HIV, nó không trực tiếp gây rabệnh ung thư nhưng chúng làm suy giảm và mất khả năng miễn dịch của cơ thểkhiến hệ miễn dịch mất khả năng diệt tế bào ung thư nguyên phát, dẫn tới cơ thểrất mẫn cảm với nhiều loại virus, vi khuẩn gây bệnh ung thư [5] Virus gây suygiảm hệ miễn dịch

Ngoài ra, virus viêm gan B được xem là một trong những nguyên nhânchính gây ung thư gan.

1.2.4 Khả năng phòng và chữa bệnh ung thư

Ung thư là căn bệnh tiến triển trong thời gian tương đối dài kể từ khikhởi phát một tế bào ban đầu, nên việc phòng và trị bệnh ung thư mang lạisức khoẻ cho cộng đồng là hoàn toàn có thể Tuy nhiên, khi các khối u đó dicăn thì việc chữa trị trở nên khó khăn, tỉ lệ tử vong của người bệnh là rất cao

Vì vậy, việc phòng hay chữa trị bệnh nên được thực hiện càng sớm càng tốt[28], [57]

Việc phòng bệnh có hiệu quả là tránh tiếp xúc với các tác nhân gâybệnh và thực hiện lối sống lành mạnh, có chế độ ăn uống, làm việc hợp lý vàkhoa học, nên thường xuyên tập luyện thể thao

Việc chữa trị bệnh ung thư tùy thuộc từng loại ung thư, từng giai đoạnkhác nhau, vào tính chất của tế bào ung thư mà áp dụng một hay nhiềuphương pháp điều trị khác nhau như liệu pháp sinh học, hoá trị, xạ trị, phẫuthuật hay kết hợp cả bốn liệu pháp này Gần đây, xuất hiện khái niệm mới về

“hoá học phòng chống ung thư-Cancer chemoprevention” là việc sử dụng cáchoạt chất có khả năng chống oxy hoá, kích hoạt hệ enzyme khử độc, v.v… đểloại bỏ các tác nhân gây ung thư cho cơ thể hoặc sử dụng các hoạt chất có khảnăng tác động tới các yếu tố truyền tín hiệu thứ cấp như NfkB (nuclear factorkappa binding), cAMP (3'-5'-cyclic adenosine monophosphate), v.v… liênquan đến quá trình phát triển ung thư để ngăn cản bệnh phát triển Hoá họcphòng chống ung thư đang được xem là rất có triển vọng trong phòng và chữatrị bệnh ung thư [4], [27], [29], [30], [37], [51]

 Liệu pháp sinh học (Biological therapy)

Liệu pháp sinh học là sử dụng hệ miễn dịch của cơ thể một cách trựctiếp hoặc gián tiếp để chống lại bệnh ung thư hoặc thông qua việc làm giảm

thiểu các tác dụng phụ của các liệu pháp chữa trị ung thư khác Liệu pháp nàybao gồm việc sử dụng các interferon, interleukin, kháng thể đơn dòng,vaccine, can thiệp vào hệ gen và các chất tăng cường miễn dịch không đặctrưng để chống lại tế bào ung thư [21], [57].

Liệu pháp sinh học được sử dụng để:

+ Giám sát ngăn chặn hoặc chấm dứt các phản ứng sinh học cho phép tếbào ung thư phát triển [34], [57]

+ Làm cho tế bào ung thư được nhận dạng nhờ đó hệ miễn dịch nhận biết

và tiêu diệt tế bào ung thư [57]

+ Tăng cường sức mạnh tiêu diệt của các tế bào trong hệ miễn dịch như

tế bào lympho T, NK và macrophages [57]

+ Chuyển dạng phát triển của tế bào ung thư để hướng những tế bào độtbiến này đi vào quá trình tự chết [57]

+ Tăng cường khả năng sửa chữa hoặc thay thế những tế bào bình thường

bị tồn thương trong quá trình chữa trị ung thư bằng xạ trị hay hoá trị [57]

+ Ngăn chặn hoặc đảo ngược quá trình chuyển dạng từ tế bào bìnhthường hay tế bào tiền ung thư thành tế bào ung thư

+ Phòng chống tế bào ung thư di chuyển tới các bộ phận khác của cơ thể [57]

 Liệu pháp hoá trị

Đây là liệu pháp chữa trị bằng hoá chất có khả năng ngăn chặn hoặctiêu diệt sự phát triển của tế bào ung thư Các hoá chất được sử dụng tuỳ vàotừng loại ung thư khác nhau có liều lượng khác nhau Đến nay việc chữa trịung thư bằng liệu pháp hoá trị đang được xem là phổ biến và mang lại hiệuquả cao Tuy nhiên, liệu pháp này thường đi kèm với nhiều tác dụng phụkhông mong muốn như nôn mữa, rụng tóc, giảm lượng hồng cầu [13], [33]

 Liệu pháp xạ trị

Là liệu pháp sử dụng nguồn năng lực cao từ tia X, tia gamma, neutron

và các nguồn phóng xạ khác để tiêu diệt tế bào ung thư và các khối u Liệukhác này sử dụng máy chiếu phóng xạ từ ngoài cơ thể hoặc thông qua một sốnguồn vật liệu phóng xạ được chuyển vào cơ thể ở vị trí gần khối u ung thư.Ngoài ra, còn sử dụng các chất đồng vị phóng xạ gắn với kháng thể đơn dòng

để tăng cường tính hiệu quả và đặc hiệu, tránh làm tổn thương các tế bào lànhkhác trong quá trình điều trị bệnh ung thư [11], [57]

 Liệu pháp phẫu thuật

Sử dụng phẩu thuật để cắt bỏ khối u ung thư Liệu pháp này thực sựđem lại hiệu quả chữa trị cao, nếu đây là giai đoạn đầu của bệnh ung thư,chưa có di căn, khối u vẫn còn khu trú tại chỗ Trong trường hợp bệnh đã dicăn đến các khu vực khác trong cơ thể thì liệu pháp này cần kết hợp với cácliệu pháp khác để điều trị tích cực và triệt để [3], [17]

 Liệu pháp hoá học phòng chống ung thư (HHPCUT)

Mục đích của liệu pháp hoá trị liệu ung thư (cancer chemotherspy) nhằmtiêu diệt tế bào ung thư để ngăn ngừa sự tiến triển của căn bệnh , thì liệu phápHHPCUT nhằm ngăn chặn bệnh hình thành và phát triển [39], [40], [57]

Các nhóm hoạt chất phòng chất ung thư hoạt động theo 2 cách:

- Phòng chống hoặc ngăn chặn những đột biến gen có khả năng dẫn tớibệnh ung thư [57]

- Phòng chống hoặc ngăn chặn quá trình tăng sinh liên tục của các tếbào bệnh dẫn tới hình thành một khối u [57]

Phòng chống ung thư, bảo vệ sức khoẻ cho cộng đồng nói chung và chonhóm người làm việc trong môi trường tiếp xúc thường xuyên với hoá chất,phóng xạ, ô nhiễm, v.v… có nguy cơ mắc bệnh ung thư cao là vấn đề dược

nhiều nhà khoa học quan tâm Viên nghiên cứu ung thu của Hoa Kỳ - NCI đãđưa HHPCUT thành một trong những vấn đề được ưu tiên hàng đầu.

 Phòng chống chữa trị ung thư ngay ở các giai đoạn phát triển ung thư

Một tế bào bình thường khi chịu tác động của các tác nhân gây ung thư

sẽ có sự biến đổi bất thường về mặt di truyền, các gen Proto - oncogene biếnđổi thành các oncogene gây ung thư và hình thành ở giai đoạn khởi phát củabệnh ung thư Quá trình này có thể phòng chống bằng nhiều phương cáchkhác nhau như dùng hoạt chất cảm ứng các enzyme khử độc của cơ thể nhưGlutathione - S -transferase (GST), Quinone reductase (QR) nhằm loại bỏcác yếu tố gây ung thư [38], hay sử dụng các dược chất chống oxi hoá nhằmloại bỏ các gốc tự do gây đột biến gen, [37] Ngoài việc giúp cơ thể tránhảnh hưởng hoặc loại bỏ tác nhân ung thư, các hoạt chất phòng chống ung thưcòn kích hoạt hệ gen sửa chữa đột biến hay kích hoạt tế bào chuyển dạng đivào quá trình tự chết Nhờ vậy, sự hình thành ung thư sẽ được loại bỏ Cáchoạt chất có khả năng phòng chống ung thư ở giai đoạn này gọi là các dượcchất phòng ung thư tiền phát (anti - intiation agents) [36]

Trong giai đoạn ung thư phát triển, việc phòng chống ung thư tập trungvào các dược chất có khả năng kìm hãm, ức chế sự phát triển, trì hoãn haydừng sự tăng sinh của tế bào ung thư, từ đó ngăn chặn sự phát triển của khối u

đã có, phòng chống sự hình thành các khối u mới sinh [35]

1.3 MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CÓ TÁC DỤNG PHÒNG CHỐNG VÀ CHỮA TRỊ BỆNH UNG THƯ

Sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên trong phòng ngừa và chữatrị bệnh ung thư đang là hướng đi chính của nhiều nhà nghiên cứu khoa học.Đây là một hướng đi có hiệu quả vì tính an toàn và tính kinh tế

Từ lâu, việc chữa trị ung thư bằng hoá chất (hoá trị liệu) được sử dụngphổ biến và có hiệu quả nhất định trong cứu chữa các bệnh nhân ung thư

Phương pháp chữa trị ung thư bằng hoá chất này mang tính độc cao đối với tếbào ung thư, tiêu diệt hoặc ngăn chặn tế bào ung thư phát triển song cũng độcvới tế bào bình thường, gây ra những tác dụng phụ không mong muốn Vìvậy, các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm những hoạt chất đặc hiệu hơntrong việc tiêu diệt hoặc ức chế tế bào ung thư phát triển mà ít ảnh hưởng tới

tế bào bình thường khác [35]

Đến nay đã chính thức có 15 hoạt chất được sử dụng trên toàn thế giới

để điều trị một số bệnh ung thư (bảng 1) [8], 23], [26], [33], [41]

Bảng 1 Danh mục 15 hoạt chất từ thực vật và sử dụng để điều trị ung thư

3 Colchiceine amide Colchcum autumnale

9 Monocrotaline Crotalaria sessiliflorra

10 Podophyllotoxin Podophyllum peltatum

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rất nhiều hợp chất trong tự

nhiên có hoạt tính phòng chống ung thư cao ở điều kiện in-vitro, in-vivo đã

cho những kết quả khả quan khi được thử nghiệm tiền lâm sàng cũng như ởmức lâm sàng trên cơ thể người như Polyphenol của chè xanh, Piroxicam,Oltipraz Vitamin B12, Folate v.v… [4], [40]

Đến nay, được biết có 12 hợp chất và nhóm hoạt chất được sử dụng đểphòng chống ung thư trong những điều kiện nhất định đem lại một số hiệuquả khả quan trong việc phòng chống và cứu chữa cho bệnh nhân ung thư [3],[27], [51] Một số hoạt chất phòng, chống ung thư đã và đang được sử dụngphổ biến được thể hiện ở bảng 2.

Bảng 2 Các hợp chất phòng, chống ung thư phổ biến

1 Vitamin A và các Retinoid khác Vitamin

6 Hợp chất Selenium Chất khoáng (Mineral)

Đỗ thị Thảo (2006), trong luận văn tiến sĩ của mình, đã phát hiện ra

hoạt chất Scuterbarbalactone VN tách chiết từ cây Bán chi liên, chứng minh

có khả năng ức chế và diệt tế bào ung thư phát triển ở điều kiện in-vitro

nhưng không ảnh hưởng đến tế bào bình thường khác Vậy việc kiểm nghiệm

ở mức in-vivo và kiểm nghiệm lâm sàng ở động vật và người để phát triển

thành thuốc phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư đang cần được tiếp tục

Bên cạnh việc chữa trị, phòng ngừa ung thư cũng đóng vai trò quantrọng Đa phần việc phòng chống nhiều bệnh nguy hiểm là thông qua vaccine.Tuy nhiên, việc sử dụng vaccine phòng tất cả các loại ung thư cho đến nay làchưa thể thực hiện được do đặc tính của căn bệnh ung thư là đa dạng, đanguyên nhân Hiện nay đã chế xuất ra loại vacxin phòng chống ung thư cổ tửcung cho phự nữ đã được bán rộng rãi trên thị trường Vì thế, việc tiếp tục hi

vọng một liệu pháp vaccine cho các loại bệnh ung thư trong tương lai đang làhướng nghiên cứu chung của các nhà nghiên cứu khoa học và là hướng đichính của thời đại.

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM THUỐC PHÒNG CHỐNG VÀ CHỮA TRỊ UNG THƯ TRONG NƯỚC

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có thảm thực vậtphong phú và đa dạng Theo số liệu thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiênnhiên Thế giới (IUCN) thì Việt Nam có trên 12.000 loài thực vật và khoảng4.000 loài được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh Đây chính lànguyên liệu quý giá cung cấp cho nền công nghiệp dược phẩm nước nhà Từ

xa xưa ông cha ta đã tận dụng nguồn tài nguyên này để cứu chữa bệnh tật chonhân dân Các kinh nghiện thực tế đã được đúc kết thành rất nhiều sách quý

và lưu truyền cho đến tận ngày nay Với căn bệnh ung thư đã có nhiều tài liệughi lại khả năng chữa trị u bướu của một số loại thực vật [6], [15]

Các nhà khoa học Việt Nam, bên cạnh việc phát huy những kinhnghiệm của cha ông, đang gắng sức tìm hiểu khả năng thực sự trong việc chữatrị căn bệnh ung thư ở mức độ phân tử Đã có một số báo cáo khoa học công

bố và chứng minh khả năng chữa trị ung thư của một số loài thực vật nhưTrinh nữ hoàng cung [5], [16], cây Bổ béo đen, cây Diếp cá [14], cây Hà thủ

ô trắng, cây Bí kỳ nam [43] và một số loại cây khác [42]

Tuy nhiên, còn nhiều loài thực vật được ghi nhận là có khả năng chữatrị ung thư, chống viêm hay tăng cường hệ miễn dịch chống ung thư, đã vàđang tiếp tục được nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử nhằm tìm ra hoạt chất cóhoạt tính phòng chống ung thư Đây là hướng đi tích cực, khả quan của ngành

y tế với mục tiêu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

1.4.1 Tổng quan về cây Bán chi liên (Scutellariabarbata D Don).

Hình 2 Cây Bán chi liên (Scutellaria barbata D Don)

Bán chi liên (hình 2) hay còn gọi là Thuẩn râu, cỏ Hàn tín lá hẹp có

tên khoa học là Scutellariabarbata D Don hay Scutellaria rivularis Wall

thuộc chi Hoàng cầm (Scutellaria), họ Bạc hà Lamiaceae [6], [9] Bán chi liên

là một thảo dược lưu niên được phân bố ở Hàn Quốc, phía nam Trung Quốc,

và Việt Nam Cây được biết đến trong y học dân tộc Trung Quốc với tên Zhi-Lian và trong y học Hàn Quốc có tên gọi là Banjiryun Còn ở Việt Nam,theo GS Võ Văn Chi (1996), Bán chi liên còn được gọi là Hoàng cầm râu,phân bố nhiều ở các ruộng khô thuộc Hoà Bình, Hà Tây, Bắc Thái, Hà Giang,Hoà Bình, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hoá Toàn cây được thu hái vàomùa xuân, mùa hè lúc cây ra hoa, rửa sạch, phơi khô, bó lại để dùng Theodân gian, cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc lợi tiểu,tiêu sưng, giảm đau, chống khối u tân sinh, áp xe phổi, viêm ruột thừa, viêmgan, xơ gan cổ trướng [7], [8], [9], [25], [44]

Ban-Trong y học Trung Quốc toà cây khô được dùng làm thuốc hạ sốt, lợitiểu, điều trị khối u tân sinh, ung thư phổi, ung thư gan, ung thư trực tràng Ngoài ra, dùng cây tươi giã đắp, nấu nước rửa, trị mụn nhọt, sưng đau, viêm

vú, dùng thay ích mẫu chữa bệnh phụ khoa Bán chi liên có trong đơn thuốcchữa, ung thư phổi, ung thư gan, ung thư trực tràng [9],[26], [65],[66 ], Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm tớicây Bán chi liên của Trung Quốc vì khả năng chống ung thư của nó Nhiều

nghiên cứu in-vitro đã chứng minh rằng một số thành phần hoá học của cây

Bán chi liên có khả năng diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển [20], có khảnăng tác động đến quá trình tự chết apoptosis của tế bào [63], [64], kích hoạt

hệ enzyme caspase [59], tác động và ức chế nhiều yếu tố liên quan quá trìnhtăng sinh, phát triển và bất tử của tế bào ung thư như Cyclooxygenase-2(COX-2), extracellular signal-regulated kinase (ERK)/ Akt, v.v… [63]

Ở mức độ lâm sàng, loài thực vật này đã được sử dụng rất nhiều chochữa trị các bệnh ung thư đường tiêu hoá, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư

vú, ung thư tử cung [44], [45] Gần đây, một số nhà khoa học thuộc trườngđại học California, Hoa Kỳ thậm chí đã tiến hành thử nghiệm chữa trị ung thưlâm sàng pha I cho 21 bệnh nhân ung thư bằng chất chiết thô bằng nước củacây Bán chi liên Thí nghiệm này đã cho những kết quả rất khả quan Chấtchiết thô của cây Bán chi liên ức chế mạnh sự phát triển của khối u trên cácbệnh nhân ung thư vú, duy trì và thậm chí làm giảm kích thước khối u (theotiêu chuẩn RECIST) ở 16 bệnh nhân và cho thấy có độ an toàn nhất định, hầunhư không có tác dụng phụ [67]

Năm 2007, công ty dược phẩm Bionovo đã đăng ký một sáng chế pháttriển chế phẩm BZL101 từ dịch chiết nước của cây Bán chi liên trong điều trịung thư, đặc biệt là ung thư vú Theo các nhà nghiên cứu, hiệu quả của BZL

101 là ngăn chặn các tế tào ung thư phát triển ở pha G1 trong chu kỳ tế bào vàhướng những tế bào này đi đến quá trình tự chết (apoptosis) mà không ảnhhưởng đến tế bào thường Do vậy, nó ít khả năng gây tác dụng phụ Đây thực

sự là phát hiện quan trọng và tạo động lực để phát triển Bán chi liên làm thuốchoá dự phòng ung thư, đặc biệt là bệnh ung thư phụ thuộc hoocmon [22],[63], [64], [67]

Với mong muốn làm sáng tỏ tác dụng sinh học từ cây Bán chi liên, cácnhà khoa học trên thế giới đã tiến hành khảo sát thành phần hoá học tìm rahoạt chất đóng vai trò chính đối với công dụng của cây Bán chi liên là hợpchất Flavonoid và các hợp chất diterpenlactone có khung neoclerodan nhưscutebarbatine A, scuterivulactone C1, scutebarbatine G (1), 6,7-di-O-nicotinoylscutebarbatine G (2), 6-O-nicotinoyl-7-O-acetylscutebarbatine G(3), scutebarbatine H (4) and 7-O-nicotinoylscutebarbatine H hay nhưpheophorbide v.v… [59], [63], [65], [66] Các hợp chất này đã được chứngminh là có khả năng phòng chữa ung thư ở mức nhất định, ví dụ nhưpheophorbide tác động đến quá trình tự chết của tế bào apoptosis [64], từ dịchchiết thô của thân, lá cây Bán chi liên, Yoichi Sato và cộng sự đã phân lập vàxác định cấu trúc của hợp chất Flavonoid là Apigenin và Luteolin có hoạt tínhchống oxy hoá, chống dị ứng và kháng một số dòng ung thư ở người như ungthư phổi, ung thư vú và ung thư gan Hep-G2 [59] Luteolin ức chế sự sinh sảncủa tế bào ung thư LLC [63] Tiếp đó, Chen LG và cộng sự trường đại họcQuốc gia Đài loan đã phân lập được Wogonin từ thảo dược này Kết quả chothấy, Wogonin có khả năng chống ung thư và điều tiết tác dụng kháng viêmthông qua việc kìm hãm hoạt động của enzyme COX-2 là enzym làm tiếntriển quá trình ung thư trong cơ thể [63]

Năm 2006, Dai SI cùng cộng sự của trường Đại học Quảng Tây TrungQuốc đã phân lập được các neo-clerodanes là barbatin A, barbatin C Các chấtnày thể hiện hoạt tính độc tế bào kháng lại các dòng tế bào gây ung thư ởngười là HONE-1 (ung thư vòm họng) KB (ung thư biểu bì miệng) và HT-29(ung thư thanh quản) với giá trị IC50 nằm tromg khoảng 3,5-8,1µM [68].

Cũng trong năm 2006, nhóm nghiên cứu của Sheng Jun Dai, trườngĐại học Quảng Tây Trung Quốc đã phân lập được thêm 5 neo-clerodanediterpenoid alkloid là scutebarbatins B-F Các chất này cũng thể hiện hoạttính độc tế bào kháng lại các dòng tế bào gây ung thư ở người là HONE-1(ung thư vòm họng) KB (ung thư biểu bì miệng) và HT-29 (ung thư thanhquản) với giá trị IC50 nằm trong khoảng 3,9-7,8μM [68]

Năm 2007, nhóm nghiên cứu trên lập được thêm 9 alkloid mới làscutebarbatins G, 6-7-di-O-nicotynoylscutebarbatin G, 6-nicotynoyl-7-O-acetyl scutebarbatins G, scutebarbatine H và 7-O-nicotynoylscutebarbatin H

và các scutebarbatins I-L, có hoạt tính chống lại các dòng tế bào gây ung thư

ở trên với giá trị IC50 nằm trong khoảng 3,5-8,5 μM [66]

Năm 2008, Nguyễn Thu Hà- Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đãnghiên cứu và phân lập được 3 hoạt chất là barbatine (C, D) và Scutebarbatine

A có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư qua phép thử độc

tế bào với 04 dòng tế bào ung thư là ung thư biểu mô (KB), ung thư vú(MCF-7), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU) Vì các tế bào ung thư lànhững tế bào kém biệt hoá do sự phân chia quá nhanh chóng và diễn ra liêntục Chúng có khả năng vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch của cơ thể vàtăng cường xâm lấn vào các tổ chức sống lân cận Vì vậy những chất có khảnăng phòng chống và điều trị ung thư là những chất được đánh giá có hoạttính gây độc cho tế bào ung thư, do đó có khả năng ức chế sự phát triển và

diệt tế bào ung thư Kết quả cho thấy, chất barbatine C có khả năng gây độccho tế bào ung thư biểu mô -KB với giá trị IC50 là 19,78 μM/ml, chấtbarbatine D có hoạt tính độc trên 2 dòng tế bào là ung thư biểu mô-KB và ungthư gan Hep-G2 với giá trị IC50 là 28,32 μM/ml và 24,97 μM/ml, chấtScutebarbatine A có hoạt tính độc với tế bào ung thư phổi với giá trị IC50 là10,86 μM/ml [19].

Tuy nhiên, đa phần các nghiên cứu đã công bố về khả năng phòng chữaung thư của cây Bán chi liên đều tập trung vào chất chiết thô hoặc chỉ một sốphân đoạn hoá học nhất định như phân đoạn Chloroform v.v

Đỗ thị Thảo (2006) đã phân lập được một số hợp chất từ cây Bán chiliên, trong đó có một hoạt chất mới được đặt tên là Scuterbarbalactone VN

Qua khảo sát hoạt tính độc tế bào ở điều kiện in-vitro đã chứng minh khả

năng diệt và ức chế của hoạt chất này trên nhiều dòng tế bào ung thư nhưdòng tế bào ung thư biểu mô-KB, tế bào ung thư phổi LU, tế bào ung thư ganHepa1c1c7, tế bào ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, tế bào ung thư máu cấp tínhHL-60, v.v… hoạt chất này thể hiện hoạt tính rất tốt với giá trị IC50 nằm trongkhoảng từ 2,2 - 8,3 μM và thể hiện hoạt tính mạnh nhất trên dòng tế bào ungthư vú (IC50 = 2,2 μμM), yếu nhất trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB (IC50 =8,3 μM), hoạt chất cũng có thể có tính độc tế bào trên tế bào bình thường khikiểm tra bằng tế bào gốc ESC (IC50 ≥20µM) nhưng không đáng kể Theo tácgiả, Scuterbarbalactone VN có tác dụng ức chế tế bào ung thư là do nó ảnhhưởng tới hoạt động phiên mã của gen Oct4 Gen Oct4 là gen mã hoá cho yếu

tố điều hoà phiên mã và được xem là gen quan trọng giám sát quá trình sinhsản và biệt hoá của tế bào gốc, cũng như đối với tế bào ung thư Ngoài ra,hoạt chất này còn ức chế được hoạt động của enzyme aromatase (CYP19).Aromatase là enzyme biến đổi androgen thành steroid C18 estrogen vòng,

bước quan trọng nhất trong quá trình tổng hợp hoocmon estrogen Đối vớimột số loại ung thư như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến thì hoạt động củaenzyme này sẽ là yếu tố kích thích khối ung thư phát triển Do vậy, hợp chấtnào có khả năng ức chế hoạt động của enzyme này sẽ được xem là có hoạttính phòng chống ung thư ở giai đoạn tiến triển bệnh lý Mặt khác, hoạt chấtnghiên cứu này có thể có tính độc tế bào với các tế bào bình thường nhưngkhông đáng kể nhưng tác động mạnh tới các tế bào ung thư [10].

Như vậy, hoạt chất SBVN tách chiết từ cây bán chi liên đã được chứngminh có hoạt tính mạnh diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển ở điều kiên

in-vitro Đây là cơ sở để chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về khả

năng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất tiềm năng này ở mức in-vivo,

góp phần nhằm làm sáng tỏ vai trò của hoạt chất SBVN trong phòng ngừa vàchữa trị bệnh ung thư của cây Bán chi liên Dưới đây là quy trình tách chiết vàphân lập tìm ra hoạt chất SBVN của nhóm tác giả Đỗ Thị Thảo và chúng tôidựa trên quy trình này để tách chiết ra hoạt chất SBVN với một lượng là 8,2

gram, lượng cần thiết để phục vụ cho nghiên cứu của in vivo của chúng tôi.

1.4.2 Quy trình tách chiết, phân lập và cấu trúc hóa học của SBVN

Cây Bán chi liên được rửa sạch bụi đất, thái nhỏ và hong ngoài khôngkhí ở nhiệt độ phòng đến khi khô, bảo quản trong kho có điều hoà nhiệt độ rồixay thành bột mịn trước khi chiết xuất Bột nguyên liệu thực vậtkhô này được ngâm chiết 3 lần với methanol ở nhiệt độ phòng Dịch chiếtmethanol thu được (ký hiệu là R1) được cất loại bớt methanol (MeOH) trongthiết bị cô quay chân không cho đến khi thể tích của dịch methanol/nước cònlại bằng khoảng 1/10 thể tích ban đầu Dịch methanol/nước này được chiết lầnlượt với n-hexan (3 lần) và CH2Cl2 (4 lần)

Sơ đồ qui trình tách chiết và phân lập hoạt chất SBVN

SBVN (3) C 34 H 38 O 8 (MW= 574)

Các sản phẩm thu được sau khi cất loại hết dung môi trong chân không

là cặn n-hexan (ký hiệu là R2), cặn CH2Cl2 (ký hiệu là R3) Một phần của cặn

dịch chiết CH2Cl2 trước tiên được chạy sơ bộ qua một cột Sephadex LH-20,rửa giải bằng methanol để loại các chất diệp lục Phần không chứa các chấtdiệp lục được đem tách trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môin-hexan/acetone có hàm lượng acetone tăng dần từ 5% đến 30% Kết quả cho

6 phân đoạn gộp F1 - F6 Phân đoạn F2 được làm sạch nhiều lần qua các cột

Sephadex LH-20 (dung môi rửa giải là methanol) và silica gel (dung môi rửagiải là 15% acetone trong n-hexan) thu được hoạt chất SBVN Phổ hồngngoại của SBVN có các dải hấp thụ đặc trưng ở 3440 (nhóm chức OH), 1787(nhóm γ-lacton), 1714 (nhóm este), và 1639 (vòng benzen) Phân tích các phổ13C NMR và DEPT cho thấy phân tử có 34 nguyên tử carbon bao gồm 4nhóm CH3, 5 nhóm CH2, 15 nhóm CH, 3 nhóm C=O (δC 166,44; 167,32;C 166,44; 167,32;

174,01) cùng 7 carbon bậc bốn khác Phổ khối lượng EIMS cho pic có số khốicao nhất tại m/z 574, ứng với ion phân tử M+ Các dữ kiện này dẫn đến côngthức phân tử là C34H38O8 Phổ HMQC cho phép ta gán mỗi nguyên tửcarbon với các nguyên tử hiđro gắn trực tiếp với nó.

Phân tích các dữ liệu phổ cho phép dự đoán một cấu trúc khungditecpen tương tự như khung của các hợp chất scutebarbatine A

và scuterivulactone C1 được phân lập trước đây từ các cây Bán chi liên củaTrung Quốc Việc phân tích các chuỗi gắn kết nguyên tử dựa trên các phổCOSY và HMBC cho phép ta thấy phân tử có một mảng decalin gắn với mộtmảng spirolacton

(A) (B)

Hình 3 (A) Cấu trúc hóa học của hoạt chất SBVN; (B) Hình ảnh tinh thể hoạt

chất SBVN Phổ khối lượng EIMS của chất này cung cấp các chứng minh bổ sung

cho các kết quả trình bày ở trên với các mảnh đặc trưng ở m/z 574 (M+), m/z

452 (M+ - C6H5COOH), m/z 105 (C6H5CO+), và m/z 77 (C6H5+) Các căn cứnày, kết hợp với kết quả phân tích toàn bộ các phổ NMR một chiều và haichiều, cho phép chúng tôi tìm được cấu trúc của hợp chất SBVN là 6,11-dibenzoyloxy-8,13-epoxy-7-hydroxy-3(4)-cleroden-15,16-olide và có cấu trúchóa học như hình 3

- Nhiệt độ nóng chảy

Sau khi được tách chiết, một số tính chất cơ bản của hoạt chất SBVN

đã được xác định như sau: Hợp chất SBVN kết tinh trong hexan/acetone cho các tinh thể không màu, có điểm nóng chảy là 218 - 2190C, trọng lượng phân

tử là 574

- Khả năng hoà tan của SBVN trong nước và trong PBS

Hoạt chất này tan tốt trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO), rất kém tan trong nước và trong Phosphate Buffer Saline (PBS)

- Nồng độ bão hoà của SBVN trong nước và trong PBS

Không xác định được vì SBVN hầu như không tan trong nước và trongPBS Việc làm tan SBVN chỉ có thể thực hiện khi sử dụng máy khuấy

siêu âm

- Điều kiện tối ưu để lưu giữ SBVN

Hoạt chất SBVN tồn tại bình thường trong điều kiện nhiệt độ phòng,

vì vậy có thể cất giữ ở điều kiện bình thường, không cần giữ ở 4oC hoặc ở nhiệt độ thấp hơn

1.5 MÔ HÌNH GÂY UNG THƯ THỰC NGHIỆM TRÊN ĐỘNG VẬT

Mô hình này nhằm kiểm tra, đánh giá tác dụng phòng và chữa trị ungthư của hoạt chất tiềm năng trên động vật được gây ung thư thực nghiệm

Để nghiên cứu bệnh học cũng như tìm ra phương thức điều trị hiệu quảbệnh ung thư, việc tạo ra mô hình ung thư thực nghiệm trên động vật như

chuột, thỏ, v.v là rất cần thiết để thực hiện những nghiên cứu in-vivo

Hiện nay, có thể gây ung thư thực nghiệm trên động vật nói chung vàchuột nói riêng theo 2 mô hình:

+ Mô hình gây u bằng tế bào;

+ Mô hình gây u bằng hoá chất

Mô hình gây u bằng hoá chất: Hiện tại, có thể gây ung thư thực nghiệmtrên động vật bằng hoá chất như 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) –

gây ung thư vú (Whitsett và cộng sự, 2006), DMBA là một trong những hoá

chất gây ung thư được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm nghiêncứu về ung thư DMBA gây u bằng cách tạo nên những đột biến gen và làmtăng kính thước khối u với sự có mặt của chất 12-O-tetradecanoylphorbol-13acetate (TPA), nhờ vậy mà khối u sẽ phát triển với tốc độ rất nhanh Đã cómột số công trình gây ung thư thực nghiệm bằng hoá chất DMBA thành côngnhư Nicolas Currier và cộng sự đã tiến hành gây u thực nghiệm trên dòngchuột FVB/N bằng cách cho chuột uống DMBA trong 6 tuần liên tiếp, kết quảthu được rất khả quan với 100% chuột xuất hiện u ở những bộ phận khác nhaunhư phổi, tuyến vú, tuỷ, da (Currier và cộng sự, 2005) Russo và cộng sự đãkết hợp 2 chất DMBA và hCG (human chorionic gonadotropin) gây u trêndòng chuột cống nhằm khảo sát, đánh giá khả năng gây ung thư cho chuột.Kết quả sau 24 tuần gây u ở thí nghiệm với 100% DMBA thì 61,3% chuột đãxuất hiện các khôi u và vẫn đang tăng trưởng về kích thước

Mô hình gây u bằng tế bào: có thể gây ung thư cho động vật nghiên cứubằng các dòng tế bào ung thư như Sarcom - 180 gây u báng trên chuột (HàViệt Hải và cộng sự, 2000; Đỗ Thị Thảo, 2006; Graft và cộng sự, 1952) hoặcdòng tế bào LLC Trong đó, gây u báng là phép thử sinh học nhằm xác định

khả năng kháng tế bào ung thư của hoạt chất nghiên cứu ở điều kiện in-vivo.

Trong đó, tế bào u báng Sarcom -180 được cấy vào xoang bụng chuột nhắttrắng dòng tế bào Swiss để xác định khả năng sinh khối u, khối lượng u báng,xác định tỷ số ức chế phát triển u, xác định tỉ lệ tế bào ung thư bị chết so vớiđối chứng, từ đó xác định hoạt tính ức chế sự phát triển ung thư ở điều kiện invivo của hoạt chất cần nghiên cứu

Cho đến nay, tại nhiều viện nghiên cứu trên thế giới, dòng tế bào LLCvới khả năng gây u và di căn mạnh đã được sử dụng như dòng chuẩn để đánh

giá hiệu quả thử nghiệm in-vivo của thuốc phòng chống ung thư mới LLC

được tiến sĩ Lewis phát hiện vào năm 1951 Sau đó, nó tiếp tục được các nhàkhoa học khác nghiên cứu Các nghiên cứu của Sugiura và Stock đã phát hiện

ra các khối u hình thành ở 100% chuột thí nghiệm sau khi tiêm LLC một thờigian và phát triển rất ác tính Sau này, DeWys đã đưa ra tiêu chuẩn để xácđịnh sự phát triển của khối u sơ cấp bằng cách đo thể tích khối u [69], [70]

LLC là dòng tế bào di căn và gây u mạnh, có thể gây u thực nghiệmcho chuột bằng cách tiêm tế bào LLC vào bắp đùi hoặc dưới da lưng và chuột

bị tiêm ở bắp đùi sẽ có khả năng hình thành khối u cao hơn và khối u cũngphát triển nhanh, mạnh hơn so với chuột bị tiêm dưới da lưng Thời gian gây

u nhanh 2 đến 3 ngày xuất hiện khối u Với ưu điểm trên, chúng tôi lựa chọn

mô hình gây u thực nghiệm trên chuột BALB/c bằng dòng tế bào ung thưLLC cho các thử nghiệm tìm hiểu khả năng phòng chống ung thư của hoạtchất tiềm năng là hoàn toàn phù hợp

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Động vật thí nghiệm

Chuột BALB/c 6 tuần tuổi, khoẻ mạnh được nuôi với mật độ 10con/lồng tại chuồng nuôi động vật của Viện công nghệ sinh học, Viện Khoahọc - Công nghệ Việt Nam, số 18 đường Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Chuộtđược cung cấp thức ăn tiêu chuẩn, nước uống tự do

- Hoạt chất nghiên cứu

8,2 gram hoạt chất SBVN được tách chiết từ cây Bán chi liên, lượng cần thiết

để phục vụ cho quá trình nghiên cứu

• Một số vật liệu khác phục vụ cho nghiên cứu của chung tôi:

- Tế bào

Dòng tế bào ung thư LLC (Lewis Lung Carcinoma) do trường Đại họcUniversit degli Studi di Milano của Italia cung cấp Tế bào được nuôi trongmôi trường DMEM (Gibco, USA) với 10% huyết thanh phôi bò (FBS), 1%Penicilline-Streptomycine, ở điều kiện 37°C và 5% CO2

- Mẫu thực vật

Cây Bán chi liên rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ thành dạng bột khô đểtách chiết ra hoạt chất bảo vệ phòng, chữa trị ung thư SBVN

- Hoá chất nghiên cứu

- Các loại hoá chất, môi trường nuôi cấy tế bào: MEME, DMEM,RPMI 1640, v.v (Gibco, Hoa Kỳ ), huyết thanh FBS (Atlanta Biological,Hoa Kỳ), kháng sinh, trypsin, cồn 70o và các hoá chất thông thường khác

- Dung môi được sử dụng để chiết tách và tinh chế mẫu cây Bán chiliên gồm: n-hexane, methanol, acetone

- Thiết bị nghiên cứu

- Máy lọc không khí National (Nhật Bản)

- Tủ cấy vô trùng Safety Laminar Level II Microflow (Anh)

- Tủ nuôi tế bào National (Nhật Bản)

- Kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật Bản)

- Máy li tâm lạnh (Đức)

- Máy khuấy từ nhiệt (Đức), thiết bị làm khô tuyệt đối và các dụng cụthí nghiệm thông thường khác như kim uống, kim tiêm, dao, kéo, thước,compa; bình nitơ lỏng bảo quản tế bào, tủ sấy vô trùng, nồi hấp diệt trùng…

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in-vitro

Phương pháp nuôi cấy tế bào ung thư được tiến hành theo phương phápđang lưu hành tại Viện ung thư Quốc gia Hoa Kì NCI (National CancerInstitute) đã được WHO công nhận

Các dòng tế bào ung thư do ngân hàng tế bào ATCC (American TypeCulture Collection) cung cấp ở dạng bảo quản trong nitơ lỏng (-196oC), vì vậycác dòng tế bào này trước khi sử dụng gây ung thư cho động vật nghiên cứu

để thử thuốc phải được đánh thức (phục hồi tế bào) Trong nghiên cứu này,chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào ung thư LLC do trường Đại học Universitdegli Studi di Milano của Italia cung cấp Tế bào được nuôi ở điều kiện 37°C

và 5% CO2 trong môi trường Dulbeco Modifie (DMEM) (Gibco, USA) với10% huyết thanh phôi bò Fetal Bovine Serum (FBS), có bổ sung Penicilline,Streptomycine, Pyruvat, Glucosa…

Quy trình đánh thức tế bào như sau:

- Lấy tế bào ra khỏi nitơ lỏng, đưa vào cốc nước 37oC cho đến khi dungdịch trong ống tan đá hoàn toàn, lau phía ngoài ống cất bằng cồn 70o để khửtrùng

- Chuyển tế bào sang ống li tâm quay với tốc độ 300 vòng/phút trong 5phút Sau đó, hút bỏ dịch nổi để loại DMSO (Dimethyl Sulfoxide).

- Chuyển tế bào sang chai nuôi, nhỏ từ từ từng giọt môi trường nuôi cấythích hợp vào chai nuôi để tế bào bám thành một lớp dưới đáy chai nuôi Tếbào mới đánh thức rất nhạy cảm, dễ bị chết nếu đưa vào môi trường mới quánhanh

- Để chai nuôi vào tủ ấm ở điều kiện 37°C và 5% CO2

2.2.2 Phương pháp gây ung thư thực nghiệm trên chuột dòng BALB/c

 Phương pháp gây ung thư bằng hoá chất

Hoá chất DMBA: Phương pháp gây u bằng hoá chất DMBA dựa trên

phương pháp của Boston University Institutional Animal Care and USCommittee [30] 40 chuột BALB/c được chia làm 4 lô thí nghiệm (mỗi lô 10chuột)

Lô 1: Chuột uống 0,1 ml DMBA/con/lần/tuần (tương ứng 0,5mg/con/lần/tuần) bằng ống thông dạ dày trong 6 tuần liên tục

Lô 2: Chuột uống 0,2 ml DMBA/con/lần/tuần (tương ứng 1 mg/con/lần/tuần) bằng ống thông dạ dày trong 6 tuần liên tục

Lô 3: Chuột uống 0,4 ml DMBA/con/lần/tuần (tương ứng 2 mg/con/lần/tuần) bằng ống thông dạ dày trong 6 tuần liên tục

Lô 4 (lô đối chứng): Chuột uống dung dịch sinh lý bằng ống thông dạdày

- Để kiểm tra tốc độ tăng trọng, toàn bộ chuột thí nghiệm được kiểm tratrọng lượng vào tuần thứ 6, 12, 18, 24, 30 cố định, liên tục trong 30 tuần kể từkhi bắt đầu thí nghiệm

- Sau khi cho chuột uống DMBA lần cuối cùng, mỗi tuần kiểm trachuột 2 lần bằng cách xờ nắn hai bên bụng chuột để xác định ngày đầu tiênhình thành khối u, vị trí, kích thước khối u

 Phương pháp gây ung thư bằng dòng tế bào ung thư (LLC)

Dòng tế bào ung thư LLC, được nuôi trong môi trường DMEM (có bổsung 10% huyết thanh phôi bò, 1% kháng sinh) ủ ở 37°C, 5% CO2, khi tế bàomọc tốt tiến hành thu hoạch tế bào và tiêm vào bắp đùi chuột với nồng độ2×106 tế bào/con

Mô hình gây u trên chuột:

50 chuột BALB/c được chia làm 5 lô, mỗi lô 10 con

- Lô 1: Tiêm 1×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vàobắp đùi

- Lô 2: Tiêm 1×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vàodưới da lưng

- Lô 3: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vàobắp đùi

- Lô 4: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào

Sau khi chuột chết hoặc đến ngày thứ 30, tiến hành mổ khám chuột.Các khối u được tách ra và cân trọng lượng, kiểm tra khả năng di căn đến các

cơ quan nội tạng U ở phổi sẽ được phát hiện bằng cách bơm 01ml India Pink

(nồng độ 5%) vào phổi qua đường khí quản sau đó tách phổi và đểm khốilượng u không bắt mầu xanh trên bề mặt phổi Tuy nhiên, tế bào LLC là tế

bào ung thư phổi nên việc xuất hiện u phổi là hoàn toàn bình thường và khôngđược xem là di căn.

2.2.3 Phương pháp thử độc tính cấp của hoạt chất SBVN

Trong nghiên cứu này, 60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, đồng đều về tuổi,khối lượng và được chia thành 6 lô (10 chuột/lô) Bỏ đói 16 giờ trước khi chouống hoạt chất SBVN Hoạt chất SBVN được cho uống một lần duy nhất ởcác nồng độ: 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 và 100000 mg/kg thể trọng (kgP)tương ứng với 6 lô thí nghiệm Lô đối chứng (5con/lô) cho uống dung dịchdùng để pha loãng SBVN nồng độ 1ml/con/1 lần duy nhất Sau khi cho uốnghoạt chất 1-2 giờ, chuột được nuôi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uốngnước tự do), và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số con chết của từng

lô và xác định tính độc cấp của hoạt chất SBVN bằng cách tính giá trị LD50theo phướng pháp của Abrham (1978) và Turner (1965)

LD50= Xk - d/2 - d/n xSmi

Trong đó: LD50: liều gây chết 50% động vật thí nghiệm

n: số động vật sử dụng trong từng lô thí nghiệm

k: số lô động vật

mi: số động chết đếm theo từng lô trong 72 giờ

d: khoảng cách giữa các mức liều

Xk: liều ở mức độ cao nhất

2.2.4 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương phápcủa Abrham (1978), theo quy định của WHO và của Bộ Y tế Việt Nam vềhiệu lực an toàn của hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên

Động vật được dùng SBVN liên tục trong 30 ngày mức liều suy ra từliều độc cấp và số liệu tham khảo

 Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất đối với chỉ tiêu huyết học máu của chuột khi cho uống bán trường diễn

30 Chuột khoẻ mạnh, đồng đều về tuổi và khối lượng được chia thành 3

lô, mỗi lô gồm 10 con Chuột được cho ăn và uống nước tự do

+ Lô đối chứng: Cho uống dung môi 0,2 ml/con/24giờ là dung môi hoà tan SBVN;+ Lô thứ 1: Cho uống SBVN mức liều 500 mg/kgP liên tục trong 30 ngày;+ Lô thứ 2: Cho uống SBVN mức liều 1000 mg/kgP liên tục trong 30 ngày;

Trước khi thí nghiệm 2 ngày và sau khi kết thúc thí nghiệm 30 ngàytheo dỏi, mỗi lô chọn ra 1 con lấy máu để xác định: Số lượng hồng cầu, bạchcầu, tiểu cầu, lượng Hemoglobin, creatin và xác định hoạt độ của các enzymetransamiase (SGOT, SGPT) để đánh giá chức năng thận, gan theo phươngpháp của Bermeyer (1974)

 Nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất khi cho uống bán trường diễn đến

sự tăng trọng lượng cơ thể của chuột

Số lô thí nghiệm và mức liều dùng được bố trí tương tự như ở thinghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hoạt chất đối với chỉ tiêu huyết học máukhi cho uống bán trường diễn Chuột cho uống liên tục trong 30 ngày

Theo dỏi biểu hiện của chuột hàng ngày

Sáu ngày cân trọng lượng chuột một lần, để đánh giá khả năng tăngtrọng lượng cơ thể chuột theo phương pháp của Abrham (1978)

 Nghiên cứu ảnh hưởng của SBVN khi cho uống bán trường diễn đối với các biến đổi giải phẫu ở gan, thận, chuột thí nghiệm

Được tiến hành theo phương pháp của Abrham (1978) Chuột sau quátrình thí nghiệm cho uống bán trường diễn, giết mổ, kiểm tra sự biến đổi ở gan,thận, lách