Tìm hiểu hoạt tính enzim proteaza ở vi khuẩn bacillus subtilis luận văn tốt nghiệp đại học

Vi khuẩn Bacillus subtilis đã đợc ứng dụng khá nhiều trong các nghành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzim nh Proteaza, Amylaza,..[2].. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC

===  ===

TÌM HIỂU HOẠT TÍNH CỦA ENZIM PTOTEZA Ở VI KHUẨN BACILLUS

SUBTILIS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Dương Tuệ Sinh viên thực hiện : Phan Thị Huyền

VINH - 2011

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu,

sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dương Tuệ, người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn di truyền – vi sinh – phương pháp giảng dạy, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như

sự hướng dẫn giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn hỗ trỡ, giúp đỡ cho tôi cả về tinh thần, vật chất lẫn công sức để cho tôi hoàn thành tốt để tài.

Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót về nội dung và hình thức, rất mong nhận được sự góp ý của các thầy, cô giáo, bạn bè để đề tài được hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn !

Vinh, tháng 5 năm 2011

sinh viên

Phan Thị Huyền

Mục lục

Mở đầu

1

I Đặt vấn đề 1

II Mục tiêu 2

III Nhiệm vụ 3

Chương I: Tổng quan tài liệu.

1.1 Cở sở khoa học 4

1.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis: 4

1.1.2 Tổng quan về enzim 5

1.1.3 Các chế phẩm enzim 7

1.1.4 Các enzim vi sinh vật, sinh tổng hợp và phương pháp 9

1.1.5 Enzim proteaza của vi sinh vật 11

1.1.6 Sự phân giải protein 12

1.1.7 Đặc tính và ứng dụng của proteaza 13

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15.

1.2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn và enzim proteaza trong nước 15

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

Chương II: Đối tượng thời gian và phương pháp nghiên cứu.

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 20

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp thu xử lý và bảo quản mẫu 20

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 21

2.2.3 Phương pháp phân loại vi khuẩn 22

2.2.4 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tăng sinh 22

2.2.5 Phương pháp xá định số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis 24.

2.2.6 Phương pháp xác đinh tốc độ tăng trưởng theo Black man 26

2.2.7 Phương pháp quan sát tế bào 26

2.2.8 Phương pháp nghiên cứu các yêu tố 26

2.2.9 Phương pháp xác đinh các yếu tố 27

2.2.10 Phương pháp xác đinh hoạt tính 28

2.2.11 Phương pháp phân lập 29

Chương III: Kết quả nghiên cứu.

3.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn 30

3.1.1 Phân loại 30

3.1.2 Hình thái 30

3.2 Số lượng, vi khuẩn Bacillus subtilis 31

3.3 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng 32

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 32.

3.3.2 Ảnh hưởng của độ ẩm 35

3.3.3 Ảnh hưởng của PH 37

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính enzim 40

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 40

3.4.2 Ảnh hưởng của độ ẩm 43

3.4.3 Ảnh gưởng của PH 45

3.5 Ảnh hưởng của mật độ đến hoạt tính của enzim 48

3.6 Xây dựng quy trình thu nhận và làm sạch enzim 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ:

Kết luận 53

Kiến nghị 53

Tài liệu tham khảo

54

MỞ ĐẦU

I: ĐẶT VẤN ĐỀ.

Enzim là những chất xúc tác sinh học được ứng dụng rộng rãi trongnhiều lĩnh vực công nghiệp và nền kinh tế quốc dân như: Công nghiệp thựcphẩm, y học, hóa phân tích…

Người ta có thể thu nhận enzim từ nhiều nguồn khác nhau như từ độngvật, thực vật, vi sinh vật Tuy nhiên enzim lấy từ động vật, thực vật không ưuthế bằng enzim vi sinh vật do hoạt tính thấp, xúc tác không đa dạng, khôngchủ động điều khiển để thu nhận enzim Vì thế không thể dùng làm nguyênliệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzim thõa mãn nhu cầu củađời sống Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì vi sinh vật lànguồn nguyên liệu dồi dào và hứa hẹn sẽ khắc phục được các hạn chế trên, vìthực tế đã chứng tỏ được ưu việt của nguồn nguyên liệu vi sinh vật (hóa sinhcông nghiệp - Lê Ngọc Tú, 2005)

- Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzim

- Hệ enzim vi sinh vật thì vô cùng phong phú và đa dạng

- Hệ enzim vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh

- Thu enzim từ vi sinh vật có khả năng tăng cường sinh tổng hợp cácenzim nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao

- Việc nuôi vi sinh vật khá dễ dàng Từ đó ta thấy rằng việc tách chiếtenzim từ vi sinh vật thuận lợi và có ý nghĩa rất lớn

Mà một trong những vi sinh vật có khả năng cho khối lượng enzim lớn

là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, trong đó có enzim proteaza

Proteaza là enzim có rất nhiều ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau,trong công nghiệp chế biến thịt, công nghiệp sữa, sản xuất tơ tằm, trong yhọc… nó đã có những đóng góp to lớn trong đời sống con người

Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu, thu nhận enzim proteaza từ visinh vật còn đang phát triển, đang tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng

vô vàn của enzim protein

Còn ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về việc sử dụngenzim proteaza nhưng chủ yếu tập trung vào enzim proteaza của động vật,thực vật còn enzim proteaza từ vi sinh vật thì chỉ mới được nghiên cứu Côngnghệ enzim ở nước ta hiện còn đang mới mẻ, đang trong giai đoạn hưởng ứng

và ngày càng hoàn thiện, việc đi sâu vào tìm hiểu enzim proteaza từ vi sinhvật cũng như những ứng dụng của nó là một vấn đề mang tính thời đại và cấpthiết

Xuất phát từ những ưu việt cũng như sự cấp thiết đó của enzim

proteaza được chiết xuất từ vi sinh vật nói chung và từ vi khuẩn Bacillus

subtilis nói riêng nên chúng tôi chọn đề tài: “Tìm hiểu hoạt tính của enzim

proteza ở vi khuẩn Bacillus subtilis” Nhằm mong muốn góp phần đưa ra

những điều kiện tối thích cho việc sử dụng nó trong thực tiễn phục vụ đờisống con người

II: MỤC TIÊU

Do thấy được vai trò của proteaza từ vi khuẩn Bacillu subtilis nên

chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu:

- Nuôi cấy từ đó phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để có thể thu

nhận được enzim

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn

Bacillus subtilis hướng tới việc điều khiển sự sinh trưởng, phát triển của vi

Để đạt được mục tiêu trên thì nhiệm vụ của đề tài gồm:

- Thu thập, xử lý, bảo quản mẫu

- Pha chế môi trường nuôi cấy, nuôi và phân lập vi khuẩn Bacillus

- Nghiên cứu tác dụng xúc tác của enzim proteaza

- Xây dựng được quy trình sản xuất sinh khối vi sinh vật để thu nhậnenzim

Chơng 1: Tổng quan tài liệu

1.1 Cơ sở khoa học:

1.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis:

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc loại trực khuẩn (Bacillus) là vi khuẩn có

dạng hình que, nhuộm Gram dơng, có kích thớc (0,5-1)*(1-4) àm, có nội bào

tử, sống hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc Chúng sinh bào tử gần nh hình cầu để tồn tại trong trạng thái “ngủ đông” Bacillus subtilis là loại vi khuẩn nổi

tiếng làm hỏng thức ăn, bào tử của nó có thể sống sót trong độ nóng cùng cực thờng thấy khi nấu thức ăn và đây chính là tác nhân làm h hỏng bánh mì [2] Hệenzim của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm: Proteaza, Amylaza,

Glucoamylaza, Glucanaza, Celluloza, Dextranaza, Pectinaza [21]

Quan sát dới hính hiển vi Bacillus subtilis đơn lẻ có dạng hình que, phần

lớn những chiếc que này có bào tử hình oval có khuynh hớng phình ra một đầu.Thờng khi quan sát thấy tập đoàn của vi khuẩn này rất rộng lớn, có hình dạngbất định

Bacillus subtilis không phải là tác nhân gây bệnh cho con ngời, nó có thế

gây ô nhiễm thực phẩm nhng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm, có thể sinh raenzim phân giải protein subtilisin Là loài sống phổ biến nhất đợc thấy nhiềutrong môi trờng đất và trên bụi cây rậm Chúng có khả năng phân giải các hợpchất hữu cơ thải ra từ thức ăn d thừa và phế thải nhờ có khả năng tổng hợp cácenzim phân huỷ các hợp chất hữu cơ nh : Poteaza, Amylaza… Chúng còn có khảnăng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lợng vi sinh vật gây bệnh pháttriển quá mức nh: Vibrio, Aeromonas

Vi khuẩn Bacillus subtilis đã đợc ứng dụng khá nhiều trong các nghành

công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzim nh Proteaza, Amylaza, [2]

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế

biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc [3]

1.1.2 Tổng quan về enzim:

1.1.2.1 Giới thiệu chung về enzim:

Nhóm enzim Proteaza xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là cácaxitamim

(-HN2 - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - COOH + H2O

R1 R2 Rx

H2N - CH - COOH + H2N - CH - CO…NH - CH - COOH

R1 R2 Rx

Proteaza cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên đợc phân bố rỗng rãi trên nhiều đối tợng từsinh vật đến động vật, thực vật So với proteaza động vật và thực vật thì proteazacủa vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trớc hết proteaza vi sinh vật là một

hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzim rất giống nhau về cấu trúc, khối ợng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra đợc dạng tinh khiết

l-Cũng do phức hệ gồm nhiều enzim khác nhau nên proteaza vi sinh vật ờng có tính đặc hiệu rỗng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để

th-1.1.2.2 Phân loại enzim proteaza:

Proteaza đợc chia thành hai loại: endopeptidaza và exopeptidaza:

- Dựa vào vị trí tác động lên chuỗi polypeptide, exopeptidaza đợc phânthành hai loại :

+ Aminopeptidaza : xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do củachuỗi polypeptide để giải phóng ra một aminoaxid, một dipeptide hoặc một

tripeptide

+ Carboxypeptidaza : xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của

chuỗi polypeptide và giải phóng ra một aminoaxit hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza đợc chia thành 4nhóm:

+ Nhóm serinproteaza: là những proteaza có nhóm -OH của gốc serine

trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động

xúc tác của enzim

Peptidaza(proteaza)

Aspartic proteaza

Metallo proteaza

+ Nhóm cysteinproteaza : là các proteaza co nhóm -SH trong trung tâmhoạt động.

+ Nhóm aspartic proteaza : hầu hết các aspartic proreaza thuộc nhómpepsin

+ Nhóm metallo proteaza; là nhóm enzim kim loại đợc tìm thấy ở vikhuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao hơn

1.1.3 Các chế phẩm enzim:

Trong đời sống của thế giới vi sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hoá sinhchuyển hoá vật chất, các phản ứng này đợc thực hiện nhờ sự có mặt của hệenzim (hay còn gọi là ferment)

Enzim là những hợp chất có cấu tạo phức tạp và đóng vai trò là chất xúctác sinh học Dới tác dụng của enzim các phản ứng hoá sinh trong cơ thể xảy rarất nhanh mà không cần các điều kiện nhiệt độ, áp suất cao, nồng độ axit haykiềm đậm đặc Tên enzim bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: “enzim” (có nghĩa là “chấttrong nấm men”) Fecment bắt nguồn từ chữ LaTinh “fermentum” (nghĩa là lênmen) Tất cả những quá trình biến đổi hoá sinh đều xảy ra dới tác dụng của hệmen

Các enzim có thể xếp thành hai nhóm theo thành phần cấu tạo: đơn cấu

tử và hai cấu tử Nhóm đơn cấu tử là những enzim với protein thuần tuý, phầnlớn các enzim có thành phần cấu tạo phức tạp gồm hai cấu tử: Phần protein gọi

là apoenzim, phần không phải protein gọi là coenzim

Tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật có chứa nhiều loại enzim Vì vậy

có thể dùng những tế bào hoặc các mô của chúng làm nguồn sản xuất enzim.Trớc kia ngời ta sản xuất enzim từ động vật và thực vật với số lợng khá lớn(hàng chục vạn tấn/năm) song trong cơ thể động vật và thực vật quá trình sinhtổng hợp enzim gắn liền với sự trao đổi chất của tế bào, số lợng enzim cần tổnghợp gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể, hơn nũa các bộ phận cơ thể có số lợngenzim không đồng nhất Vì vậy chỉ có một số bộ phận cơ thể dùng để sản xuấtenzim đợc, muốn thu đợc enzim cần phải phá bỏ các tổ chức để chiết rút Nh

vậy việc dùng động vật, thực vật làm nguyên liệu để sản xuất enzim là rất hạnchế và không kinh tế, không thể đáp ứng đợc nhu cầu ngày càng cao về enzim.

Tế bào vi sinh vật có thể sản sinh ra rất nhiều enzim nội và ngoại bào.Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật các enzim đợc tạo thành trong tế bào gọi làenzim nội bào và ở vi sinh vật còn tiết vào môi trờng enzim ngoài tế bào phânhuỷ cơ chất giúp tế bào dễ đồng hoá Vi sinh vật là một nguồn sản xuất enzim t-

ơng đối lý tởng, nó có nhiều u việt so với nguồn động vật và thực vật bởi:

Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, có thể thu đợc khối lợng lớn tếbào trong một thời gian ngắn (từ 6-8h đến 20-30h) Đặc biệt ở vi khuẩn chỉ 20– 60 phút/thế hệ nên sản sinh ra một lợng enzim vô cùng lớn

Các enzim của vi sinh vật có hoạt tính cao Trong 24h có những vi sinhvật có thể chuyển hoá một lợng thức ăn gấp 30-40 lần so với trọng lợng cơ thểcủa chúng

Nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thờng là rẻ tiền: Bã thảicủa công nghiệp, chế biến lơng thực, thực phẩm, nguyên liệu tự nhiên (dầu mỏ,khí đốt )

Có thể điều khiển các điều kiện để tối u hoá trong quá trình nuôi cấy và

để có thể thu đợc hiệu suất cao trong quá trình sản xuất

Trong khoảng 50 năm gần đây các chế phẩm enzim từ vi sinh vật đã dầndần thay thế các chế phẩm enzim từ động vật và thực vật

Cho đến nay, nhất là trong vòng vài chục năm gần đây, nền công nghiệpsản xuất các chế phẩm enzim đã có những bớc tiến khổng lồ với tiến độ pháttriển khá mạnh mẽ

Số lợng enzim đợc sản xuất ngày càng tăng, các phơng pháp tách tinh chếngày càng đợc hoàn thiện và hợp lý hoá, lĩnh vực ứng dụng các chế phẩm enzimngày càng đợc mở rộng Sản lợng hàng năm tới vài trăm ngàn tấn chế phẩm và

đợc sử dụng trong hơn 30 ngành khác nhau: Công nghiệp thc phẩm, thuộc da,dệt, y học trong số các enzim đợc sản xuất thì số lợng các chế phẩm proteaza

và emylaza là cao nhất

Hiện nay thì có rất nhiều công trình nghiên cứu về các enzim Các nghiêncứu nhằm theo hớng tách, tinh sạch enzim, tạo ra các chế phẩm có độ tinh sạchkhác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh họccủa enzim, khả năng ứng dụng của enzim trong thực tế.

Các nghiên cứu bao gồm:

- Nghiên cứu về công nghệ enzim đã đợc tiến hành bởi nhiều tác giả: sửdụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancreaza, pepsin, tripsin

- Nghiên cứu về sử dụng nấm men để sản xuất amylaza

- Đã có những thử nghiệm công nghệ nh sản xuất aminoacid từ nhộngtằm bằng proteaza, bột protein thịt bằng bromelain từ quả dứa

- Trong y dợc : Nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzim nhằm tạo ramột số thuốc dùng điều trị một số bệnh, đặc biệt là tạo ra một số sản phẩmthuốc chống suy dinh dỡng ở trẻ em [25]

1.1.4 Các enzim vi sinh vật, sinh tổng hợp và phơng pháp thu các chế phẩm enzim từ vi sinh vật:

1.1.4.1 Các loại enzim vi sinh vật:

Các vi sinh vật đợc dùng để sản xuất enzim gồm có vi khuẩn, nấm mốc,nấm men và xạ khuẩn Các enzim này đã đợc ứng dụng trong nhiều ngành côngnghiệp khác nhau Những enzim đó chủ yếu là enzim thuỷ phân nh: Amylaza,proteaza, pectinaza, xenluloza

Amylaza từ nấm mốc: Nhiều loại nấm có khả năng sinh amylaza, có khảnăng phân huỷ tinh bột

Amylaza vi khuẩn: Một số vi khuẩn có khả năng sinh enzim amylazaProteaza: Là nhóm enzim thuỷ phân các liên kết peptit, đợc sản xuất từcac vi sinh vật nh: Vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn

Pectinaza: Đây là nhóm thuỷ phân pectin, sản phẩm tạo thành là axitgalacturonic, glucoza, galactoza…

Xitolaza: Trong thiên nhiên không gặp xeluloza ở dạng tinh khiết, nó ờng tồn tại ở dạng kết hợp với các chất khác nh : Hemyxelulo, pentoza, lignin…

th-vi sinh vật đặc biệt là nấm mốc, th-vi khuẩn sản sinh ra hệ enzim có hoạt lực cao

có thể thuỷ phân các hợp chất này

Invectaza: Là một enzim phổ biến trong nhiều động vật, thực vật và visinh vật, nấm mốc, nấm men có khả năng tạo thành enzim hoạt động

Enzim oxy hoá: Glucozooxydaza là enzim oxy hoá khử, chỉ tác dụng lênD-glucoza khi có mặt oxy, nó oxy hoá glucoza thành gluconic và H2O

1.1.4.2 Sinh tổng hợp enzim vi sinh vật: (Theo Lê Ngọc Tú, 2005)

Quá trình sinh tổng hợp enzim là một quá trình rất phức tạp, gắn liền mậtthiêt với cấu trúc tế bào và đợc tiến hành qua nhiều giai đoạn với sự tham giacủa nhiều hệ enzim và các axit nucleic khác nhau

Theo thuyết khuôn và dựa trên những quan điểm hiện đại có thể chia quátrình này làm 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Hoạt hoá axit amin

- Giai đoạn 2: Vận chuyển axit amin đã đợc hoạt hoá đến ribôxom là địa

điểm tổng hợp protein mạnh mẽ nhất của tế bào

- Giai đoạn 3: Xếp đặt và phối tác các axtit amin đã đợc hoạt hoá theomột trật tự đã cho trên ARN thông tin và hình thành liên kết peptit

- Giai đoạn 4: Giải phóng mạch polypeptit đã đợc tổng hợp và thiết lậpcấu trúc không gian của phân tử enzim trong không gian 3 chiều

1.1.4.3 Phơng pháp thu các chế phẩm enzim từ vi sinh vật (công nghệ

vi sinh vật- Nguyễn Dơng Tuệ, 2005)

Công nghệ sản xuất enzim hiện nay trên thế giới đã áp dụng hai phơngpháp: Nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm

- Phơng pháp nuôi cấy bề mặt: Trong phơng pháp này vi sinh vật mọctrên bề mặt môi trờng rắn hoặc lỏng, môi trờng rắn trớc khi nuôi cấy vi sinh vậtcần làm ẩm, thờng dùng cám, gạo, ngô, bã bia hoặc hỗn hợp những nguyênliệu này

+ Ưu điểm của phơng pháp này là: Nồng độ enzim tạo thành của môi ờng rắn cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy theo phơng pháp chìm sâu khi

tr-dễ tách tế bào vi sinh vật Nuôi bề mặt tr-dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt tínhenzim.

+ Phơng pháp nuôi cấy này không cần các thiết bị phức tạp, chủ yếunuôi cấy trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, quá trình sảnxuất ít tiêu hao năng lợng

+ Phơng pháp này đợc nuôi cấy trong điều kiện vô trùng không tuyệt

đối

- Phơng pháp nuôi cấy chìm: Nuôi cấy vi sinh vật theo phơng pháp chìm

ở quy mô công nghiệp đợc thực hiện trong các thùng lên men Biorcactor cókhuấy và thổi khí liên tục Trong nhiều phơng pháp nuôi cấy chìm nguồncacbon thờng là tinh bột, các loại bột khác nhau, đôi khi còn dùng các nguyênliệu khác nữa

Trong phơng pháp nuôi cấy chìm tất cả các quy trình phải đợc tiến hànhtrong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt Tuy nhiên phơng pháp này xét về mặt kỹthuật thì hiện đại hơn vì dễ dàng cơ khí hoá và tự động hoá cũng nh chuyểnsang quy mô sản xuất lớn rất dễ dàng và đơn giản

1.1.5 Enzim proteaza của vi sinh vật (công nghệ vi sinh vật – Nguyễn

Dơng Tuệ, 2005)

Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo thành enzim proteaza nh vi khuẩn, nấmmốc, nấm men, xạ khuẩn

Vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành proteaza có hoạt tính cao ở môi

tr-ờng có tinh bột Nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8 đến 2% thì hoạt lực proteazagiảm vài lần Với vi khuẩn sinh proteaza ngời ta còn dùng các đờng mônô hoặcdixaccarit trong môi trờng dinh dỡng

Nhiều xạ khuẩn a nhiệt trong đó có Micromonospora vulgaris 42 mọc

tốt và sinh tổng proteaza cao ở môi trờng có tinh bột Tăng nồng độ tinh bột từ0,25 đến 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzim Nếutăng nồng độ hơn nữa sẽ không thu đợc kết quả dơng tính

Một số chủng Ps.seruginosa có thể đồng hoá hidrocacbua và sinh ra

proteaza

Nhiều loài nấm mốc khác nhau (Asp.oryzae, Asp.awamory, Asp.niger).

Trên môi trờng có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp proteaza axit cao Trênmôi trờng MPA- NaNO3 đợc thay bằng cazêin hoạt lực của proteaza của nấmmốc đợc tăng lên 3,5 lần Còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung peptonhoạt lực enzim tăng lên 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu chỉ thấy sinh tổng hợpenzim đợc nâng cao khi trong môi trờng có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ vànitơ vô cơ

Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có Bacillus subtilis các hợp

chất nitơ vô cơ và hữu cơ đợc dùng phối hợp trong môi trờng sẽ tạo điều kiệnthuận lợi cho sinh tổng hợp proteaza

Những nguồn protein khác nhau nh (pepton, albumin, gluten, sừng móngnghiền nhỏ, bột đậu tơng ) có ảnh hởng nhất định tới việc sinh proteaza của xạkhuẩn Các axit amin cũng có ảnh hởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzim bằng visinh vật Đối với Bacillus subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là

glyxin, metionin, axit glutamic, alanin, lơxin

1.1.6 Sự phân giải protein:

Muốn phân giải protein, cũng nh đối với các hợp chất cao phân tử khác,

đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzim phân giải protein ngoại bào và làmchuyển hoá protein thành các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polypeptit vàolygopeptit) Các chất này hoặc tiếp tục đợc phân giải thành các axit amin nhờcác peptidaza ngoại bào hoặc đợc xâm nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đómới chuyển hoá thành axit amin Một phần các axit amin này đợc vi sinh vật sửdụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một phần khác đợc tiếp tụcphân giải theo những con đờng khác nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩmtrung gian khác

protit proteaza Polypeptit peptidaza axit amin

Proteinaza phân huỷ phân tử protein thanh polypeptit, pepton Chúng cótính dặc hiệu tơng đối rộng Tiếp đó là sự phân huỷ các peptit có phân tử nhỏnày thành các axit amin tự do dới tác dụng của peptidaza Các peptidaza có tính

đặc hiệu hẹp hơn, chúng chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở những vị trí nhất

định

Proteaza của nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với proteazacủa động vật và vi khuẩn Proteaza của vi khuẩn hoạt động ở vùng ở 7-8 Cònproteaza của nấm mốc Asp.oryzae hoạt động trong khoảng pH 3,5 - 9 tối thích

ở pH 7-8 Nhờ vậy nó đợc dùng nhiều trong việc ổn định bia (pH 4-5) và trongviệc làm mềm da (pH 8-9) Dựa vào khoảng pH hoạt động ngời ta chia proteaza

ra làm ba loại: Loại axit hoạt động trong vùng pH 2,5-3; loại trung tính hoạt

động trong ph 6-7,5; và loại kiềm hoạt động trong khoảng pH 8-11

Còn dựa vào đặc trng của tâm hoạt động ngời ta chia proteaza của vi sinhvật thành proteaza serin, proteaza tiol, peptidaza chứa kim loại và proteaza tácdụng trong môi trờng axit

Chế phẩm proteaza tinh khiết từ vi khuẩn Bacillus có thể thuỷ phân hoàn

toàn nhiều protein, chế phẩm này đợc gọi là suptilizin, khi tác dụng trên cazeinthì hoạt độ sẽ cực đại ở pH trung tính