Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza ở vi khuẩn bacillus subtilis luận văn tốt nghiệp đại học

Nhóm enzim này ngày càng đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bánh mì, thực phẩm, dệt và giấy...Pandey và cộng sự, 2000 chiếm khoảng 25% nguồn enzim trên thị tr-ờng, enzim amylaza gần

Lời cảm ơn

Trong quá trình thực hiện đề tài này, tôi đã nhận đợc sự giúp đỡ quý báu, sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, gia đình, bạn bè.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn

D-ơng Tuệ, ngời thầy đã luôn tận tình hớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình nghiên cứu hoàn thành đề tài.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Di truyền - Vi sinh - Phơng pháp giảng dạy, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng nh

sự hớng dẫn, giúp dỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn hỗ trợ thiết thực cho tôi cả về tinh thần, vật chất và công sức để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài.

Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót về nội dung và hình thức, rất mong nhận đợc sự góp ý của các thầy, cô giáo, bạn bè để đề tài đ-

ợc hoàn thiện hơn.

Vinh, tháng 5 năm 2011

Sinh viên Mai Thị Phơng

Mở đầu

1 Lý do chọn đề tài

Amylaza là enzim xúc tác thuỷ phân tinh bột và các polyose tơng tự

nh dextrin, glicogen (Windish và Mhatre, 1965) Nhóm enzim này ngày càng đợc ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp bánh mì, thực phẩm, dệt và giấy (Pandey và cộng sự, 2000) chiếm khoảng 25% nguồn enzim trên thị tr-ờng, enzim amylaza gần nh đã thay thế cho công nghiệp thuỷ phân tinh bột bằng phơng pháp hoá học (Pandey và cộng sự, 2000)

Trong hệ enzim này, α - amylaza là enzim xúc tác sự thuỷ phân liên kết α - 1,4 - glucozit nội mạch, sản phẩm thuỷ phân tinh bột chủ yếu là các dextrin phân tử thấp không cho phản ứng màu với iôt và một ít maltose Đây

là nhóm enzim tơng đối bền vững với các tác dụng của nhiệt, đặc biệt α - amylaza của vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, chúng có thể giữ đợc hoạt tính ở

70 - 90oC [12] Nhờ đặc tính này mà α - amylaza của vi khuẩn đợc dùng dịch hoá tinh bột, làm giảm độ nhớt của dịch hồ, đợc dùng trong sản xuất đờng mật ngô và sôcôla, trong sản xuất bia, sản xuất dextrin với dịch đờng để sản xuất thức ăn giành cho ngời già và trẻ nhỏ, dùng để sản xuất nớc quả và đợc

sử dụng rộng rãi trong y học

Trong công nghệ đờng hóa tinh bột thay malt để sản xuất rợu, bia, mạch nha, bánh kẹo…

Qua nhiều công trình nghiên cứu, nhiều chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylaza có ý nghĩa trong công nghiệp đã đợc tuyển chọn nh

Bacillus subtilis, Bacillus licheni formis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae [12].

Theo mô tả trong khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis là một loài thuộc chi Bacillus thuộc họ Bacillacaea Bacillus subtilis

tử ở trung tâm có kích thớc 1,5 - 1,8 * 0,8 micromet, ở điều kiện 100oC bào

tử của Bacillus subtilis chịu đợc 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ

thấp và sự khô cạn, tác động của hoá chất và tia bức xạ Bacillus gồm nhiều chủng nh: subtilis I - 168, DB 110,…trong đó các chủng Bacillus subtilis đợc

sử dụng nhiều nhất vì đã đợc nghiên cứu tơng đối đầy đủ về đặc tính sinh lý, sinh hoá và di truyền với toàn bộ genome đã đợc xác định So với E.coli,

Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dơng sinh bào tử không gây bệnh và

không chứa độc tố Tuy nhiên chúng có nhợc điểm là: Plasmit tái tổ hợp chứa ADN ngoại lai và thiếu bền vững nên việc biểu hiện trên Bacillus subtilis th-

ờng yêu cầu tái tổ hợp vào NST Do đó, để khảo sát đặc tính một enzim mới ngời ta thờng lựa chọn biểu hiện trên E.coli trớc sau đó khi sản xuất prôtêin l-ợng lớn thì chuyển sang hệ thống biểu hiện của Bacillus subtilis.

Sử dụng amylaza của Bacillus subtilis là cần thiết vì:

- Vi khuẩn sinh trởng, phân bào nhanh (20 - 60 phút/thế hệ) chứng

tỏ khả năng tổng hợp enzim rất lớn

- Có thể nuôi cấy và thu nhận enzim ở bất kể thời điểm nào

- Enzim có hoạt tính mạnh hơn enzim ở động vật, thực vật

- Thay thế malt (phải nhập nội từ ngoài vào) tốn kém

- Có thể điều khiển và tối u hóa công nghệ đờng hóa

Đặc biệt vi khuẩn này hiện nay đợc sử dụng nhiều trên thị trờng ở Mỹ, Pháp, Đức và tại thành phố Hồ Chí Minh - Việt Nam cũng có hãng liên doanh với Mỹ sản xuất sinh khối vi khuẩn phục vụ công nghệ lên men, xử lý môi trờng

Vì vậy chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tìm hiểu hoạt tính enzim amilaza ở vi khuẩnBacillus subtilis” để hiểu rõ hơn về nó cũng

nh các ứng dụng trong đời sống

2 Mục tiêu của đề tài

Do thấy đợc vai trò quan trọng của enzim amilaza ở Bacillus subtilis

nên tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm:

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến sự sinh trởng của vi khuẩn

- Thử nghiệm khả năng biến đổi của enzim lên cơ chất

- Tìm các điều kiện tối thích cho sự hoạt động của enzim từ đó sản xuất sinh khối ứng dụng vào thực tiễn

- Rèn luyện cho bản thân một số kỹ năng làm thí nghiệm đồng thời làm quen với phơng pháp nghiên cứu khoa học

3 Nhiệm vụ của đề tài

Để đạt đợc mục tiêu trên, nhiệm vụ của đề tài này gồm:

- Thu thập xử lý và bảo quản mẫu

- Pha chế môi trờng nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

Enzim là hợp chất tự nhiên có khả năng xúc tác trong các phản ứng sinh hóa.

Enzim có hoạt tính xúc tác sinh học Các enzim xúc tác cho hơn 400 phản ứng hoá học khác nhau, đảm bảo cho các quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ cao nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hớng xác định Nhờ enzim mà đảm bảo cho sự trao đổi thờng xuyên của cơ thể sống hoặc tạo ra nhiều sản phẩm trong công nghệ

Enzim có bản chất là protein và ARN vì từ năm 2000, Cech T và năm

2005 Lilley D đã cho thấy một số phân tử ARN cũng có khả năng xúc tác

Đó chính là enzim Ribozyme xúc tác chuyển pro ARN thành mARN

Enzim vi sinh vật

Ngời ta có thể thu nhận enzim từ các nguồn khác nhau nh từ động vật, thực vật, vi sinh vật Tuy nhiên so với enzim động vật, thực vật thì enzim vi sinh vật là nguồn enzim phong phú nhất, nó có ở hầu hết các loài vi sinh vật

nh nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzim ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính nh sau:

- Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật

- Chu kỳ sinh trởng của vi sinh vật ngắn 6 - 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm đặc biệt ở vi khuẩn thời gian thế hệ ngắn nên khả năng tổng hợp enzim rất lớn

- Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzim dễ dàng theo hớng có lợi (định hớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi)

- Giá thành tơng đối thấp vì môi trờng nuôi cấy tơng đối rẻ, đơn giản,

dễ tổ chức sản xuất

Tuy nhiên trong một số trờng hợp cần lu ý khả năng sinh độc tố nên phải phân lập chủng thích hợp

Để sản xuất chế phẩm enzim, ngời ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hớng có lợi nhất , chỉ tổng hợp u thế một loại enzim nhất định cần thiết nào đó.

Vai trò của enzim vi sinh vật

Enzim có ở động vật, thực vật, vi sinh vật nhng ở vi sinh vật u thế hơn

Nó sinh sản, phân bào rất nhanh, đặc biệt ở vi khuẩn E.coli chỉ 20 – 60 phút một thế hệ Đáng chú ý là vi khuẩn có cả enzim nội bào và ngoại bào nên đợc ứng dụng nhiều trong công nghệ

- Enzim ngoại bào: Là những chất hoạt động ở bên ngoài tế bào Hầu hết những chất có khối lợng phân tử lớn không thể xuyên qua màng tế bào bởi vậy những thực phẩm, khoáng chất thô sơ nh polisaccharic, lipid và protein cần làm thoái hóa thành những phân tử có trọng lợng phân tử thấp tr-

ớc khi chúng chuyển vào tế bào Vì những phản ứng liên quan với nhau, enzim ngoại bào chủ yếu là enzim thủy phân khử những khoáng chất có khối lợng phân tử cao vào những khối xây dựng của chúng bằng cách tạo những khối phân tử ngậm nớc Điều này giúp phóng thích những phân tử nhỏ hơn,

có thể đợc vận chuyển vào tế bào và tiêu hóa

- Enzim nội bào: bên trrong tế bào và chịu trách nhiệm chính tổng hợp những điều kiện tất yếu về chất nguyên sinh và tạo năng lợng tế bào từ sự tiêu hóa khoáng chất Khả năng những chất dinh dỡng thấm qua màng tế bào chỉ ra sự có mặt của nhiều nội tế bào có khả năng biến đổi những chất hóa học thành những khoáng chất cơ bản Sự biến đổi này cần thiết cho sự tồn tại lâu dài và chức năng của tế bào và nó là nền tảng cho các chuyển hóa của tế bào Nh một kết quả của quá trình chuyển hóa, sản phẩm của quá trình chuyển hóa đợc hình thành và đào thải khỏi tế bào vào môi trờng Sự phân tích những sản phẩm cuối cùng không chỉ giúp cho sự xác định hệ thống enzim của loài mà còn định danh, phân tách và phân loại vi khuẩn

Chọn vi khuẩn Bacillus subtilis là loại đang đợc chú ý đặc biệt để sản

xuất enzim

1.1.2 Đặc tính xúc tác của enzim:

Enzim có các đặc tính chung nh sau:

+ Enzim đợc tạo ra trong tế bào vi sinh vật: quá trình tổng hợp enzim rất phức tạp và đợc kiểm soát chặt chẽ

+ Enzim tham gia phản ứng cả khi ở trong tế bào sống và cả khi tách

ra khỏi cơ thể sống

+ Enzim tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hoà Vì trong quá trình sống của tế bào, enzim đợc tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ cơ thể Nhiệt độ của tế bào và nhiệt độ cơ thể thờng thấp (khoảng 30-400C)

+ Enzim có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lợng dự trữ trong các hợp chất hoá học Quá trình này đợc thực hiện theo chuỗi phản ứng đợc xúc tác bởi 1 loại enzim, cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lợng Trong một chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trớc là cơ chất cho phản ứng sau

+ Enzim có thể thực hiện một phản ứng Các phản ứng này xảy ra ngoài tế bào

+ Phản ứng enzim là phản ứng tiêu hao năng lợng rất ít Trong khi đó các phản ứng hoá học đợc xúc tác bởi các chất xúc tác hoá học đòi hỏi năng lợng rất lớn

+ Enzim chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Gen quyết định tổng hợp ra một loại enzim, mỗi một enzim quyết định một phản ứng sinh hoá Gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hoá học của enzim

+ Enzim có thể hoà tan trong nớc, trong dung dịch muối loãng nhng không tan trong các dung môi không phân cực Dung dịch enzim có tính chất của dung dịch keo a nớc Khi hoà tan enzim vào nớc, các phân tử lỡng cực n-

ớc sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân

tử enzim tạo thành lớp vỏ hidrat Lợng nớc hidrat khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hoá

+ Enzim dễ bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và các yếu tố hoá học vốn làm kết tủa protein

+ Apoenzim quyết định tính đặc hiệu cao của enzim và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzim

+ Coenzim quyết định kiểu phản ứng mà enzim xúc tác, trực tiếp tham gia trong phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzim đối với các yếu tố gây biến tính

Từ đó ta thấy xúc tác enzim u thế hơn so với xúc tác hóa học

1.1.3 Các nhân tố ảnh hởng tới hoạt tính enzim

+ Nhiệt độ: tốc độ của phản ứng enzim chịu ảnh hởng của nhiệt độ, mỗi enzim có một nhiệt độ tối u tại nhiệt độ này enzim có hoạt tính cao nhất

Ví dụ: đa số các enzim ở tế bào của cơ thể ngời hoạt động tối u ở khoảng nhiệt độ nhng enzim của vi khuẩn suối nớc nóng lại hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ cao Khi cha đạt đến nhiệt độ tối u của enzim thì sự gia tăng nhiệt độ

sẽ làm tăng tốc độ phản ứng của enzim,tuy nhiên khi đã qua nhiệt độ tối u của enzim thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm giảm tốc độ phản ứng và có thể enzim bị mất hoàn toàn hoạt tính

+ Độ pH: mỗi enzim có pH tối u riêng Đa số enzim có pH tối u từ 6 -

8, có enzim hoạt động tối u trong môi trờng axit nh pepsin hoạt động tối u ở

pH = 2

+ Nồng độ cơ chất: Với một lợng enzim xác định nếu tăng dần lợng cơ

lúc nào đó thì sự gia tăng về nồng độ cơ chất cũng không làm tăng hoạt tính của enzim Đó là vì tất cả các trung tâm hoạt động của enzim đã đợc bão hoà bởi cơ chất.

+ Nồng độ enzim: với một lợng cơ chất xác định nồng độ enzim càng cao thì tốc độ xẩy ra phản ứng càng nhanh Tế bào có thể điều hoà tốc độ chuyển hoá vật chất bằng việc tăng giảm nồng độ enzim trong tế bào

+ Chất hoạt hóa và ức chế: Hoạt tính enzim có thể thay đổi dới tác dụng của các chất hoạt hóa và ức chế Và do đó ta có thể sử dụng các chất hoạt hóa hay ức chế để điều khiển phản ứng enzim Nguyên nhân của hiện t-ợng này có dính líu tới trung tâm hoạt động của enzim và cấu trúc phân tử (nhất là cấu trúc bậc 3) của protein - enzim

1.1.4 Vai trò của enzim trong quá trình chuyển hoá vật chất

Nhờ enzim mà các quá trình sinh hoá trong cơ thể sống xảy ra rất nhanh với tốc độ lớn trong điều kiện sinh lý bình thờng Khi có enzim xúc tác, tốc độ của một phản ứng có thể tăng hàng triệu lần Nếu tế bào không có các enzim thì các hoạt động sống không thể duy trì đợc vì tốc độ của các phản ứng sinh hoá xảy ra quá chậm Tế bào có thể tự điều chỉnh quá trình chuyển hoá vật chất để thích ứng với môi trờng bằng cách điều chỉnh hoạt tính của các loại enzim Một trong các cách điều chỉnh hoạt tính của enzim khá hiệu quả và nhanh chóng là sử dụng các chất ức chế hoặc hoạt hoá enzim Các chất ức chế đặc hiệu khi liên kết với enzim sẽ làm biến đổi cấu hình của enzim làm cho enzim không thể liên kết đợc với cơ chất, ngợc lại các chất hoạt hoá khi liên kết với enzim sẽ làm tăng hoạt tính của enzim ức chế ngợc là kiểu điều hoà trong đó sản phẩm của con đờng chuyển hoá quay lại tác động nh một chất ức chế, làm bất hoạt enzim xúc tác cho phản ứng ở

đầu của con đờng chuyển hoá

Khi một enzim nào đó trong tế bào không đợc tổng hợp hoặc bị bất hoạt thì không những sản phẩm không đợc tạo thành mà cơ chất của enzim

đó cũng sẽ bị tích luỹ lại gây độc cho tế bào hoặc có thể đợc chuyển hoá theo con đờng phụ thành các chất độc gây nên các triệu chứng bệnh lý Các bệnh

nh vậy ở ngời đợc gọi là bệnh rối loạn chuyển hoá

1.1.5 Cơ chế tác dụng của enzim

Bản chất của các phản ứng enzim khi có sự tham gia xúc tác của các enzim, các cơ chất sẽ đợc hoạt hoá mạnh, làm thay đổi tính chất hoá học của cơ chất kết quả sau phản ứng tạo ra sản phẩm của phản ứng Dới tác dụng của enzim cơ chất không chỉ thay đổi cấu trúc hoá học mà còn thay đổi tính chất hoá học

Quá trình xúc tác enzim xảy ra theo 3 giai đoạn :

+ Giai đoạn 1 : Enzim kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu nhờ

đó sẽ tạo ra phức hệ enzim-cơ chất Phức hệ này thờng không bền Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lợng

+ Giai đoạn 2 : Khi cơ chất tạo phức với enzim sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

+ Giai đoạn 3 : Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng đợc tạo thành và tách ra khỏi enzim

Sơ đồ tổng kết quá trình xúc tác của enzim :

E + S < => ES < => E + P

1.1.6 Tính đặc hiệu của enzim:

+ Tính đặc hiệu phản ứng: Mỗi một enzim chỉ tác động lên một loại phản ứng nhất định Mỗi kiểu phản ứng chỉ có một enzim tác động

Ví dụ: Thuỷ phân liên kết peptit là enzim peptidase Thuỷ phân liên kết ester là enzim esterase+ Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối : enzim chỉ tác động lên một cơ chất

+ Đặc hiệu nhóm chất tuyệt đối : Xúc tác chuyển hoá cho nhóm chất xung quanh enzim có tính chất giống nhau

+ Đặc hiệu cơ chất tơng đối : Enzim tác động lên một số cơ chất khác nhau Ví dụ : Bromelain ở quả dứa có hoạt tính của peptidase, esterase, amylaza nên thuỷ phân đợc các liên kết peptid, ester, glucosid

+ Đặc hiệu cấu hình không gian (trừ Epimerase, raxemase)

+ Đặc hiệu kép: Đặc hiệu với cả 2 cơ chất cùng lúc, trong đó có cơ chất đặc hiệu hơn cơ chất kia

1.2 Enzim amylaza

1.2.1 Đặc điểm phân loại hệ enzim amylaza

Amylaza là một hệ enzim rất phổ biến trong giới sinh vật Các enzim này thuộc nhóm enzim thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nớc:

- Exoamylaza gồm có β - amylaza và γ - amylaza Đây là những enzim thuỷ phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Các giai đoạn chính và những biến đổi enzim tham gia trong việc chế tác các sản phẩm thuỷ phân tinh bột:

Tinh bét

Dextrin ho¸

Dextrin m¹ch th¼ng vµ m¹ch nh¸nh

§­êng ho¸

Oligo saccharide maltose glucose

α - amylaza

B - amylasepullulanase

Glucoamylase

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo, cơ chế tác dụng của - amylazaα

Tên hoá học: 1,4 - α - D - glucanolydrolase

Tên thờng gọi: α - amylaza

α - amylaza là enzim xúc tác thuỷ phân liên kết α - 1,4 glucoside nội mạch ở bất kì vị trí nào trong phân tử tinh bột Với cơ chất là amylose, α - amylaza cho sản phẩm thuỷ phân chủ yếu là maltose (khoảng 87%) và một ít glucose (13%) Với cơ chất là amylopectin, α - amylaza chỉ thuỷ phân liên kết 1,4 không thuỷ phân liên kết 1,6 Sản phẩm tạo thành là các dextrin phân

tử thấp không cho phản ứng tạo màu với iodine, maltose, glucose và izomaltose (Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998)

Đặc diểm cấu tạo:

α - amylaza có cấu tạo gồm 3 tiểu đơn vị:

- A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trng helix (α/β) barel

- Tiểu đơn vị C nối với A có cấu trúc 8 đoạn β - sheet song song

- Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β - sheet đợc lồng vào giữa đoạn β - sheet thứ 3 và α - helix thứ 3 của tiểu đơn vị Tiểu đơn vị B quyết định độ bền hoạt động của enzim và liên kết enzim - cơ chất Ion canxi nối giữa tiểu đơn

vị A và B có từ 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn canxi ra khỏi enzim thì α - amylaza mất hết hoạt tính vì Ca duy trì cấu hình hoạt động của enzim đồng thời có tác dụng đảm bảo độ bền rất lớn của enzim đối với các tác động gây biến tính và sự thuỷ phân của các enzim phân giải protein (Najafi và cộng sự, 2005; Reddy và cộng sự, 2003)

Tuỳ thuộc vào dạng enzim mà có thể có thêm một số tiểu đơn vị khác

đợc gắn với đầu C - Terminalor, đầu N - Terminal của phân tử protein

Tâm hoạt động của α - amylaza có chứa nhóm - COOH và NH3

Enzim α - amylaza là phân tử protein phân tử lợng thấp, thờng nằm trong khoảng 50000 - 60000 Da Theo Grupt và cộng sự 2003, khối lợng phân tử của α - amylaza khác nhau ở các chủng Bacillus lichenifomis (58000

Da), Bacillus subtilis (57700 Da), Bacillus sp (42000Da), Bacillus AX20

ợc pH = 2,5 - 2,8

- Nhiệt độ: α - amylaza bền nhiệt hơn so với các amylaza khác,

đặc tính này đợc cho rằng có liên quan đến hàm lợng ion canxi trong phân tử (α - amylaza của vi khuẩn a nhiệt có chứa Ca nhiều hơn amylaza của nấm mốc 3 - 4 lần) Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α - amylaza từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α - amylaza của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 50oC và bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 1991)

- Điểm đẳng nhiệt: điểm đẳng nhiệt nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 Tất cả các α - amylaza đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng nh Cu2+,

Hg2+

1.3 Tinh bột

1.3.1 Khái quát về tinh bột

Tinh bột là cơ chất của amylaza Trong thực tế tinh bột là nguồn dự trữ cung cấp năng lợng rất quan trọng cho vi sinh vật, nó là hợp chất khá phổ biến trong tự nhiên, tinh bột đợc tích luỹ chủ yếu trong các loại hạt đặc biệt

là trong các loại hoà thảo và các loại củ (Pandey và cộng sự, 1999; Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998; Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị áng, 1992).

Dù tinh bột có ở các nguồn khác nhau nhng nó đều đợc cấu tạo từ hai cấu tử là amylose và amylopectin đặc thù cho từng loại vi sinh vật Cả hai cấu

tử này đều đợc cấu tạo bởi các phân tử đờng α - D - glucose qua liên kết 1,4

và 1,6 - glycoside (Nigam và cộng sự, 1995; Sivaramarishnan và cộng sự, 2006) Tinh bột không hoà tan trong nớc lạnh nhng khi đun nóng đến 60 -

80oC thì tinh bột sẽ bị hồ hoá Dới tác dụng của enzim hoặc axit mạnh các liên kết glucoside sẽ bị phá huỷ và nh vậy tinh bột sẽ bị thuỷ phân Sự thuỷ phân xảy ra ở hai mức độ là dịch hoá và đờng hoá Sản phẩm chủ yếu của dịch hoá tinh bột là các polyglucose tơng ứng (dextrin), còn sản phẩm của đ-ờng hoá là glucose và và maltose

Tinh bột tồn tại dới dạng các hạt có kích thớc biến đổi từ 0,002 - 0,12

mm Hạt tinh bột lúa mì có kích thớc nhỏ hơn hạt tinh bột khoai tây Hạt tinh bột lúa mì, lúa mạch có cấu tạo đơn giản hơn trong khi tinh bột ngô lúa có cấu tạo phức tạp hơn gồm nhiều hạt nhỏ

1.3.2 Cấu trúc tinh bột

Tinh bột là loại polysaccharide khối lợng phân tử cao gồm các đơn vị glucose đợn nối với nhau bởi các liên kết α - D - glucoside có công thức phân

tử là (C6H10O5)n ở đây n có thể từ vài trăm đến hơn một triệu

Tinh bột không phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccharide khác nhau: amylose và amylopectin, hai cấu tử này đều đợc cấu tạo nên từ α - D - glucoside nhng vị trí liên kết các glucose là khác nhau nên tính chất hoá học và cấu tạo của chúng là khác nhau Tỉ lệ amylose/ amylopectin khoảng 1/4 và không nh nhau ở các nguồn tinh bột Ví dụ trong tinh bột loại nếp (gạo nếp hoặc ngô nếp) gần nh 100% là amylopectin, tinh bột đậu xanh, dong riềng hàm lợng amylose chiếm trên dới 50%

- Amylose có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh, các phân tử glucose kết hợp với nhau qua liên kết α - 1,4 glycoside dài khoảng 300 -

1000 gốc glucose xoắn theo kiểu xoắn α (alpha)

Mỗi vòng xoắn có 6 gốc glucose, trọng lợng phân tử là 100000 -

300000 kDa, cấu trúc xoắn đợc giữ vững nhờ liên kết hidro giữa các nhóm -OH tự do Bên trong vòng xoắn có thể kết hợp với các nguyên tử khác, amylose tạo màu xanh khi kết hợp với iod Nếu đun nóng liên kết hidro bị cắt

đứt, chuỗi amylose duỗi thẳng do đó iod bị tách ra khỏi phân tử amylose và dung dịch mất màu xanh

- Amylopectin có cấu tạo dạng chuỗi, phân nhánh, ngoài mạch chính

có liên kết α - 1,4 glucoside còn có nhánh liên kết với mạch chính bằng kiên kết α - 1,6 glucoside Trọng lợng phân tử 500000 - 1000000 kDa, vì nó có chứa mạch nhánh nên phân tử không tạo thành dạng xoắn ốc nh amylose, khi phản ứng với iod cho màu nâu tím (do kết quả của sự hình thành nên các hợp chất hấp phụ) Khác với dung dịch amylose, amylopectin có độ nhớt và độ bền hoá [2]

Trong tự nhiên tinh bột tồn tại dới dạng hạt gồm nhiều lớp đồng tâm: lớp ngoài là amylopectin, lớp trong là amylose, ngoài cùng hạt tinh bột là lớp

vỏ xenlulaza đặc hơn lớp tinh bột bên trong chứa ít nớc nên bền với tác dụng bên ngoài Với cấu trúc này tinh bột ít chịu ảnh hởng của axit hoặc enzim Khi xử lý cấu trúc này bằng nhiệt thì hạt tinh bột hấp thụ nớc, phồng lên dính vào nhau làm độ nhớt tăng và gây hiện tợng hồ hoá Nếu xử lý nhiệt lâu hơn, hạt tinh bột sẽ bị phân cắt do tác dụng thuỷ phân từng phần và hoà tan một phần các phân tử cấu thành tinh bột, độ nhớt của dung dịnh giảm xuống [9]

1.3.3 Cơ chế của quá trình phân giải tinh bột nhờ vi sinh vật:

Tinh bột không tan trong nớc nhng khi hỗn hợp dịch tinh bột bị đun nóng thì (60 - 850oC) thì tinh bột sẽ bị hồ hoá và đợc gọi là hồ tinh bột Dới

tác dụng của enzim amylaza, tinh bột bị thuỷ phân do các liên kết glucoside

bị phân cắt Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzim amylaza theo hai mức độ: dịch hoá và đờng hoá Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian là dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đờng hoá thì sản phẩm là maltose và glucose

Vi sinh vật phân giải tinh bột có khả năng tiết ra enzim ngoại bào vào môi trờng xung quanh hệ enzim amilaza gồm 3 enzim đã kể trên

Quá trình thuỷ phân tinh bột là quá trình đa giai đoạn:

+ ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hoá): chỉ một số phân tử cơ chất

bị thuỷ phân tạo thành một lợng lớn phân tử dextrin phân tử thấp (α - dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin)

đều bị dịch hoá nhanh)

+ Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đờng hoá): các dextrin phân tử thấp đợc tạo thành bị thuỷ phân tiếp tục tạo ra các tetra - trimaltose không cho màu với iot Các chất này bị thuỷ phân rất chậm bởi α - amylaza cho tới disaccharide

và monosacchride Dới tác dụng của α - amylaza, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosacchride gồm 6 - 7 gốc glucose

+ Sau đó các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose

Qua một thời gian dài tác dụng sản phẩm thuỷ phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của amylaza lên amylopectin cũng xảy ra tơng tự nhng vì không phân cắt đợc liên kết α - 1,6 -glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đờng nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại dới tác dụng của α-amylaza, tinh bột có thể chuyển nhanh thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên

thông thờng α-amylaza chỉ thuỷ phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân

tử thấp không cho màu với iôt và một ít maltose Khả năng dextrin hoá cao của α-amylaza là tính chất đặc trng của nó Vì vậy ngời ta thờng gọi loại amylaza này là amylaza dextrin hoá hay amylaza dịch hoá

Tổng hợp quá trình thuỷ phân tinh bột của enzim amylaza

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.4.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Vi khuẩn đầu tiên đợc quan sát bởi Antony van Leeuwenhoek năm

1683 bằng kính hiển vi một mắt (monocular microscope) do ông tự thiết kế Tên vi khuẩn đợc đề nghị sau đó khá lâu bởi Christian Gottfried Ehrenberg vào năm 1828, xuất phát từ chữ βαktηРiov trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là

“cái que nhỏ” Louis Pasteur (1822-1895) và Robert Kock (1843-1910) miêu tả vai trò của vi khuẩn là các thể mang và gây ra bệnh hay tác nhân gây bệnh

Ban đầu vi khuẩn hay vi trùng (microbe) đợc coi là các loại nấm có kích thớc hiển vi ngoại trừ các vi khuẩn lam (Cyanobacteria) quang hợp đợc coi là một nhóm tảo (Cyanophyta hay tảo lam) Phải đến khi có nghiên cứu

về cấu trúc tế bào thì vi khuẩn mới đợc nhìn nhận là một nhóm riêng khác với các sinh vật khác

Vào 1956, Hebert Copeland phân chúng vào một giới (Kingdom) riêng

là Mychota sau đó đợc đổi tên thành sinh vật khởi sinh (Monera), sinh vật nhân sơ (Prokaryota) hay vi khuẩn (Bacteria)

Trong thập niên 1960 khái niệm này đợc xem xét lại và vi khuẩn (bây giờ gồm cả Cyanbacteria) đợc xem nh là một trong hai nhóm chính của sinh giới, cùng với sinh vật nhân chuẩn Sinh vật nhân chuẩn đợc đa số cho là đã tiến hoá từ vi khuẩn và sau đó cho rằng từ một nhóm vi khuẩn hợp lại Sự ra

đời của phân loại học phân tử đã làm lung lay quan điểm này

1977, Carlwoese chia sinh vật nhân sơ thành hai nhóm dựa trên trình

tự 16S rARN gọi là vi khuẩn chính thức (Eubacteria) và vi khuẩn cổ (Archaebacteria) Ông lý luận rằng hai nhóm này cùng với sinh vật nhân chuẩn tiến hoá độc lập với nhau Vào 1990, nhấn mạnh thêm quan điểm này bằng cách đa ra hệ phân loại vực bao gồm vi khuẩn (Bacteria), vi khuẩn cổ (Archaea) và sinh vật nhân chuẩn (Eucaria) Quan điểm này đợc chấp nhận rộng rãi giữa các nhà sinh học phân tử nhng cũng bị chỉ trích Một số khác cho rằng ông đã quan trọng hoá vài khác biệt di truyền và rằng cả vi khuẩn

cổ và sinh vật nhân chuẩn có lẽ đều phát triển từ vi khuẩn chính thức

Năm 1971, đánh dấu bớc mở đầu quan trọng cho những nghiên cứu về protease kiềm ở Bacillus Horikoshi là ngời đầu tiên công bố thu nhận và Markland tìm hiểu cấu trúc cơ bản và tính chất hoá lý của protease kiềm từ Bacillus

Sang 1972, ngời ta đã nghiên cứu và đa vào sản xuất trên quy mô lớn các protease kiềm ở một vài loài Bacillus

Đến thập kỉ 80, những nghiên cứu về protease kiềm của Bacillus tiếp tục đợc mở rộng và đã tạo ra đợc hàng loạt các sản phẩm thơng mại trên thị trờng, các vi khuẩn Bacillus a kiềm trở thành “một thế giới vi sinh vật mới” theo quan điểm công nghiệp

Gần đây ngời ta đã thành công trong nhân dòng phân tử,giải trình tự Nucleotit và biểu hiện gene mã hoá protease kiềm từ nhiều loài Bacillus trong

Năm 1851, Leuchs đã phát hiện nớc bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đờng Sau đó các enzim amilaza trong nớc bọt, trong dịch tiêu hoá của ngời và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu đợc quan tâm nghiên cứu

1.5 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Hầu nh mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzim - chất xúc tác sinh học Chính vì vậy các nghiên cứu về enzim đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm với nhiều nghiên cứu ở các lĩnh vực khác Các nghiên cứu nhằm theo

hớng tinh sạch enzim, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzim, khả năng ứng dụng của enzim trong thực tế Nghiên cứu về công nghệ enzim đã

đợc tiến hành bởi nhiều tác giả nh sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin…sử dụng mầm mạ để sản xuất amylaza Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rợu bằng enzim

cố định trên cột Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt - P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc Trong lĩnh vực y dợc, nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzim nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà Đấy là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dỡng ở nớc ta

Việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzim ngày càng đợc chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm

đầu thế kỷ XXI các enzim khác nhau đã đợc ứng dụng ở Việt Nam bớc đầu

đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzim trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rợu, chế biến tinh bột Việc nghiên cứu các enzim phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng đợc quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ Ví dụ chế phẩm enzim mới ra đời phục vụ nông nghiệp E2001 có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất, tăng năng suất cây trồng

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Thu mẫu vi khuẩn trên cánh đồng trồng lúa xã Hng lợi - huyện Hng Nguyên - tỉnh Nghệ An

-Phân lập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm vi sinh - khoa Sinh học - trờng Đại học Vinh

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

- Lấy mẫu, bảo quản và xử lý từ 11/10/2010 – 13/10/2010

- Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm từ 15/10/2010 – 30/11/2010

- Viết báo cáo và hoàn thành luận văn từ 12/2010 – 06/2011

2.2 Phơng pháp nghiên cứu

2.2.1 Phơng pháp thu mẫu, xử lý và bảo quản mẫu [4]

- Thu mẫu đất từ ruộng trồng lúa cho vào bao polyêtylen

- Đem về phòng thí nghiệm pha loãng cho trong ống nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh

2.2.2 Phơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn [4] [18]

2.2.2.1 Môi trờng nuôi cấy

Để có đợc loại vi khuẩn Bacillus subtilis thuần khiết chúng tôi đã tiến

hành nuôi cấy và phân lâp trên môi trờng nớc thịt-pepton-agar (MPA), với kĩ thuật hộp trải (Spread plate)

Thành phần môi trờng MPA nh sau:

Pha chế môi trờng nuôi cấy:

Cân chính xác các thành phần của môi trờng

↓

Điều chỉnh pH, hoà tan, đun sôi

↓Cho vào bình tam giác và các ống nghiệm

↓Nút bông rồi bọc giấy không thấm nớc vào đầu bình và đầu ống

nghiệm

↓Khử trùng 1atm thời gian 30phút trong nồi khử trùng (Autoclave)

↓Lấy bình và ống nghiệm ra khỏi nồi khử trùng

Đổ môi trờng từ bình ra đĩa petri (45-550) trong tủ cấy vô trùng trong không gian vô trùng nhờ bộ phận lọc khí và vô trùng bằng tia tử ngoại

↓Bảo quản trong tủ lạnh

2.2.2.2 Phân lập vi khuẩn

Thu mẫu vi khuẩn từ đất

↓Dùng đũa thuỷ tinh riêng biệt khuấy mạnh lắc đều , liên tục trong vòng

10phút

↓

Để lắng trong vòng 30phút, chắt lấy dịch lọc

Dùng pipetman vô trùng chuyền 0.5ml dịch huyền phù vào đĩa petri

chứa môi trờng rắn MPA

↓Dùng que trang Drigranxki trang đều bề mặt thạch

↓Lật ngợc hộp, gói bao polyetylen (và giấy báo) để nuôi trong tủ ấm ở

300C

↓Theo dõi từng ngày đánh dấu các khuẩn lạc xuất hiện sau đó thuần khiết chủng cần nghiên cứu bằng phơng pháp cấy ria (Streak plate)

↓Cấy chuyền sang ống thạch nghiêng chứa môi trờng rắn MPA

↓Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4-60C

2.2.3 Phơng pháp xác định số lợng vi khuẩn Baccillus subtilis (phơng pháp CFU và phơng pháp đo độ đục)

2.2.3.1 Phơng pháp CFU (Colony Forming Unit) [4]

- Lấy 0,1ml dịch bào tử nấm ở mỗi độ pha loãng thập phân 10-2, 10-3,

10-4,, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 bằng pipet riêng biệt (đã vô trùng) lên đĩa petri chứa môI trờng Czapeck và dùng que trang riêng biệt (đã khử trùng) trang đều bề mặt đĩa Sau đó đa vào tủ ấm ở 300C đến khi xuất hiệh khuẩn lạc Mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần

- Dùng máy đếm để đếm số khuẩn lạc sau 3 ngày nuôI cấy ở các độ pha loãng thập phân 10-2, 10-3, 10-4,, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 Chọn các đĩa có số khuẩn lạc 50 – 250 để tính kết quả (theo quy định của FDA – Food and Drug Administration)

- Mật độ tổng số vi khuẩn Bacillus subtilis trong 1g hay 1ml mẫu đợc

tính nh sau:

)

( ) / (

1

1v f n i v f i

n

N ml

CFU

A

+ +

=

Trong đó:

A: Số tế bào (CFU) vi sinh vật trong 1g hay 1ml mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc trên các đĩa đã chọn

ni: Số lợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích vật mẫu cấy vào trong mỗi đĩa

fi: Độ pha loãng tơng ứng

2.2.3.2 Phơng pháp đo độ đục (Nephelo Turbiditymeter) [16]

Đây là phơng pháp hoá lý, chính xác cao và nhanh rất thuận lợi kiểm tra mật độ vi sinh vật

- Lấy 5ml dịch bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis ở mỗi độ pha loãng thập

phân 10-2, 10-3, 10-4,, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 đem đo bằng máy đo độ đục

Nephloturbiditymeter - Hach (Mỹ sản xuất) ở bớc sóng 610nm của khoa sinh học - Đại học Vinh Ghi kết quả theo đơn vị NTU tơng ứng với số bào tử.

- Nguyên lý của phơng pháp: Cho một tia sáng từ nguồn sáng đi qua dịch huyền phù thì một phần bị cản lại, một phần đi qua và đến tế bào quang

điện, từ đó xuất hiện dòng quang điện (dòng thấu quang) Khi đó số lợng tế bào trong dịch huyền phù sẽ là:

) (

lg C l NTU T

l

A= = ε

Trong đó:

A: Độ hấp phụl: Bề dày của dung dịch

T : Độ thấu quang

C : Mật độ

ε : Hệ số hấp phụ

2.2.4 Phơng pháp xác định tốc độ sinh trớng theo Blackman (1981) [4]

- Sinh trởng của vi khuẩn (sinh trởng tơng đối)

(%) 100

*

d

d D

Pd = −

Trong đó:

d: Số đo đờng kính khuẩn lạc lần đầu (mm)

D: Số đo đờng kính khuẩn lạc lần sau (mm)

- Tốc độ sinh trởng:

(%) 100

*

*t

d

d D

Vp= −

Trong đó: t: khoảng thời gian giữa hai lần đo (h)

2.2.5 Phơng pháp quan sát tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis [4] [13]

Quan sát tiêu bản cố định là một phơng pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật để nghiên cứu cấu tạo tế bào của chúng và xác định các nhóm

vi sinh vật

Các bớc tiến hành:

+ Cố định vi sinh vật trên đèn cồn hoặc dùng tia tử ngoại.

+ Cách nhuộm: nhuộm dơn và nhuộm kép.

+ Quan sát các tiêu bản sống và tiêu bản cố định ở vật kính x40, x60.

2.2.6 Phơng pháp nghiên cứu ảnh hởng của nhiệt độ đến sinh trởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis [4] [14]

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đợc nuôi trong các đĩa petri và nuôi

trong tủ ấm, điều chỉnh nhiệt độ ở 20, 30, 40, 50, 600C Đo đờng kính khuẩn lạc bằng micrometer từ khi xuất hiện đến ngày thứ ba và tính tốc độ sinh tr-ởng của chủng vi khuẩn ứng với mỗi mức nhiệt độ tơng ứng theo Blackman (1981)

2.2.7 Phơng pháp nghiên cứu ảnh hởng của pH đến sinh trởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis [4] [14]

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đợc nuôi trên môi trờng MPA có pH

là 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Đo đờng kính khuẩn lạc của chủng vi khuẩn từ khi xuất hiện đến ngày thứ ba ở các độ pH Sau đó xác định tốc độ sinh trởng theo Blackman (1981)