Nghiên cứu tách và xác định cáu trúc của một số hợp chất từ cây bưởi bung (glycosmis pentaphylla corr) ở nghệ an

s

Mở đầu

1 Lý do chọn đề tài

Các hợp chất thiên nhiên nói chung, các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học nói riêng đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong đời sống con ngời, nó cung cấp nguồn nguyên liệu phong phú cho các ngành thực phẩm, công nghiệp, nông nghiệp, hơng liệu, mĩ phẩm, đặc biệt là trong y học

Hệ thực vật Việt Nam rất phong phú và đa dạng Hiện nay đã biết đợc có 10.368 loài thực vật bậc cao và dự đoán có thể tới 12.000 loài, trong đó cây làm thuốc có khoảng 600 loài Từ xa xa cha ông ta đã sử dụng nguồn dợc liệu có sẵn trong tự nhiên để tạo ra nhiều loại thuốc chữa bệnh trong dân gian

Cùng với sự phát triển của khoa học, từ những hợp chất thiên nhiên bằng con đờng biến hoá hoá học ngời ta thu đợc các hợp chất mới có hoạt tính dùng trong y học và các ngành liên quan Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) hiện nay

có khoảng 80% các loại thuốc đang giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có chứa hợp chất từ thiên nhiên, trong đó chủ yếu là từ cây thuốc

Họ Cam quít (Rutaceae) là một họ thực vật lớn, có 2000 loài, 150 chi, gồm các chi Glycosmis, Murraga, Clausena, Zanthoxilum, trong đó có hơn

100 loài cây đợc dùng làm thuốc chữa bệnh Ngoài ra cây họ cam quít còn đợc dùng trong nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm, dợc liệu, hơng liệu, mỹ phẩm

Cây bởi bung, tên khoa học là Glycosmis pentaphylla Corr, phân bố chủ

yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu á (các nớc Đông Nam á, Nam Trung Quốc, ấn Độ và Australia) ở Việt Nam có 22 loài, trong đó cây cơm rợu là cây

có vùng phân bố phổ biến ở hầu hết các tỉnh, từ đồng bằng, trung du đến vùng núi thấp dới 1000 m

Trong Đông y, ngời ta hay dùng cây bởi bung làm thuốc giúp sự tiêu hoá, hồi phục sức khoẻ của phụ nữ sau khi sinh nở, chữa thấp khớp, đau lng, tiêu chảy, da vàng, dùng ngoài phối hợp với các thuốc khác sát trùng lên da chữa về răng, tai, trị ho, thiếu máu, cảm cúm và dùng làm thơm cơm rợu.

Đã có một số công trình trong nớc và trên thế giới nghiên cứu về thành phần hoá học của cây bởi bung Tuy nhiên, cha có công trình nào nghiên cứu về thành phần hoá học của cây bởi bung ở vùng Nghệ An Vì vậy chúng tôi chọn

đề tài “ Nghiên cứu tách và xác định cấu trúc của một số chất từ cây bởi bung

(Glycosmis pentaphylla Corr.) ở Nghệ An” Từ đó góp phần xác định thành

phần hoá học của cây bởi bung và tìm nguồn nguyên liệu cho ngành dợc liệu,

h-ơng liệu và mỹ phẩm

2 Nhiệm vụ nghiên cứu:

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Thu thập rễ cây bởi bung

- Ngâm rễ cây bởi bung trong dung môi chọn lọc, rồi chng cất thu hồi dung môi, sau đó thu phần cao đặc của cây bởi bung

- Tách các hợp chất từ cao đặc cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla

Corr.) và xác định cấu trúc của hợp chất thu đợc.

3 Đối tợng nghiên cứu.

Đối tợng nghiên cứu là dịch chiết từ rễ cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla Corr.) thuộc họ Cam quít (Rutaceae) ở Nghệ An.

Chơng 1Tổng quan1.1 Đặc điểm thực vật họ Cam quít (Rutaceae)

Họ Cam quít gồm 150 chi và 2000 loài phân bố khắp thế giới trừ những

vùng lạnh.

Cây thảo, nhỏ hoặc cây to, cành có gai hoặc không có gai, vỏ chứa túi tiết trong vỏ Lá có tuyến nhờn trong mờ hay không, nom rõ hay không, lá mọc cách hay mọc đối, đơn hay kép, lá chét mọc đối hay mọc cách, có cuống hay không có cuống, đều hay không đều, có lá kèm hay không có lá kèm Cụm hoa

ở kẽ lá hay ở ngọn, hoa có tạp tính khác gốc, cánh rời hay liền ít ở gốc Ba hoặc nhiều nhị đính ở ngoài đài hay tụ họp thành bó hoặc liền thành ống, dính hoặc không dính với các cánh hoa, bao phấn hớng trong, hai ô mắt dọc Bầu có nhiều lá noãn, ít nhiều rời nhau, đầu nhụy rời hoặc liền, giá noãn trung tâm, nhiều noãn hay một noãn trong mỗi ô Quả khô tự mở hay quả mọng Hạch cứng nhxơng hay không cứng, cơm quả nhầy hay cấu tạo bởi những lông mọng nớc Hạt có nội nhũ hay không có nội nhũ, cây mầm thẳng hay cong, lá mầm mỏng hoặc, mầm thẳng hoặc cong, phẳng hay xếp nếp, đôi khi có nhiều trong một hạt

Họ Cam quít (Rutaceae) có các chi Glycosmis, Evodia, Murraga, Clausena…

trong đó có hơn 100 loài cây dùng làm thuốc chữa bệnh [1], [3], [4], [7]

1.2 Chi Glycosmis.

1.2.1.Đặc điểm thực vật và phân loại chi Glycosmis

Chi bởi bung (Glycosmis) là một chi của 44 loài thực vật, chủ yếu là cây

bụi thuộc họ Cam quít (Rutaceae) chúng phân bố ở rộng khắp ở ấn Độ, Malaixia, Australia và các đảo thuộc miền tây Thái Bình Dơng [2], 9], [13]

Tại Australia có 19 loài, chúng nói chung đợc gọi là aspen (cây dơng lá rung) mặc dù chúng không có quan hệ họ hàng gì với cây dơng lá rung thuộc chi populus trong họ Liễu (Salicaceae).

Tơng tự nh các thành viên khác trong họ Rutaceae, lá của chúng có mùi thơm khi bị nghiền nát

Theo hệ thống phân loại thực vật của Engler, chi Glycosmis thuộc họ

Cam quít (Rutaceae), phân họ Arantioideae, phân nhóm Clauseneae Phân

nhóm Clauseneae có 3 chi: Glycosmis, Clauseneae và Murraya Cả ba chi này

đều có ở nớc ta [1], [2], [8], [9], [13]

ở Việt Nam , Võ Văn Chi và cộng sự đã mô tả 5 loài Glycosmis [6]

Phạm Hoàng Hộ đã mô tả khá chi tiết 20 loài Glycosmis, chiếm một phần ba

tổng số loài trên thế giới [4] Các loài Glycosmis phân bố trong cả nớc, từ Bắc

bộ đến Nam bộ, thờng thấy mọc hoang ở vùng đất cao trung bình ở vùng núi Chi Glycosmis có tên chung là cơm rợu, lấy từ tên của loài G pentaphylla Correa, vì lá của cây này đợc dùng để làm thơm rợu Ngoài ra, lá loài G cymosa ( Pierre) Stone đợc dùng trong công thức men rợu Gần đây, Nguyễn

Nghĩa Thìn cho biết, đồng bào Dao ở Hà Tây có sử dụng loài G lanceolata

chữa bệnh về răng, tai và loài G cyanocarpa chữa chó cắn [10] Bảng 1 trình

bày tên khoa học, tên Việt Nam và vùng tìm thấy của các loài thuộc chi

Glycosmis ở Việt Nam [9].

Trong số 22 loài thấy có ở Việt Nam (bảng 1), cha có loài nào đợc nghiên cứu về hoá học hoặc dợc lý học ở nớc ta Bảy loài trong đó đã đợc nghiên cứu về thành phần hoá học ở các nớc khác [2], [9]

B¶ng 1: Ph©n bè c¸c loµi Glycosmis ë ViÖt Nam

Nguyªn)

( G motana Pierre)

Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Pù Mát17

1.2.2 Thành phần hoá học chi Glycosmis.

Cho đến nay có 11 loài Glycosmis đợc nghiên cứu thành phần hóa học,

bao gồm G angustifolia, G arborea, G bilocularis, G citrifolia * , G chlorosperma, G craibi * , G cyanocapa * , G mauritiana, G ovoidea * , G parviflora và G pentaphylla (* các loài có ở Việt Nam) Những loài trên đợc

thu hái từ các nớc ấn Độ, Srilanka, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia,

úc, New Cacledonia, Nhật Bản và Việt Nam [1], [8], [9]

Nghiên cứu đầu tiên về thành phần hoá học chi Glycosmis là vào năm 1935 ,

Sikhibhushan tách đợc một glucozit dạng tinh thể có tên glycomin (C22H26 đ.c.169 0)

từ dịch chiết benzen của lá loài G pentaphylla ở ấn Độ.

Đến nay đã có hơn 100 chất đợc tách từ các loài Glycosmis, trong đó có

hơn 70 chất đợc tách lần đầu từ tự nhiên Ancaloit chiếm hơn một nửa tổng số hợp chất đợc tìm thấy, trong đó có 37 ancaloit lần đầu tiên đợc phân lập Hầu hết các chất đợc phân lập từ lá, một số từ vỏ rễ, thân, hạt và hoa Các hợp

chất tách ra từ chi Glycosmis cũng bao gồm những hợp chất phổ biến trong họ

Cam quít, nh cumarin, flavonoit, tritecpen, và ancaloit [3] Từ năm 1992 trở lại

đây, một số đáng kể các hợp chất amit chứa lu huỳnh đã đợc phân lập từ một số loài Glycosmis, trong đó một số chất thể hiện khả năng chống, trừ sâu rõ rệt [8],

[9]

1.2.2.1 Tritecpenoit

Các tritecpen chỉ đợc tìm thấy ở loài G arborea thu hái ở ấn Độ [2]

Chúng bao gồm bốn tritecpen bốn vòng và các tritecpen năm vòng nh arborinol, isoarbonol và dẫn xuất xeton arborinon Hai ancol bốn vòng (1a) và (1b) đã đợc phân lập từ dịch chiết ete petrol của phần cây trên mặt đất, cấu trúc của chúng

đợc xác định dựa vào phổ 2D NMR và phổ khối của dẫn xuất

Cho tới nay chỉ có 4 flavonoit đợc phân lập từ loài G citrifolia thu hái ở

Đài Loan, đó là Glychalcon- A (3a) và Glychalcon- B (3b) Cấu trúc của chúng

đợc xác định nhờ phân tích phổ 1H-, 13C- NMR và NOESY [9]

O

OCH3 OCH3

ROH

OOCH3

Có 3 cumarin đợc tách từ rễ và vỏ cành của loài G cyanocarpa mọc ở ấn

Độ [24] Đó là angelical (4) limetiin (5) và xanthyletin (6)

Ancaloit là nhóm hợp chất tự nhiên chính

đợc phân lập từ chi Glycosmis Năm 1952, lần đầu tiên một số nhà nghiên cứu

ấn Độ công bố kết quả phân lập đợc các ancaloit từ loài G pentaphylla Tới

nay hơn 60 ancaloit đã đợc tìm thấy, chúng thờng có dạng quinolon, quinazolin, quinozolin, furoquinolin, cacbazol và acridon [8], [9], [20], [21], [22], [24], [25]

OMe

O

7

8N

H

O1

23

4

567

8c 3- CH2CH=CMe2, 4- OEt, 8- OH 8d 3- CH2CH=CMe2, 4- OMe, 8- OMe Đã có 9 dẫn xuất quinolon dạng (7b) và (8) đợc tách ra và xác định cấu trúc [24]

Từ loài G pentaphylla ngời ta đã phân lập glycolon A (7a) từ lá,

glycolon B (8a), glycosolon (8b), và homo-glycosolon (8c) từ vỏ rễ Wu và cộng sự đã tách glycocitridin (7b) từ lá của G citrifolia, và 8e từ lá của G

mauritiana Glycophyllon (8d) là ancaloit quinolon duy nhất đợc tách ra từ hạt

loài G pentephylla Tất cả các dẫn xuất quinolon đều có khung 2- quinolon,

hầu hết có nhóm isopentenyl ở vị trí 3 và nhóm thế chứa oxi ở vị trí 7 và 8

Gần đây, Greger và cộng sự đã tách đợc từ lá G cyanocarpa mọc ở

Srilanca hai dẫn xuất 2- quinolon khác, schinifolin (7c) và phennalydol (7d) [31]

O

OCH3

NH

O

CH3

7c 7d

1.2.2.4.2 Dẫn xuất quinazolin và quinazolon

Ancaloit khung quinazolol có thể đợc phân thành 4 nhóm chính:

Quinazolin (9), quinazonilon (10, 11), và quinazolindion (12)

N

N

NNO

12345

65

NH

O4

12

35

87

6

R

R

18

76

1.2.2.4.3 Dẫn xuất furoquinolin và furoquinolon

Một số ancaloit khung furoquinolin (13) đã đợc tìm thấy ở chi

Glycosmis Chúng bao gồm dictamnin (13a) tách từ vỏ rễ cây G pentaphylla,

G biocularis và G maurritiana; γ- faragin (13b) từ vỏ rễ cây G pentaphylla và

G arborea; skimmianin (13c), kokusaginin (13d), và evolitrin (13c) đã đợc

8

218

76

21

Glycarpin (14a) tách đợc từ lá ngoài G cyanocarpa mọc ở ấn độ là dẫn

xuất ancaloit duy nhất có dạng furoquinolon (14) [30]

1.2.2.4.4 Dẫn xuất acridon

Các ancaloit acridon của chi Glycosmis đợc tách ra từ các bộ phận khác

nhau của 2 loài G citrifolia mọc ở Đài Loan và G pentaphylla mọc ở ấn Độ

Chúng thuộc bốn nhóm chính: acridon đơn giản, furoacridon, pyranoacridon mạch thẳng dạng (15) và (16) [2], [9]

Các acridon đơn giản bao gồm arborinin tách từ lá loài G Pentaphylla,

glycocitrin- I, - II, 3- O- methylglycocitrin- II và glyfolin từ rễ và vỏ thân cây

G citrifolia, đã tách đợc dẫn xuất furoacridon nh furofolin- I và furofolin- II

cũng đã đợc tách và xác định cấu trúc

Thuộc về dẫn xuất pyranoacridon bao gồm các ancaloit đợc tác từ G

citrifolia nh zacrifolin (15a), N- methylseverifolin, và 7- hydroxy- N-

methylseverinfolin (15c), citracridon- I (15d), 7- hydroxynor- acronycin (15e), de- N- methylacronycin (15f), de- N- methylnoacronycin (15g), noacronycin (15h) và atalaphyllidin (15i) De- N- methylacronycin và noacronycin cũng thấy G pentaphylla

O

123

4567

789

15d 1- OH, 7- OMe, 8- OH, 12- Me 15h 1- OH, 12-Me

15e.1,7- diOH, 12- Me 15i 1,7- diOH

Wu và Furukawa đã tách đợc các ancaloit dạng pyranoacridon mạch thẳng từ vỏ rễ và vỏ cành loài G citrifolia mọc ở Đài Loan nh pyranofolin (16a)

56

127

Gần đây Furukawa và Wu đã tìm thấy các ancaloit acridon dạng bội (binary) glycobismin- A- B, và - C từ G citrifolia Cấu trúc của chúng đợc làm

sáng tỏ khi sử dụng các kỹ thuật phổ 1H- 13C- COSY- và HMBC

6

78

R3

R1

H 18

18a 3-CHO 18e 2-OMe, 3-Me, 6-OH

18b 2-OMe, 3-CHO 18f 2,6-diOMe, 3-Me18c 3-Me, 5-OMe 18g 3-Me, 6-OH

18d 2,6-diOMe, 3-CHO

Cho tới nay đã có 12 ancaloit cacbazol đợc phân lập từ chi Glycosmis

[9], [30] Ngoài glycomaurin (19) và glycomaurol (20) tách ra từ vỏ thân của G mauritiana mọc ở Srilanca, mà có thể xem nh là dẫn xuất 4- isoprenyl của

khung cacbazol cơ bản (18); 10 chất còn lại khác nhau bởi các nhóm thế bởi các

vị trí 2,3,5 và 6 Từ rễ của G pentaphylla mọc ở ấn độ đã tách đợc cacbazol

(18), 3- formyl cacbazol (18a), glycosinin (18b), glycozolicin (18c), và glycozolidal (18d), glycozolidol (18e), từ vỏ rễ là glycozolidin (18f) và glycozolin (18g), ancaloit (18h) đợc công bố bởi 2 nhóm nghiên cứu với hai tên khác nhau, glycozolinol và glycozolinin, sinharin từ G cyanocarpa (Blume)

Sprengel thu hái tại rừng nhiệt đới Sinharaja, ở Srilanca

NH

O

NH

OH

19 20

1.2.2.6 Amit

Đến nay đã có 27 hợp chất chứa lu huỳnh đợc tìm thấy từ các loài

Glycosmis Một số chất đợc tách bởi Greger, Hofer và cộng sự trong một dự án

sàng lọc các hợp chất tự nhiên dựa trên sự phân tách có định hớng bằng phép thử hoạt tính chống nấm, có thể phân chúng thành 3 nhóm chính: Sunfit, sunfoxit và sunphon Một điều đáng ghi nhận là tất cả các amit chứa lu huỳnh

đều đợc phân lập từ lá [2], [9], [31]

Thuộc nhóm sunfit là sinharin (21a) và methylsiharin (21b) tách từ loài

G cyanocarpa; penangin (22) và isopenangin (23) từ G chlorosperma,

illukumbin B (24a), methyl illukumbin B (24b) và methyl illukumbin A từ loài

G mauritiana Cấu trúc của chúng đã đợc sửa lại và khẳng định trên cơ sở tổng

hợp và dữ kiện phổ 1H- NMR

Wu và cộng sự đã tách hai amidosunfoxit đầu tiên từ G citrifolia (Willd)

thu hái ở Đài Loan, glycothiomin- A (26), glycothiomin- B (27) Chúng có cấu trúc nh penangin (22) và isopenangin (23), tơng ứng, trừ mức độ oxy hoá của nguyên tử lu huỳnh [2], [9], [31]

N

OS

H3C

H

CH3S

22 23

NO

HS

Hofer, Gerger và cộng sự đã tách đợc 12 sunphon mới từ G augustifolia

thu hái ở Srilanca và từ một số loài Glycosmis ở Thái Lan [9], [31]

N

ON

O

HS

CH3

S

H3C

30

NH

OS

78

9101112

1314

NO

SOO

14

11

1312

Sakerin (31a), sakeron (31b), sakerol (31c), dihydroisosakerol (31d), và methylgerambullal (32a), đợc tách từ G augustifolia dambullin (31e),

methyldambullin (32b), gerrambullin (31f), methylgerambullin (32c), gerambullindiol (31g), methylgerambullon (32d), methylisogerambullon (32e)

đợc tách từ các loài thu hái ở Thái Lan

Gần đây, Greger đã tách đợc ba dẫn xuất amit mới của axit S - methylthiocacbonic, niranin (33) từ G mauritiana; dehydroniranin A (34) và

đehdroniranin B (35) từ G cyanocarpa thu hái ở Thái Lan [2], [9], [31].

NO

CH3

H3C

33

NO

CH3

34 35

Từ dịch chiết MeOH của lá loài G ovoidea mọc ở Thái Lan, hai dẫn xuất

amit của axit N- methylanthranilic, doisuthin (36) và methoxy- doisuthin (37) đã

CH3

H3C

Một số hợp chất khác nh P- hydroquinon, β- sitosterol (33) và axit glycoric- dẫn xuất của carotenoit, cũng đợc tìm thấy ở chi Glycosmis [2], [9].

NO

38 39

NO

NO

H

40 41

1.2.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ chi Glycosmis

Mặc dù cha đợc nghiên cứu nhiều nhng các chất tách từ chi Glycosmis thể

hiện phổ hoạt tính khá rộng bao gồm ức chế khối u, kháng vi khuẩn, kháng kí sinh trùng sốt rét, kháng nấm, trừ sâu bọ Các dạng chất có hoạt tính bao gồm các ancaloit khung cacbazol, acridon, và các amit chứa lu huỳnh [9]

Glycozolidol (18e), một cacbazol ancaloit, tách từ rễ của G pentaphylla

mọc ở ấn Độ đã có hoạt tính chống lại vi khuẩn gram dơng và gram âm [26]

Khi dùng phơng pháp thử chén khuẩn ở nồng độ 200 àg /ml, glycozolidol có tác dụng với các vi khuẩn Staphylococcus aureus SH Bacillus firmis, Sarcina, Agrobacterium tumefaciens và Proteusvulgaris nhng không có tác dụng gì với

vi khuẩn Escherichia coli B.

Một số acidon ancaloit nh glycocitrin-I glyfolin (17a), citracridon- I, (de- N- methylacronycin , de- N- glycobismin- A, ở nồng độ 10 microgam/ml đã tiêu diệt ≥ 90% kí sinh trùng Khả năng chống kí sinh trùng sốt rét của các chất trên tợng hoặc cao hơn khả năng của cloroquin diphosphat

Hai amit chứa lu huỳnh đầu tiên của chi Glycosmis, sinharin (21a) và

methylsinharin (21b), đã đợc phân lập từ dịch chiết methanol của cây G cyanocarpa (Blume) Sprengel dựa vào phân tích sắc kí lớp mỏng định hớng

sinh học với chủng nấm Cladosporium cladosporioides Từ loài G mauritiana

phổ biến ở Srilanca, ba amit khác là illikumbin B (24b), đã có tác dụng chống nấm khi dùng phơng pháp đo trực tiếp dịch huyền phù nấm Cladosporium cladosporioides lên bản sắc kí lớp mỏng Trong đó, methyl illikumbin A cấu

hình "all- trans" có hoạt tính mạnh hơn illikumbin B và methylsinharin

Tơng tự, dehidroniranin B (35), một amit của axit S- methylthiocacbonic tách từ loài G cyanocarpa mọc ở Thái Lan cho phản ứng kháng với chủng nấm

Cladosporium herbarum khi thử trong ống nghiệm Dehidronirannin B (35) cùng với ritigalin (30) và nitranin (33), cũng có hoạt tính trừ sâu cao khi thử với loài Spodotera littoralis.

Trong số các dẫn xuất sunpho, metyldambulin (32b), tách từ G augustifolia mọc ở Srilanca, có phản ứng kháng chủng nấm Cladosporium

herbarum (Per Fr.) Link

1.2.4 Sử dụng trong dân gian.

Chi Glycosmis có nhiều loài đã đợc sử dụng rộng rãi từ rất lâu trong dân

gian ở nhiều nớc [1], [2], [3] Loài đợc biết đến nhiều nhất là G pentaphylla

Ngời ấn Độ hay dùng loài này làm thuốc ở Trung Quốc, nớc sắc rễ và lá của

G pentaphylla đợc dùng để chữa ho, chữa thâm tím mình mẩy ở malaysia

ngời ta uống nớc sắc rễ chữa sng mặt Hoa cây này trộn với hạt tiêu chữa ngứa ngáy; vỏ thân đợc dùng với datura làm độc cá ở Indonexia, nớc sắc dùng để

điều trị mật Loài G arborea ( Roxb.) cũng là một cây thuốc phổ biến ở ấn Độ

với các tên nh Ashshoura, Bon- nimbu, dùng để chữa sốt, đau gan và một số bệnh khác ở Đài Loan, loài G citrifolia (wild.) Lindl, đợc sử dụng để chữa

ngứa ghẻ, mụn nhọt và sng u Nớc sắc lá của loài G ovoidea Pierre dùng để

điều trị đau nhức; nớc sắc rễ và lá cây G puberula Lindl dùng chống nhiễm

trùng cho phụ nữ sau khi đẻ; hỗn hợp gồm vỏ thân, rễ và lá với hạt tiêu đen, gạo dính dùng để chống nôn

1.3 Cây bởi bung (Glycosmis pentaphylla Corr.)

1.3.1 Đặc điểm thực vật [1, 4, 5]

ở Việt Nam cây bởi bung hay còn gọi cây cơm rợu, cát bối, cỏ dọng dạnh Tên khoa học là … Glycosmis pentaphylla Corr, thuộc họ Cam quít:

(Rutaceae) nh hình 1

Hình 1: Cây bởi bung

Cây nhỏ hay cây nhỡ, cao 3-5m Cành màu lục pha tím đỏ Lá kép dài tới

30 cm, có 1-5 lá chét mọc so le, ít khi mọc đối, hình mác thuôn, dài 6- 16 cm, rộng 2- 5 cm, mép nguyên hoặc có răng ca không rõ, gốc tròn đầu nhọn, mặt trên bóng nhẵn, mặt dới vàng nhạt

Cụm hoa mọc thành chùm tán ở đầu cành, ngắn hơn lá; hoa nhỏ màu trắng nhẵn; lá dài 5, rất ngắn, hình tròn; cánh hoa thuôn nhẵn; nhị 10, có 5 cái dài gần bằng cánh hoa; bầu nhẵn có 5 ô

Quả mọng, hình cầu, khi chín màu hồng trong, ăn đợc Mùa hoa quả là tháng 11 đến tháng 3 [1], [3], [7], [8]

Chi Glycosmis gồm các loài cây gỗ nhỏ hoặc gỗ nhỡ, phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu á ( các nớc Đông Nam á, nam Trung Quốc

và ấn Độ) và Australia ở Việt Nam có 22 loài, trong đó cây cơm rợu là cây có vùng phân bố phổ biến ở hầu hết các tỉnh, từ đồng bằng, trung du (tập trung nhất) đến vùng núi thấp dới 1000m [1], [2], [3], [8], [9]

Cây cơm rợu là cây a ánh sáng, a ẩm, có thể hơi chịu bóng và chịu khô Cây thờng mọc lấn với các loài cây bụi khác trong các lùm bụi quanh làng, bờ nơng rẫy hoặc ở đồi Cây mọc ở vùng thấp thờng xanh tốt quanh năm ở vùng núi cao khoảng 1000 m, cây có hiện tợng rụng lá mùa đông [1], [2], [3], [9] Cây ra hoa quả hàng năm; quả chín đợc chim và một số loài bò sát ăn tha hạt đi khắp nơi Sau khi bị chặt, phần thân và gốc còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh Cây trồng đợc bằng hạt Cành, lá, rễ cơm rợu thu hái quanh năm, dùng tơi hay phơi khô [4], [9].

1.3.2 Thành phần hoá học

Trên thế giới đã có một số tác giả nghiên cứu về thành phần hoá học của cây bởi bung nh mẫu ở Papua New Guinea đã phân lập đợc 1- naphthoquinol (glycoquinol), và 1 acridon ancaloit mới (glycocitrin) và 12 hợp chất đã biết

Đây là lần đầu tiên phân lập một dẫn xuất naphthoquinon từ chi Glycosmis (noacronycin, des- N- methyl noacronycin, des- N- methylacronycin, citracrido-

1, arborini, 5- hydroxy- arborin, acrifolin, skimmiani, korkusagi, avicenol- B, avicenquino và aricenon)

Glycozolin, một dẫn xuất của carbazol [19]; 1 ancaloit quinazolin, glycophymin và 1 amit, glycomit [20]; glycophymolin, 1 ancaloit quinazolin [22] mới đã đợc tách từ cây Glycosmis pentaphylla Cấu trúc của glycozolin đã

đợc xác định là 3- methyl-6- methoxycarbazol [21] Một ancaloit carbazol với khung C-18 cacbon đợc phân lập từ cây Glycosmis pentaphylla đã đợc xác định

là mupamin bằng bán tổng hợp [23]

Glycolon, 1 ancaloit quinolon từ lá cây Glycosmis pentaphylla Cấu trúc

của hợp chất này đợc xác định là 3,8- dimetoxy-3- (- metyl but- 2- enyl)- 2- quinolon [24]

Một dẫn xuất carbazol, glycozolinin, đợc tách ra từ hạt cây Glycosmis pentaphylla (6- hydroxy- 3- metylcarbazol) [25].

Glycozolidon, một ancaloit carbazol mới, đợc phân lập từ rễ cây Glycosmis pentaphylla Cấu trúc của nó là 6- hydroxy-2- metoxy- 3- metylcarbazol Hợp chất

này có tính kháng khuẩn Gram âm và Gram dơng [26]

Ba ancaloit carbazol, glycozolicin, 3- formylcarbazol và glycosinin, đã

đ-ợc tách từ rễ cây Glycosmis pentaphylla Cấu trúc của glycozolicin và

glycosinin đã đợc xác định là 5- metoxy- 3- metylcarbazol và 2- metoxy- 3- formylcarbazol, tợng ứng dựa trên dữ kiện phổ, hoá học và tổng hợp [28]

Carbazol và 3- metylcarbazol đã đợc phân lập từ vỏ rễ cây Glycosmis pentaphylla [28].

Arborinin, 1 ancaloit acridon thu đợc từ cây Glycosmis pentaphylla, có

hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào khối u ở mật [29]

Sự phân lập hợp chất skimmianin và 3 hợp chất ancaloit acridol mới từ rễ cây Glycosmis pentaphylla (Retz ) Correa đã đợc công bố Dựa trên dữ kiện

phổ và biến đổi hoá học đã xác định các hợp chất này là noracronycin, des- N- methyl- acronycin và des- N- methylnoracronycin [30]

Từ dịch chiết lá cây Glycosmis mauritiana và G pentaphylla đã thu ở

các vùng khác nhau ở Srilanca đợc phân tích bằng sắc kí lỏng cao áp và thử hoạt tính kháng nấm Tất cả các mẫu cây G pentaphylla thu đợc đều xác định

có các ancaloit đã biết nh arborin, skimmianin và arborinin Ngợc lại, các mẫu

illukumbin B, metylillukumbin B, metylillukumbin A, đã đợc phân lập Các hợp chất này đều có hoạt tính kháng nấm với các mức độ khác nhau [31]

ở Việt Nam, Trần Huy Thái và cộng sự [32] đã nghiên cứu thành phần hoá học của tinh dầu lá và hoa của cây bởi bung (G pentaphylla (Retz) corr.,) ở

huyện Mê Linh, tỉnh Vĩnh Phúc và phát hiện trong cành và lá có chứa tinh dầu, mùi thơm dễ chịu, thành phần chính là: α-pinen, limonen, β- caryophyllen

Theo kết qủa thu đợc của tác giả Lê Văn Hạc và Nguyễn Thị Minh Hờng [9] khi nghiên cứu tinh dầu lá cây bởi bung ở nghệ An và Hà Tĩnh đã phát hiện

thêm thành phần chính của tinh dầu lá cây bỏi bung là: β- pinen, (E)- β– oximen, β- bisabolen

Trên thế giới những năm gần đây ngời ta đã phân tích thấy trong bởi bung có các ancaloit: dictamin C12H9O2N (đ c 1320), skimmiamin C14H13O4N (độ chảy 1750), kokusaginin C14H13O4N (đ c 1680), noracromyxin C19H17O3N (đ

c 1980-2000), arborin C16H14O2N (đ c 1500-1520), aborinin (đ c 1750), glycorin C9H8ON (đ c 145-1470), glycosminin C15H12ON (đ c 2490), veratroylsalixin C22H28O12 có trong lá non và nụ hoa với hàm lợng chiếm 0,2% [3], từ dịch chiết của cành cây G.pentaphylla (Retz) lần đầu tiên đã phân lập đ-

ợc một glycoquinon (noracronycin, des- N- methyl noracronycin) và 1 glycocitrin

CH

CH3

CH3

kokusaginin noracromyxin

Cây bởi bung đã đợc nghiên cứu về tác dụng chống tiêu chảy trên mô hình gây tiêu chảy thực nghiệm trên chuột cống trắng bằng các cao chiết bằng

nớc, clorofom, xăng, etanol của vỏ cây Trong đó cao chiết bằng etanol có hiệu quả cao hơn và với liều thấp hơn Thử nghiệm độc tính cho thấy bởi bung có phạm vi an toàn rộng

Rễ bởi bung đợc dùng để chữa phong thấp, chân tay nhức mỏi, bán thân bất toại, chữa mụn nhọt, chốc lở, răn cắn Nớc sắc từ rể còn dùng chữa sng mặt Những cành nhỏ có sợi có tác dụng làm săn và đợc dùng ở ấn Độ để chải răng [1], [2], [3], [7], [8]

Lá chữa tích huyết tử cung ở phụ nữ sau khi sinh và kích thích tiêu hoá(sao vàng, sắc đặc cho phụ nữ uống) Nớc ép từ lá có vị đắng, dùng để chữa sốt, bệnh về gan và trị giun, nõn từ lá bởi bung và gừng giã nát đắp trị eczema

và bệnh về da [2], [9]

Trong y học dân gian ấn Độ cây bởi bung còn đợc dùng trị ho, thiếu máu, tiêu chảy, da vàng

Bài thuốc có bởi bung

Rễ bởi bung 20g, rễ cốt khó 16 g, rễ cỏ xớc 20g, dòi đau xơng 24g, hoa kinh giới 20g, rễ hoàng lực, mỗi thứ 20 g Cách dùng: Cho 600ml nớc sắc cùng với 200ml nớc, ngày uống một thang, chia làm 2 lần

Công dụng: Chữa phong thấp, đau nhức, mình mẩy và khớp xơng

Chơng 2

phơng pháp nghiên cứu và thực nghiệm

2.1 Phơng pháp nghiên cứu:

2.1 1 Phơng pháp lấy mẫu

400C Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phơng pháp chng cất lôi cuốn hơi nớc hoặc

chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đợc nêu ở phần thực nghiệm.

2.1.3 Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp các phơng pháp phổ:

- Dung môi ngâm chiết: Dùng loại tinh khiết

+ CH3OH

- Dung môi sắc kí cột: Là loại tinh khiết phân tích (PA).

+ n- Hexan C6H14 + Clorofom CHCl3

+ Metanol CH3OH + Axeton CH3COCH3

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị:

- Cột sắc ký, ống sinh hàn, bình cầu, ống nghiệm

- Các phơng pháp sắc ký:

+ Sắc ký cột: Sử dụng silicagen 254 (Merck)

+Sắc ký bản mỏng: Dùng bản mỏng tráng sẵn, dùng hơi iot

để hiện vết, hoặc dùng máy phát tia tử ngoại

- Tinh chế các hợp chất bằng kết tinh lại, kết tinh phân đoạn, rửa trong các dung môi khác nhau.

- Các phơng pháp phổ:

+ Phổ khối lợng ESI - MS ( positive, negative) đợc ghi trên máy HP

5989 - MS Viện hoá học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Phổ 1H- NMR đợc đo trên máy BRUKER 500 MHz, dung môi CDCl3

+ Phổ 13C- NMR, DEFT, COSYGP, HSQC, HMBC đợc đo trên máy BRUKER 125 MHz dung môi CDCl3 (Viện Hoá học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

2.2.3 Tách các hợp chất từ cao đặc rễ cây bởi bung

Mẫu đợc lấy về rửa sạch, bảo quản nơi khô ráo Sau đó phơi hong trong điều kiện không có ánh nắng cho đến khô đợc 5kg, sau đó xay vừa phải và ngâm vào 1 bình nút nhám với 10 lít dung môi metanol trong khoảng 30 ngày

(hình 2)

Hình 2.1: Mẫu cây bởi bung ngâm trong dung môi metanol

Thu dịch chiết và cất thu hồi metanol ta thu đợc 300g cao đặc metanol

(hình 3)

Hình 2.2 ảnh dụng cụ cất thu hồi dung môi

II.2.3.3 Tiến hành sắc ký cột cao đặc metanol

Cao metanol đợc trộn với lợng silicagel vừa đủ rồi đảo đều, sau đó lại tiếp

tục cách thuỷ đảo đều tay đến khi khô tạo thành bột mịn

- Cột sắc ký: Cột sắc ký đợc cho 1 lớp bông phía dới, đổ vào 1/3 cột silicagel,

sau đó đổ bột cao mịn khô (cao metanol) vào, rồi tiếp tục đổ 1 lớp silicagel mỏng lên phía trên và cho thêm một lớp bông ở trên cùng,

( hình 4)

Hình 2.3 ảnh cột sắc ký

Cao metanol đợc trộn theo tỷ lệ thích hợp với silicagel (254-Merck) rồi cho vào cột sắc ký đã đợc nhồi bằng pha silicagel Tiến hành sắc ký với các hệ dung môi triển khai theo tỷ lệ thay đổi (bảng 5), lấy lần lợt những thể tích xác định dung dịch chảy ra khỏi cột Cất thu hồi dung môi, dùng axeton hoặc metanol để rửa chất thu đợc còn đọng lại trong bình cầu Tiếp tục sắc ký với các hệ dung môi thích hợp tuỳ vào sự thay đổi màu sắc và chất cất đợc Trong quá trình chạy cột tốc độ chạy đợc khống chế ổn định, không thay đổi trong toàn bộ quá trình chạy cột (120 giọt/phút) Dung môi luôn đợc duy trì

không để khô cột

- Kết quả sắc ký cột cao metanol phần rễ cây bởi bung

Khi chạy với hệ dung môi theo thứ tự thì thấy có sự thay đổi màu trên cột sắc ký : Lớp trên cùng có màu vàng nhạt, lớp thứ hai có màu xanh nhạt, lớp thứ

ba có màu tím đậm và lớp cuối cùng có màu đen rồi nhạt dần

Sau khi tiến hành sắc ký cột cao rễ, chúng tôi thu đợc các phân đoạn từ PHa1 đến PBF 147, thể hiện ở bảng 2

Bảng 2: Số liệu của quá trình chạy sắc ký cột cao rễ bởi bung

dÇn tÝnh ph©n cùc cña hÖ sao cho sau khi hiÖn vÕt, chÊt n»m ë kho¶ng gi÷a cña b¶n máng (h×nh 5).

H×nh 2.4 S¾c ký líp máng

tiÕn hµnh s¾c ký b¶n máng víi c¸c hÖ dung m«i nh b¶ng 3

B¶ng 3: Sè liÖu cña qu¸ tr×nh ch¹y s¾c ký b¶n máng cao rÔ bëi bung

Từ hệ dung môi là clorofom: metanol: nớc = 30:1: 0,05 thu đợc 13 phân

đoạn đợc một chất rắn dạng tinh thể hình kim không màu ở phân đoạn PBC 76 gọi là hợp chất A

Từ hệ dung môi là clorofom: metanol: nớc = 19: 1: 0,05 thu đợc 14 phân

đoạn đợc một chất rắn tinh thể màu trắng ở phân đoan PBD 87 gọi là hợp chất BDới đây là sơ đồ của qui trình ngâm, chiết, tách một số hợp chất từ rễ cây bởi bung (hình 7)

- Ngâm trong metanol

- Chng cất loại metanol

Rễ (5 kg khô)

Cao tổng Metanol (300g)

Clorofom: metanol: níc Clorofom: metanol: níc

•Phổ ESI - MS :

Phổ đợc ghi bằng phơng pháp đa mẫu vào trực tiếp (DIP), phun mù electron (ESI) năng lợng 70 eV

Hình 3.1: Phổ khối lợng negaitive của hợp chất A

+ Phổ khối lợng negative của hợp chất A cho thấy pic phân tử là 354 (M-)

H×nh 3.2: Phæ khèi lîng positive cña hîp chÊt A

+ Phæ khèi lîng positive cña hîp chÊt A cho thÊy pic ph©n tö lµ 356,2 ( M+)

Tõ 2 phæ CI- MS cho ta thÊy hîp chÊt A cã khèi lîng ph©n tö 355

• Phæ 1H- NMR

-Có phổ đồ nh hình 3.3, 3.4

4 pic của 4 H

vòng benzen

multiplet 8 H của 4 nhóm

CH2

H×nh 3.3: Phæ 1 H - NMR cña hîp chÊt A (0-10ppm)

H×nh 3.4: Phæ 1 H - NMR cña hîp chÊt A (2,6- 4,2ppm)