Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất của cây nhãn chày (dasymaschalon rostratum merr & chun) thuộc họ na (annonaceae) ở hà tĩnh

Các nghiên cứu về hoá thực vật một số loài thuộc chi Dasymaschalon Annonaceae.... các loại thuốc đang được lưu hành hiện nay hoặc đang trong giai đoạn thửnghiệm đều có nguồn gốc từ các h

Bộ giáo dục và đào tạo Trờng Đại học Vinh

= = =    = = =

Nguyễn Mạnh Tuấn

Tách và xác định cấu trúc một số hợp chất của cây nh n chàyãn chày

(Dasymaschalon rostratum Merr et Chun) thuộc họ Na

* Các phương pháp sắc ký:

CC : Column Chromatography (sắc ký cột)

TLC : Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng)

* Các phương pháp phổ :

MS : Mass Spectroscopy (phổ khối lượng)

EI - MS : Electron Impact Mass Spectroscopy (phổ khối va chạmelectron)

1H - MNR : Proton Magnetic Resonance Spectronscopy(phổ cộng hưởng

từ hạt nhân )

13C- NMR : carbon Magnetic Resonance Spectronscopy (phổ cộng hưởng

từ hạt nhân cacbon - 13 )

DEPT : Distotionless Enhancement by polarisaton Transfer

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương quan đalượng tử )

HMBC : : Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương quan dịhạt nhân qua nhiều liên kết )

NOESY : Nulear Overhauser and Exchange Spectroscopy

COSY : Correlated Spectroscopy

Mở đầu …… ……… ……… 1

1 Lý do chọn đề tài ……… ……… ……… 1

2 Nhiệm vụ nghiên cứu……… ……… ……… 2

3 Đối tợng nghiên cứu ……… ……… ……… 2

Chơng 1 Tổng quan về họ Na (Annonaceae) 3

1.1 Họ Na (Annonaceae) 3

1.2 Sơ lợc về chi Dasymaschalon họ Na 6

1.2.1 Đặc điểm thực vật của các loài thuộc chi Dasymaschalon (Annonaceae) 7

1.2.2 Các nghiên cứu về hoá thực vật một số loài thuộc chi Dasymaschalon (Annonaceae) 9

1.3 Cây nhãn chày (Dasymaschalon rostratum Merr et Chun) 14

1.3.1 Thực vật học

1.3.2 Thành phần hoá học

15 17 Chơng 2 Phơng pháp nghiên cứu 25

2.1 Phơng pháp lấy và xử lí mẫu 25

2.2 Phơng pháp phân lập các hợp chất 25

2.3 Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 25

Chơng 3 Thực nghiệm 26

3.1 Hoá chất và thiết bị 26

3.1.1 Hoá chất 26

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị

3.2 Nghiên cứu tách hợp chất từ thân cây nhãn chày

Chơng 4 Kết quả và thảo luận

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất A

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất B

4.2.1 Phổ EI - MS của hợp chất B

26 27 30 30 30 31 4.2.2 Phổ 1H - NMR của hợp chất B

4.2.3 Phổ 13C - NMR của hợp chất B

4.2.4 Phổ DEPT của hợp chất B

4.2.5 Phổ COSYGP của hợp chất B

4.2.6 Phổ HMBC của hợp chất B

4.2.7 Phổ HSQC của hợp chất B

4.3 Xác định cấu trúc của hợp chất C

4.3.1 Phổ EI - MS của hợp chất C

4.3.2 Phổ khối lợng của hợp chất C

4.3.3 Phổ 1H - NMR của hợp chất C

4.3.4 Phổ 13C - NMR của hợp chất C

4.3.5 Phổ DEPT của hợp chất C

4.3.6 Phổ COSYGP của hợp chất C

36 33

38 40 43 48 54 54 55 57 60 63

Với nguồn thảo dược đóng vai trò rất quan trọng với 10884 loài thuộc

2257 chi và 305 họ trong đó khoảng 1850 loài cây phân bố trong 244 họ thựcvật khác nhau Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật học Việt Nam cótrên 10.000 loài trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong y họcdân tộc và 600 loài cây cho tinh dầu Đó là nguồn nguyên liệu trực tiếp hoặcnhững chất dẫn đường để tìm kiếm các loại biệt dược mới Có khoảng 60%

67697576

các loại thuốc đang được lưu hành hiện nay hoặc đang trong giai đoạn thửnghiệm đều có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [11].

Họ Na (Annonaceae) là họ lớn nhất của bộ Mộc Lan (Magnoliales) còn

được gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật có hoa bao gồm các loại cây thân

gỗ, cây bụi hay dây leo Với khoảng 2.300 đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi,đây là họ lớn nhất của bộ Mộc lan (Magnoliales) Các chi điển hình của họ

này là Annona (na, mãng cầu xiêm), Goniothalamus (dẻ, lan tây) Họ này sinh

trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ônđới Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, và các loàikhác ở châu Á

Bên cạnh đó, một số loài như hoàng lan (Cananga odorata) còn chứa

tinh dầu thơm và được sử dụng trong sản xuất nước hoa hay đồ gia vị, thuốc chữa bệnh như nhiễm trùng, bệnh gan, tiêu chảy… Các loài cây thân gỗ còndùng làm củi

Chính vì vậy mà chúng tôi chọn đề tài: “Tách và xác định cấu trúc

một số hợp chất của cây nhãn chày (Dasymaschalon rostratum Merr et

Chun) thuộc họ Na (Annonaceae) ở Hà Tĩnh ”

2 Nhiệm vụ nghiên cứu:

Trong luận văn này, chúng tôi có nhiệm vụ sau:

2.1 Chiết chọn lọc với các loại dung môi thích hợp để thu được hỗn

hợp các hợp chất từ thân cây nhãn chày (Dasymaschalon rostratum Merr.et

Chun)

2.2 Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất từ thân cây nhãn chày

3 Đối tượng nghiên cứu:

Dịch chiết phần thân cây nhãn chày (Dasymaschalon rostratum Merr.

et Chun) thuộc họ Na (Annonaceae).

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN VỀ HỌ NA (ANNONACEAE)

1.1 Họ Na (Annonaceae)

Họ Na (Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật

đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của bộ Mộc lan

này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ởvùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung và Nam Mỹ, 450 loài ở châu Phi, vàcác loài khác ở châu Á [11]

Trong họ Na hầu như gặp tất cả các dạng sống chủ yếu, chỉ trừ các câythân cỏ và các dạng sống phụ sinh và ký sinh Trong số các cây mọc đứng,thường gặp các cây gỗ nhỏ, hiếm khi là cây bụi rất nhỏ hoặc ngược lại, lá cáccây thân gỗ lớn [1]

Trong số các chi có ở châu Á, dạng dây leo thân gỗ hoặc cây bụi tr ờn

đ-ợc đặc trng cho các chi Anomianthus, Artabotrys, Cyanthostemma, Desmos,

Fissistigma, Friesodielsia, Melodorum, Mitrella, Uvaria [1].

Lá của tất cả các loài họ Na không có lá kèm, mọc cách, đơn, nguyên,mép lá nguyên, với gân lông chim (hiếm khi là lông chân vịt) Gân chính nổi

rõ ở mặt dới và thờng lõm ở mặt trên, nhng ở các chi Artabotrys, Cyathocalyx,

Stelechocarpus, gân chính lại lỗi rõ ở hai mặt.

Hoa ở họ Na thờng là lỡng tính, hiếm khi hoa đơn tính (Stelechocarpus,

Pseuduvaria), hoặc có khi hoa tạp tính; hoa mọc đơn độc hoặc họp thành các

dạng cụm hoa khác nhau, ở nách lá hoặc ở ngoài nách lá, ở đỉnh cành hoặchoa mọc trên thân già không lá

Trong họ Na có hai kiểu nhị chính Kiểu thứ nhất đợc gọi là "kiểu

Uvarioid"; trong kiểu này, trung đới khá dày và dài vợt quá bao phấn để tạo

thành mào trung đới Kiểu thứ hai là "kiểu Millusiod" có trung đới mỏng và

hẹp, khiến cho bao phấn lồi lên so với trung đới

Phần lớn các loài họ Na có bộ nhụy gồm các lá noãn rời Từ đó thấy cơ quan sinh sản cái gồm những lá noãn riêng biệt Mỗi lá noãn đợc chia thành bầu, vòi nhụy và núm nhụy Sau khi thụ phấn mỗi lá noãn tạo thành một quả riêng

B ng 1: Cỏc chi trong h Naảng 1: Cỏc chi trong họ Na ọ Na

Greenwayodendron Guamia Guatteria Guatteriella

Các chi khác với tên gọi thông thường:

 Artabotrys - dây công chúa hay dây móng rồng

 Cananga - hoàng lan hay ngọc lan hoặc ylang ylang

 Deeringothamnus - giả đu đủ Mỹ

 Guatteria - haya minga, haya blanca

 Oxandra - blacklancewood, haya

 Rollinia - na dại

 Stelechocarpus - kepel

1.2 S¬ lîc vÒ chi Dasymaschalon hä Na

Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân [2] đặc điểm thực vật của chi

Dasymaschalon (Hook f & Thoms ) Dalla Torre & Harms - mao quả, dất

mèo là các cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, lá có gân bên nổi rõ ở mặt d ới Hoa lỡngtính, mọc đơn độc Phân quả hình trụ, dạng tràng hạt, thờng thắt eo thành các

đốt hình cầu, hình trứng hoặc thuôn Có khoảng 15 loài, phân bố ở Nam và

Đông Nam Á, ở Việt Nam có 7 loài:

1 D robinsonii Ast - mao quả robinson

2 D evrardii Ast - mao quả evrard

3 D lomentaceum Fin & Gagnep - ngẵng chày

4 D tueanum Ban - mao quả đắc lắc

5 D macrocalyx Fin & Gagnep - dất mèo

6 D rostratum Merr & Chun - chuối chác đẻ, mao quả cú mỏ

7 D sootepense Craib - mao quả trụ.

Theo tài liệu [12] thì chi này có đến 23 loài:

D blumei D evrardii D macrocalyx D sootepense

D borneense D filipes D moniliferum D tibetense

D cleistogamum D glaucum D oblongatum D trichophorum

D clusiflorum D hirsutum D robinsonii D tueanum

D coelophloeum D lomentaceum D rostratum D yunnanense

D ellipticum D longiflorum D scandens

1.2.1 Đặc điểm thực vật của các loài thuộc chi Dasymaschalon

(Annonaceae)

* D evrardii Ast - mao quả evrard

- Bụi thập; nhỏnh sà, lỳc non cú lụng Lỏ cú phiến nhỏ, dài 6 - 8cm,

khụng lụng, trụng giống lỏ Litsea cubeba, nõu ở măt trờn, mốc ở mặt dưới,

gân mịn, rõ, vào 10 cặp, cuống 1-2 mm Cọng như chỉ, dài 3-4 cm, có tiềndiệp ở 1/3 dưới; lá đài 3, không lông; cánh hoa 3, cao 1cm, không lông; tiểunhuy nhiều; tâm bì 4 mà thôi Trái do 1-2 đốt tròn, không lông.

- Phân bố: Phan Thiết

* D lomentaceum Fin & Gagnep - ng½ng chµy, mao quả có ngấn.

- Bụi cao 3 m; nhánh đen đen Lá có phiến bầu dục hẹp, mốc ở mặtdưới; cuống ngắn Hoa ở nách lá ở chót nhánh; lá đài 3, nhỏ; cánh hoa 3 thon,dính nhau ở đáy, tâm bì có lông Trái nâu, hình chuỗi, có lông; hột 1-5, láng;trắng có sọc nâu

- Phân bố: Dựa sông Đồng

* D macrocalyx Fin và Gagn - mao quả đài to, Dất mèo, Dây vú trâu.

- Bụi cao 1-2m, cành mảnh mọc trườn, dọc thân có vết màu nâu sáng, cólông mềm màu trắng rồi nhẵn Lá có phiến thuôn, hơi hình tim ở gốc, thonnhọn ở đầu, mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông màu tro, dài 12cm, rộng 4cm;cuống lá có lông, dài 4-6mm Hoa ở ngọn, đơn độc, lá đài 3, nhọn; cánh hoa

3, cao 2cm, có lông ở mặt ngoài; nhị nhiều, cùng rụng với cánh hoa; lá noãnrộng 6mm, hình nón, có lông, chứa 2-3 noãn Quả dạng tràng hạt, có các đốthình cầu, có lông trăng trắng; hạt 1-3, to 5-6mm, màu vàng, bóng

Ra hoa tháng 3, có quả tháng 4 trở đi

Đồng bào dân tộc vùng núi Đại từ tỉnh Bắc Thái dùng thân cây đun nướcđặc tắm chữa đau lưng, nhức xương và đau thấp khớp

Loài của Nam Trung Quốc, Việt Nam và Campuchia Ở nước ta, cây mọc ởbìa rừng, chân núi đá hay núi đất từ Lạng Sơn, Bắc Thái, Vĩnh Phú cho tớiĐồng Nai, Tây Ninh các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, cũng phân bố ở CônĐảo

* D Robinsonii Ast- mao quả Robinson

- Cây bụi cao 2 m; nhánh non lún phún lông hoe dài Lá có phiến khônglông, gân- phụ 7-9 cặp Hoa to ở chót nhánh, trên cọng ngắn, có 1 tiền diệp; láđài 3, nhỏ; cánh hoa 3, dài đến 2,5 cm; tiểu nhụy nhiều; tâm bì 11 Trái hìnhchuỗi, 4-5 hột.

- Phân bố: Nha Trang, Khánh Hoà, Phan Rang

* D rostratum Merr và Chun- maoquả có mỏ, chuối chác đẻ

- Cây bụi đứng hay trườn; nhánh nâu hay đen đen Lá có phiến to 20 x 6 cm,mặt dưới mốc mốc, có lông nằm, gân- phụ 10-13 cm; cuống 7-8 mm Hoa côđộc ở nách lá, cọng 1-2 cm; lá đài nhỏ; cánh hoa 3, dài 3-5 cm, có lông mịn;tiểu nhụy và tâm bì nhiều Trái hình chuỗi, hột 1-4

- Phân bố: rừng luôn luôn xanh: từ Hoàng Liên Sơn, Lào Cai, đến TrảngBom

* D sootopensis Craib - mao quả Lào, mao qu¶ trô.

- Cây bụi cao đến 7,5 m; nhánh mảnh, không lông Lá có phiến thon, nhọn,dài đến 20 cm, mặt dưới mốc mốc, gân phụ 9-10 cặp, lồi ở mặt dưới, cuống 7-

8 mm Cọng dài 1,5-3 cm ở nách lá ngọn hay ngoài nách; hoa to, cao 3 cm, cólông; lá đài cao 3 mm; cánh hoa 6, hẹp; tiểu nhụy nhiều; tâm bì 8, có lônghoe; noãn 7, một hàng Trái có lông mịn nằm, đốt dài đến 2 cm; hột màu lợt,dài 1,8 cm

- Phân bố: Trung bộ

* D tueanum- mao quả đắc lắc

Cây bụi, cao khoảng 1.8m có măt ở các vùng thuộc các nước Đông Nam Á

và một số nước Châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ…

1.2.2 Các nghiên cứu về hóa thực vật một số loài thuộc chi Dasymaschalon

( Annonaceae)

Húa học thực vật của chi Dasymaschalon khỏ đa dạng và phong phỳ, cú rất

nhiều loại hợp chất cú ứng dụng thực tiễn trong nghiờn cứu và y học Hiệnnay, đang được cỏc nhà khoa học quan tõm nghiờn cứu

Nghiên cứu hóa thực vật loài Dasymaschalon sootepense Craib – mao quả

trụ hoặc mao quả Lào:

Năm 1997 khi nghiên cứu hóa thực vật của loài Dasymaschalon

sootepense Craib, Andrea Sinz và cộng sự [4] đã phân lập đợc hai hợp chất

flavonoit glucosit mới là quercetin 3,7-dimetyl ete

3’-O--L-ramnopyranosyl-ramnopyranosyl-(12)- -L- ramnopyranosyl-(16)- β-D-glucopyranosit (2)

từ dịch chiết MeOH của lá Chất (1) là tinh thể không màu, nhiệt độ nóng

H3CO

OH O

OH OH

CH3

OCH 3

1''' 2''

3'

(1)

O

O OCH3

H3CO

OH O

OH OH

CH3

OCH3

1''' 2''

3'

(2)

O

OH OH OH

CH36''

1'''' OH

OH

Ngoài ra họ cũn phõn lập được một số ankaloit từ dịch chiết trờn, chỳng

gồm : (-) - dicentrin (3), Dasymaschalin (4), (-) - N - metyllaurotetanin (5).

Bằng phương phỏp sắc kớ khớ ghộp nối khối phổ (GC - MS) cỏc tỏc giả đó

phỏt hiện thờm một số ankaloit ở dạng vết như N - nornuciferin (6), norlaurelin (7), sinactin (8), xylopinin (9), và caseadin (10):

NH H OH

H3CO

H3CO N

(10)

Từ dịch chiết n-Hexan của lá cây này Andrea Sinz và cộng sự [14] cũng

phân lập đợc bốn hợp chất acetogenin là sootepensin A (11), sootepensin B (12), tonkinin C (13) và tonkinesin C (14), trong đó 11 và 12 là hai chất mới

Tất cả bốn chất này đều có hoạt tính đối với dòng tế bào ung th L1210

(11)

17

Theo một nghiên cứu khác, sootepenseone (15) (hay isobactatin) một

hợp chất xanthon đã đợc phân lập [22], chất này cũng đợc tách ra từ cây Đằng

hoàng đài hoa lớn ( Garcinia bracteata – Clusiaseae họ Bứa) thu hái ở Hòa

Bình- Việt Nam và đợc thử hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng KB cho giátrị IC50 là 1,2 g/ml [15]

O OH

(15)

Khi nghiên cứu hoá thực vật cây Dasymaschalon trichophorum Yong

-Long và các cộng sự đã phân lập được một hợp chất falavom mới :

dasytrichone (16) có khả năng ngừa ung thư

O O

O OH

(16)

1.3 Cây nhãn chày (Dasymaschalon rostratum Merr & Chun)

Cây nhãn chày còn gọi là cây chuối chác đẻ, cây mao quả có mỏ Tên

khoa học: Dasymaschalon rostratum (Merr & Chun) thuộc họ Na

(Annonaceae)

1.3.1.Thực vật học

Hiện nay, cây nhãn chày chưa biết rõ về nguồn gốc Cây được trồng hoặcmọc hoang dại ở hầu hết các nước Đông Nam Á nhất là các nước Lào, TháiLan, Camphuchia, Việt Nam Ngoài ra người ta tìm thấy cây Nhãn Chày có mặt

ở Trung Quốc, Ấn Độ… Ở Việt Nam, Cây Nhãn Chày có rải rác ở các tỉnhthuộc vùng núi và trung du Các tỉnh có nhiều Cây Nhãn Chày là Lào Cai,Lạng Sơn, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, các tỉnh thuộc đồng bằng sông CửuLong (gặp nhiều ở Long An)

Cây bụi đứng hay trườn, nhánh nâu hay đen đen, có chấm trắng, có nhiềumấu sần sùi Lá mọc so le, có phiến to 20×60cm, mặt dưới mốc mốc có lôngnằm, gốc trong, đầu nhọn, gân phụ 10 - 13 đôi, nổi rõ ở mặt dưới, cuống lá dài

7 - 8 cm, đài nhỏ, cánh hoa 3, dài 3 - 5 cm, có lông mịn, nhị và lá noãn nhiều.Quả hình chuỗi hạt, khi chín có màu đỏ, có nhiều ngăn, mỗi ngăn 1- 4 hạt Hoathường có vào tháng 5 và tháng 7, quả chín vào tháng 12 Thu hái rễ, lá quanhnăm và phơi khô trước khi sử dụng

Theo kinh nghiệm dân gian thì rễ và lá của cây nhón chày đợc dùng làmthuốc thông huyết, chữa tê mỏi nhức xơng, phù thũng, chữa đái dắt, đái són vàcũng đợc dùng để giải độc mã tiền [10].

Cây nhón chày ( Dasymaschalon rostratum Merr & Chun.) đợc thu hái

ở huyện Hơng Sơn, tỉnh Hà Tĩnh, tháng 12 năm 2004 Dới đây là hình ảnh lá

và hoa của cây nhón chày:

1.3.2 Thành phần hóa học

Năm 2001, LD Zhou và các cộng sự đã phân lập được ba hợp chất flavonoit:

Lawinal (17), unonal (18), isounonal (19) và một oxoapocphinoit ankaloit 7 oxodehydroasimilobin (20) từ thân cây của cây nhãn chày.

epicatechin (34), dicentrin (35), (4-hydroxy-Z-cinnamoyl)-tyramin (36),

N-(3,4-dihydroxy-Z-cinnamoyl)-tyramin (37), Aristolactam AII (39) [8,

9,10,11,12]

Trong đó dasyrostraton (28) một flavonoit mới đợc phân lập lần đầu

tiên từ thiên nhiên, chất này là sản phẩm phụ thu đợc trong quá trình tổng hợptoàn phần desmosdumotin C đi từ 2,4,6-trihydroxyacetophenone Ngoài ra, hai

ancaloit mới thu đợc từ cây này là dasymaschalonin (29), discretin N-oxit (30)

và một hợp chất cyclopeptit mới là dasymacyclopeptide (25) Ngoài ra dasymaschalonin (29) và discretin N-oxit (30) là hai ancaloit mới phân lập từ

dịch chiết CH2Cl2 từ thân của cây này

OH Me

H3C

(22)

O

CH3HO

O

O

O O

N

NH

H N

OH

(36)

NH O

MeO HO

(39)

N H O

HO

OH

(37)

HO

Từ lá của cây này đã phân lập đợc β-sitosterol glucosit, desmosdumotin

B (22), demethoxymatteucinol (23), oroxylin A (26),N-trans-feruloyltyramin (38), quercetin 3,7-dimetyl ete 3’-O--L-ramnopyranosyl-(12)- -L- ramnopyranosyl-(16)- β-D-glucopyranosit (2), kuafumin (40), lanuginosin

(41).

N H O

Các hợp chất phân lập đợc đem thử hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tếbào KB ( ung th màng tim) và hoạt tính chống sốt rét với loại kí sinh trùng

Plasmodium falciparum Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính

chống sốt rét đợc đa ra ở Bảng1, desmosdumotin C (21) và demethoxymatteucinol (23) có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng KB ( giá

trị IC50 tơng ứng là 6,5 và 5,5 g/ml), oroxylin A (26) biểu thị hoạt tính đáng

kể đối với P Falciparum (IC50 là 1,3 g/ml) trong khi đó nó biểu hiện hoạttính yếu đối với dòng tế bào KB, còn lại các hợp chất khác thể hiện hoạt tính

yếu đối với cả hai dòng KB và P Falciparum.

Bảng 2: Hoạt tính gây độc tế bào và chống sốt rét của một số hợp chất (IC50, g/ml)

HO

O

OMe OMe

HO

OMe OMe

MeO

N

OMe OMe

HO

MeO

O NH

17 18

O O

Desmosdumotin C (49)

CHƯƠNG 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp lấy và xử lý mẫu

Mẫu được thu hồi vào ngày 24/11/2008 tại Hương Sơn – Hà Tĩnh, gồmphần thân và rễ Mẫu tươi sau khi thu về được cắt nhỏ, phơi khô tự nhiên ởnơi thoáng mát

Khi mẫu đã khô, tiến hành nghiền và ngâm mẫu với dung môi metanoltinh khiết

Mẫu được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môithích hợp để thu được hỗn hợp các chất dùng cho nghiên cứu được trình bày ởphần thực ngiệm

 Các phương pháp kết tinh phân đoạn

2.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất được xác định nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:

 Phương pháp khối phổ

 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H - NMR

 Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13C – NMR

 Phương pháp DEPT

 Phổ hai chiều DMSO – COSYGP

 Phổ hai chiều DMSO – HSQC

 Phổ hai chiều DMSO – HMBC

Dung môi ngâm chiết:

Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254nm

Tinh chế các hợp chất bằng kết tinh phân đoạn, rửa trong các dung môikhác nhau

- Các phương pháp phổ:

Phổ khối lượng EI – MS (positive, negative) được ghi trên máy HP5989B – MS

Viện Hóa học – Viện Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia.Năng lượng bắn phá ở 70eV.

Phổ 1H –NMR được đo trên máy BRUKER 500 MHz, dung môiCDCl3.

Phổ 13C – NMR, DEPT, COSYGP, HSQC, HMBC được đo trên máyBRUKER 125 MHz dung môi CDCl3 (Viện Hóa học – Viện Khoa học Tựnhiên và Công nghệ Quốc gia)

3.2 Nghiên cứu tách hợp chất từ thân cây nhãn chày

Mẫu thân cây nhãn chày được lấy ở Hà Tĩnh vào ngày 24 tháng 11 năm

2008, được định danh bởi TS Nguyễn Quốc Bình – Viện sinh thái và Tàinguyên sinh học Việt Nam

Thân được rửa sạch, phơi khô nhẹ trong bóng râm, tán nhỏ, ngâm vớimetanol khoảng 30 ngày Cất thu hồi dung môi được cao metanol

Chiết lần lượt cao metanol với dung môi có độ phân cực tăng dần Hexan, clorofom, etylaxetat, metanol thu hồi các cao tương ứng

Cao n – Hexan được phân tích bằng sắc ký cột:

Th©n c©y ( 12 Kg kh« )

Cao Metanol (400g)

Cao n - Hexan (125g)

Cao Etylaxetat (103g)

DÞch n íc

- ng©m trong metanol

- Ch ng cÊt lo¹i metanol

ChiÕt lÇn l ît víi c¸c dung m«i sau:

Sơ đồ 1: Quá trình ngâm, chiết, tách hợp chất từ thân cây nhãn Chày

Mẫu thân c©y (17 kg) được cắt nhỏ, phơi khô sau đó đem nghiền nhỏ (8kg), ngâm với metanol ở nhiệt độ phòng Cất thu hồi dung môi được cao tổng(900 g).Phân bố trong nước, chiết lần lượt với n - Hexan, etyl axetat,clorofom, dịch nước và metanol cất thu hồi dung môi được các cao tươngứng là: 125g, 103 g, 67 g, 89 g

Cao n-Hexan được phân tách trên cột silicagen, với hệ dung môi rửa giải:clorofom: metanol Thu được 11 phân đoạn Phân đoạn 36 - 49 - 67 thu chấtrắn màu trắng Tinh chế và kết tinh lại nhiều lần bằng clorofom và metanol

thu được 3 chất A, B và C

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất A

Bằng các phương pháp: kết tinh phân đoạn, kết tinh lại, hòa tan nóng, đểkết tinh lạnh, gạn tinh thể ra khỏi dung dịch nghiên cứu và làm khô tinh thể, tathu được chất rắn Lấy chất rắn thu được hòa tan vào metanol nóng dùng sắc kýbản mỏng chấm so sánh với chất chuẩn- sitosterol, thì thấy hai chấm tròngiống nhau ở hai vị trí giống nhau Thử lại nhiều lần với nhiều hệ dung môikhác nhau đều cho ta kết quả như trên Do chất- sitosterol đã phát hiện ởnhiều cây khác nhau, đây là một chất phổ biến có ở nhiều cây nên chúng tôikhông tiếp tục nghiên cứu cấu trúc của nó nữa

Công thức cấu tạo của - sitosterol là:

HO

H

H

H H

4.2 Xác định cấu trúc hợp chất B

Chất B là một chất rắn màu trắng, tan tốt trong nước, có nhiệt độ nóngchảy là 316- 318oC Phần trăm các nguyên tố trong phân tử: C 78.90%; H

4.2.1 Phổ EI – MS của hîp chất B

Phổ khối lượng phun mù electron (ESI - MS) negtive [M+H]+ cho pic 457,positive cho pic [M-H]+ 455, hợp chất B có khối lượng phân tử 456, ứng vớicông thức C30H48O3

Từ phổ Phổ 1 H-NMR có 6 tín hiệu tại  = 1.58; 0.84; 0.72; 0.85; 0.64;0.87 (ppm) cho biết trong phân tử có 18 nguyên tử H của 6 nhóm –CH3 Có

11 tín hiệu ở  = 1.84 & 1.47; 1.30 &1.84; 4.61 & 4.49; 0.93 & 1.60; 1.17 &1.32; 0.79 & 1.58; 1.31 & 1.41; 1.32 & 1.31; 1.07 & 1.46; 1.3 & 2.14 (ppm),cho biết có 22 nguyên tử H ở 11 nhóm -CH2 Mặt khác tín hiệu tại  = 1.47;2.90; 2.14; 1.19; 0.57 cho biết có 5 nguyên tử H ở 5 nhóm – CH Tín hiệu tại

 = 10  12 (ppm) cho biết trong phân tử có 1 nguyên tử H của nhóm COOH

và tín hiệu tại=3.06 cho biết trong phân tử có 1 nguyên tử H của nhóm –CHliên kết với –OH Như vậy, dựa vào phổ 1

H NMR ta thấy hợp chất C có 48

nguyên tử H

Từ bộ phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất B có 30 nguyên tử C ở các pic là

 =178.8; 56.1; 37.0; 30.4; 48.7; 150.5;109.2; 19.0; 46.8; 38.2; 25.4; 25.7;50.4;36.9; 15.8; 38.6; 26.8; 78.7; 40.5; 15.7; 27.7; 55.3; 18.1; 34.2; 42.3; 15.1;48.2;14.4; 29.5; 32.1(ppm)

Từ DEPT 90 có 6 pic cho ta biết hợp chất có 6 nhóm –CH ứng với C10 ở38.2; C9 ở 46.8; C5 ở 48.9; C13 ở 50.4; C22 ở 55.3; C18 ở 78.7

Số nguyên tử C không liên kết với nguyên tử H bằng 7 tương ứng với cácvạch ở  = 178.8; 56.1; 150.5; 36.9; 40.5; 34.2; 48.2 ppm Trong đó có một Cliên kết với O dạng C = O ở pic  = 178.8 (ppm), còn lại là 6 nguyên tử cacbonbậc IV

Từ DEPT 135 có 12 pic gồm các nhóm –CH và -CH3 kêt hợp với DEPT

90 ở trên ta có 6 nhóm –CH3 tương ứng gồm C28 ở 14.4; C26 ở 15.1; C20 ở 15.7;

C15 ở 15.8; C8 ở 19.0; C21 ở 27.7 DEPT 135 cho biết có 11 pic chỉ ra 11 nhóm –CH2tương ứng C23 ở 18.1; C12 ở 20.7; C11 ở 25.4; C17 ở 26.8; C29 ở 29.5; C4 ở 30.4;

C30 ở 32.1; C24 ở 34.2; C3 ở 37.0; C16 ở 38.6; C7 ở 109.2

Vậy chất B có 30 nguyên tử cacbon, có các nhóm 9(6 nhóm –CH; 6 nhóm–CH3; 11 nhóm CH2; 7 C không có hidro, trong đó có 1 nhóm C = O)

Hình 1 : phổ khối lượng của hîp chất B

4.2.2 Phổ 1 H-NMR của hợp chất B

Hình 2 : Phổ 1H - NMR của hợp chất B (0- 8 ppm)

Hình 3 : phổ 1H - NMR của hợp chất B (1.2 - 2.2 ppm)

Hình 4 : Phổ 1H - NMR của hợp chất B (3.0 - 4.6 ppm)

4.2.3 Phổ 13 C-NMR của hợp chất B