Góp phần nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

Trờng Đại Học Vinh Khoa Sinh HọcGóp phần hoàn tiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền – gerbera bằng công gerbera bằng công nghệ nuôi cấy mô invitro Luận văn tốt nghiệp đại họcNg

Trờng Đại Học Vinh Khoa Sinh Học

Góp phần hoàn tiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền – gerbera bằng công gerbera bằng công

nghệ nuôi cấy mô invitro

Luận văn tốt nghiệp đại họcNgành cử nhân s phạm sinh học

Ngời hớng dẫn: Th.S Mai Văn Chung

Vinh , 2006

Lời cảm ơn

Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi xin chân

thành cảm ơn sự chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của Thầy giáo, Th.S Mai Văn

Chung, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào, những ý kiến đóng góp quý báu của

các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Sinh lý- Sinh hoá thực vật, sự tạo điềukiện và ủng hộ của khoa, của các cán bộ phòng thí nghiệmNuôi cấy mô, tếbào thực vật và sự giúp đỡ, cung cấp t liệu, mẫu vật của nhân dân huyệnNghĩa Đàn

Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi nhữngthiếu sót, rất mong nhận đợc ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để

đề tài nghiên cứu khoa học của tôi đợc hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn.

Tác giả

Những chữ cái viết tắt sử dụng trong luận văn

NCM - TB : Nuôi cấy mô - tế bào

CNSH : Công nghệ sinh học

IAA : Axit - indol axetic

NAA : Axxit - naphtyl axetic

Mở đầu

Lý do chọn đề tài

Ngày nay, sử dụng hoa trong sinh hoạt và công tác hàng ngày đã trởthành một thói quan tót,tạo nên một nét văn hoá mới trong thởng ngoạn, giảitrí cũng nh trong tiêu dùng Hoa đã trở nên quen thuộc và cần thiết trongcuộc sống hàng ngày của mỗi con ngời.Để có thể đáp ứng đợc nhu cầu tiêuthụ hoa ngày càng tăng, nhiều giống hoa, loại hoa mới, có giá trị thẩm mĩ,giá trị kinh tế và giá trị văn hoá đợc đa vào sản xuất trên quy mô lớn, dùngnhiều phơng thức tạo giống khác nhau, trong đó, Nuôi cấy mô - tế bào thựcvật invitro đợc đánh giá là một phơng pháp tiên tiến, u việt

Trong các loại hoa đợc a chuộng trên thế giới hiện nay, Đồngtiền(gerbera) đợc coi là một trong 10 loài hoa đẹp nhất, chỉ xếp sau hoahồng, lay ơn, cúc, cẩm chớng Đồng tiền là loại hoa có nhiều u điểm nổi bật:hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa đẹp, chonăng suất cao, nên đang ngày càng đợc ngời tiêu dùng a chuộng Song mộtkhó khăn trong sản xuất hoa đồng tiền hiện nay là nguồn giống cây cung cấpcho quá trình trồng trọt chủ yếu là cây tách thân, mặc dù sinh trởng mạnhtrong giai đoạn đầu nhng sau đó cây sinh trởng chậm, nhanh già cỗi, do đónăng suất thấp, chất lợng và sản lợng hoa không cao, không ổn định Bêncạnh đó,bằng phơng pháp tách thân, số lợng cây giống mỗi lần tạo ra làkhông nhiều,do đó không đủ đáp ứng nhu cầu của thị trờng sản xuất.[ ]

Phơng pháp nhân giống vô tính invitro đã bổ sung cho kĩ thuật tạo câygiống bằng cách tách thân trong sản xuất hoa đồng tiền và đang ngày càng đ-

ợc chú ý phát triển bởi kỹ thuật nhân giống vô tính invitro cho phép sản xuấtnhững cây giống đòng tiền khoẻ mạnh, sạch bệnh, có đọ đồng đều cao vachất lợng tốt Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nhân

giống vô tính các loại hoa đa đợc công bố và ứng dụng.[ ].Tuy nhiên việctiếp tục hoàn thiện cũng nh đề xuất những quy trình kỹ thuật mới cho cácgiống hoa vẫn thực sự cần thiết Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn đó,chúng tôi thực hiện đề tài “Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa

đồng tiền - gerbera bằng công nghệ nuôi cấy mô - invitro”

Mục đích của đề tài là áp dụng cơ sở khoa học của công nghệ vi nhângiống để nhân nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh của cây,nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiền này,Nội dung của đề tài là nghiên cứu tim ra các điều kiện nuôi cấy invitrothích hợp trong các giai đoạn xử lý mẫu, nhân chồi invitro, ra rễ, tạo câyhoàn chỉnh, huấn luyện thích nghi,…từ đó đề xuất một quy trình nhân giốngtừ đó đề xuất một quy trình nhân giốnghoàn thiện đối với hoa đồng tiền

CHƯƠNG I: tổng quan tài liệu

1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô invitro[ ].

1.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Theo Habertland, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật nào cũng đềumang toàn bộ lợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó Khigặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thểhoàn chỉnh

Tính toàn năng của tế bào mà Habertland đa ra chính là cơ sở lý luậncủa Nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay con ngời đã hoàn toànchứng minh đợc khả năng tái sinh mọt cơ thể thực vật từ một tế bào riêng rẽ.Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật invitrothực chất là kết quả của sự phân hoá và phản phân hoá tế bào[]

1.1.2 Phân hoá và phản phân hoá tế bào

Tất cả các loại tế bào trong một cơ thể sinh vật đều bắt nguồn t một tếbào phôi sinh, từ tế bào phôi sinh này sẽ chuyển thành tế bào của các môchuyên hoá đảm nhận các chức năng khác nhau Đó gọi là sơ phân hoá tếbào

Tuy nhiên trong trờng hợp cần thiết ở diều kiện nhất định, các tế bàocủa các mô chuyên hoá lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại có khảnăng phân chia mạnh mẽ Quá trình này đợc gọi là phản phân hoá tế bào.[]

1.1.3 Môi trờng nuôi cấy [ ]

Môi trờng nuôi cấy là một trong những điều kiện đặc biệt cần thiết ,quyết định đến sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy Môi trờng nuôi cấyphải có đầy đủ các chất dinh dỡng cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tếbào cũng nh hco quá trình sinh trởng bình thờng của cây

Thành phần của môi trờng nuôi cấy thay đổi tuỳ đối tợng nuôi cấy, bộphận nuôi cấy, ngoài ra còn tuỳ thuộc giai đoạn phát triển của cây và mục

đích nuôi cấy: tạo rễ, tạo mầm, tái sinh hay muốn giữ trạng thái mô sẹo.Tuy nhiên tất cả các môi trờng nuôi cấy bao giờ cũng có các thành phần:

_ Nguồn carbon (thờng là đờng)

_ Khoáng đa lợng

_ Khoáng vi lợng

_ Vitamin

_ Chất điều tiết sinh trởng

Có thể bổ sung thêm một số hợp chất : axit amin, EDTA, nớc dừa hay dịchchiết nấm men,

a Đờng

Đờng là nguồn cung cấp carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên cácchất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô nuôi cấy nhân tạo.Các loại đờng thờng dùng là saccaroze va glucoze nhng saccaroze đợc dùng

phổ biến hơn Nồng độ đờng có thể thay đổi từ 1-6%, thông dụng nhất là 2-3

Trong tế bào, Mg có vai trò xúc tác cho nhiều hệ enzim quan trọng, làcầu nối giữa enzim và cơ chất, làm tăng hoạt tính enzim, Mg còn ảnh hởng

đến quá trình hấp thu, đồng hoá P, O2,

+ Sắt ( Fe )

Trong môi trờng cổ điển, dùng Fe dới dạng FeCl2.FeCl3.6H2O;FeSO4.7H2O; Fe2(SO4)2; Fe(C4H4O), còn hiện nay dùng Fe ở dạng EDTA, ởdạng này Fe không bị kết tủa mà giải phóng dần ra môi trờng tuỳ nhu cầucủa mô thực vật

+Canxi ( Ca )

Đợc cung cấp cho cây dới dạng Ca(NO3).4H2O, CaCl2.6H2O,CaCl2.2H2O, nồng độ 1-3,5 mM

c Các khoáng vi lợng

Các nguyên tố vi lợng đợc tìm thấy trong cây dới dạng các phức chất

hữu cơ- khoáng, các phức chất này có thể tham gia vào các phản ứng mà bảnthân các chất thành phần không thể tham gia đợc Đặc biệt vai trò của các

nguyên tố vi lợng quan trọng nhất là tham gia vào cấu trúc của các enzim vàtham gia vào tất cả các quá trìng sinh tổng hợp và chuyển hoá các chất trong

tế bào, do đó có thể nói các nguyên tố vi lợng là cơ sở của sự sống

Bảng : Một số các nguyên tố vi lợng thờng dùng []

MnBZnCuMo

CoI

MnSO4.4H2O

H3PO3

ZnSO4.7H2OCuSO4.5H2O(NH4)6Mo7O24.4H2ONaMoO4.2H2OCoCl2.6H2OKI

15-1006-10015-300,04-0,08

0,07-10,1-0,42,5-20

d Các vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khảnăng tổng hợp đợc hầu hết các vitamin nhng thợng không đủ về lợng, do đócần phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, nhất là các vitamin nhóm B

Bảng : Một số vitamin thờng đợc dùng trong môi trờng nuôi cấy [ ]

Myo_InositolAxit nicotinic ( niaxin )Pyridoxine HCl ( vitamin B6 )

Thiamine HCl ( B1 )Pandothenat canxiRiboflavin ( B2 )BiotinAxit folic

1000,5-10,05-0,510-501-51-50,1-10,1-1

Các vitamin thờng đợc pha trong hỗn hợp các dung dịch mẹ có nồng độcao gấp 500 đến 1000 lần so với dung dịch lam việc, cần giữ trong điều kiện

e Các chất điều khiển sinh trởng

Bảng : Một số chất điều khiển sinh trởng thờng dùng [ ]

Tên chất sinh trởng Nồng độ sử dụng ( mg/l )

2,4 D [dichlorophenoxy axetic]

_NAA [ naphtylaxetic axit]

_NAA [ indol axetic axit]

IBA [ indol butyric axit]

Thờng pha các dung dịch mẹ chất sinh trởng có nồng độ cao gấp 1000 lần

so với dung dịch làm việc

g Các hỗn hợp chất tự nhiên

+ N ớc dừa:

Từ 1941, nớc dừa đã đợc sử dụng để nuôi phôi Daruta và năm 1949nuôi mô của Daucus Lợng nớc dừa dùng trong môi trờng khá lớn, 10-20 %thể tích môi trờng

+ Dịch chiết nấm men

Là các chế phẩm thờng dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào độngvật 1934,White lần đầu tiên đã nuôi cấy thành công rễ cà chua trong ốngnghiệm kéo dài vô thời hạn trên nền dịch chiết nấm men Thành phàn hoáhọc không rõ, chủ yếu chứa đờng, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin vàkhoáng.Lợng thờng dùng là 1g/l môi trờng

h Một số môi trờng nuôi cấy cơ bản

đợc sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật Thích hợp chocây Một lá mầm và cây Hai là mầm

cây họ Rhododendron ( Mẫu đơn ) và một số cây thân gỗ loại nhỏ Nồng độcác loại muối khoáng dùng trong môi trờng này thấp, chỉ bằng một nửa sovới môi trờng MS

nh-ng đợc dùnh-ng nhiều tronh-ng nhân giốnh-ng vô tính, đặc biệt tronh-ng nuôi và tách tếbào trần

+ M«i tr êng nu«i cÊy phong lan ( P )

1650-6,2322,2-0,0250,02537,26-27,8180,716,90,250,831900 8,6

400-6,2332,2-0,0250,02574,5-55,7180,716,90,250,3480330-8,6

134-3,1113,2-0,0250,02537,26-27,8122,1100,250,752500130,5-2,0

825-3,1166-0,01250,012537,26-27,890,358,450,1250,41595085,5-5,3

4631,6125,3 -37,26-27,890,3533,3-0,82830400-1,5

-ChÊt h÷u c¬ vµ vitamin

20,41000,50,5-

0,4100 -

1010011-

11000,50,51000

-211000,50,5-

_indolaxetic axit

_ Naphthalen axetic axit6_Benzyl amino purineSaccaroza (g/l)Agar ( g/l )PH

-

-3085,6

80

-2 0,53085,8

-

-3085,8

-

-0,5220-5,8

-

-2 -2085,8

1.2 Quy trình chung của NCM_TB invitro

Về nguyên tắc, quy trình nhân giống vô tính invitro gồm 4 giai đoạn []1.2.1 Giai đoạn vào mẫu và cấy gây

Đây là giai đoạn rất quan trọng, đóng vai trò quyết định đối với toàn

bộ quy trình Mục đích của giai đoạn này là phải tạo đợc nguyên liệu thựcvật vô trùng để đa vào nuôi cấy invitro

Yêu câù của giai đoạn này là:

có thể bổ sung vào môi trờng than hoạt tính hoặc ngâm mẫu trớc khi cấy vàohỗn hợp axit ascobic và axit citric nồng độ 25-150 mg/l

Chọn đúng phơng pháp khử trùng sẽ đa lại tỷ lệ sống cao, chọn môi ờng dinh dỡng thích hợp sẽ giúp cho mẫu đạt tốc độ sinh trởng nhanh

Môi trờng nuôi cấy thờng dùng là môi trờng MS

1.2.2 Giai đoạn nhân nhanh

Toàn bộ quá trình nhân giống invitro nhằm mục đích tạo ra hệ số nhânchồi invitro cao nhất, vì vậy đây đợc coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân,phải đa thêm vào môi trờng dinh dỡng nhân tạo cácchất điều hoà sinh trỡng: auxin, xitikinin, gibberelin,…từ đó đề xuất một quy trình nhân giống,các hợp chất tựnhiên: nớc dừa, dịch chiết nấm men,…từ đó đề xuất một quy trình nhân giốngkết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánhsáng thích hợp Trong giai đoạn này, ngời ta kích thích tạo cơ quan phụ hoặc

có cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.Những khả năngtạo cây mới là: phát triển chồi nách, tạo phôi vô tính hoặc tạo đỉnh sinhtrởngmới

1.2.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, cần chuyển chồi sang môi trờng tạo rễcó bổ sungmột lợng nhỏ auxin, thờng sau 2-3 tuần,từ những chồi riêng lẻ sẽ xuất hiện rễ

và tạo thành cây hoàn chỉnh.Auxin là nhom hoormon thực vật quan trọng cóvai trò sinh lý là tạo rễ bất định cho mô nuôi cấy, trong đó các chất IAA;IBA; _NAA; 2,4D đợc sử dụng nhiều nhất

1.2.4 Giai đoạn huấn luyện thích nghi

Quá trình thích nghi đợc hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh

lý và giải phẫu của bản thân cây non đó Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi

là 2-3 tuần, trong thời gian này cây cần đợc chăm sóc bảo vệ cẩn thận trớcmột số yếu tố bất lợi: mất nớc, nhiễm khuẩn, nấm , nắng,…từ đó đề xuất một quy trình nhân giống

Trong giai đoạn huấn luyện thích nghi này, cây hoàn chỉnh với đầy đủ

rễ, thân , lá đợc đa từ ống nghiệm ra đất Giai đoạn này cây cần có giá thể vàchế độ chăm sóc phù hợp Yêu cầu của giai đoạn này là:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt đợc những tiêu chuẩn hình thái nhất

Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mố phát triển trong mộvài thập niên trở lại đây, với thời gian ngắn nhng có ý nghĩa thực tiễn và triểnvọng phát triển to lớn, công nghệ sinh học đã có nhiều thành tựu đáng kể,

đặc biệt trong lĩnh vực trồng trọt Hiện nay công nghệ sinh học là lĩnh vực

đ-ợc đầu t khá lớn ở hầu hết các nớc trên thế giới.Cây giống nuôi cấy mô- tếbào không còn xa lạ đối với các nông hộ

Đối với lĩnh vực nhân giống cây trồng, Công nghệ nuôi cấy mô- tếbào đã cho phép sản xuất giống nhiều loại cây trồng nh: khoai tây, bắp cải,

củ kiệu, các cây công nghiệp nh: bông , hông , tếch, ,các loại cây thuốcquý: sa nhân, sâm, , nhiều loại hoa: cúc, hồng, phong lan, ,cây cảnh, cácloại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao: nho, chuối , cam , chanh, []

Đối với các lĩnh vực khác có ứng dụng những thành tựu của nuôi cấymô- tế bào cũng có nhiều thành tựu đáng chú ý: phục tráng cây, tạo dòng câysạch bệnh [], lựa chọn dòng lúa , ngô đáp ứng yêu cầu cụ thể của môi tr ờng,cấy ghép cam, chanh, nhân nhanh cây từ phôi,

Công nghệ Mô- tế bào, ngoài việc sử dụng để nhân nhanh các giốngcây trồng, còn đợc sử dụng vào nhiều lĩnh vực khác đạt nhiều thành công,

đóng góp đáng kể cho nhiều ngành sản xuất, phục vụ nhu cầu ngay càng lớncủa con ngời: sản xuất sinh khối các loại thức ăn cho ngời và động vật,nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài cây, con, tạo ngân hàng gen vatinh trùng, thụ tinh nhân tạo, chuyển gen, Trong tơng lai đây sẽ là một trongnhững ngành có nhiều tiềm năng phát triển nhất, và nớc nào phát triển đựơccàng cao về công nghệ nuôi cáy mô- tế bào, nớc đố sẽ phát triển về congnghiệp, nông nghiệp, và có nền kinh tế vững mạnh

1.3.2 ở Việt Nam

ở nớc ta, ứng dụng thành tựu của Nuôi caýy mô- tế bào còn là một lĩnh vựckhá mới mẻ và có nhiều tiềm năng phát triển.Do điều kiện chiến tranh kéodài, các ngành khoa học nói chung và Nuôi cấy mô- tế bào nói riêng của nớc

ta đã đi chậm hơn so với thế giới, tuy vạy chúng ta cũng đã đạt đợc một ssốthành tựu đáng kể, nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mo- tế bào đã đợc xâydựng tại các Viện: Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới thànhphố Hồ Chí Minh, Viện Nghiên cứu Đà Lạt, Ngoài ra nhiều trờng Đạihọccũng đã bắt đầu chú ý đầu t xây dựng các phòng thí nghiệm Nuôi cấymô- tế bào để cho sinh viên có thể tiếp cận với công nghệ mới mẻ này.ởnhiều tỉnh, thành phố đã xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô- tế bào ,

thực hiện những nghiên cứu và chuyển giaocong nghệ nuôi cấy mô- tế bàotrên các đối tợng có kinh tế của địa phơng( Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh,Bình Định, )

Hiện nay, Công nghệ sinh học nói chung, Nuôi cấy mô- tế bào nóiriêng đã thu đợc nhiều thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân nhanh cácloại cây: cà phê, cỏ ngọt, chuối(Trung tâm công nghệ sinh học), dứa(Việnnghiên cứu dầu và cây có dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đờng(Trungtâm công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinhhọc thực nghiệm), cây vani(Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu), nho khônghạt(Trung tâm công nghệ sinh học), dâu tằm, măng cụt, lúa, khoai tây và cácloại cây có củ khác.Đối với các giống hoa, ngoài phong lan và cúc là hai đốitợng thờng đợc nuôi cấy mô- tế bào, hiện nay có rất nhiều loại hoa đợcnghiên cứu nhân nhanh bằng công nghệ này, chủ yếu phụ thuộc vào giá trịcủa các loại hoa chứ không phải phụ thuộc vào mức độ dễ thành công nh trớc

đây: rẻ quạt (Viện ngiên cứu hạt nhân Đà Lạt ),Cẩm chớng(Đại học Tổnghợp Đà Lạt ), cúc chùm Hà Lan, loa kèn,[]

Chơng II : Đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu

I.Đối tợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.

2.1.1Đối t ợng nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu của đề tài là hoa đồng tiền (gerbera) kép, hoa đỏ,vàng có nguồn gốc từ Hà Lan đợc nhập nội từ 2003 Các bộ phận đợc sửdụng để tiến hành nghiên cứu là : chồi , đỉnh sinh trởng, chồi nách,…từ đó đề xuất một quy trình nhân giống

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

_ Các giai đoạn: khử trùng, vào mẫu, nhân nhanh, ra rễ, tạo cây hoànchỉnh đợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô_ tế bào thực vật Khoasinh học, trờng Đại học Vinh.

_ Các nghiên cứu về khả năng thích ứng của cây invitro với điều kiệnmôi trờng bình thờng đợc tiến hành tại nhà lới _ Koa Sinh học_ trờng Đạihọc Vinh

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 3-2005 đến tháng 4-2006

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu của đề tài là:

 ảnh hởng của thời gian, nồng độ, hoá chất khử trùng đến các chỉ tiêu:

tỷ lệ sống, tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ bật chồi của mẫu

 ảnh hởng của BAP đến sự phát triển của chồi invitro trong quá trìnhnhân nhanh

 ảnh hởng của - NAA đến sự ra rễ của chồi invitro

 ảnh hởng của giá thể đến sức sống của chồi exvitro

2.3 Phơng pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu khởi đầu

Vật liệu khởi đầu,tức là các cây giống để từ đó lấy các chồi, đỉnh sinh ởng, là các cây đồng tiền trởng thành đợc trồng tại nhà lới Các cây muốn đ-

tr-ợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu phải đạt đtr-ợc các yêu cầu về hình thái, phảikhoẻ mạnh, không mang mầm bệnh, phát triển tốt Mẫu đợc lấy vào nhữngngày nắng ráo , trớc đó 3 ngày không có ma để hạn chế sự nhiễm khuẩn.2.3.2 Giai đoạn khử trùng mô nuôi cấy_ vào mẫu

Bộ phận đợc dùng là đỉnh sinh trởng Đồng tiền có đỉnh sinh trởng yếu,

ít, khó tách, mặt khác có nhiều lông tơ là nơi có nhiều vi khuẩn, do đó việcvào mẫu gặp nhiều khó khăn, hoá chất và thời gian xử lý phải vừa đủ để diệthết vi khuẩn, nấm mà không ảnh hởng đến đỉnh sinh trởng Các công thức đ-

ợc sử dụng là :

 CT M1 : Cồn 700 (3 phút) + H2O2 15% (10 phút) + HgCl2 0,1%(10 phút)

 CT M2 : Cồn 700 (3 phút) + H2O2 15% (15 phút) + HgCl2 0,1%(10 phút)

 CT M3 : Cồn 700 (3 phút) + H2O2 15% (15 phút) + HgCl2 0,1%(15 phút)