Luận văn thạc sĩ nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh suy giảm hô hấp do vi khuẩn ornithobacterium rhinotracheale gây ra trên gà thả vườn tại ba vì, hà nội và biện pháp phòng trị

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAMTHẠCH THỊ THU TRANG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH SUY GIẢM HÔ HẤP DO VI KHUẨN ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE GÂY RA TRÊN GÀ THẢ VƯỜN TẠI BA VÌ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

THẠCH THỊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH SUY GIẢM HÔ HẤP DO VI KHUẨN ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE GÂY RA TRÊN GÀ THẢ VƯỜN TẠI

BA VÌ, HÀ NỘI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Đức Thắng

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kì công trình nào khác.

Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc./.

Hà Nội, ngày… tháng… năm2017

Tác giả luận văn

Thạch Thị Thu Trang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ của các tổ chức, cơ quan, các nhà khoa học, các thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp và những người thân trong gia đình.

Nhân dịp này, tôi xin trân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các giảng viên khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình, đầy trách nhiệm và hết lòng vì khoa học của PGS.TS Chu Đức Thắng.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, đồng nghiệp đã luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày… tháng… năm2017

Tác giả luận văn

Thạch Thị Thu Trang

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Lịch sử và tình hình nghiên cứu bệnh 3

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 4

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 5

2.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Ornithobacterium Rhinotracheale. 6

2.2.1 Phân loại 6

2.2.2 Hình thái cấu trúc của vi khuẩn 6

2.2.3 Tính chất nuôi cấy của vi khuẩn. 7

2.2.4 Đặc tính sinh hóa 8

2.2.5 Cấu trúc kháng nguyên và độc lực 8

2.2.6 Sức đề kháng 9

2.3 Truyền nhiễm học 9

2.3.1 Loài mắc bệnh 9

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh 10

2.3.3 Phương thức truyền lây 10

2.3.4 Định serotype và phân loại chủng 11

2.3.5 Khả năng gây bệnh 12

2.3.6 Khả năng miễn dịch 12

2.4 Một số đặc điểm của bệnh do ORT 12

2.4.1 Triệu chứng của gà mắc bệnh do ORT 12

2.4.2 Bệnh tích của gà mắc bệnh do ORT 13

2.5 Chẩn đoán 14

2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 14

2.5.2 Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn 14

2.5.3 Phát hiện kháng nguyên 15

2.5.4 Huyết thanh học 16

2.5.5 Chẩn đoán phân biệt 16

2.6 Biện pháp phòng và điều trị 19

2.6.1 Phòng bệnh 19

2.6.2 Điều trị 20

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Đối tượng nghiên cứu 22

3.3 Thời gian nghiên cứu 22

3.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 22

3.5.2 Phương pháp mổ khám 23

3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 23

3.5.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 24

3.5.5 Phương pháp nhuộm Gram 24

3.5.6 Phương pháp PCR 25

3.5.7 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được. 26

3.5.8 Sử dụng một số loại kháng sinh để điều trị bệnh do ORT gây ra ở gà 28 3.5.9 Phương pháp xử lý số liệu 29

3.6 Nguyên liệu nghiên cứu 29

3.6.1 Mẫu bệnh phẩm 29

3.6.2 Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 29

3.6.3 Các loại hoá chất 30

3.6.4 Máy móc 30

3.6.5 Dụng cụ 30

Phần 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1 Một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT 31 4.1.1 Các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT. 33

4.1 2 Một số đặc điểm bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh do ORT 37

4.2 Một số đặc điểm dịch tễ của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT 41 4.2.1 Tình hình gà mắc bệnh do ORT theo lứa tuổi 41

4.2.2 Tình hình mắc bệnh do ORT theo mùa vụ 43

4.2.3 Tình hình mắc bệnh do ORT theo truyền thồng chăn nuôi 45

4.3 Biện pháp phòng trị 46

4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn ORT 46

4.3.2 Kết quả xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh và thử nghiệm điều trị 49

4.3.3 Biện pháp phòng trị 51

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 57

Tài liệu tham khảo 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTTên viết tắt Tên đầy đủ

BEAs Boiled Extract Antigens

BHB Brain Heart Infusion Broth

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ILT Infectious Laryngo Tracheitis

ORT Ornithobacterium rhinotracheale

PAP Peroxidase - Anti Peroxidase

PGNR Pleomorphic Gram Negative Rod

Rrna Ribosomal Ribonucleic Acide

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

SPAT Standard Plate Agglutination Test

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phản ứng enzyme O Rhinotrachaele (Chin et al., 2008) 8

Bảng 3.1 Bảng tiêu chuẩn của nhà cung cấp giấy tẩm kháng sinh 27

Bảng 4.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm tại các địa phương 31

Bảng 4.2 Kết quả chẩn đoán vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 32

Bảng 4.3 Triệu chứng lâm sàng của gà nhiễm ORT 34

Bảng 4.4 Kết quả mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể của gà nhiễm ORT (n=45) 37

Bảng 4.5 Tình hình gà nhiễm ORT ở các lứa tuổi tại huyện Ba Vì, Hà Nội 42 Bảng 4.6 Tình hình nhiễm ORT theo mùa vụ tại huyện Ba Vì, Hà Nội 43

Bảng 4.7 Kết quả điều tra tình hình nhiễm bệnh do ORT trên đàn gà nuôi tại huyện Ba Vì theo truyền thống chăn nuôi 45

Bảng 4.8 Kết quả phân lập vi khuẩn ORT từ các mẫu bệnh phẩm trên gà thả vườn tại Ba Vì 47 Bảng 4.9 Bảng tổng hợp kết quả thử tính mẫn cảm của ORT với một số loại kháng sinh 49

Bảng 4.10 Kết quả sử dụng một số kháng sinh điều trị bệnh do ORT gây ra 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn ORT sau 48 giờ nuôi cấy (Charlton et

al., 1993; Pan et al., 2012) 7

Hình 3.1 Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin 30

Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR 32

Hình 4.2 Kết quả chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kĩ thuật PCR 33

Hình 4.3 Gà có biểu hiện khó thở 36

Hình 4.4 Trứng méo mó, biến dạng, chất lượng vỏ trứng kém 37

Hình 4.5 Phổi viêm đỏ sẫm 40

Hình 4.6 Phổi viêm có mủ ở nhánh phế quản 40

Hình 4.7 Phổi viêm đỏ có mủ 41

Hình 4.8 Túi khí dầy, đục màu 41

Hình 4.9 Tỷ lệ gà nhiễm và chết do ORT ở các lứa tuổi trên đàn gà thả vườn tại huyện Ba Vì, Hà Nội 42

Hình 4.10 Tỷ lệ mắc bệnh do ORT theo mùa vụ 44

Hình 4.11 Khuẩn lạc ORT nuôi cấy trên thạch máu sau 48 giờ 47

Hình 4.12 Hình thái vi khuẩn ORT dưới kính hiển vi 48

Hình 4.13 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn ORT đối với các loại kháng sinh trên thạch 50

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Thạch Thị Thu Trang

Tên luận văn: “Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh suy giảm

hô hấp do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra trên gà thả vườn tại Ba Vì, Hà Nội và biện pháp phòng trị”.

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp

Việt Nam I Mục đích nghiên cứu

Xác định được một số đặc điểm bệnh lý của bệnh suy giảm hô hấp

do vi khuẩn ORT gây ra trên gà thả vườn tại Ba Vì.

II Phương pháp nghiên cứu

2.1 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT

- Chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR.

- Xác định các triệu chứng lâm sàng của đàn gà mắc bệnh do ORT.

- Xác định những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh

- Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh

- Xác định tính mẫn cảm của chủng ORT phân lập được với kháng sinh và thử nghiệm điều trị.

- Xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

- Phương pháp mổ khám

- Phương pháp PCR

- Lấy mẫu bệnh phẩm và bảo quản mẫu làm tiêu bản

- Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

- Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng

vi khuẩn phân lập được.

III Kết quả chính và kết luận

Một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT: Chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kĩ thuật PCR : Xác định được 45/58 mẫu dương tính (77,59%) với vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR.

Triệu chứng lâm sàng của đàn gà mắc bệnh do ORT: Ủ rũ, mệt mỏi, xã cánh, khó thở, bỏ ăn hoặc giảm ăn 100%; sốt, chảy dịch mũi, dịch miệng, giảm đẻ, trứng biến dạng, giảm tăng trọng từ 77,78-89,29% số gà theo dõi.

Những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh do ORT: Xác định được bệnh tích đại thể ở các cơ quan phủ tạng có tỷ lệ cao: Phổi viêm 100%; khí quản

có dịch nhày, túi khí có fibrin 93,33%; xuất huyết khí quản 80%; phổi viêm hóa mủ 77,78% và một số bệnh tích khác có tỷ lệ thấp hơn (ở thận; gan, lách ).

Một số đặc điểm dịch tễ của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT:

Điều tra tình hình mắc bệnh do ORT trên đàn gà theo lứa tuổi: Gà mắc bệnh theo lứa tuổi, nặng nhất ở ≤ 6 tuần tuổi (53,1%), đến gà 7-20 tuần tuổi (51,43%) và cuối cùng là >20 tuần tuổi (44,23%) Tỷ lệ chết tương ứng: 32,95%; 16% và 12,82%.

Điều tra tình hình mắc bệnh do ORT trên đàn gà theo mùa vụ: Gà mắc bệnh theo mùa vụ, nặng nhất Đông-Xuân (54,37%), đến Thu-Đông (49,79%) và cuối cùng là Xuân-Hè (39,56%) Tỷ lệ chết tương ứng: 24,33%, 22,55% và 17,58%.

Điều tra tình hình mắc bệnh do ORT trên đàn gà theo truyền thống chăn nuôi: Gà mắc bệnh theo truyền thống chăn nuôi, nặng nhất ở hộ chăn nuôi 1-5 năm (58,36%), đến hộ chăn nuôi 6-10 năm (47,16%) và cuối cùng là hộ chăn nuôi 11-15 năm (35%) Tỷ lệ chết tương ứng: 26,62%, 20,45% và 15,83%.

Xây dựng các giải pháp phòng và trị bệnh: Dựa vào kết quả nghiên cứu và các văn bản pháp quy đã xây dựng được biện pháp phòng bệnh; dựa vào thử kháng sinh đồ đã xây dựng được biện pháp trị hiệu quả, đặc biệt là Bio-Amox (thành phần là Amoxicillin) hiệu quả khỏi bệnh đến 80%.

THESIS ABSTRACTMaster candidate: Thach Thi Thu Trang

Thesis title: Study on some pathological characteristics of respiratory depression caused by Ornithobacterium rhinotracheale bacteria in free range chicken in Ba Vi, Hanoi and measures to prevent".

Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

(VNUA) I Research Objectives

Identification of some pathological characteristics of respiratory distress caused by ORT in free range chicken in Ba Vi.

II Research Methods

2.1 Research content

Study on some pathological characteristics of free range chickens infected by ORT

- Diagnosis of ORT bacteria by PCR technique.

Identify clinical symptoms of diseased chickens caused by ORT

-Identify macroscopic change in chickens infected by ORT.

Study on some epidemiological characteristics of free range chickens infected by ORT

Investigate the status of chickens infected ORT by age, by season and by traditional livestock.

Measures to prevent

- Isolation of ORT from infected chickens.

- Determine susceptibility of ORT isolates with antibiotics and evaluate treating regimens.

- Develop prevention and treatment measures.

2.2 Research Methods

- Clinical diagnostic methods

- Surgery method

- Sampling and storage of specimens

- Methods of culture and isolation of bacteria

- Test method for antibiotic susceptibility of isolated bacteria III Main findings and conclusions

The result of some pathological characteristics of free range chickens infected by ORT:

Diagnosis of ORT bacteria by PCR technique: 45/58 positive samples (77.59%) were determine by PCR.

Clinical symptoms of chickens infected by ORT: fatigue, dyspnea, decreased feeding 100%; fever, nasal discharge, mouth fluid, reduced fertility, deformed eggs, decreased weight gain from 77.78-89.29%.

The macroscopic changes of ORT chickens: Determine the macroscopic symptom in the organs of high incidence: pneumonia 100%; trachea with mucus 93,33%; tracheal hemorrhage 80%; pulmonary inflammation 77.78% and some other lesions in lower rates (kidney, liver, spleen ).

The result of some epidemiological characteristics of free range chickens infected by ORT:

Investigation of infecting ORT in chickens by age group: The percentage of infected chickens was highest at the age of 6 weeks (53.1%),then 7-20 weeks of age (51.43% ) and finally more than 20 weeks old (44.23%) Mortality rate: 32.95%, to 16% and 12.82% respectively.

Survey on status of chicken infected by ORT by season: The percentage of infected chickens was highest in winter-spring (54.37%), followed by Thu-Dong (49.79%) and Spring-Summer (39.56%) Mortality rates were 24.33%, 22.55% and 17.58% respectively.

Investigate situation of chickens infected ORT by breeding tradition: The percentage of infected chickens was highest in 1-5 year livestock production (58.36%), followed by livestock producers from 6 -10 years (47.16%) and then was 11-15 year livestock producers (35%) Mortality rates were 26.62%, 20.45% and 15.83% respectively.

Measures to prevent:

Isolation of ORT from diseased chickens: isolation and morphologic examination 135 sample, 111 samples have positive results (82.2%) which were Gram-negative or polymorphism bacteria

Antiticrobial testing showed that 100% Amoxycilliline / Clavulanic Acid and Tetracycline were susceptibility, Ampicillin was 80%, Erythromycin was 60%; Cephalecine, Lincomycine, Doxycillin completely resistant.

Development of preventive and curative solutions: Based on research results and legal documents, preventive measures have been developed; Antibiotic resistance testing has been shown effective treatment method, especially with Bio- Amox (an ingredient called Amoxicillin) which had 80% recovery.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, dịch bệnh trên đàn gia cầm nước ta có chiều hướng gia tăng, diễn biến phức tạp ảnh hưởng lớn tới việc phát triển chăn nuôi gia cầm nói riêng và phát triển kinh tế nói chung Dịch bệnh bùng phát do nhiều nguyên nhân gây ra, trong đó phải kể đến sự góp mặt của các loại virus, vi khuẩn và nấm Mỗi loại vi khuẩn, virus và nấm khác nhau gây ra các triệu chứng và bệnh tích khác nhau cho gia cầm Trong đó, bệnh suy giảm hô hấp trên gà do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) tuy những thiệt hại kinh tế do bệnh này chưa được thống kê đầy đủ, nhưng chắc chắn tại Mỹ cũng như ở các nước chăn nuôi gà phát triển, hàng năm mất hàng triệu đô la do bệnh có tỷ lệ chết cao, năng suất trứng giảm.

Bệnh suy giảm hô hấp do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây

ra trên gà (hay còn gọi là bệnh ORT) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra hay gặp ở gà và gà tây ở mọi lứa tuổi Năm 1981, một chủng ORT lần đầu tiên được phân lập từ dịch nước mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khi bị viêm của gà tây từ năm tuần tuổi tại phía Bắc nước Đức Năm 1993, Ornithobacterium rhinotracheale lần đầu tiên được mô tả Bệnh do vi khuẩn ORT là bệnh khó phòng và điều trị Bệnh làm giảm khả năng sản xuất, gây thiệt hại kinh tế với những triệu chứng bệnh tích như:

ho, khó thở, đớp không khí, màng niêm mạc mắt viêm thùy thũng, khí quản xung huyết, có nhiều dịch nhầy, phổi viêm tơ huyết (Charlton et al., 1993) Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn ORT và các virus, vi khuẩn kế phát, các vấn đề chế độ nuôi dưỡng, chăm sóc, độ tuổi, mùa vụ bị nhiễm bệnh và đặc biệt là thời gian can thiệp chữa trị có kịp thời hay không cùng với đó là việc dùng thuốc đúng và phù hợp…

Tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về ORT còn rất hạn chế Tháng 6 năm 2014, Nguyễn Thị Lan và cộng sự lần đầu tiên đã có báo cáo tổng hợp cụ thể về tình hình nghiên cứu trên thế giới và các đặc điểm quan trọng của ORT làm cơ sở cho việc chẩn đoán xét nghiệm Đến tháng 12 năm 2014, Võ Thị Trà An

và cộng sự đã tiến hành nhận dạng, phân lập và xác định mức độ mẫn cảm của

vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale Tháng 11 năm 2016, Nguyễn Thị

Lan và cộng sự đã công bố đặc điểm vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) phân lập được từ đàn gà nuôi tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Cho đến nay, chưa có thêm bất cứ một nghiên cứu nào về ORT được công bố Do đó việc chẩn đoán chính xác bệnh dựa trên các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích còn gặp nhiều khó khăn và dễ nhầm lẫn với các bệnh gây ra trên đường hô hấp của gia cầm như bệnh Infectious bronchitis (IB), Infectious Laryngo tracheitis (ILT), Chronic Respiratory Disease (CRD), Newcastle, chính vì vậy cần phải có các nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý cũng như các phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng: phân lập vi khuẩn, giám định PCR… để việc chẩn đoán sớm tìm ra vi khuẩn gây bệnh làm cơ sở cho phòng và trị bệnh đạt hiệu quả cao Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi tiến hành triển khai đề tài “ Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh suy giảm hô hấp do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây

ra trên gà thả vườn tại Ba Vì, Hà Nội và biện pháp phòng trị ”.

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Xác định được một số đặc điểm bệnh lý của bệnh suy giảm hô hấp do

vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra trên gà thả vườn tại Ba Vì.

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Kết quả của đề tài nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của bệnh suy giảm hô hấp do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây ra trên gà thả vườn tại Ba Vì,

Hà Nội là tư liệu khoa học giúp cho nghiên cứu sâu hơn về bệnh do ORT.

Những kết quả thu được có thể dùng làm tư liệu tham khảo hữu ích cho những người làm công tác nghiên cứu và giảng dậy về bệnh do ORT gây ra trên gà.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH

Bệnh do vi khuẩn ORT gây ra hay còn được gọi là Ornithobacteriosis, là một bệnh truyền nhiễm của gia cầm, chủ yếu là gà tây và gà, bệnh gây suy hô hấp, giảm tăng trưởng và tỷ lệ tử vong cao (Chin et al., 2008) ORT được coi như là một tác nhân gây bệnh chủ yếu ở gia cầm (Van Veen et al., 2000; Pan et al., 2012) Bệnh có triệu chứng lâm sàng, thời gian, mức độ nghiêm trọng, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong diễn biến khá phức tạp và trầm trọng hơn bởi các yếu tố môi trường như quản lý kém, sự thông thoáng kém, mật độ chăn thả cao, chất lót nền kém, vệ sinh kém hoặc ghép với các bệnh khác Bệnh do vi khuẩn ORT được cọi là một gánh nặng lớn cho ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm (Chansiripornchai, 2004).

Triệu chứng lâm sàng thường xuất hiện ở gà thịt 3-6 tuần tuổi với tỷ lệ chết khoảng 5-10% với các triệu chứng ủ rũ, kém ăn, giảm tăng trọng, tăng tiết dịch, vẩy mỏ có hiện tượng phù mặt.

Ở gà giống bố mẹ, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn đầu của gà

đẻ đạt đỉnh hay ngay trước khi đưa gà lên chuồng đẻ Có biểu hiện: tăng tỷ lệ chết, giảm ăn, giảm đẻ, giảm kích thước trứng, chất lượng

vỏ trứng kém, tỷ lệ có phôi và khả năng ấp nở cũng bị ảnh hưởng.

Ở gà đẻ thương phẩm, giảm đẻ, tăng trứng méo và tăng tỷ lệ chết có liên hệ tới sự nhiễm ORT.

Ở gà thịt thương phẩm, các tổn thương đại thể thường gặp bao gồm viêm phổi, viêm màng phổi và viêm túi khí Khi giết mổ hoặc kiểm tra sau giết mổ sẽ thấy dịch dạng bọt, màu trắng, chất dịch tiết này có màu giống sữa chua và có thể thấy rõ trong các túi khí Hầu hết các tổn thương chỉ tiến triển ở một bên thùy phổi Các tổn thương do ORT có thể làm tỷ lệ chết tăng cao tới 50% hoặc hơn Thêm nữa, phù thũng dưới da mặt, gây viêm xương tủy, viêm màng não cũng được thấy ở gà.

Lần đầu tiên người ta phân lập được một chủng ORT từ dịch nước mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khí bị viêm của gà tây 5 tuần tuổi tại phía Bắc nước Đức Năm 1983, người ta đã tiến hành nuôi cấy vi khuẩn từ dịch khí quản của quạ non Năm 1986, ORT được phân lập từ gà tây tại Isarel ở nhiều lứa tuổi với bệnh tích viêm xuất huyết cấp tính ở phổi và viêm túi khí Năm 1987,

ORT được phân lập từ giống vịt Bắc Kinh 10 tuần tuổi ở Hungary và người ta cho rằng cùng với bệnh tụ huyết trùng, bệnh do vi khuẩn ORT được coi như một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên gà Giữa những năm 1986 và 1988 là thời điểm ORT được nhận định như một chủng vi khuẩn giống Pasteurella, được phân lập từ đàn gà tây giống ở Anh, kèm với triệu chứng như yếu ớt, giảm đẻ, vảy mỏ, tỷ lệ chết thấp, túi khí viêm tơ huyết và viêm phổi.

Năm 1986, người ta bắt đầu nghiên cứu phân lập ORT ở Califonia Kết quả:

đã xác định được các đặc điểm của 14 chủng vi khuẩn thu thập và phân lập được trên các đàn gà tây và gà có triệu chứng của bệnh hô hấp (Charlton et al., 1993) Vào năm 1991, Du Preez thấy rằng có các biểu hiện của bệnh hô hấp trên các đàn gà thịt thương phẩm tại Nam Phi, nơi sau đó cũng đã phân lập được ORT.

Năm 1993, lần đầu tiên ORT được miêu tả chính thức (Charlton et al., 1993) Đến năm 1994, người ta đã công bố cây phát sinh loài, các genotype, phân loại sinh hoá học và các đặc trưng phenotype cổ điển của 12 chủng đã phân lập và được đề xuất mang tên ORT (Vandamme et al., 1994) Tuy nhiên sự phát hiện và phân lập được vi khuẩn đã được thực hiện từ những năm trước 1993.

ORT được báo cáo là nguyên nhân gây ra bệnh với các triệu chứng, bệnh tích giống tụ huyết trùng trên gà tây ở Đức vào năm 1993 và 1994 và gà tây giống

32 tuần tuổi tại Mỹ năm 1996 Và kể từ đó tơi nay, có nhiều báo cáo phân lập của Vandamme et al Vào năm 1994, ORT đã được phân lập từ chim hoang dã ở nhiều quốc gia trên thế giới trính theo Nguyễn Thị Lan và cs (2014).

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1981, lần đầu tiên người ta phân lập được một chủng ORT từ dịch nước mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khí

bị viêm của gà tây 5 tuần tuổi tại phía Bắc nước Đức.

Năm 1983, vi khuẩn được nuôi cấy từ dịch khí quản của quạ non.

Năm 1986, ORT được phân lập từ gà tây tại Isarel ở nhiều lứa tổi với bệnh tích viêm xuất huyết cấp tính phổi và viêm túi khí Năm 1987, ORT được phân lập từ giống vịt Bắc Kinh 10 tuần tuổi ở Hungary và cùng với bệnh tụ huyết trùng, vi khuẩn ORT được coi như một tác nhân gây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên gà Giữa những năm 1986 và 1988 là thời điểm ORT được nhận định như một chủng

vi khuẩn Pasteurella, được phân lập từ đàn gà tây giống ở Anh, kèm với triệu chứng như yếu ớt, giảm đẻ, ho, tỷ lệ chết thấp, túi khí viêm tơ huyết và viêm phổi.

Năm 1986, người ta đã bắt đầu nghiên cứu phân lập ORT ở Califonia Kết quả: đã xác định được các đặc điểm của 14 chủng vi khuẩn thu thập và phân lập

được từ năm 1980 đến 1981 trên các đàn gà tây và gà có triệu chứng của bệnh hô

hấp (Charlton et al., 1993) Vào năm 1991, Du Preez thấy rằng có các biếu hiện của bệnh hô hấp trên các đàn gà thịt thương phẩm tại Nam Phi, nơi sau đó cũng

đã phân lập được ORT.

Năm 1993, một số gà tây đã được quan sát ở Hà Lan và Đức, với những triệu chứng lâm sàng như vảy mỏ, khó thở và sung huyết xoang hốc mắt, cùng với sự tăng trưởng chậm của gà thịt (Hafez, 1996).

Tại Đức, người ta thấy rằng tỷ lệ nhiễm chủ yếu ở gà tây 14 tuần trở lên (Hafez, 1996) Sau đó, tìm thấy vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm đường hô hấp gia cầm ở Israel (Bock et al., 1995), Bỉ (Wyffels and Hommez, 1990) và Mỹ (Charlton et al., 1993).

Ban đầu, các loại vi khuẩn mới chỉ được gọi tên như là một vi khuẩn Gram âm, hình que (PGNR) (Charlton et al., 1993); Pasteurela – like (Hafez, 1996) hoặc Kingella –like (Van Empel and Hafez, 1999) Năm 1994, ORT được phân lập

từ chim hoang dã và được đặt tên dùng cho đến nay (Vandamme et al., 1994).

ORT đã được phân lập từ gà gô, gà lôi, chim bồ câu, chim cút, vịt, chim đa đa, đà điểu, ngỗng, gà sao, gà và gà tây (Charlton et al., 1993).

Trong các khu vực khác nhau ở Mỹ, O rhinotracheale gây ra viêm phổi cấp tính với tỷ lệ tử vong 1 – 15%, và thậm chí lên đến 50% ở gà tây vào năm 1995 và

1996 Sự hiện diện của O rhinotracheale trên chim ở Nam Mỹ và Châu Á có thể đã được nghiên cứu, quan sát nhưng chưa được công bố (Vandamme et al., 1994).

Hiện nay, tình hình dịch bệnh do ORT cũng như các nghiên cứu về chúng vẫn đang được tiến hành tại nhiều quốc gia Sau khi xác định và mô tả các đặc điểm của vi khuẩn ORT vào năm 1994 bởi Vandamme et al, ORT đã được phân lập trên toàn thế giới như Israel (Bock et al., 1995), Anh (Amonsin

et al., 1997), Pháp (Leroy-Setrin et al., 1998), Canada (Joubert et al., 1999), Slovenia (Zorman-Rojs et al., 2000), Hàn Quốc (Yoon et al., 2000), Nhật bản (Sakai et al., 2000), Peru (Hung and Alvarado, 2001), Jordan (El-Sukhon et al., 2002), Thổ Nhĩ Kỳ (Akan et al., 2002) và Mexico (Soriano et al., 2003)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về bệnh do ORT được

công bố tuy nhiên tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về bệnh do ORT, trong khi những năm gần đây Việt Nam đã xuất hiện nhiều đàn gia cầm mắc bệnh do ORT có triệu trứng và bệnh tích giống như các mô tả về bệnh do ORT trên thế giới, tại nhiều tỉnh trên cả nước, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người chăn nuôi Hiện nay, mới chỉ có một số bài báo tổng hợp từ các tài liệu nước ngoài đăng trên Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y: tháng 6 năm 2014, Nguyễn Thị Lan và cs đã có những tổng hợp cụ thể về tình hình nghiên cứu trên thế giới và các đặc điểm quan trọng của ORT trên Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XXI số 5- 2014; tháng 12 năm 2014, đã có người tiến hành nghiên cứu nhận dạng, phân lập và xác định độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn O rhinotracheale ở gà (Võ Thị Trà An và cs., 2014) Tháng

11 năm 2016, Nguyễn Thị Lan và cộng sự đã công bố đặc điểm vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) phân lập được từ đàn gà nuôi tại một

số tỉnh phía Bắc Việt Nam trên Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam tập

14 số 11: 1734-1740 Cho đến nay, chưa có thêm bất cứ một nghiên cứu nào

về bệnh do ORT trên gà tại Việt Nam.

2.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE

2.2.1 Phân loại

ORT nằm trong họ rRNA-V cùng với Bacteroidesphylum và có mối quan hệ mật thiết với hai loại vi khuẩn khác gây bệnh trên gia cầm là Riemerella anatipestifer và Coenonia anatine (Vandamme et al., 1994) Trước đây, vi khuẩn này được này được biết đến với rất nhiều tên như: Pleomorphic Gram Negative Rod (PGNR), vi khuẩn dạng Pasteurella, trực khuẩn gram âm đa hình dạng trước khi có tên gọi Ornithobacterium rhinotracheale được sử dụng cho đến ngày hôm nay (Charlton et al., 1993; Hinz et al., 1994; Bock et al., 1995).

Cythophaga-Flavobacterium-2.2.2 Hình thái cấu trúc của vi khuẩn

ORT là vi khuẩn Gram âm, đa hình thái, không có khả năng di động, dạng trực khuẩn nhỏ, không hình thành nha bào Trên môi trường thạch, chúng thường có dạng ngắn, trực khuẩn dạng dùi trống, với kích thước đường kính 0,2-0,9µm và dài 0,6-5µm (Van Empel and Hafez, 1999; Chin et al., 2008) Nhưng trong môi trường dạng lỏng, chúng rất dài có thể tới 15µm (Charlton et al., 1993; Hinz et al., 1994; Hafez, 1996).

Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn ORT sau 48 giờ nuôi cấy

Nguồn: Charlton et al (1993); Pan et al (2012)

2.2.3 Tính chất nuôi cấy của vi khuẩn.

Vi khuẩn ORT sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tùy tiện và

gian nuôi cấy 24 – 72 giờ; tuy nhiên, chúng vẫn sinh trưởng tốt ở nhiệt độ từ

thạch máu có 5-10% máu cừu (có bổ sung 10µg/ml Gentamycine), theo nghiên cứu của Vandamme et al (1994) vi khuẩn ORT kháng với kháng sinh Gentamycin

và Polymycin B, vì vậy nên thêm 5µg kháng sinh vào 1ml môi trường thạch máu (van Empel, 1998; Asadpour et al., 2008) nhằm hạn chế sự phát triển của những

vi khuẩn khác, sau khi nuôi cấy 24 giờ khuẩn lạc ORT rất nhỏ dễ bị xâm lấn nhất

là E.Coli (De Rosa et al., 1996) Vi khuẩn ORT cũng sinh trưởng được trên môi trường thạch Tryptone soy và môi trường Chocolate agar; không sinh trưởng trên các môi trường MacConkey agar, Endo agar, Gassner agar, Drigalskil agar hay Simon’s Citrate (Chin et al., 2008) Sự phát triển của

(Brain Heart Infusion Broth), PB (Pasteurella Broth), hay Todd Hewitt broth.

ORT có khuẩn lạc rất nhỏ, không gây dung huyết ra xung quanh, màu xám tới trắng xám, đôi khi hơi đỏ thẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, sắc nét và có mùi riêng biệt tương tự như mùi axit butyric (Van Empel and Hafez, 1999) Ở những lần nuôi cấy đầu tiên, khuẩn lạc ORT đạt kích thước lớn nhất (1-3mm sau 48 giờ nuôi cấy) nhưng ở những lần nuôi cấy tiếp theo, khuẩn lạc thường nhỏ hơn và biến dạng, không đồng nhất (Hinz et al., 1994).

2.2.4 Đặc tính sinh hóa

Các xét nghiệm sinh hóa để xác định ORT thường không phù hợp (Van Empel and Hafez, 1999; Chin et al., 2008) Năm 2008, Chin và Charlton đã đề xuất các xét nghiệm phù hợp để xác định ORT bao gồm: oxydase (+), catalase (-), β-galactosidase (+), indone (-), không gây phản ứng trên môi trường thạch đường sắt III, không có khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit.

Mặc dù khi sử dụng các kit xét nghiệm sinh hóa bằng dải xác định 20NE (Biomerieux, Pháp) đã góp phần tích cực cho việc xác định ORT mặc dù

API-vi khuẩn này không có trong cơ sở dữ liệu API (Van Empel and Hafez, 1999; Chin et al., 2008) Phản ứng enzyme được mô tả ở bảng 2.1.

Bảng 2.1 Phản ứng enzyme O Rhinotrachaele (Chin et al., 2008) Kiểm tra

2.2.5 Cấu trúc kháng nguyên và độc lực

Tới nay vẫn chưa có bất kỳ phát hiện hay nghiên cứu nào cho thấy cấu

trúc đặc trưng – các thành phần như lông pili, tua diềm, plasmid hay các yếu tố độc lực được báo cáo (Van Empel and Hafez, 1999; Chin et al., 2008) Tất cả các chủng cho thấy khả năng bám dính của các tế bào biểu mô khí quản gà.

Mặc dù vi khuẩn ORT được xác định là một vi sinh vật không dung huyết (Van Empel and Hafez, 1999; Hafez, 2002; Canal et al., 2005; Chin et al., 2008) ORT không gây phản ứng trên môi tường thạch đường sắt ba (Back et al., 1998) Tuy nhiên, sự hoạt động của β-hemolytic rất rộng và bất thường được báo cáo ở Bắc Mỹ và Argentina sau khi phân lập và nuôi cấy 48 giờ ủ ở nhiệt độ phòng (Tabatabai et al., 2010; Walters et al., 2014) β -hemolytic của ORT phân lập được được xét nghiệm trong phòng thí nghiệm để quan sát sự dung huyết các tế bào máu cừu (Tabatabai et al., 2010) Walters et al (2014)

đã tiến hành một xét nghiệm gây chết phôi để xác định sự khác biệt về độc lực giữa chủng dung huyết và không dung huyết của ORT được phân lập từ

gà tây ở Virginia's Shenandoah Valley, Mỹ Kết quả cho thấy phôi gây nhiễm bằng chủng dung huyết có tỷ lệ tử vong cao hơn Điều đó chứng tỏ chủng dung huyết nguy hiểm hơn chủng không dung huyết.

2.2.6 Sức đề kháng

ORT có thể sống một ngày ở 37 o C, 6 ngày ở 22 o C, 40 ngày ở -40 o C

và ít nhất 150 ngày ở -102 o C Sự tồn tại của ORT ở nhiệt độ thấp có liên quan tới sự bùng phát các trường hợp bệnh tập trung vào các tháng mùa đông của năm Chúng không thể tồn tại quá 24 giờ ở nhiệt độ 42 o C.

Các chủng vi khuẩn ORT nhạy cảm với các yếu tố vật lý, hóa học Vi khuẩn bị vô hoạt hoàn toàn bởi dung dịch chứa formic và glyoxyl acid 0,5%, dung dịch có chứa hợp chất của aldehyde-based (20% glutaraldehyde) 0,5% sau 15 phút Các dung dịch hỗn hợp 0,5% này cũng có thể vô hoạt ORT invitro trong 15 phút (Hinz et al., 1994) 2.3 TRUYỀN NHIỄM HỌC

tuổi gà giò và gà lớn Gà thịt công nghiệp thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 3 đến tuần thứ 6 Gà lông mầu, gà hậu bị, gà đẻ và gà giống thường mắc ở độ tuổi từ tuần thứ 6 trở đi và trong suốt quá trình đẻ trứng.

Nhiều ca bệnh của ORT thường được phát hiện gây bệnh ghép với các nguyên nhân gây bệnh hô hấp khác như Escherichia coli, Mycoplasma synoviae,

et al., 2012) Hầu hết các thí nghiệm nghiên cứu đều kết luận rằng, khi gây bệnh riêng lẻ do chính nó gây ra, ORT thường chỉ gây các triệu chứng tối thiểu ở gà

và gà tây Chúng chỉ thực sự có triệu chứng bệnh nghiêm trọng khi đồng thời kết hợp với các virus, vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp khác.

Tuy nhiên, cũng có một số nghiên cứu cho rằng các tổn thương nghiêm trọng tương tự như trong thực địa ở gà và gà tây chỉ xuất hiện khi gây nhiễm thực nghiệm chỉ với ORT.

2.3.2 Chất chứa mầm bệnh

Cho đến nay có rất ít báo cáo chi tiết về khả năng ORT định vị tại các

cơ quan của gà bị nhiễm bệnh Vi khuẩn ORT đã được phân lập từ màng nhầy niêm mạc mũi, khí quản và phổi cho đến ngày thứ 7 sau khi nhiễm trùng, tuy nhiên không có triệu chứng lâm sàng của bệnh Số lượng trung bình các đơn vị hình thành của chủng tái tổ hợp trên một gram của màng nhầy khí quản tăng lên, đạt được mức tối đa vào ngày 3 - 4 sau khi nhiễm bệnh (khoảng 6 log10 CFU/gram mô) Sau thời gian này giá trị giảm nhanh, vào ngày thứ 7 sau khi nhiễm bệnh không tìm thấy ORT (Marien et al., 2006).

ORT cũng được phân lập từ buồng trứng và ống dẫn trứng 3 ngày sau khi nhiễm khuẩn đường ruột của chim Sự hiện diện của vi khuẩn trong buồng trứng và ống dẫn trứng đã khẳng định trong giai đoạn cấp tính cho thấy việc truyền ORT qua đường giao phối (Travers et al., 1996).

Ở gà bệnh có thể tìm thấy vi khuẩn ORT ở trong phổi, túi khí, chất tiết của đường hô hấp như: nước mũi, nước mắt, dịch nhầy khí quản và ở hai bên phế quản.

2.3.3 Phương thức truyền lây

ORT xuất hiện và truyền ngang thông qua sự tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với mầm bệnh có trong không khí hay nước uống Do đó, các chuồng hở, sự thông thoáng của chuồng nuôi tạo điều kiện cho quá trình phát tán bệnh trở nên

dễ dàng hơn.

Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể gà chủ yếu qua đường hô hấp, sinh sôi và phát triển ở niêm mạc đường hô hấp, sau đó đến cư chú ở cơ quan đích là phổi, hai phế quản gốc và gây nên bệnh tích đặc trưng của bệnh do ORT ở đó.

Bệnh lây truyền từ gà bệnh cho gà khỏe qua tiếp xúc trực tiếp Gà bệnh bài thải mầm bệnh ra ngoài không khí qua chất tiết đường hô hấp (hắt hơi) và từ

đó lây cho gà khỏe bằng đường hít thở Ngoài ra, mầm bệnh có thể lây lan theo đường gió, qua dụng cụ chăn nuôi, xe vận chuyển, động vật mang mầm bệnh và con người cũng đóng vai trò lớn trong sự truyền lây của bệnh do ORT.

Ở những vùng chăn nuôi gà tập trung theo hình thức công nghiệp nhưng không đảm bảo các điều kiện vệ sinh như môi trường

ô nhiễm (mùi phân, độ thông thoáng kém…) hay nuôi gà nhiều độ tuổi khác nhau trong cùng một khu vực luôn là điều kiện lý tưởng cho bệnh do ORT bùng phát và lây lan với tốc độ nhanh.

Ngoài ra, vi khuẩn này có những bằng chứng cho thấy chúng có khả năng truyền dọc ORT cũng được phân lập từ buồng trứng, ống dẫn trứng, trứng nở, trứng đã thụ tinh, trứng không được thụ tịnh, trứng đã chết phôi

và chết bệnh trong vỏ trứng của gà và gà tây Tuy nhiên, khi tiêm ORT vào trứng đã có phôi, phôi được giết ở ngày thứ 9 và không phân lập được ORT

từ trứng đó Như vậy, có thể thấy rằng ORT không truyền qua trứng trong quá trình ấp (Hinz et al., 1994; Nguyễn Thị Lan và cs., 2014).

2.3.4 Định serotype và phân loại chủng

Sử dụng boiled extract antigens (BEAs) và huyết thanh đơn trong agargel precipitation (AGP) và kít ELISA để định type, 18 serotype (từ A tới R) của ORT

đã được ghi rõ Serotype A là serotype phổ biến nhất trong các chủng phân lập

từ gà (97%) và từ gà tây (61%) Dường như có sự tương quan về mối quan hệ giữa nguồn gốc địa lý của ORT phân lập với các serotype của chúng Serotype C

có thể phân lập được chỉ từ gà và gà tây ở Nam Mỹ và Mỹ Không thấy các dấu hiệu đặc trưng của các serotype ở các vật chủ.

Hafez and Sting (1999) so sánh hiệu quả của việc sử dụng các kháng nguyên tách chiết từ các chủng (heat-stable, proteinase K-stable và sodium dodecyl sulfate) trong định type ORT bằng xét nghiệm AGP và ELISA Kết quả chỉ ra rằng với các xét nghiệm AGP với kháng nguyên các chủng bằng heat-stable hay proteinase K-stable là phương pháp thích hợp cho định type.

Sử dụng một phương pháp thực nghiệm mới kết hợp với suy giảm miễn dịch và vận chuyển thụ động của hệ miễn dịch trong cùng một cơ thể, thấy rằng kháng thể trung gian gây miễn dịch ở gà là một thành phần quan trọng trong bảo vệ giúp chống lại ORT (Schuijffel et al., 2005).

2.3.5 Khả năng gây bệnh

Các mầm bệnh khác nhau xuất hiện và tồn tại giữa các chủng ORT phân lập Ba chủng ORT phân lập từ các vùng thuộc Nam Phi được tiêm vào túi khí của gà thịt 28 ngày tuổi cho thấy sự khác nhau về hiện tượng viêm túi khí và viêm khớp Ngoài ra, Van Veen et al (2000) phát hiện được rằng các chủng vi khuẩn phân lập từ Hà Lan và Nam Phi có đặc tính gây bệnh nghiêm trọng hơn là các chủng phân lập từ gà thịt của Mỹ khi thí nghiệm.

Khả năng gây bệnh của 119 chủng được phân lập từ gà tây và gà thường

sử dụng thử nghiệm gây chết phôi để nghiên cứu Nghiên cứu này cho thấy tiêm khoảng 500 cfu ORT vào túi niệu của gà 11 ngày tuổi, phân tách giữa bên gây bệnh và bên không gây bệnh phân lập được Trên cơ sở tỷ lệ chết phôi, có thể chia ra các nhóm không gây bệnh có tỷ lệ chết phôi từ 10-20%, nhóm gây bệnh

2.4 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH DO ORT

2.4.1 Triệu chứng của gà mắc bệnh do ORT

Triệu chứng lâm sàng, trong suốt giai đoạn bệnh và tỷ lệ chết vì bệnh do ORT ở các ổ dịch bùng phát diễn biến khá đa dạng Chúng thường chịu ảnh hưởng bởi các nhân tố môi trường như quản lý chăm sóc kém, độ thông thoáng

chủng loại mầm bệnh thứ phát (Charlton et al., 1993; Hinz et al., 1994).

Triệu chứng lâm sàng ở gà thịt thương phẩm thường xuất hiện ở 3-6 tuần

tuổi với tỷ lệ chết vào khoảng 2-10% với các triệu chứng ủ rũ, giảm ăn, giảm tăng trọng, tăng tiết dịch và vẩy mỏ, kèm theo các hiện tượng phù mặt (Sprenger et al., 1998) ORT có thể là nguyên nhân gây chết đột ngột (dưới 20% trong 2 ngày) ở gà con với sự nhiễm trùng não và xương sọ kèm theo hoặc không kèm theo các triệu chứng hô hấp.

Ở giống gà bố mẹ, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn đầu của gà đang

đẻ đạt đỉnh hay ngay trước khi đưa gà lên chuồng đẻ Có sự tăng nhẹ tỷ lệ chết, giảm ăn và các triệu chứng hô hấp nhẹ Tỷ lệ chết thường biến động

và ít có liên hệ ở các ca không bị ghép bệnh Có thể gặp các biểu hiện giảm đẻ, giảm kích thước trứng và chất lượng vỏ trứng kém Tỷ lệ có phôi

và khả năng ấp nở cũng có thể bị ảnh hưởng (Chin et al., 2008).

Ở gà đẻ thương phẩm, giảm đẻ, tăng trứng méo và tăng tỷ lệ chết có liên quan tới nhiễm ORT.

Roepke (1996) đã tìm ra rằng các triệu chứng bệnh và tỷ lệ chết cao hơn ở các gà tây trưởng thành và các gà con chủ yếu chỉ có các triệu chứng thông thường Ở một số trường hợp, gà con mắc bệnh từ 2 đến 8 tuần tuổi Tỷ lệ chết thường trong khoảng 1-15% trong pha cấp (8 ngày), nhưng tỷ lệ nhiễm có thể tăng cao với tỷ lệ chết tới 50% (De Rosa et al., 1996; Back et al., 1998).

Các triệu chứng ban đầu bao gồm ho, vẩy mỏ và kèm theo dịch nhầy Ở một số trường hợp có hiện tượng trụy hô hấp nặng, khó thở, vươn cổ và viêm xoang mũi (Charlton et al., 1993) Các triệu chứng sẽ kéo dài hiện tượng giảm ăn và giảm uống nước Ở đàn gà tây giống, cũng có hiện tượng giảm đẻ và tăng tỷ lệ ấp nở không đạt tiêu chuẩn.

ORT được báo cáo là nguyên nhân gây ra các triệu chứng thần kinh hoặc liệt do viêm màng não, viêm xương và viêm tủy xương ở gà và gà tây (Moreno et al., 2009).

2.4.2 Bệnh tích của gà mắc bệnh do ORT

Bệnh tích đại thể

phổi, viêm màng phổi và viêm túi khi Khi giết thịt hoặc kiểm tra sau giết mổ sẽ thấy dịch dạng bọt, màu trắng, chất dịch tiết này có màu giống sữa chua và có thể thấy rõ trong các túi khí (thùy túi bụng trước), hầu hết các tổn thương chỉ tiến triển ở một bên thùy phổi Ở gà có thể có hiện tượng phù thũng dưới da mặt, tại các điểm tiếp giáp với sụn gây ra viêm đầu, viêm xương, viêm xương

tủy và viêm màng não được báo cáo thấy ở gà (Van Empel and

Hafez, 1999; Moreno et al., 2009).

Ở gà tây, có hiện tượng phù và viêm một bên thùy phổi hoặc đối xứng

2 bên với các tơ huyết trên màng phổi Ngoài ra, có thể có các hiện tượng viêm mủ tơ huyết gây viêm túi khí, ngoại tâm mạc, màng bao tim và khí quản Trong một số trường hợp, gan và lách có thể sưng cũng như có sự biến đổi

ở cơ tim có thể quan sát được Hiện tượng nhiễm khuẩn tại khớp, xương sống có thể bắt gặp ở gà lớn (Hinz et al., 1994; Sprenger et al., 1998).

Bệnh tích vi thể

Các tổn thương vi thể gặp hầu hết tại phổi, màng phổi và túi khí Phổi sung huyết, trong tất cả nhu mô có một lượng lớn hỗn hợp các fibrin lẫn với đại thực bào và tế bào heterophil (bạch cầu trung tính) nằm tự do trong lòng các mao mạch, phế nang và đoạn cuống phổi Sự khuyếch tán

và thâm nhiễm các đại thực bào với số lượng ít hơn các tế bào heterophil.

rộng Ổ hoại tử thường chứa đầy hỗn hợp của các tế bào hoại tử, heterophil thâm nhiễm hoặc chất tiết, và có thể có sự phân tán thành các cụm nhỏ của vi khuẩn Do có các cục huyết khối nên nhiều mao mạch bị căng phồng Màng phổi

và túi khí có thể dày lên và phù nề do lắng đọng tơ huyết ở các kẽ, sự xâm nhiễm của các tế bào bạch cầu trung tính, rải rác các ổ hoại tử nhỏ có sự thâm nhiễm của các bạch cầu trung tính và xơ hóa (Charlton et al., 1993).

2.5 CHẨN ĐOÁN

2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào các triệu chứng lâm sàng: ủ rũ, giảm ăn, giảm uống nước,

ở gà đẻ có hiện tượng giảm đẻ, tỷ lệ trứng ấp nở không đạt tiêu chuẩn.

Các triệu chứng điển hình của bệnh hô hấp phức hợp trên gà như: ho, vẩy mỏ kèm theo dịch nhầy, một số trường hợp có hiện tượng trụy hô hấp, khó thở, vươn cổ và viêm xoang mũi.

Bệnh tích điển hình như viêm phổi hóa mủ, viêm màng phổi, viêm túi khí, túi khí dày lên, gan lách có thể sưng.

2.5.2 Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn

Các mô, cơ quan như phổi, khí quan, túi khí được xem là tối ưu nhất khi

sử dụng để phân lập được ORT Ngoài ra, xoang dưới hốc mắt và hốc mũi

cũng là những vị trí phù hợp phục vụ cho việc nuôi cấy, nhưng ORT dễ dàng bị bao phủ bởi sự phát triển quá nhanh của các vi khuẩn khác Nuôi cấy vi khuẩn từ máu tim và mô của gan dưới các điều kiện thực

tế cho kết quả âm tính, mặc dù trước đó vi khuẩn đã được phân lập từ các cơ quan cũng như ở các khớp xương, não, buồng trứng và ống dẫn trứng sau khi gây bệnh thực nghiệm (Hassanzadeh et al., 2010).

ORT cũng có thể được phân lập một cách thông thường, trên thạch máu thường hoặc thạch chocolate (Charlton et al., 1993) Khuẩn lạc phát triển tốt trong 24 giờ, nhưng tốt nhất nên giữ các đĩa gây nhiễm từ 48-72 giờ trong điều kiện không khí làm giàu 5-10% CO 2 Khuẩn lạc sẽ xuất hiện

có kích thước từ đầu định ghim tới nhỏ (đường kính khoảng 1-2mm), màu xám tới trắng, mặt lồi và cạnh sắc nét Nhuộm Gram cho kết quả vi khuẩn Gram âm đa hình thái đặc trưng Khuẩn lạc âm tính với catalase và dương tính với oxidase Nuôi cấy ORT thuần khiết có mùi riêng biệt, tương tự như mùi acid butyric Các thử nghiệm bổ sung là rất cần thiết để xác định các đặc tính của ORT (Charlton et al., 1993; Hassanzadeh et al., 2010).

Trong các mẫu bị tạp nhiễm với sự phát triển nhanh của các vi khuẩn khác như E.coli, Proteus sp hoặc Pseudomonas sp, khuẩn lạc ORT có thể phát triển quá mức và rất khó để xác định khi kiểm tra thường xuyên Vì đã chứng minh được rằng hầu hết các ORT đều kháng Gentamycin, nên khuyến khích sử dụng 10µg Gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để có thể phân lập được ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm Thạch máu có chứa 5µg/ ml Gentamycin và Polymixin B cũng cho hiệu quả tốt (Charlton et al., 1993).

Kiểm tra ngưng kết nhanh trên phiến kính cũng được sử dụng cho mục đích chẩn đoán Trong một nghiên cứu với 112 mẫu phân lập, tuy nhiên hiện tượng tự ngưng kết thường xuất hiện (Charlton

et al., 1993; Soriano et al., 2002; Zahra et al., 2013).

Kiểm tra Accelerated Graphics Port (AGP) sử dụng kháng huyết thanh dương tính đã biết có thể sử dụng để xác định và định type ORT đã phân lập (Charlton et al., 1993).

Một phương pháp khác được sử dụng để phát hiện các chủng phân lập nghi ngờ là PCR.

2.5.3 Phát hiện kháng nguyên

PCR được sử dụng để phát hiện các ORT trong mẫu dịch khí quản được

lấy từ các gà mắc bệnh nặng Ngoài ra, xét nghiệm bằng miễn dịch huỳnh quang cũng đã được sử dụng để phát hiện ORT trên gà Sau đó, van Veen et

al (2000) đã thấy rằng các xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang và kỹ thuật peroxidase-anti peroxidase (PAP) nhạy cảm như nhau Sử dụng các xét nghiệm này có thể xác định một tỷ lệ nhiễm ORT cao ở đàn gà thịt sau giết

mổ khi so sánh với các phương pháp chẩn đoán thông thường như huyết thanh học và vi khuẩn học (Charlton et al., 1993; Hassanzadeh et al., 2010).

2.5.4 Huyết thanh học

Huyết thanh học rất hữu dụng trong việc giám sát cũng như

hỗ trợ chẩn đoán bệnh do ORT.

Các phản ứng kiểm tra ngưng kết huyết thanh trên tấm (SPAT) được

sử dụng như một xét nghiệm nhanh cho việc phát hiện các kháng thể chống lại ORT Tuy nhiên, SPAT chỉ phát hiện được 65% gia cầm bị nhiễm bệnh trong hai tuần đầu gây nhiễm và giảm đáng kể ở các thời gian tiếp theo Điều này cho thấy SPAT chỉ phát hiện được kháng thể IgM, loại chỉ có khả năng gây ngưng kết với một kháng nguyên đặc hiệu Hầu hết các SPAT chỉ phản ứng với một serotype nhất định, dù cho phản ứng chéo xảy ra.

ELISA đã được phát triển bằng sử dụng các serotype khác nhau và chiết tách kháng nguyên của ORT Kháng nguyên cô đặc được sử dụng cho việc định type, có khả năng cho những kết quả chính xác nhất cho các serotype cụ thể Ngược lại kháng thể SDS chiết tách và dịch tiết từ lớp màng protein của ORT sẽ cho kết quả nhiều phản ứng kháng chéo, cho phép phát hiện các kháng thể chống lại của nhiều serotype khác nhau trong cùng một lần xét nghiệm.

Điều tra thực địa sử dụng các kỹ thuật ELISA hoặc bộ kit ELISA thương mại (VDPro ® CSFV AB C-ELISA) rất hữu dụng khi theo dõi đàn gia cầm và chẩn đoán mắc ORT.

Erganiş et al (2002) phát triển phương pháp DIA (Dot Immunobinding Assay), một xét nghiệm dường như ít nhạy hơn so với các xét nghiệm ngưng kết khác.

2.5.5 Chẩn đoán phân biệt

Các tổn thương do ORT gây ra trên hệ thống hô hấp khá giống với các nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp khác như E.coli, Pasteurella mutocida, Ranatipestifer, Haemophilus paragallinarum và Chlamydophyla psittaci

và da chân xung huyết màu thâm tím.

Gà có các triệu chứng cảm mạo như chảy nước mũi, dịch nhày màu xám, khó thở, vươn cổ để thở, thở khò khè, hắt hơi Con vật chảy nước mắt, viêm kết mạc mắt, nhắm mắt Sưng phù đầu, mào tích sưng phù, màu tím sẫm.

Con vật có triệu chứng thần kinh: co giật, mất thăng bằng, vận động xoay tròn Gà bị ỉa chảy.

Bệnh CRD

Những triệu chứng chung nhất trong đàn gia cầm trưởng thành mắc bệnh tự nhiên bao gồm: khí quản có tiếng ral, chảy nước mũi và ho; thức ăn tiêu thụ giảm, giảm tăng trọng.

Trong các đàn gà đẻ, sản lượng trứng giảm và thường giữ ở mức thấp Một số các biểu hiện khác gồm: sưng khớp, què, mất điều hòa thần kinh,

sưng đầu, sưng phù mí mắt, chảy nước mắt, kém ăn, mỏ và chân khô, chân kém bóng láng.

Bệnh Newcastle

Trong đàn xuất hiện một số con ủ rũ, kém hoạt động, bỏ ăn lông xù lên, cánh xã như khoác áo tơi Gà con chậm chạp, thường đứng tụ lại thành đám, gà lớn tách đàn thích đứng một mình, con trống thôi gáy, con mái ngừng đẻ Trên nền chuồng thấy xuất hiện nhiều bãi phân trắng như phân cò Gà thường sốt cao 42,5 - 43 o C.

Sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên, gà lờ đờ rồi trở lên khó thở trầm trọng Từ trong mũi chảy ra một chất nhớt màu đỏ nhạt hoặc trắng xám hơi nhớt Gà bệnh hắt hơi, vẩy mỏ liên tục thường kêu thành tiếng ‘‘toác toác“; bệnh nặng gà không thở được bằng mũi; do có nhiều fibrin màu xám xẫm ở niêm mạc miệng, hầu, họng, xoang mũi cho nên gà phải vươn cổ, há

mỏ ra để thở Xung quanh mặt và đầu thường bị phù thũng.

Gà bệnh bị rối loạn tiêu hóa trầm trọng: gà bỏ ăn, uống nhiều nước Thức ăn

ở diều không tiêu, nhão ra do lên men, sờ tay vào diều như sờ vào túi bột Khi cầm chân gà dốc ngược lên từ mồm sẽ chảy ra một chất nước nhớt, mùi chua khắm Con vật ỉa chảy lúc đầu còn đặc, có thể lẫn máu, mầu nâu sẫm; sau loãng

dần có màu trắng xám do chứa nhiều muối urat Lông đuôi gà bẩn, dính bết phân.

Niêm mạc hậu môn xuất huyết có những tia máu đỏ.

Mào, yếm gà bị ứa máu màu tím bầm trong thời gian khó thở, sau chuyển màu tái dần do mất máu Gà bị run cơ, cổ nghẹo, liệt chân và cánh, biểu hiện tư thế opisthotonus.

Bệnh IB (Viêm phế quản truyền nhiễm)

Gà con có triệu chứng hô hấp rất đặc trưng: thở khó, thở khò khè ngắt quãng, ho, hắt hơi, chảy nước mũi, chảy nước mắt, xoang bị sưng to, viêm hầu họng làm cho con vật khó thở Gà mệt mỏi thường nằm tụm lại dưới nguồn nhiệt Gà giảm ăn và tăng trọng giảm rõ rệt.

Gà trên 6 tuần tuổi và chim trưởng thành cũng có triệu chứng tương tự trên, nhưng hiện tượng chảy nước mũi không phải là triệu chứng thường gặp Gà có hiện tượng sưng mặt.

Gà thịt thương phẩm mắc phải một trong những chủng virus gây bệnh ở thận có thể qua khỏi giai đoạn bệnh ở đường hô hấp, nhưng sau đó trở nên yếu ớt, mệt mỏi, lông xù, phân ướt, uống nhiều nước.

Gà đẻ, tỷ lệ đẻ và chất lượng trứng giảm là triệu chứng đặc trưng bên cạnh những triệu chứng ở đường hô hấp, có thể ngừng đẻ hoặc tỷ lệ đẻ giảm 10-50% Tỷ lệ trứng dị hình tăng lên, tỷ lệ ấp nở giảm Chất lượng bên trong quả trứng cũng bị giảm sút Lòng trắng lỏng và nhiều nước, không có ranh giới rõ ràng giữa lòng trắng đặc (phần bao quanh lòng đỏ) và lòng trắng lỏng.

Bệnh ILT (Viêm thanh quản truyền nhiễm)

Gà chảy nước mũi, có mủ, khò khè, ho, thở khó Ban đầu gà kém ăn, mệt mỏi, hắt hơi, sổ mũi Từ khóe mắt, hốc mũi dịch nhớt chảy ra khô thì quánh lại Sau 1-2 ngày bệnh trầm trọng hơn Do khó thở, con vật thường vươn cổ, từng lúc ho khan hoặc há mỏ nuốt không khí Nếu ổ viêm tập trung

ở vùng hầu họng có thể nghe thấy tiếng ran ướt khi con vật thở Gà ngày càng khó thở, ho và hắt hơi bắn ra ngoài niêm dịch đặc có lẫn máu Trên mỏ, mặt, lông gà có các vệt máu Nếu vạch miệng gà, có thể thấy trên niêm mạc miệng và hầu họng có những lớp màng giả màu vàng xám, to nhỏ không đều, dễ bóc Nhiều trường hợp màng giả phủ kín cả niêm mạc hầu họng Bệnh ở thể cấp tính, tỷ lệ mắc lên đến 100% và tỷ lệ chết khoảng 50%-100%.

Ở thể bệnh nhẹ gà giảm tỷ lệ đẻ (10-40%), chảy nước mắt, viêm

và xuất huyết kết mạc mắt, xoang dưới mắt sưng to, chảy nước mũi.

độ chăn nuôi lớn (Roepke et al., 1998; Hafez and Schulze, 2003) + Phòng bệnh bằng vacxin

Phòng bệnh bằng vacxin trên gà thịt bằng vacxin vô hoạt được khuyến cáo là hiệu quả (van Empel, 1998; Van Veen et al., 2004) Nhưng đương nhiên

nó không có tính thực tiễn ở các gà thương phẩm Vacxin dành cho gà thịt giống là vacxin vô hoạt bổ sung kích thích sản sinh kháng thể cho gà bố mẹ (Cauwerts et al., 2002; Bisschop et al., 2004), đủ để bảo vệ đàn gà con cháu khi công cường độc thí nghiệm ở gà trên 4 tuần (van Empel, 1998) và làm giảm tỷ lệ chết cũng như tỷ lệ mắc lại ở thế hệ gà con cháu từ người nuôi Hơn nữa, việc sử dụng cách phun đối với vacxin sống ở 14 ngày tuổi kết quả cho tỷ lệ viêm túi khí và viêm phổi thấp nhất khi công cường độc.

Schuijffel et al (2005) đã chứng minh rằng khả năng tạo miễn dịch chéo chống lại các chủng ORT khác nhau có thể được sinh ra nhờ tiêm vacxin sống ở gia cầm Các gen mã hóa 8 kháng nguyên tạo phản ứng chéo được khuếch đại, nhân bản trong một vector biểu hiện, đưa vào E.Coli Protein tái tổ hợp với một khối lượng phân tử nằm trong khoảng 35,9-62,9 kDa được trọn lẫn và thử nghiệm như một loại vacxin.

Sprenger et al (1998) đã chủng vacxin cho gà tây 6 tuần tuổi với một loại vacxin sống hoặc tiêm dưới da với một loại vaccine ORT vô hoạt và công cường độc bằng đường khí quản với ORT sống ở 14 hoặc 21 tuần tuổi Hiện tượng viêm túi khí và viêm phổi thường thấy thấp hơn so với các gà không chủng vacxin sau công cường độc; ORT lưu lại trong đàn gà không chủng vacxin ở nhóm chủng vacxin thì không hoặc gà không công cường độc.

Một chủng đột biến do nhạy cảm với nhiệt độ của ORT được phát triển và được sử dụng như vacxin sống cho đàn gà tây (Lopes et al., 2002) Đàn gà tây

được sử dụng vacxin lúc 5 ngày tuổi qua đường nước uống và công cường độc sau 7 ngày dùng vacxin Những con được dùng vacxin có những biểu hiện bệnh tích đại thể được đánh giá thấp hơn đáng kể, cũng như một tỷ lệ thấp hơn bị phân lập lại và số lượng thấp hơn đơn vị khác của ORT ở mỗi gram mô phổi so với những con không dùng vacxin, có khả năng bảo hộ cho

gà tây nhưng không thí nghiệm kiểm chứng nào được thực hiện mà cho kết quả là có giá trị và hiệu quả, tính an toàn của chủng này (Hafez et al., 1999).

Chủng vacxin cho gà tây với chủng tự sinh vô hoạt đã thành công trong việc làm giảm sự bùng phát dịch ORT trên gà tây ở Israel (Bock et al., 1997).

Roepke (1996) đã sử dụng một chủng vacxin sống tư sinh theo đường uống cho gà tây ở 6 tuần tuổi kết quả cho thấy cũng có hiệu quả làm giảm mức độ tổn thương và tỷ lệ gây chết khi chúng trưởng thành Điều rất thú vị

ở đây là ngay sau đó đàn gà này được chủng bằng đường phun sương với vacxin sống phòng bệnh Newcastle mà không gặp bất kỳ vấn đề gì.

Do khả năng gây nhiễm với rất nhiều chủng khác nhau nên việc sử dụng nhiều chủng vi khuẩn trong vacxin là rất cần thiết 2.6.2 Điều trị

Nói chung, các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn trong chăn nuôi gia cầm có thể được điều trị hoặc kiểm soát bằng kháng sinh kết hợp với các biện pháp vệ sinh Tuy nhiên, việc điều trị ORT bằng kháng sinh gặp rất nhiều khó khăn bởi rất nhiều chủng của ORT có khả năng làm giảm độ nhạy hoặc có tính kháng cao với nhiều loại kháng sinh Tính nhậy cảm với thuốc kháng sinh của ORT phụ thuộc vào các loài gia cầm mắc bệnh và vùng địa lý Các chủng ORT phân lập ở Châu Âu thường đề kháng với Trimethoprim/Sulphonamide, Gentamycin, Spectinomycin, Neomycin, Enrofloxacin và Colistin (Van Beek, 1994; Hafez, 1996; van Empel, 2002) nhạy cảm với Ampicillin, Ceftiofur, Doxycyline, Lincomycin, Tetracycline, Chloramphenicol, Amoxycillin, Penicillin và Tylosin (Hafez, 1996) Ở hầu hết các vùng trên thế giới, ORT nhạy cảm với Doxycycline và Tetracycline (Van Beek, 1994; Hafez, 1996) Tính nhạy cảm với kháng sinh còn phụ thuộc vào chế độ sử dụng kháng sinh ở ngành chăn nuôi gia cầm ở các quốc gia, khu vực khác nhau Ví dụ: ở một số quốc gia, trứng thường được nhúng vào một loại kháng sinh như Enrofloxacin thì gần như tất cả các chủng sẽ có thể kháng với kháng sinh đó.

Năm 2002, Hafez báo cáo rằng cho uống Amoxicillin pha với liều 250ppm cho 3 – 7 ngày cho kết quả khá tốt ở nhiều trường hợp và việc sử dụng Chlortetracycline với liều 500ppm pha nước uống 4 – 5 ngày cũng cho hiệu quả Một vài trường hợp, tiêm Tetracycline và Penicillin cũng cho hiệu quả cao.

Ngoài ra, theo một số nghiên cứu ở các nước như Đức, Mỹ thì các chủng phân lập ở mỗi nước sẽ có độ mẫn cảm khác nhau với một số loại kháng sinh như Ampicillin, Erythromycin, Tylosin, Neomycin,…(Hinz et al., 1994) Khi gây bệnh nhẹ, ở giai đoạn đầu chỉ cần cho tổng đàn uống kháng sinh Amoxycilin hoặc Ampicillin với liều 25mg/ kg thể trọng liên tục trong 3 – 5 ngày Nếu bệnh tiến triển nhanh và nặng thì ngoài việc cho uống kháng sinh với liều lượng và liệu trình như trên cần phải tiêm thêm Gentamycine với liều 8mg/ kg thể trọng.

Trong điều trị bệnh do ORT, việc chăm sóc tốt và bổ sung các vitamin và khoáng chất rất quan trọng Việc giữ cho tiểu khí hậu chuồng nuôi, môi trường xung quanh được thông thoáng, sạch sẽ

là rất cần thiết, giúp công tác điều trị bệnh đạt hiệu quả cao.

PHẦN 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Huyện Ba Vì - Hà Nội

Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 – Khoa Thú

Y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.

3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Gà thả vườn Ba Vì ở các nhóm tuổi khác nhau nghi nhiễm ORT nuôi tại các hộ, trang trại chăn nuôi ở huyện Ba Vì – Hà Nội 3.3 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Tháng 10/2016 đến tháng 9/2017.

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT

- Chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR

- Các triệu chứng lâm sàng của đàn gà mắc bệnh do ORT

Một số đặc điểm dịch tễ của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT

Điều tra tình hình mắc bệnh do ORT trên đàn gà theo lứa tuổi, mùa vụ và truyền thống chăn nuôi.

Biện pháp phòng và trị bệnh

- Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh

- Xác định tính mẫn cảm của chủng ORT phân lập được với kháng sinh và thử nghiệm điều trị

- Xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh.

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

Chúng tôi tiến hành theo dõi, quan sát và lấy mẫu gà trên các đàn gà nghi nhiễm ORT nuôi tại các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội; sau đó ghi chép các triệu chứng lâm sàng của gà nghi nhiễm ORT còn sống Gà có các triệu chứng như: ủ rũ, gà ngáp khó thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm, đau mắt…

3.5.2 Phương pháp mổ khám

Với những gà có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y.

Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).

Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…

Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong

Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm.

Xử lý tiêu độc xác gia cầm.

3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.

Mẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng vùng tổn thương điển hình, lấy đủ (đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lượng cần thiết).

Mẫu có thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi Ta lấy mẫu theo phương pháp sau:

Đối với dịch ngoáy mũi và dịch ngoáy hầu họng dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi/ hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70 o để một thời gian cho dịch thấm vào tăm bông ─> Để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển (Stuart Transport Medium), môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đưa về phòng thí nghiệm sau sau 2-8h Nếu

ở xa phòng thí nghiệm thì môi trường vận chuyển phải để ở tủ lạnh Sau vận chuyển bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp.

Đối với dịch khí quản hay phế quản: dùng kéo vô trùng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đó dùng tăm bông vô trùng đưa dọc theo đường ống để lấy dịch Đặt tăm bông vào môi trường như trên, đậy nút, ghi nhãn và vận chuyển về phòng thí nghiệm.

Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.

Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên.

3.5.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

Phân lập vi khuẩn là việc tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đưa vi khuẩn về dạng thuần khiết Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Bằng các phương pháp phân lập vi sinh vật sẽ phân lập được vi khuẩn thuần khiết để từ đó xác định một số đặc điểm sinh vật, hoá học gây bệnh của vi khuẩn.

Mẫu sau khi lấy về được xử lý, nuôi cấy trên các môi trường thạch máu

cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt.

Khuẩn lạc ORT được nuôi cấy trên môi trường thạch máu Columbia có bổ sung 5% Gentamycin nuôi ở 37 o C là những khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết ra xung quanh, màu xám tới xám trắng, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng Không mọc trên môi trường Macconkey.

3.5.5 Phương pháp nhuộm Gram

Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians không bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím gentians còn vi khuẩn Gram âm bắt mầu hồng của fucshin

Các bước tiến hành:

Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản:

Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1 – 3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước để khô trong điều kiện tự nhiên Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2

– 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt

mầu tốt hơn Bước 2: Nhuộm màu:

Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước

Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước Khử

màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô.

Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô.

Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với

độ phóng đại 100.

3.5.6 Phương pháp PCR

PCR được sử dụng để phát hiện sự có mặt của ORT trong mẫu dịch khí quản được lấy từ gà mắc bệnh Thành phần của PCR là: đoạn DNA đích, các mồi có trình tự bổ sung với DNA đích, hỗn hợp của 4 loại base và một DNA-polymerase phù hợp.

3.5.6.1 Phương pháp chiết tách DNA

Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:

Bước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf Thêm 180

µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56 o C trong 3 giờ.

Bước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL Ủ ở 70 o C trong 30 phút.

Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.

Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch ở dưới.

Bước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dưới.

Bước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong

2 phút, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.

Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml Thêm 100 µl Buffer

AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20 o C 3.5.6.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR

Thành phẩn của phản ứng PCR:

Nội dung Nuclease-Free Water

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen rnn: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G; OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT (Charlton et al., 1993).

2

3 4

3.5.6.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Bước 1: Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 10ml

10µl Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.

Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thêm 2µl loading dye vào 8µl sản phẩm RT-PCR

Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.

Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6µl marker 100bp và 10µl sản phẩm PCR mỗi giếng.

Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.

Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.

3.5.7 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được.

Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch.