Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày

Luận văn được thực hiện với mục tiêu nhằm đánh giá tác động của ATRA lên sự phiên mã của các gen chính trong con đường tín hiệu phân tử EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày, cũng như ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen apoptosis. Mời các bạn cùng tham khảo.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––

MAI VĂN LINH

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN – 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

––––––––––––––––––––

MAI VĂN LINH

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ

DẠ DÀY

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Mai Văn Linh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu tại Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, em đã nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các thầy cô trong khoa, các phòng ban trong nhà trường

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy giáo - TS Nguyễn Phú Hùng, Thầy đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp

đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em học tập, tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học và bộ phận Đào tạo sau đại học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt quá trình em học tập tại trường

Đề tài luận văn đã nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ, mã số B2017 - TNA - 48

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị lớp Cao học K11 đã luôn cổ vũ, động viên em hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019

Tác giả

Mai Văn Linh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày 3

1.1.1 Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư 3

1.1.2 Tổng quan về ung thư dạ dày 7

1.2 All-trans retinoic acid (ATRA) 13

1.2.1 Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA) 13

1.2.2 Thụ thể của ATRA 16

1.2.3 Retinoids trong điều trị 17

1.3 Con đường tín hiệu EGF 19

1.4 Con đường tín hiệu JAK/STAT 22

1.5 Khái quát về apoptosis 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D 27

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA 27

2.3.3 Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA 28

2.3.4 Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu

EGF bằng Realtime PCR 28

2.3.5 Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng Realtime PCR 29

2.3.6 Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường apoptosis bằng Realtime PCR 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere 31

3.1.1 Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D 31

3.1.2 Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lí tumorsphere với ATRA 31

3.2 Kết quả tách chiết RNA tổng số 33

3.3 Tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu EGF 34

3.3.1 ATRA ức chế sự biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR 34

3.3.2 Tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen CBL, EPS8, BCAR1, NCK2 và SHC1 38

3.4 Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu JAK/STAT 40

3.4.1 ATRA ức chế biểu hiện của các gen STAT1 và STAT3 40

3.4.2 Ảnh hưởng của ATRA đến sự điều hòa biểu hiện của các gen GAB1, GAB2, SRC và PPP2CA 41

3.5 Ảnh hưởng ATRA lên sự biểu hiện của các gen củ quá trình apoptosis 43 3.5.1 ATRA tác động lên sự biểu hiện của các gen ức chế apoptosis 44

3.5.2 ATRA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

1 Kết luận 48

2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ viết đầy đủ

AML Acute myeloid leukemia

ATRA All trans retinoic acid

BMDCs Bone marrow derived Dendritic cells

CSC Cancer stem cells

EGF Epidermal growth factor

EGFR Epidermal growth factor receptor

ErbB Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog GSCs Gastric stem cells

JAK Janus kinases

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu EGF 29

Bảng 2.2 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu

Bảng 2.3 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường apoptosis 30

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018 6

Hình 1.2 Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018 6

Hình 1.3 Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren 9

Hình 1.5 Mô hình nhuộm Lgr5 trong mô ung thư dạ dày 12

Hình 1.7 Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể 15

Hình 1.9 Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR 21

Hình 1.11 Một con đường JAK/STAT trong ung thư 24

Hình 3.1 Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào sau 3 ngày nuôi cấy 31

Hình 3.2 Nuôi cấy tạo tumorsphere và xử lý với ATRA 32

Hình 3.3 Kết quả xác định hàm lượng RNA tổng số 34

Hình 3.4A Mức độ biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5,

Hình 3.4B Mức độ biểu hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL, NCK2,

Hình 3.5A Mức độ biểu hiện các gen STAT3, STAT1 40

Hình 3.5B Mức độ biểu hiện các gen GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA 42

Hình 3.6A Mức độ biểu hiện các gen ức chế apoptosis 44

Hình 3.6B Mức độ biểu hiện các gen thúc đẩy apoptosis 46

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (http://gco.iarc.fr/), trong năm 2018 có 1.033.701 bệnh nhân ung thư dạ dày mới (chiếm 5,7%, trong tổng số các ca ung thư mới), 782.685 ca tử vong do ung thư dạ dày (chiếm 8,2%, trong tổng

số các ca tử vong do ung thư) Ung thư dạ dày được thống kê là dạng ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 trong nhóm ung thư Có 769.728 (74,5%) các ca ung thư dạ dày mới được phát hiện ở các nước châu

Á Tỉ lệ ung thư dạ dày cao nhất được thống kê là Hàn Quốc, Mông Cổ, Nhật Bản và Trung Quốc Việt Nam xếp thứ 10 trong thống kê các nước có tỉ lệ ung thư dạ dày nhiều nhất thế giới với tỉ lệ 15,9 ca mắc ung thư dạ dày trong

100.000 dân số

Các tế bào gốc ung thư dạ dày là nguyên nhân gây ra các khối u dạ dày Các tế bào gốc ung thư dạ dày, còn được gọi là các “tế bào khởi nguồn” của ung thư dạ dày, có nguồn gốc chủ yếu từ các tế bào gốc dạ dày hoặc các tế bào gốc định hướng dạ dày [4], [27] Các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có thế có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng bị biến đổi [6] Giống với các tế bào gốc thông thường, các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có chứa các marker sinh học đặc trưng như CD44, ALDH,… [4] Đây là những chỉ thị phân tử quan trọng để xác định tế bào gốc ung thư dạ dày trong nghiên cứu và

điều trị

All trans retinoic acid (ATRA) là một chất chuyển hóa từ vitamin A, thuộc nhóm retinoid, có tác dụng điều hoà sự tăng trưởng, biệt hóa và quá trình apoptosis của tế bào ATRA được biết đến như một chất có khả năng ức chế

tế bào gốc của nhiều dạng ung thư khác nhau [53] Hiện nay, ATRA đã được

sử dụng trong điều trị bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML), cũng như sử dụng trong nhiều thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư Tuy nhiên, ảnh hưởng

của ATRA lên tế bào gốc ung thư ở cấp độ phân tử vẫn chưa được hiểu rõ Vì

vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: ¨Nghiên cứu tác động của all

trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày¨.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá tác động của ATRA lên sự phiên mã của các gen chính trong con đường tín hiệu phân tử EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày, cũng như ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen apoptosis

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nuôi cấy tế bào trong điều kiện 3D để hình thành nên các

tumorsphere từ các tế bào gốc ung thư dạ dày

Nội dung 2: Phân tích tác động của ATRA lên sự hình thành và tăng

trưởng của các tumorsphere

Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín

hiệu EGF bằng phương pháp Realtime PCR đối với các tế bào được xử lý

hoặc không xử lý với ATRA

Nội dung 4: Phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các

gen của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng phương pháp Realtime PCR

Nội dung 5: Phân tích sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen

apoptosis bằng phương pháp Realtime PCR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày

1.1.1 Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư

1.1.1.1 Lịch sử, khái niệm, phân loại ung thư

Ung thư được miêu tả sớm nhất vào khoảng năm 1.600 TCN (thời Ai Cập cổ đại) trong các Edwin Smith Papy (một loại giấy cói ghi chép về văn bản y tế lâu đời nhất) Trong các Edwin Smith Papy có chứa mô tả về ung thư

vú cũng như thủ thuật để loại bỏ các khối u vú Hippocrates (khoảng năm 460 TCN- khoảng năm 370 TCN) đã mô tả một số loại ung thư, gọi chúng bằng thuật ngữ karkinos (carcinos) - tiếng Hy Lạp có nghĩa là ¨cua¨ hoặc ¨tôm càng¨, dựa trên đặc điểm quan sát được của khối u rắn Celsus (khoảng năm

25 TCN - 50 SCN) đã dịch karkinos thành ¨cancer¨ - ung thư [1]

Hiện nay, khái niệm ung thư (cancer) được sử dụng để chỉ một nhóm bệnh liên quan đến sự phát triển bất thường của tế bào với khả năng xâm lấn hoặc lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể [34]

Các dấu hiệu của ung thư bao gồm: duy trì các tín hiệu tăng sinh, tránh khỏi sự ức chế sinh trưởng, chống lại quá trình chết của tế bào, nhân lên số lượng lớn tế bào, tăng cường hình thành mạch máu, xâm lấn và di căn, tái lập trình trao đổi chất và tránh sự phá hủy của hệ miễn dịch Những thay đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u chủ yếu do sự mất ổn định bộ gen, sự biểu hiện bất thường về chức năng của các gen ức chế khối u và gen gây ung thư [34]

Ung thư có thể xuất hiện ở tất cả các bộ phận khác nhau trong cơ thể Ung thư được đặt tên theo cơ quan mà chúng bắt đầu và loại tế bào được tạo

ra ngay cả khi chúng lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể Hiện nay đã thống kê được hơn 100 loại ung thư ảnh hưởng đến con người [34] Ngoài ra ung thư được phân loại theo loại mô, bao gồm:

 Carcinomas: (ung thư biểu mô) là loại ung thư bắt nguồn từ da hoặc các

mô lót hay phủ các cơ quan bên trong

 Sarcomas: (ung thư mô liên kết) là loại ung thư bắt nguồn từ xương, sụn, mỡ, cơ, mạch máu hay các mô liên kết khác

 Lymphomas và leukemias: hai loại ung thư này phát sinh từ các tế bào tạo máu và có xu hướng phát triển trong các hạch bạch huyết và máu

 Germ-cell tumor: là loại ung thư bắt nguồn từ các tế bào đa năng, thường gặp nhất là seminoma (ung thư tinh hoàn) và dysgerminoma (ung thư buồng trứng)

 Blastoma: là loại ung thư có nguồn gốc từ các tế bào "tiền thân" (precursor) chưa trưởng thành hoặc phôi Dạng ung thư này thường gặp ở trẻ nhỏ

Carcinomas (ung thư biểu mô) là loại ung thư thường gặp nhất Ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư dạ dày

là các bệnh ung thư có số lượng bệnh nhân mắc phải và tử vong nhiều nhất trong nhóm ung thư (WHO, 2018) Carcinomas và arcomas đa phần sẽ tạo thành các khối tế bào bất thường gọi là khối u (neoplasia), trong khi leukemias và lymphomas thường không tạo thành các khối u rắn

1.1.1.2 Tế bào gốc ung thư

Tế bào gốc (Stem cells) là đơn vị phát triển chức năng tái tạo các mô và

cơ quan, đóng vai trò trong cân bằng nội môi và sửa chữa sau khi bị tổn thương Các tế bào gốc nằm ở những vị trí đặc biệt bảo vệ chúng khỏi sự hoạt động quá mức [80] Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các khối u chứa các tế bào ung thư không đồng nhất về kiểu hình và chức năng [27] Các khối

u có thể bắt nguồn từ một quần thể nhỏ tế bào gốc ung thư (Cancer stem cell)

có khả năng duy trì sự phát triển lâu dài của khối u, cũng như khả năng tái phát, kháng apoptosis, di căn, hóa trị và xạ trị [34]

Tế bào gốc ung thư có các đặc điểm tương tự như các tế bào gốc thông thường bao gồm khả năng tự làm mới không giới hạn, tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng Tế bào gốc ung thư chỉ chiếm một phần nhỏ, tồn tại ở một vùng trong khối u (CSCs occupy) và thường không hoạt động trong một thời gian dài Các tế bào gốc ung thư có khả năng kháng lại các phương pháp điều trị ung thư thông thường như hóa trị và xạ trị vì chúng có khả năng kích hoạt các con đường liên quan đến sự phát triển, chống độc tế bào và tăng khả năng sửa chữa DNA Hơn nữa, hóa trị và xạ trị còn có thể làm biến đổi các tế bào trong khối u, biến các tế bào không phải là tế bào gốc ung thư thành các tế bào gần giống như tế bào gốc ung thư Các tế bào này có thể vẫn còn tồn tại sau khi điều trị hóa trị và xạ trị, chúng có thể là nguyên nhân tái phát khối u [11]

Sự tồn tại của tế bào gốc ung thư lần đầu tiên được Bonnet và Dick [10] chứng minh có ở bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML) bằng cách sử dụng marker bề mặt tế bào CD34+/CD38- Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã cho thấy sự có mặt của tế bào gốc ung thư trong nhiều khối u rắn, trong đó có ung thư não, ung thư vú, ung thư đầu và cổ, ung thư thận, ung thư ruột kết, ung thư tuyến tụy, ung thư gan, khối u ác tính, ung thư phổi [11]

Những nghiên cứu in vivo gần đây đã chứng minh các khối u có nguồn gốc từ

tế bào gốc ung thư Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng tới việc xác định các tế bào gốc ung thư bằng các marker sinh học, thông qua đó sử dụng các biện pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư [34]

1.1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư và tình hình ung thư hiện nay

Phần lớn các bệnh ung thư, khoảng 90% - 95% các trường hợp là do đột biến gen từ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sống và lối sống, khoảng 5% - 10% còn lại là do yếu tố di truyền Các yếu tố môi trường phổ biến gây

tử vong do ung thư được thống kê bao gồm: thuốc lá (25%-30%), chế độ ăn

uống (30%-35%), nhiễm trùng (15%- 20%), phóng xạ (10%), stress, ít hoạt động và ô nhiễm [34]

Theo ước tính của WHO trong năm 2018, có 18.078.957 trường hợp mắc ung thư, trong đó có 7 loại ung thư phổ biến nhất (chiếm 54%), bao gồm: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư

dạ dày, ung thư gan và ung thư thực quản (Hình 1.1)

Hình 1.1 Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018 (Nguồn WHO)

Hình 1.2 Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018 (Nguồn WHO)

Ở các nước châu Á, trong năm 2018, ước tính có 8.750.932 trường hợp mắc mới ung thư và 5.477.064 ca tử vong do ung thư Hơn 70% số lượng các các ca tử vong do ung thư tập trung ở các nước đang phát triển (Hình 1.2)

1.1.2 Tổng quan về ung thư dạ dày

1.1.2.1 Dịch tễ học của ung thư dạ dày

Ung thư dạ dày (gastric cancer hay stomach cancer) là loại ung thư phát triển đầu tiên ở mô dạ dày và di căn sang các bộ phận khác của cơ thể Tỉ lệ mắc ung thư dạ dày đang có xu hướng giảm ở cả hai giới trên phạm vi toàn cầu Tuy nhiên, do sự già hóa dân số và sự gia tăng dăn số ở các nước đang phát triển nên số lượng ung thư dạ dày trên thế giới vẫn tiếp tục tăng [3] Việt Nam có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày (tính trên 100.000 dân số) là 15,9 (đứng thứ 10 trên thế giới) với tỉ lệ mắc theo độ tuổi ở nam là 23,3 (đứng thứ

11 trên thế giới), ở nữ là 10,2 (đứng thứ 14 trên thế giới)

Ung thư dạ dày là kết quả của các tác động phức tạp giữa vật chủ và các

yếu tố môi trường, trong đó đáng chú ý nhất là nhiễm Helicobacter pylori (H

pylori) WHO xếp H pylori vào tác nhân gây ung thư nhóm I Ước tính H pylori là nguyên nhân của khoảng 63% các trường hợp ung thư dạ dày không

thuộc tâm vị trên toàn thế giới Một số yếu tố đáng chú ý khác như chế độ ăn uống và hút thuốc lá cũng ảnh hưởng tới nguy cơ mắc ung thư dạ dày Hoocmon nội tiết tố nữ (estrogen) là một yếu tố làm giảm nguy cơ mắc ung thư dạ dày ở nữ giới, tỉ lệ mắc mới ung thư dạ dày ở phụ nữ thấp hơn nhiều so với ở nam giới [3]

1.1.2.2 Phân loại ung thư dạ dày và điều trị

Tùy thuộc vào chỉ tiêu phân loại mà ung thư dạ dày có thể được chia thành nhiều loại khác nhau Một số hệ thống phân loại đáng chú ý như hệ thống phân loại theo vị trí (ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị), phân loại 4 type của Borrmann [81] và Hiệp hội Ung thư Dạ dày Nhật Bản

[47], phân loại vi thể [56], phân loại theo mô bệnh học của Lauren [56] hay

hệ thông phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Tổ chức Y tế Thế giới [31]

Hiện nay, ung thư dạ dày có xu hướng được chia làm 2 loại là ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị Ung thư tâm vị là ung thư trong khoảng 1cm trên đến 2 cm dưới đường nối thực quản dạ dày Ung thư dạ dày không thuộc tâm vị gồm ung thư ở phình vị, thân vị, bờ cong lớn, bờ cong nhỏ, hang vị và môn vị Có sự khác nhau rất rõ trong dịch tễ, nguyên nhân gây bệnh, mô bệnh học, điều trị và tiên lượng giữa ung thư dạ dày tâm vị và ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [61] Ung thư dạ dày không thuộc tâm vị thường gặp hơn ở những khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày cao, ung thư tâm vị thường gặp ở khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày thấp Ung thư tâm vị

đã tăng đáng kể trong vòng 50 năm qua ở các nước phát triển và cả một số nước điều kiện kinh tế phát triển Ung thư tâm vị thường là hậu quả của trào ngược dạ dày thực quản mạn tính, trong khi đó ung thư dạ dày không thuộc

tâm vị có liên quan chặt chẽ tới tình trạng nhiễm H pylori mãn tính Tiên

lượng ung thư tâm vị thường xấu hơn ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [61]

Lauren phân loại ung thư dạ dày thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là thể ruột (intestinal type) và thể lan tỏa (diffuse type) (Hình 1.3) [56] Thể ruột gồm những tế bào u kết dính tạo ra cấu trúc ống tuyến tương tự như tuyến ruột, đi kèm với thâm nhập tế bào viêm lan tỏa U này thường xuất phát từ

phần xa dạ dày cùng với nhiễm H pylori, có đặc điểm teo niêm mạc dạ dày

diện rộng, dị sản ruột và thường được đi trước bằng một giai đoạn tiền ung thư Thể lan tỏa gồm những mảng tế bào rải rác trong mô đệm, không tạo tuyến, không có tính kết dính Ung thư thể lan tỏa có thể gồm các tế bào hình nhẫn, lan rộng theo lớp dưới niêm mạc, ít thâm nhập tế bào viêm, thường có mức độ biệt hóa kém Có xấp xỉ 5-10% các khối u vẫn không thể phân loại

được xếp vào thể “không xác định” hoặc có đặc điểm của cả hai thể ruột và lan tỏa được xếp vào thể “hỗn hợp” (mixed type) Trong đánh giá bệnh học lâm sàng, các khối u thể này thường được xem như là thể lan tỏa [56] Phân loại mô bệnh học của Lauren khá đơn giản và được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Hai thể mô học này có sự khác nhau rõ rệt về dịch tễ, nguyên nhân gây bệnh và đặc biệt là tiên lượng Sự khác nhau về hình thái được cho là do vai trò của các phân tử kết dính liên bào, các phân tử này được bảo toàn ở thể ruột và khiếm khuyết ở thể lan tỏa [56]

A Intestinal type B Diffuse type C Mixed type

Hình 1.3 Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren [56]

Để đánh giá giai đoạn của ung thư dạ dày, có hai hệ thống đánh giá được

sử dụng rộng rãi là hệ thống đánh giá của AJCC/UICC [87] và hệ thống đánh giá của Nhật Bản [47] Cả hai hệ thống này đều đánh giá giai đoạn của ung thư dạ dày dựa trên đánh giá mức độ xâm lấn của khối u (Tumor), tình trạng

di căn vùng hạch (Node) và di căn xa (Metastasis) nên còn được gọi là cách đánh giá giai đoạn TNM (Khối u - Hạch - Di căn) Khối u (Tumor) được đánh giá dựa vào độ xâm nhập sâu của khối u, giai đoạn hạch bạch huyết (Node) được đánh giá dựa trên số lượng bạch huyết vùng bị di căn

Phẫu thuật cắt bỏ là phương pháp điều trị chính và có thể chữa khỏi cho bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở giai đoạn đầu Tuy nhiên, tỉ lệ sống sót của bệnh nhân vẫn còn thấp Phương pháp xạ trị sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày đem lại hiệu quả thấp [56] do tính kháng xạ trị của các tế bào ung thư dạ

dày Hóa trị liệu là phương pháp điều trị quan trọng nhằm giảm tỉ lệ tái phát sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm của bệnh nhân Thời gian sống thêm của bệnh nhân sử dụng hóa trị có thể kéo dài thêm 9-36 tháng Độc tính cao, thời gian đáp ứng ngắn, tỷ lệ đáp ứng thấp là những hạn chế của hóa trị liệu [70] Điều trị nhắm đích là phương pháp mới, sử dụng các loại thuốc điều trị có tác dụng chọn lọc lên tế bào gốc ung thư ở mức độ phân tử mà không hoặc ít làm ảnh hưởng đến các tế bào bình thường, đang được nghiên cứu và thử nghiệm trong điều trị ung thư dạ dày [70]

1.1.2.3 Tế bào gốc ung thư dạ dày

Tế bào gốc dạ dày (Gastric stem cells) là các tế bào gốc ở dạ dày, được tìm thấy ở vùng eo của tuyến dạ dày, gồm nhiều loại tế bào gốc khác nhau (Hình 1.4) Tế bào gốc dạ dày được bao quanh bởi một lớp myofibroblasts (SMFs) hoạt động như một hốc chứa và tiết ra các yếu tố tăng trưởng và biệt hóa khác nhau Tế bào gốc dạ dày giữ vai trò thiết yếu trong việc tự làm mới

và căn bằng nội môi của tuyến dạ dày; chúng giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sửa chữa biểu mô dạ dày sau chấn thương Các tế bào gốc tủy xương (BMDCs) có vai trò quan trọng trong sự tái tạo, phục hồi lại các phần

niêm mạc bị tổn thương do H pylori Quá trình tự tái tạo và biệt hóa ở niêm

mạc dạ dày được điều chỉnh bởi một số con đường tín hiệu như Wnt, Notch, Hedgekey và yếu tố phiên mã liên quan đến Runt 3 (Runx3) [40]

Tế bào gốc ung thư dạ dày được Yang và cộng sự mô tả lần đầu tiền vào năm 2007 [92] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ung thư dạ dày có thể bắt nguồn

từ tế bào gốc dạ dày bình thường hoặc các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương [6], [40] McDonand và cộng sự đã đưa ra bằng chứng về quá trình loạn sản ở các đơn vị dạ dày do sự biến chất đường ruột và nhận thấy rằng chứng loạn sản đường ruột là vô tính, chứa nhiều tế bào gốc và lây lan qua sự phân hạch [62] Tuy nhiên, Barker và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu truy tìm nguồn gốc của tế bào gốc gây ra ung thư dạ dày [6] Trong thí nghiệm,

Barker đã nhận thấy các tế bào gốc môn vị Lgr5+ có khả năng gây khối u khi

bị tác động [6] Simon và cộng sự tiếp tục kiểm tra mức độ phổ biến, phân bố

và ý nghĩa sinh học khối u của các tế bào Lgr5 trong dạ dày bằng cách nghiên cứu biểu hiện khác biệt của Lgr5 ở mức độ phiên mã và dịch mã [79] Nghiên cứu đã chỉ ra các mô ác tính có sự biểu hiện Lgr5+ cao hơn các mô không ác tính và có sự di chuyển của các tế bào Lgr5+ ở các giai đoạn khác nhau của ung thư dạ dày Nghiên cứu cũng chỉ ra ở trong niêm mạc dạ dày bình thường các tế bào Lgr5+ nằm chủ yếu ở vùng cổ niêm mạc, trong khi ở ung thư dạ dày các tế bào Lgr5+ xuất hiện ở vùng eo, trung tâm khối u và mặt trước xâm lấn (Hình 1.5) Các bệnh nhân dương tính với Lgr5+ cũng có tỉ lệ sống trung bình ngắn hơn các bệnh nhân âm tính với Lgr5+ [79] Các tế bào gốc ung thư

dạ dày ngoài nguồn gốc từ tế bào gốc dạ dày [6] còn có thể có nguồn gốc từ các tế bào gốc tủy xương [85] Sự viêm nhiễm, tổn thương mãn tính biểu mô

dạ dày do H pylori dẫn đến mất tế bào gốc dạ dày thường trú và gây ra sự tái

lập tế bào gốc tủy xương trong dạ dày, sau đó là tăng sản, biến chất, loạn sản

và cuối cùng là tăng sản ung thư dạ dày [85]

Hình 1.4 Cấu tạo tuyến dạ dày (Nguồn: Giải phẫu học - Nguyễn Quang Quyền)

Hình 1.5 Mô hình nhuộm Lgr5 trong mô ung thư dạ dày [79]

(A, E) Niêm mạc dạ dày bình thường (B, F) Mô dạ dày dị sản ruột (C, G) Ung thư dạ dày trước xâm lấn

Tế bào gốc ung thư dạ dày được xác định chủ yếu nhờ các marker bề mặt

tế bào Việc sử dụng các marker bề mặt thuận lợi hơn so với sử dụng các yếu

tố nội sinh trong việc xác định tế bào cũng như nhắm đích trong nghiên cứu điều trị ung thư dạ dày Hiện nay, các nghiên cứu sử dụng liệu pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày đang được nghiên cứu và phát triển Trong nhiều năm qua, các liệu pháp thông thường như hóa trị, xạ trị và miễn dịch đã được sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ tiêu diệt được các tế bào khối u đã biệt hóa, do đó, sau một thời gian các khối u lại tái phát do hoạt động của các tế bào gốc ung thư dạ dày Ở

ung thư dạ dày có các tế bào gốc ung thư dạ dày hoạt động và không hoạt động, do đó cần có loại thuốc đặc biệt được thiết kế để nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày, ức chế sự phân chia của tế bào gốc ung thư dạ dày, thúc đẩy biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày và điều hòa môi trường vi mô trong khối u [34], [91] Để nhắm mục tiêu các tế bào gốc ung thư dạ dày, một số chiến lược đã được đề xuất, bao gồm sự kết hợp apoptosis liên quan đến hóa trị liệu, nhắm đích phân tử và cảm ứng biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày; gây ra apoptosis trong khối u; liệu pháp nhắm đích marker bề mặt tế bào gốc ung thư

dạ dày; phát triển kháng thể đơn dòng; nhắm mục tiêu vào môi trường vi môi

tế bào gốc ung thư dạ dày; ức chế các con đường tín hiệu tế bào gốc ung thư

dạ dày [34]

1.2 All-trans retinoic acid (ATRA)

1.2.1 Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA)

Retinoids là những chất có cấu tạo hoặc chức năng tương tự retinol (Vitamin A) Hiện nay đã có khoảng hơn 4.000 phân tử retinoids tự nhiên và tổng hợp được công bố Retinoids là phân tử sinh học thiết yếu cho sự phát triển của phôi thai và cân bằng nội môi của cơ thể trưởng thành Động vật hấp thu retinoids dưới dạng vitamin A, thu được từ 2 nguồn là: vitamin A được tạo thành từ trước (retinol và retinal ở dạng retinyl ester) và provitamin A carotenoids (β-carotene, α-carotene, β-cryptoxanthin) Các chất trung gian có hoạt tính sinh học của vitamin A được xác định là ATRA và 11 – cis retinol ATRA là một chất có liên quan đến việc điều chỉnh sự phiên mã của gen, trong khi đó 11 – cis RA liên quan đến sự cảm nhận màu của thị giác [22] Retinoids được phân chia thành 3 thế hệ:

 Thế hệ thứ nhất: bao gồm retinol (Vitamin A), tretinoin/retinoic acid/retin-A (ATRA), isotretinoin (13- cis RA) và alitretinoin (9- cis RA) (Hình 1.6.A)

 Thế hệ thứ 2: có etretinate, acitretin (Hình 1.6.B)

 Thế hệ thứ 3: gồm tazarotene, bexarotene, adapalene (Hình 1.6.C)

All-trans retinoic acid (ATRA) hay còn được gọi là Tretinoin, là một một chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học chính của retinoids Trong quá trình phát triển phôi thai sớm, ATRA điều chỉnh sự hình thành lớp mầm, hình thành trục cơ thể, phát sinh thần kinh, phát sinh tim mạch, cũng như sự phát triển của tuyến tụy, phổi và mắt Nó cũng là một yếu tố quan trọng cho chức năng thị giác [22] Ở cơ thể trưởng thành, ATRA có liên quan đến sự phát triển của tế bào, quá trình apoptosis, đáp ứng miễn dịch và sự tăng trưởng biểu mô [30]

A Thế hệ thứ nhất của retinoids

B Thế hệ thứ 2 của retinoids

C Thế hệ thứ 3 của retinoids Hình 1.6 Các thế hệ của retinoids [22]

Hình 1.7 Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể [30]

Trong cơ thể, ATRA được tạo thành từ vitamin A Quá trình biến đổi tạo thành ATRA từ vitamin A có thể bị đảo ngược bởi một số yếu tố Enzyme CYP26 thuộc họ cytochrom P450 hydroxylase là enzyme phân hủy ATRA (Hình 1.7) Một số enzyme thuộc CYP26 gồm CYP26A1, B1, C1 và D1 đều

có khả năng phân giải ATRA thành retinoids ít hoạt tính sinh học hơn [30]

1.2.2 Thụ thể của ATRA

ATRA được đưa vào nhân bằng CRABP-II và tương tác với các RAR, bản thân ATRA là một yếu tố phiên mã RAR và RXR (thụ thể X retinoid) thuộc họ thụ thể retinoid RAR có khả năng nhận biết cả ATRA và 9-cis retinoic acid, trong khi RXR chỉ nhận biết được 9-cis retinoic acid Thụ thể RAR gồm 3 thành viên là RARα / β / bind [68] Khi liên kết với các phối tử, RAR nhị trùng hợp với RXR tạo thành một heterodimer, sau đó khởi động quá trình phiên mã bằng cách gắn vào yếu tố phản ứng acid retinoic (RARE)

ở promotor của các gen mục tiêu (Hình 1.8) Sự biểu hiện của các RAR cũng

nằm dưới sự kiểm soát của ATRA Trong promotor của RARα và β cũng tìm thấy sự có mặt của RARE [68]

Hình 1.8 Quá trình hoạt động của tín hiệu RA [68]

1.2.3 Retinoids trong điều trị

Retinoids (vitamin A cùng các chất tự nhiên và tổng hợp của vitamin A) được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về thị giác và da liễu [22] Retinoids đã được chứng minh là có thể ức chế sự phát triển của một số dòng

tế bào ung thư [30] Retinoids có tác dụng ức chế quá trình gây ung thư vì chúng ức chế sự tăng trưởng, gây ra sự biệt hóa và gây chết tế bào ở nhiều loại tế bào ung thư khác nhau [30], [69] Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, lượng vitamin A thấp hơn dẫn đến nguy cơ phát triển ung thư cao hơn, phù hợp với các quan sát về động vật thiếu vitamin A Thay đổi biểu hiện của thụ thể RAR cũng liên quan đến sự biến đổi ác tính của các mô động vật hoặc

tế bào nuôi cấy Hơn nữa, retinoids ức chế quá trình gây ung thư trong các mô hình động vật ở da, miệng, phổi, vú, bàng quang, buồng trứng và tuyến tiền liệt [30] Ở người, retinoids đảo ngược các tổn thương biểu mô ở giai đoạn tiền ung thư, gây ra sự biệt hóa của các tế bào tủy và ngăn ngừa ung thư phổi, gan và ung thư vú [30]

ATRA là retinoid tự nhiên đã được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều năm ATRA hiện đang được thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư hạch, ung thư bạch cầu, ung thư da, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, ung thư thận,

u nguyên bào thần kinh và u nguyên bào thần kinh đệm [68] Tuy nhiên, ở mức độ phân tử, tác động của ATRA lên các tế bào ung thư chưa được hiểu

rõ Ở một hướng nghiên cứu khác, tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen thông qua điều chỉnh các miRNA cũng được chỉ ra [53]

Tác động của ATRA lên ung thư được nghiên cứu trước tiên ở ung thư bạch cầu (Acute promyelocytic leukemia- APL) Breitman và cộng sự đã nhận thấy sự biệt hóa của dòng tế bào APL HL-60 khi sử dụng butyrate, dimethyl sulfoxide và ATRA [12] Hiện nay, ATRA được sử dụng trong điều trị APL

Việc điều trị kết hợp ATRA với các chất ức chế HDAC SL142 hoặc SL325 có khả năng chống khối u đáng kể và là một phương pháp trị liệu đầy

hứa hẹn để điều trị ung thư phổi ở người Biểu hiện thúc đẩy apoptosis và hoạt tính caspase-3 đã tăng lên sau khi điều trị kết hợp Sự kết hợp của ATRA

và một số các chất chất ức chế HDAC cho thấy tác dụng chống khối u trong u nguyên bào thần kinh Liệu pháp kết hợp ATRA với chất ức chế HDAC có thể cải thiện hiệu quả đồng thời giảm tác dụng phụ [26] Hơn nữa, ATRA là chất điều biến mạnh của sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào biểu mô có thể có tiềm năng để điều trị loạn sản cổ tử cung (CIN) [39]

ATRA đã được chứng minh là có khả năng điều chỉnh sự biểu hiệu của HbsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B) và ức chế sự biểu hiện của topoisomerase II, là một loại enzyme có khả năng thúc đẩy sự phân ly của nhiễm sắc thế (NST), ở tế bào gan và một số dòng tế bào ung thư gan được nghiên cứu Như vậy, ATRA là một chất tiền năng ngăn chặn sự phát triển của ung thư gan, có thể sử dụng để kết hợp với các chất chống ung thư khác trong điều trị ung thư gan [41] Ở ung thư vú, ATRA có khả năng gây ra sự biệt hóa của các tế bào biểu mô vú biến đổi sớm, qua đó có tác dụng trong phòng ngừa và làm giảm sự phát triển của ung thư vú [4]

Ở ung thư dạ dày, bằng cách sử dụng các dòng tế bào ung thư dạ dày có

sự biểu hiện RAR khác nhau, Su Liu và cộng sự đã chứng minh được tác động của ATRA lên tế bào ung thư dạ dày thông qua thụ thể RAR [82] Trong nhiều nghiên cứu về ung thư dạ dày đã chỉ ra ATRA cũng có tác dụng ức chế

sự tiến triển của chu kỳ tế bào qua cảm ứng p21WAF1/ CIP1; ức chế sự tăng sinh tế bào bằng sự ức chế yếu tố phiên mã AP1; ức chế giảm hoạt động của con đường ERK/MAPK; cảm ứng biểu hiện các dấu hiệu phân biệt tế bào gốc ung thư dạ dày; ức chế sự tăng sinh tế bào; cảm ứng apoptosis và ức chế tính chất của tế bào gốc ung thư [23], [69] Gần đây, tác dụng của ATRA ức chế

sự phát triển của các tế bào gốc ung thư dạ dày có nguồn gốc từ bệnh nhân đã được ghi nhận ATRA ức chế sự khởi đầu và tăng trưởng của khối u trong

ống nghiệm, cũng như ức chế sự tiến triển của khối u dạ dày in vivo Cùng với

đó, việc giảm thiểu các gen CD44, ALDH1, Ki67, PCNA cũng được ghi nhận ATRA là một tác nhân mạnh mẽ ức chế hiệu quả sự phát triển của khối

u và quan trọng hơn nữa là nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày [69]

1.3 Con đường tín hiệu EGF

Sự dẫn truyền thông tin là quá trình tế bào tiếp nhận các tín hiệu thông tin từ môi trường và truyền đạt lại thông tin thông qua một loạt các phân tử trong tế bào, tiếp đến là sự đáp ứng lại các tín hiệu đó thông qua các cơ chế khác nhau Các con đường tín hiệu tế bào được hoạt hóa bởi nhiều phân tử khác nhau từ phức hệ tế bào hay từ sự kết nối tế bào- tế bào, chúng tham gia điều hòa các quá trình của tế bào như sinh tổng hợp protein, sự phát triển và biệt hóa tế bào, kiểm soát chu trình chết tế bào Sự rối loạn điều hòa các con đường tín hiệu làm thay đổi các đặc điểm di truyền hoặc di truyền ngoại sinh của tế bào đồng thời gây ra những thay đổi ở phức hệ ngoại màng (extracellular matrix), dẫn tới sự phát triển và lan rộng của khối u [78]

EGFR (epidermal growth factor receptor) thuộc họ thụ thể tyrosine kinase EGFR hay còn được biết đến với tên ErbB (Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog), bao gồm 4 thụ thể: EGFR (ErbB-1/HER1), ErbB-

2 (Neu, HER2), ErbB-3 (HER3) và ErbB-4 (HER4) Ở động vật có vú, có 7 phối tử liên kết và kích hoạt EGFR: EGF, TGF-α, HB-EGF, betacellulin (BTC), ameraldgulin (ISG), epiregulin (EREG) và epigen (EPGN) Trong đó, EGF, TGF-α, HB-EGF và BTC là các phối tử có ái lực cao với EGFR; trong khi ISG, EREG và EPGN là các phối tử có ái lực thấp với EGFR Các thụ thể EGFR liên kết thành từng cặp trên màng tế bào (Hình 1.9) Sự kích hoạt các thụ thể EGFR bằng cách liên kết với các phối tử của chúng tạo ra khởi đầu của con đường tín hiệu EGF Đặc biệt, HER2 là thụ thể không có phối tử liên kết trực tiếp, tuy nhiên ảnh hưởng của HER2 trong ung thư được đặc biệt quan tâm [54]

Liên kết với phối tử dẫn đến giảm thiểu EGFR và kích hoạt tyrosine kinase của nó Phosphoryl hóa tiếp theo của dư lượng tyrosine của EGFR cung cấp vị trí lắp ghép cho protein với các miền SH2 và PTB, kích hoạt sự tải nạp tín hiệu thông qua kinase protein được kích hoạt Ras-Raf-mitogen/kinase 1/2 (MAPK/ERK1/2), phosphoinositide 3-kinase, AKT, Src

họ kinase (SFKs), STATs, phospholipase Cγ1, Rho họ GTPase và các con đường tín hiệu khác Thông qua các con đường tín hiệu nội bào được kích hoạt, tín hiệu EGF có ảnh hưởng đến các quá trình tăng sinh, di động tế bào, biệt hóa và sống sót của tế bào Hơn nữa, tín hiệu EGF có thể trực tiếp kiểm soát chu kì tế bào thông qua sự dịch chuyển thụ thể vào nhân tế bào Sự tăng cường hoạt động của tín hiệu EGF cũng đã được chứng minh là có khả năng bảo vệ tế bào khỏi quá trình apoptosis [44]

Tín hiệu EGF được kích hoạt bất thường hoặc biểu hiệu bất thường trong nhiều bệnh khác nhau Vai trò của tín hiệu EGF trong ung thư chưa được hiểu rõ hoàn toàn, tuy nhiên, sự bất thường của tín hiệu EGF được nghiên cứu khá kĩ trong quá trình phát triển của ung thư Ngoài các dạng đột biến, sự biểu hiện quá mức của tín hiệu EGF cũng thúc đẩy sự tiến triển của ung thư cũng được nghiên cứu ở các dạng ung thư khác nhau như: ung thư biểu mô, sarcomas, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC), ung thư thần kinh ác tính Sự biểu hiện quá mức của tín hiệu EGF là một mục tiêu nghiên cứu chính trong tiên lượng và điều trị ung thư [16] Ở ung thư dạ dày,

sự biểu hiện quá mức cũng như các đột biến của các gen thuộc con đường tín hiệu EGF đã được nghiên cứu và sử dụng trong chuẩn đoán Matuzumab, panitumumab, trastuzumab và cisplatin là các loại thuốc được sử dụng phổ biến, mang lại nhiều hiệu quả tích cực trong điều trị nhắm đích con đường tín hiệu EGF trong ung thư dạ dày [43]

Hình 1.9 Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR (Nguồn: Thermo Fisher) 1.4 Con đường tín hiệu JAK/STAT

Con đường tín hiệu JAK/STAT (Janus kinases - Signal Transducer and Activator of Transcription proteins) là một cơ chế điều hòa sao chép gen, có ở nấm mốc, giun, ruồi, động vật có xương sống nhưng không có ở nấm và thực vật Con đường JAK/STAT liên quan đến tăng trưởng tế bào, biệt hóa, apoptosis và các chức năng quan trọng khác của tế bào Con đường JAK/STAT điều chỉnh sự phát triển phôi và tham gia vào việc kiểm soát các quá trình như duy trì tế bào gốc, tạo máu và phản ứng viêm Con đường dẫn truyền tín hiệu từ các cytokine, interleukin và các yếu tố tăng trưởng hoạt động thông qua một số họ thụ thể xuyên màng đến JAK sau đó kích hoạt STAT, các STAT liên kết với trình tự khởi đầu và điều chỉnh quá trình phiên

mã các gen kiểm soát các quá trình tế bào, bao gồm tăng sinh, biệt hóa và apoptosis (Hình 1.10) Con đường JAK/ STAT cung cấp một cơ chế trực tiếp chuyển đổi tín hiệu ngoại bào thành phản ứng sao chép Tín hiệu JAK/STAT cũng có liên quan tới hàng loạt các con đường tín hiệu tế bào khác như: EGF, Ras/Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT và apoptosis [28]

So với các con đường tín hiệu tế bào khác, con đường tín hiệu JAK/STAT tương đối đơn giản với ít thành phần Protein JAK và STAT là 2 thành phần cốt lõi của con đường tín hiệu JAK/STAT Ở động vật có xương sống, có 4 protein JAK là JAK1, JAK2, JAK3 và TYK2; có 7 protein STAT bao gồm: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B và STAT6, chủ yếu đóng vai trò là yếu tố phiên mã Một loạt các phối tử bao gồm cytokine, hormone và các yếu tố tăng trưởng cùng các thụ thể tương ứng kích thích con đường JAK / STAT Các protein JAK được kích hoạt khi các phối

tử gắn vào các thụ thể của chúng trên bề mặt tế bào Các phối tử khác nhau kích hoạt các JAK/ STAT khác nhau Các JAK được kích hoạt sẽ làm thay đổi cấu trúc của các protein STAT giúp cho 2 STAT liên kết với nhau tạo thành một dimer Các dimer ở tế bào chất di chuyển vào nhân liên kết với DNA của gen đích [28]

Giống với các yếu tố phiên mã khác, STAT có khả năng kết hợp với các đồng kích hoạt (coactivator) như CBP (CREB-binding protein) và p300 (histone acetyltransferase p300) để làm tăng tốc độ phiên mã của gen đích Các yếu tố đồng kích hoạt này có thể giúp tăng tốc độ phiên mã là nhờ khả năng có thể tạo các điều kiện thuận lợi cho quá trình phiên mã Con đường tín hiệu JAK/STAT có thể liên kết với các con đường tín hiệu khác như PI3K/AKT/mTOR và MAPK/ERK Sự điều chỉnh con đường tín hiệu JAK/STAT được thực hiện nhờ ba nhóm protein là các chất ức chế protein của STAT hoạt hóa (PIAS), protein tyrosine phosphatase (PTPs) và ức chế tín hiệu cytokine (SOCS) [28]

Sự rối loạn trong hoạt động của con đường tín hiệu JAK/STAT có thể dẫn đến nhiều bệnh liên quan đến hệ thống miễn dịch và ung thư Mức độ kích hoạt STAT cao có liên quan đến ung thư, đặc biệt kích hoạt STAT3 và STAT 5 cao gây ra các khối u nguy hiểm hơn Hoạt động của STAT3 cao quá mức liên quan đến tái phát khối u sau điều trị ở ung thư da [66] Hoạt động quá mức của STAT3 cho phép phiên mã các gen như BCL2, c- Myc có liên quan đến sự phân chia tế bào (Hình 1.11) Đột biến trong gen JAK2 có thể dẫn tới leukemia và lymphoma Cụ thể hơn, các đột biến ở exon 12, 13, 14 và

15 của gen JAK2 là một yếu tố gây nguy cơ phát triển trong leukemia và lymphoma [48] Ngoài ra, STAT3 và STAT5 bị đột biến có thể làm tăng tín hiệu JAK/STAT trong các tế bào NK và T, thúc đẩy tăng sinh tế bào, gây nguy cơ tiến triển của leukemia [32] Hơn nữa, sự hoạt động của STAT3 và STAT5 đã được chứng minh là có khả năng ức chế apoptosis, một dấu hiệu đặc trưng của ung thư [28] Các phương pháp điều trị nhắm đích tín hiệu JAK/STAT với thuốc nhắm mục tiêu phân tử và can thiệp RNA (RNAi) đã được nghiên cứu rộng rãi Trong đó, ruxolitinib, tofacitinib và fludarabine là những thuốc nhắm đích tín hiệu JAK/STAT duy nhất được sử dụng trong các phòng khám [28]

Hình 1.10 Con đường tín hiệu JAK/STAT (Nguồn Thermo Fisher)

Ở ung thư dạ dày, rối loạn điều hòa con đường tín hiệu JAK/STAT liên

quan mật thiết với protein CagA của vi khuẩn H pylori [54] Hơn nữa, nhiễm

H pylori liên quan đến tăng biểu hiện cytokine, đặc biệt là interleukin-6 (IL

6) và phản ứng viêm mạnh trong ung thư dạ dày [54] Do đó, có thể thấy việc

kích hoạt con đường tín hiệu IL6-JAK/STAT3 rất quan trọng cho sự phát triển của ung thư dạ dày Kích hoạt STAT3 rất quan trọng cho sự khởi đầu và tiến triển của ung thư dạ dày Việc kích hoạt STAT3 cũng được xác định xảy

ra mạnh mẽ hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày nhiễm H pylori dương tính

CagA [45] Trong ung thư dạ dày, các thuốc nhắm mục tiêu phân tử con đường tín hiệu JAK/STAT hiện nay chủ yếu tập trung vào nhắm đích JAK1/JAK2 và STAT3 Các thuốc ức chế JAK1/JAK2 như: INCB018424, TG101348, CEP701, AZD1480 đang trong giai đoạn thử nghiệm trên người đem lại những tín hiệu tích cực trong việc ức chế sự phát triển của khối u và cảm ứng apoptosis [49] Thuốc WP-1066 cũng đã được thử nghiệm trên mô hình ung thư dạ dày là chuột gp757FF và dòng tế bào AGS Kết quả thử nghiệm cho thấy sự tăng sinh của các tế bào đã bị chặn, tình trạng viêm giảm và quá trình apoptosis được tạo ra nhờ cảm ứng ức chế STAT3 [17]

Hình 1.11 Một con đường JAK/STAT trong ung thư [66]

1.5 Khái quát về apoptosis

Apoptosis hay còn gọi là sự chết tế bào được lập trình, là một cơ chế phức tạp ở mức độ gen để loại bỏ các tế bào bị hư hỏng có trật tự và hiệu quả như những tế bào sau khi bị tổn thương DNA hay do sai lệch trong quá trình phát triển Các thành phần của apoptosis rất phức tạp và có liên quan đến nhiều con đường tín hiệu tế bào trong đó có con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT Sự ức chế các con đường tín hiệu liên quan đến sự phát triển của tế bào làm tế bào dễ dàng đi vào quá trình apoptosis [90] Quá trình apoptosis trong một tế bào có thể được kích hoạt thông qua con đường ngoại sinh - extrinsic apoptotic pathway (phụ thuộc death receptor) hoặc con đường nội sinh - intrinsic apoptotic pathway (phụ thuộc ty thể) Cả hai con đường này hội tụ để kích hoạt các apoptotic effector dẫn đến cuối cùng là sự thay đổi tế bào với các đặc điểm đặc trưng và hình dạng, đặc điểm sinh hóa của apoptosis [90] Thông thường, sự cân bằng giữa các chất điều hòa protein pro-apoptotic và anti apoptotic là một điểm quan trọng để xác định quá trình apoptosis ở một tế bào Việc gây ra apoptosis do tổn thương DNA trong các tổn thương tiền ung thư có thể loại bỏ các tế bào có hại, do đó ngăn chặn sự phát triển của khối u Sự ức chế apoptosis có liên quan đến tăng sinh tế bào không được kiểm soát, sự phát triển và tiến triển của ung thư và khả năng kháng thuốc trong điều trị Sự ức chế apoptosis được coi là một trong những dấu hiệu đặc trưng của bệnh ung thư [34]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư dạ dày MKN45 do phòng Thí nghiệm Inserm U1053 - Viện Sức khỏe và Nghiên cứu Y học Quốc gia Pháp tại Bordeaux cung cấp

Nhóm đối chứng là các tế bào MKN45 được xử lý bằng DMSO nồng độ 0,01% trong thời gian 48 giờ

Các hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: môi trường nuôi cấy DMEMF12 và RPMI1640 (Invitrogen cung cấp), huyết thanh bò, trypsin, kháng sinh Penicillin/Streptomycin, DMSO (Sigma cung cấp) Các đĩa nuôi cấy tế bào, ống pipette và một số dụng cụ nhỏ khác do Thermo Fisher cung

(Qiagen), TOPreal qPCR 2X PreMix SYBR (Invitrogen)

Các primer dùng trong phân tích mức độ biểu hiện gen do hãng Qiagen

cung cấp

Các thí nghiệm được triển khai trên các hệ thống trang thiết bị gồm máy Realtime PCR (Analytic gena), hệ thống nuôi cấy tế bào (Memmert), buồng thao tác sinh học an toàn sinh học cấp 2 (Thermo Fisher) và các trang thiết bị phụ trợ khác tại phòng Thí nghiệm Y sinh – Trường Đại học Khoa học

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện tại phòng Thí nghiệm

Y Sinh – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 05/2018 đến tháng 06/2019