TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma spp
2.1.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp
Nấm Trichoderma Pers thuộc họ Moniliaceae, bộ moniliales, lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, có sợi nấm dạng bò lan, không màu hoặc sáng màu Chúng phát triển thành những tảng nấm nhỏ dạng gối phẳng với cành bào tử đơn bào không màu, thường phân nhánh đối xứng Cuống đính bào tử hình chai, bào tử có hình tròn hoặc hình trứng, sáng màu và có thành dày, với kích thước thay đổi từ 3,0 µm đến 4,0 µm Nấm Trichoderma spp là các nấm đối kháng sống trong đất, thường tồn tại ở dạng sợi nấm hoặc bào tử, với số lượng bào tử nhiều trong đất ẩm.
Trichoderma spp có hình dạng khuẩn lạc khác nhau trên cùng một môi trường nuôi cấy, giúp phân biệt các loài Chúng phát triển nhanh chóng và đạt độ trưởng thành trong 5 - 7 ngày Trên môi trường PDA ở nhiệt độ 25°C, khuẩn lạc ban đầu có màu trắng, sau đó chuyển sang xanh đậm hoặc xanh vàng khi bào tử xuất hiện Một số loài còn tiết ra sắc tố vàng trên môi trường PGA và có mùi đặc trưng, như Trichoderma viride với mùi dừa.
Nấm Trichoderma spp có khả năng phát triển và tạo bào tử trong môi trường giàu cellulose như bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc và bã bia Các loài Trichoderma spp thường phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 25 đến 30 độ C, với một số loài có thể phát triển tốt ở 35 độ C và thậm chí 40 độ C Độ ẩm tối ưu cho môi trường lên men để sinh khối Trichoderma spp là từ 54 đến 56% Độ pH thích hợp cho sự phát triển của nấm Trichoderma spp là từ 5 đến 6; khi pH vượt quá 6, sự sinh trưởng của nấm sẽ yếu đi.
4 sinh trưởng của nấm rất yếu
Trong quá trình nhân nuôi nấm Trichoderma spp., cần đảm bảo điều kiện thoáng khí Sau khi vô trùng, môi trường nhân nuôi cần được làm xốp bằng cách lắc để tránh tình trạng kết lại thành mảng Nếu bào tử bị kết mảng, sẽ dẫn đến việc hình thành rất ít bào tử và sợi nấm không thể lan rộng.
Hình 2.1 Hình thái nấm Trichoderma spp
Kết quả nghiên cứu của Choudhary (1992) cho thấy, chủng T viride làm giảm thiểu sự sinh sản độc tố aflatoxin B1 (73,5%) và aflatoxin G (100%) khi nuôi cấy chung với chủng A flavus
Nghiên cứu của Srilakshmi et al (2001) đã phân tích tiềm năng đối kháng của 212 chủng nấm Trichoderma được thu thập từ đất ở bang Andhra Pradesh và Karnataka, Ấn Độ, trong đó có 145 chủng cho thấy khả năng chống lại nấm A.flavus.
Trung tâm BIOTEC (Thái Lan) đã nghiên cứu và tuyển chọn thành công nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của nấm R solania, đặc biệt là các chủng thuộc loài T harianum trên hạt giống lạc Qua 15 năm nghiên cứu, các nhà khoa học tại BIOTEC đã phát hiện ra hiệu quả của các loài nấm Trichoderma trong việc phòng trừ các bệnh do nấm gây hại cây trồng có nguồn gốc từ đất Các ứng dụng vi sinh cho thấy Trichoderma không chỉ có khả năng ức chế nấm mà còn đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ cây trồng.
R.solania, S.sclerotium và Fusarium oxysporum gây hại các loại cây trồng, đặc biệt là rau màu
Nghiên cứu của Dusanee Thanaboripat và cộng sự (Thái Lan, 2009) chỉ ra rằng nấm Trichoderma atroviride có khả năng kiểm soát sinh học đối với A parasiticus IMI 10.256, mở ra khả năng sản xuất các chất kháng nấm Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã ứng dụng nấm Trichoderma sp để phòng trừ các loài nấm gây hại cho vùng rễ và cây con, đồng thời phát triển phân bón an toàn và thân thiện với môi trường.
2.1.2 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp lên các tác nhân gây bệnh cây trồng
Nấm đối kháng Trichoderma sp phổ biến trong đất và nổi bật với khả năng kiểm soát các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Pythium ultimum và Botrytis cinerea Hiệu quả đối kháng của chúng chủ yếu nhờ vào cơ chế cạnh tranh, sản sinh kháng sinh và ký sinh.
Nấm Trichoderma sp sản sinh ra nhiều loại kháng sinh khác nhau, tùy thuộc vào loài, trong đó Trichoderma viride tạo ra các kháng sinh như viridin, trichodermin, xosukacylin và almatecin, cùng với vitamin, carbohydrate và nitơ, giúp cải thiện chất lượng đất Những kháng sinh này có thể tồn tại ở dạng bay hơi hoặc không bay hơi và đều có khả năng ức chế sự phát triển của các sợi nấm gây bệnh ở mức độ khác nhau.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Trichoderma sp có khả năng sản sinh ra các enzym Chitinase và β-glucanase với hàm lượng cao, hai enzym này có khả năng thủy phân vách tế bào của các loài nấm gây bệnh rất hiệu quả Theo Jollès và Muzzarelli, sự hiện diện của những enzym này đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát nấm bệnh.
Năm 1999, các loài nấm mốc như Trichoderma và Gliocladium đã được phát hiện có hàm lượng chitinase cao, đóng vai trò quan trọng trong việc ký sinh và chống lại các loài nấm gây bệnh cho cây trồng Nấm Trichoderma sp tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh, bao gồm 2 enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase Các chủng nấm mốc như Trichoderma, Aspergillus, và Candida albicans có khả năng sản sinh -glucanase cao, với Trichoderma đặc biệt nổi bật Enzyme -glucanase của Trichoderma đóng vai trò chính trong việc đối kháng với nấm gây bệnh, trong khi enzyme -1,3-glucanase giúp kìm hãm sự tổng hợp -1,3-glucan của vách tế bào, từ đó ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh.
Tác động đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với vi sinh vật gây bệnh cây được thông qua bởi một số cơ chế sau đây:
Cơ chế ký sinh của Trichoderma sp được Weindling mô tả từ năm 1932, gọi là hiện tượng "giao thoa sợi nấm" Quá trình bắt đầu khi sợi nấm Trichoderma sp vây quanh sợi nấm gây bệnh Sau đó, các sợi nấm Trichoderma sp thắt chặt lấy sợi nấm bệnh, và cuối cùng, nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh, làm thủng màng ngoài và gây phân huỷ các chất nguyên sinh bên trong.
Nghiên cứu gần đây bằng kính hiển vi điện tử đã chỉ ra rằng cơ chế ký sinh của nấm Trichoderma sp trên nấm gây bệnh liên quan đến sự xoắn quanh sợi nấm vật chủ, dẫn đến thủy phân và xâm nhập vào bên trong sợi nấm đó Quá trình này làm phá hủy chất nguyên sinh của sợi nấm vật chủ, cuối cùng dẫn đến sự mất mát nguyên sinh chất và phá vỡ sợi nấm vật chủ, từ đó giải phóng các sợi nấm Trichoderma sp đang sinh sản Hiện tượng tan rã Kitin cũng được quan sát thấy xung quanh khu vực xâm nhập của nấm Trichoderma sp (Dubey, 1995; Inbar and Ramirez, 1996).
Để nấm Trichoderma sp ký sinh hiệu quả trên nấm gây bệnh cây, các bào tử đính cần phải tiếp xúc với nấm vật chủ và hình thành thể giác bám Thể giác bám này sẽ xâm nhập vào trong thành tế bào của nấm vật chủ, từ đó tỉ lệ ký sinh sẽ tăng lên với sự gia tăng tiếp xúc trực tiếp giữa nấm Trichoderma sp và nấm vật chủ (Inbar và Ramirez, 1996).
Nấm Trichoderma sp có khả năng sản sinh ra nhiều loại kháng sinh khác nhau, với sự khác biệt về khả năng sinh ra giữa các loài và chủng khác nhau Một số loại kháng sinh tiêu biểu mà Trichoderma sp tạo ra bao gồm:
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI
Ý niệm sử dụng nấm Trichoderma sp để phòng trừ nấm gây bệnh hại cây trồng đã xuất hiện từ đầu thập kỷ 30, khi Weidling là người đầu tiên đề xuất ứng dụng loài nấm này nhằm kiểm soát bệnh do Rhizoctonia sp gây ra, đặc biệt là bệnh thối lở cổ rễ ở cây con mới mọc từ hạt Kể từ đó, nhiều nghiên cứu về Trichoderma sp đã được thực hiện trên toàn thế giới để khai thác tiềm năng của chúng trong việc phòng trừ bệnh hại cây trồng.
Nấm Trichoderma sp thuộc bộ Hyphales và lớp nấm bất toàn, trong đó ba chủng phổ biến nhất là T viride, T harzianum, và T hamatum, với T viride được chú ý đặc biệt Loài nấm này sống hoại sinh trong đất và trên tàn dư thực vật, đóng vai trò quan trọng trong việc chống lại nấm gây bệnh cây Cơ chế đối kháng của Trichoderma sp chủ yếu thông qua ký sinh, tiêu diệt sợi nấm bệnh hoặc sản xuất các chất kháng có hoạt tính sinh học cao, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh Ngoài ra, Trichoderma sp còn tiết ra các enzym gây suy biến sợi nấm bệnh và thể hiện tính đối kháng bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng và nơi cư trú, thường định cư trước nấm gây bệnh cây.
Nghiên cứu về nấm Trichoderma sp đã được thực hiện tại khoảng 30 quốc gia, bao gồm Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Hungary, Ấn Độ và Thái Lan, nhằm sử dụng chúng để phòng trừ bệnh hại cây trồng Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma sp có hiệu lực cao trong việc kiểm soát bệnh hại Weinding đã chứng minh rằng việc bón nấm Trichoderma sp vào đất có thể bảo vệ cây con mới mọc khỏi bệnh thối do nấm Rhizoctonia sp gây ra.
Trong phòng thí nghiệm, các loài nấm Trichoderma như T harzianum, T viride, T pseudokonigii và T reesei thể hiện khả năng đối kháng cao với nấm R solani, có thể gây hại cho nhiều loại cây trồng trên toàn thế giới, với hiệu lực đạt tới 71% Dung dịch chứa 50% dịch nuôi cấy nấm T viride đã ức chế 61,1% sự phát triển của khuẩn lạc R solani trên môi trường Agar (Dubey et al., 1995) Ngoài ra, nấm T pseudokonigii có khả năng ức chế hơn 60% sự phát triển của nấm bệnh đạo ôn Pyricularia oryzae.
Nấm Trichoderma sp cho thấy hiệu lực cao trong việc phòng trừ bệnh nấm cho các loại cây như cà chua, dưa chuột, ớt và lạc Cụ thể, nấm Trichoderma harzianum đã bảo vệ được 86,7% cây cà chua khỏi bệnh thối thân do nấm S rolfsii, đồng thời hạn chế bệnh do nấm R solani và S rolfsii trên cây Iris Tại Rumani, nấm T viride cũng cho hiệu quả cao hơn so với thuốc Methyl tiophanate trong việc phòng trừ bệnh nấm R solani trên đậu đỗ trong nhà kính (Sesan et al., 1995).
Nấm T harzianum đã chứng minh hiệu quả cao trong việc kiểm soát nấm Pythium sp và R solani, gây bệnh chết héo trên đậu đỗ và củ cải R.sativus tại Nam Mỹ (Chet et al., 1981) Tại Israel, nấm này được áp dụng để trị bệnh héo cây Iris do R solani với hiệu lực đạt 93,0% so với đối chứng (Chet et al., 1980) Ở Thái Lan, T harzianum cũng cho thấy tiềm năng trong việc bảo vệ cây cà chua khỏi bệnh thối thân do S rolfsii với hiệu quả lên đến 91,7% (Chamswarng, 1990; Deema et al., 1991) Ngoài ra, nấm T viride đã được ghi nhận có hiệu quả cao trong việc kiểm soát bệnh Nigrospora oryzae trên ngô ở Rumani (Dumitras, 1983).
Nấm Trichoderma konigii tại Mỹ có khả năng phòng trừ hiệu quả bệnh héo rũ lúa mì do nấm Gaeumannonyces graminis var tritici (Duffy et al., 1996) Tại Trung Quốc, nấm T viride chủng T22 cho thấy tính đối kháng mạnh với nấm F oxysporum gây héo vàng cây cà chua (Wang et al., 1996) Đối với nấm Pythium debaryanum, một số vi sinh vật như T viride, Streptomyces grines, và Bacillus subtilis đã chứng minh hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh rõ rệt (Ychia et al., 1981) Nghiên cứu cho thấy nấm T harzianum có khả năng kết hợp với thuốc hóa học, nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh hại cây trồng Tại Thái Lan, sự phối hợp giữa T harzianum (T20) và Mancozeb 1800mg/l đã được chứng minh là hiệu quả trong việc phòng chống nấm.
S rolfsii trong nhà kính đạt hiệu lực 90% và trên đồng ruộng đạt hiệu lực 88,9% (Saksirirat et al., 1996), nếu chỉ sử dụng T20 trên đồng ruộng thì chỉ đạt hiệu lực 61%
Nghiên cứu cho thấy nấm đối kháng Trichoderma sp không chỉ là tác nhân sinh học hiệu quả trong phòng trừ sinh học mà còn kích thích sự phát triển của cây trồng, bao gồm tăng số lượng cây mọc, chiều dài thân, diện tích lá và trọng lượng chất khô Khi được bón vào đất đã khử trùng dưới dạng huyền phù bào tử, dạng cám – than bùn, hoặc xử lý hạt, nấm Trichoderma sp có thể ức chế các nấm thứ yếu trong vùng rễ, sản sinh hoocmon thực vật và vitamin, đồng thời biến đổi các chất thành dạng dễ tiêu cho cây trồng Kết quả này chứng minh rằng Trichoderma sp có thể được sử dụng như phân vi sinh cho cây trồng.
Nghiên cứu về nấm T harzianum chủng T22 cho thấy nấm này có khả năng tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của cây ngô (Samia et al., 2012) Các chủng Trichoderma sp cũng có thể tương tác tích cực với bộ rễ của cây trồng, giúp cải thiện khả năng sinh trưởng và khả năng chống lại các yếu tố vô sinh gây stress (Hermosa et al., 2012).
Nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma sp có hiệu lực cao trong việc phòng trừ nấm bệnh hại cây trồng, cả trong phòng thí nghiệm lẫn thực địa Do đó, việc sản xuất và sử dụng chế phẩm từ Trichoderma sp trở nên rất quan trọng trong nông nghiệp.
Các quốc gia khác nhau sử dụng nguyên liệu khác nhau để tạo môi trường nuôi trồng nấm Trichoderma sp Cụ thể, Israel sử dụng cám lúa mì hoặc than bùn, trong khi Pháp chọn hạt yến mạch và Agar Mỹ áp dụng cám, than bùn hoặc sự kết hợp giữa cám và mạt cưa Ấn Độ tận dụng các phế liệu từ chế biến nông sản như vỏ quả cà phê, còn Đài Loan sử dụng vỏ trấu làm môi trường nuôi trồng.
Sau khi nhân sinh khối nấm, việc sử dụng chế phẩm Trichoderma sp để phòng trừ bệnh hại là rất quan trọng Có thể áp dụng các phương pháp phòng trừ như xử lý hạt giống, bón vào đất, phun lên cây hoặc nhúng vào dịch bào tử để đạt hiệu quả cao.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Ở Việt Nam, việc phòng trừ bệnh hại cây trồng chủ yếu dựa vào biện pháp hóa học, dẫn đến ô nhiễm môi trường và chi phí cao Đặc biệt, các bệnh do nấm như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysforum và Pythium debaryanum có hiệu quả phòng trừ hóa học thấp Do đó, biện pháp sinh học, đặc biệt là việc sử dụng nấm Trichoderma spp., đã được nghiên cứu từ năm 1996 và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong những năm gần đây.
Nghiên cứu biện pháp sinh học để phòng trừ bệnh hại cây trồng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể Bộ môn bệnh cây - Viện bảo vệ thực vật đã công bố kết quả về nấm đối kháng Trichoderma sp vào năm 1991-1992, cho thấy nấm này có khả năng ức chế hiệu quả các loài nấm gây hại như Fusarium sp và R solani Năm 1997, Trần Thị Thuần đã chỉ ra cơ chế đối kháng của Trichoderma sp bao gồm ký sinh, kháng sinh và cạnh tranh Trong môi trường nhân tạo, nấm T harzianum cho thấy hiệu lực ức chế cao, với 76% đối với Fusarium sp., 98% đối với R solani và 79% đối với Aspergillus flavus.
Năm 1996, tác giả Trần Thị Thuần đã thực hiện thí nghiệm chậu vại, cho thấy nấm T harzianum có hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng cây lạc do nấm S rolfsii gây ra đạt 97% Đến năm 1998, tác giả cũng đã nghiên cứu và công bố một số hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với các nấm gây hại cho cây trồng.
Tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam, nấm đối kháng T viride đã được phân lập và nghiên cứu từ năm 1996, với isolate T.v-96 cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ nhiều loại nấm gây hại như R solani, S rolfsii, và F oxysporum, là những tác nhân gây bệnh lở cổ rễ và chết cây trên nhiều loại cây trồng Chế phẩm sinh học từ isolate T.v-96 đã được thử nghiệm thành công trong điều kiện invitro và invivo, giúp giảm tỷ lệ cây bệnh do nấm Fusarium sp và Rhizoctonia sp Để sản xuất sinh khối nấm đối kháng, Trần Thị Thuần đã đề xuất các phương pháp sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma sp từ năm 1999 Mặc dù nghiên cứu về nấm đối kháng ở Việt Nam vẫn còn hạn chế, nhưng đây là dấu hiệu tích cực cho việc áp dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh hại cây trồng trong tương lai.
Kết quả khảo sát cho thấy nấm T viride có khả năng tiêu diệt nấm S rolfsii trong môi trường nhân tạo, khi T viride có mặt trước nấm gây bệnh Thí nghiệm trong điều kiện chậu vại cho thấy T viride có thể phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng do S rolfsii gây hại cho cây đậu tương lên tới 94,4% (Đỗ Tấn Dũng).
2006) Các nghiên cứu của Nguyễn Văn Viên và cs (2012) cũng cho kết quả tương tự
Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng để kiểm soát nấm hại cây trồng có nguồn gốc từ đất đã thu hút nhiều sự quan tâm Một nghiên cứu cho thấy chủng nấm ĐR16, trong số 40 chủng nấm Trichoderma sp được phân lập từ 8 mẫu đất tại Thừa Thiên Huế và Quảng Trị, có khả năng ức chế hoàn toàn sự hình thành hạch của nấm S rolfsii, tác nhân gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng (Trần Thị Thu Hà và Phạm Thanh Hòa, 2012).
Nấm đối kháng T harianum có khả năng ức chế và tiêu diệt nấm gây bệnh S rolfsii cùng một số nấm bệnh khác có nguồn gốc từ đất Việc ủ hạch nấm trong 4 tuần và rửa lại bằng nước cất sẽ giúp giảm đáng kể tỷ lệ nảy mần của hạch nấm S rolfsii.
Dương Minh và cộng sự (2005, 2006) đã tiến hành thu thập, phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh mẽ với nấm bệnh Phytophthora palmivora, nguyên nhân gây ra hiện tượng chảy nhựa ở gốc, thân, cành và nhánh cây sầu riêng.
Nghiên cứu của Dương Minh và cộng sự (2005) cho thấy các dòng nấm Trichoderma sp được phân lập từ vườn quýt ở Vĩnh Long, Cần Thơ và Đồng Tháp có khả năng ức chế nấm gây hại F.solani, nguyên nhân gây bệnh thối rễ trong điều kiện đất có pH thấp (3,9 – 4,2) tại Đồng bằng sông Cửu Long Tương tự, Ngô Bích Hảo và cộng sự (2006) đã khảo sát hiệu lực của nấm T viride trong việc phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng, cho thấy nấm T viride có khả năng ức chế nấm S rolfrisii hiệu quả Cụ thể, sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm T viride đạt 87,8 mm, lớn hơn 1,7 lần so với S rolfrisii, và sau 4 ngày, đường kính tản nấm T viride là 57,8 mm, lớn hơn 2,6 lần so với S rolfrisii, với hiệu lực ức chế đạt 75,2%.
Cũng theo Đỗ Tấn Dũng (2006), khi khảo sát hiệu lực của nấm T.viride đối với các isolate nấm S rolfrisii trên môi trường nhân tạo thì thấy rằng khi nấm
T.viride có mặt trước nấm gây bệnh thì nấm T.viride có khả năng chiếm chỗ, cạnh tranh, ức chế và tiêu diệt nấm S rolfrisii và trong điều kiện chậu vại nấm đối kháng T.viride có khả năng sử dụng để phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng hại cây trồng cạn mang lại hiệu quả cao, cây lạc (86,5%), cây đậu tương (94,4%) Nguyễn Văn Viên (2009) cho biết khi xử lý giống lạc bằng chế phẩm T.viride ở các liều lượng khác nhau (5gr,10gr,15gr,20gr) trước khi gieo ngoài đồng ruộng cho kết quả khi trộn 20gr T.viride/30ml nước/1kg hạt cho hiệu quả phòng trừ cao nhất(69,84% với nấm R.solani, đạt 62,17% với nấm S rolfrisii và đạt 60,01% với nấm A.niger) Để đáp ứng nhu cầu cho việc phòng trừ nấm bệnh hại kết hợp với cung cấp một nguồn dinh dưỡng để cây trồng sinh trưởng phát triển thì việc nghiên cứu phối trộn chế phẩm nấm Trichoderma sp với một loại phân bón hữu cơ là rất quan trọng
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Nam (2011), một số chủng nấm Trichoderma được phân lập tại Tây Nguyên có khả năng ức chế các nấm gây hại cây trồng như F oxysporum, R solani và Phytophthora Những chủng nấm này không chỉ giúp cải thiện sự phát triển của cây mà còn cung cấp chất hữu cơ và phân giả lân, góp phần tăng cường sức khỏe cho cây trồng.
Hiện nay, nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa nấm Trichoderma đang được các nhà khoa học quan tâm Nguyễn Thị Thuần và cộng sự (1997) đã thử nghiệm trên nhiều loại môi trường như bã mía, lõi ngô, thóc, cám gạo, bã bia và bã đậu phụ, cho thấy nấm Trichoderma đều phát triển và hình thành bào tử Trong đó, môi trường bã đậu phụ giúp nấm phát triển tốt nhất nhưng khó khăn trong bảo quản Ngược lại, môi trường thóc không chỉ cho phép nấm sinh trưởng tốt mà còn tạo ra nhiều bào tử, đồng thời là cơ chất lý tưởng để bảo quản sau khi nhân sinh khối.
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Thùy (2004), nấm Trichoderma phát triển mạnh mẽ trên hai loại môi trường Trấu + Cám và Thóc Kết quả cho thấy mật độ bào tử cao nhất đạt được trên môi trường Thóc với 3,2 x 10^9 cfu/g, trong khi môi trường Trấu Cám cũng cho kết quả khả quan với 4,9 x 10^8 cfu/g.
Trên thị trường hiện nay, nông dân đã chấp nhận và sử dụng một số chế phẩm sinh học Trichoderma thương mại để phòng trừ bệnh hại, bao gồm TriB1 của Viện Bảo vệ Thực vật, TRICO – ĐHCT từ trường Đại học Cần Thơ, và Vi-ĐK của công ty Cổ phần thuốc sát trùng Việt Nam (Vipesco).
Công ty cổ phần phát triển phân bón nông nghiệp I đã nghiên cứu và sản xuất phân bón hữu cơ Lục thần nông từ chất thải chăn nuôi lợn gà, với thành phần dinh dưỡng gồm Nitơ (N) 16%, lân (P2O5) 5%, kali (K2O) 10% và các vi lượng chelated như kẽm, magiê, đồng và mangan Phân này đã được chứng minh hiệu quả trong việc thúc đẩy sự sinh trưởng của cây trồng như lúa, ngô và rau Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về việc phối trộn phân này với nấm Trichoderma sp Do đó, nghiên cứu này nhằm cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và tận dụng nấm Trichoderma sp để giảm thiểu tác hại của một số bệnh do nấm gây ra như R solani, S rolfsii và F oxysporum đối với các cây trồng như lúa, ngô, cà chua và cải bắp.
NGHIÊN CỨU VÀ PHÒNG TRỪ BỆNH CHẾT RẠP CÂY CON, LỞ CỔ RỄ VÀ THỐI NHŨN CẢI BẮP DO NẤM Rhizoctonia solani GÂY RA
CỔ RỄ VÀ THỐI NHŨN CẢI BẮP DO NẤM Rhizoctonia solani GÂY RA
Nấm Rhizotonia solani (R.solani) là tác nhân gây bệnh phổ biến cho cây trồng, đặc biệt là các loại rau màu Loài nấm này có nguồn gốc từ đất và xuất hiện ở hầu hết các vùng trồng trọt trên toàn cầu (Janice Y Uchida, 2008) Với khả năng tấn công hơn 165 loại cây trồng, R.solani gây ra các bệnh như lở cổ rễ và thối thân, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất cây trồng.
R solani thực sự là một loài dịch hại nguy hiểm gây ảnh hưởng lớn tới năng suất cây trồng
Nấm R solani, được Decandolle mô tả lần đầu vào năm 1815 với tên gọi Rhizoctonia crocorum, chỉ được biết đến rộng rãi vào năm 1858 khi Julius Kuhn nghiên cứu bệnh lở cổ rễ trên cây khoai tây Đây là loài nấm phổ biến và quan trọng nhất thuộc chi Rhizoctonia (Ceresini, 1999).
Nấm R solani có khả năng gây hại cho cây trồng ở mọi giai đoạn phát triển, từ khi hạt giống chưa gieo cho đến giai đoạn cây con Loại nấm này có thể tồn tại trong đất, trong tàn dư cây trồng và các ký chủ phụ, bao gồm cả cỏ dại Đặc biệt, R solani có thể sống như một loài nấm hoại sinh trong môi trường đất giàu chất hữu cơ.
Nấm R solani có khả năng xâm nhập và gây hại cho cây trồng khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi Chúng lây lan qua đất, nước, dụng cụ canh tác và các bộ phận của cây Bệnh do nấm R solani gây ra thường nghiêm trọng hơn ở những vùng đất ẩm ướt (Creek, 2012).
Theo nghiên cứu của Anderson (1982), bệnh lở cổ rễ chỉ được phát hiện sau khi cây được trồng trên ruộng, chủ yếu gây hại ở phần cổ rễ sát mặt đất Ban đầu, vết bệnh có màu khác với vỏ cây, vỏ bị rộp và sau đó lan rộng quanh cổ rễ Theo thời gian, vỏ cây khô lại và khi gặp thời tiết ẩm ướt, sẽ bị thối nhũn, để lộ phần lõi gỗ có màu thâm đen, dẫn đến hiện tượng cây héo và chết Khi bệnh nặng, phần cuối của rễ trở nên đen và có hình dạng giống như lưỡi mác.
Theo Nguyễn Kim Vân (2006) mô tả bệnh thối cải bắp và bệnh do R.solani gây ra như sau:
Bệnh chết rạp cây con là một hiện tượng nghiêm trọng có thể xảy ra trước hoặc sau khi cây mọc khỏi mặt đất Trước khi nảy mầm, cây con có thể bị tổn thương ở đỉnh sinh trưởng Sau khi nảy mầm, nấm gây ra các vết bệnh màu nâu đậm, nâu đỏ hoặc hơi đen ở gốc cây sát mặt đất, dẫn đến hiện tượng thắt lại ở phần thân non, làm cây trở nên mềm yếu, dễ đổ gục và cuối cùng dẫn đến chết cây con.
Bệnh lở cổ rễ chủ yếu ảnh hưởng đến phần gốc cây sát mặt đất, gây thối nhũn và làm lộ lõi gỗ màu thâm đen Khi mới nhiễm, lá cây vẫn giữ màu xanh tươi trong vài ngày, nhưng sau đó sẽ héo rũ và chết dần Ở gốc cây, có thể thấy vết lõm màu nâu hoặc nâu đỏ, vết bệnh lan rộng xung quanh gốc và xuống rễ, khiến gốc thân bị lở loét Vào những ngày sương mù, lớp tơ trắng có thể xuất hiện tại vết bệnh, và sau vài ngày, đốm hạch màu vàng nâu sẽ xuất hiện quanh gốc.
Bệnh do nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây ra, với hai giai đoạn phát triển chính là sợi nấm và hạch nấm Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ 17 - 28 o C và pH từ 4-7, có khả năng sống trong đất từ 2-3 năm Để phòng trừ bệnh lở cổ rễ, cần chú trọng vào khâu làm đất, xử lý đất trước khi gieo trồng khoảng 10 ngày Đất trồng nên được lên luống cao và không sử dụng phân chuồng tươi chưa hoai mục Tốt nhất là ủ phân chuồng với chế phẩm Trichoderma để đảm bảo hoai mục trước khi bón lót.
(http://www.hoinuoitrong.com/2016/07/benh-thoi-goc-re-cach-phong-tri- benh-lo-co-re-o-cay-trong.html)
Nhiều nghiên cứu về hiệu lực của các loại thuốc hoá học đối với nấm
R solani cũng đã được tiến hành Các thuốc trừ nấm được sử dụng hợp lý như: Methyl thiophanate, Chlorothalonil đều có hiệu quả trong phòng trừ bệnh nấm
Hiện nay, an toàn cho môi trường và con người trong nông nghiệp đang là vấn đề quan trọng, do đó việc sử dụng thuốc hóa học để kiểm soát bệnh từ đất không còn được coi là giải pháp khoa học Thay vào đó, con người ngày càng chú trọng đến các sản phẩm sinh học trong việc phòng trừ dịch hại cây trồng Những sản phẩm này không chỉ an toàn cho môi trường, vật nuôi và con người mà còn không gây ra hiện tượng kháng thuốc và các chủng mới, đồng thời duy trì sự cân bằng trong hệ sinh thái Trong số đó, các chế phẩm chứa nấm đối kháng Trichoderma sp đang được ứng dụng rộng rãi.
Nhiều nghiên cứu được tiến hành ở các nước trên thế giới như Anh, Pháp,
Mỹ đã áp dụng các sinh vật có ích, đặc biệt là vi sinh vật đối kháng, trong đó nấm Trichoderma sp được đánh giá cao về hiệu quả.
NGHIÊN CỨU VÀ PHÒNG TRỪ BỆNH THỐI HẠCH CẢI BẮP DO NẤM Sclerotinia sclerotiorum GÂY RA
Bệnh thối hạch cải bắp, do nấm Sclerotinia sclerotiorum gây ra, là một trong những loại nấm phổ biến toàn cầu Loài nấm này gây hại cho nhiều loại cây trồng và rau quả khác nhau, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm.
Nấm S.sclerotiorum là tác nhân gây hại phổ biến trên hơn 160 loài cây thuốc thuộc 32 họ khác nhau, chủ yếu ảnh hưởng đến các cây như cải bắp, cà rốt, đậu trắng và khoai lang Loại nấm này có phạm vi phân bố rộng, đặc biệt phổ biến ở các vùng ôn đới (Stephen A Ferreira và Rebecca A Boley, 1992).
Cây con bị bệnh gốc thân sát mặt đất thường bị thối nhũn, dẫn đến cây chết đổ gục Trên cây lớn, vết bệnh xuất hiện từ lá già gần mặt đất và gốc thân, ban đầu có màu nâu vàng Trong điều kiện ẩm ướt, vết bệnh thối nhũn không có mùi, còn trong thời tiết khô hanh, vết bệnh có màu nâu nhạt và teo lại Cuống lá và phiến lá bệnh chuyển sang màu trắng, ủng nước, lan từ rìa mép lá vào trong Bệnh tiếp tục lan lên bắp, gây thối dần từ ngoài vào trong, cuối cùng dẫn đến cây chết khô trên đồng ruộng Trên bề mặt bắp, lớp nấm màu trắng và nhiều hạch nấm màu nâu đen xuất hiện, làm cho cải bắp đổ gục, gãy thân và chết trên đồng ruộng (Marc et al., 2001).
Bệnh thối hạch cải bắp do nấm S sclerotiorum gây ra, thuộc họ Sclerotiniceae, bộ Helotiales, lớp Nấm túi Đây là một bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn cho các vùng trồng cải bắp, đặc biệt ở những khu vực có độ ẩm cao và nhiệt độ thấp.
Bệnh thối hạch do nấm S sclerotiorum thường xuất hiện vào cuối vụ Đông và vụ Xuân, với nhiệt độ phát triển lý tưởng từ 18 oC đến 22 oC Nấm này phát triển tốt trong môi trường có pH từ 4,5 đến 5,5 Để hình thành quả thể đĩa, nhiệt độ cần thiết là từ 12 oC đến 20 oC Để hạn chế sự lây lan và phát triển của bệnh ở những vùng có tỷ lệ nhiễm cao, việc sử dụng vôi bột để xử lý đất trước và sau khi trồng là rất hiệu quả.
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐÔI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Bệnh lở cổ rễ cải bắp (Rhizoctoni solani)
- Bệnh thối hạch cải bắp (Sclerotinia sclerotiorum)
- Các mẫu đất thu thập từ các vùng trồng rau mầu ở một số tỉnh miền Bắc
- Phân bón hữu cơ, phân hữu cơ lục thần nông
3.1.3 Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu
Trong phòng thí nghiệm, các dụng cụ thiết yếu bao gồm tủ sấy, nồi hấp, lò vi sóng, tủ lạnh, tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa Petri, ống nghiệm, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, và bình phun Ngoài ra, các thiết bị quan trọng khác như máy nhân gene (PCR), máy điện di, máy ly tâm, tủ lạnh -20 độ C, và máy đo pH cũng đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu và thí nghiệm khoa học.
- Dụng cụ để thu thập mẫu gồm: dao, kéo, dây chun, túi đựng mẫu,…
- Dụng cụ nhà lưới: Chậu trồng cây, bình phun nước,
- Môi trường nuôi cấy: WA, PDA, PSA và OMA (gồm các vật liệu cần thiết như khoai tây, đường D-Glucose, agar, nước cất, saccarose, )
- Bột Talc dùng để phối trộn chế phẩm nấm Trichoderma
- Chuẩn pH môi trường nuôi cấy bằng HCl 1N và NaOH 1N
Để chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR, cần chuẩn bị các hóa chất và vật liệu như đệm CTAB, cặp mồi ITS4 và ITS5, DreamTaq, nước cất dH2O, các nucleotide dNTPs, thang DNA, cùng với đệm TE và đệm TAE cho quá trình điện di.
ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu tại phòng thí nghiệm, nhà lưới số 7 của Bộ môn Bệnh cây - Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Vùng trồng rau màu tại Văn Đức – Gia Lâm – Hà Nội và Gia Phú - Bảo Thắng – Lào Cai
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này tập trung vào việc thu thập mẫu đất và xác định loài nấm Trichoderma sp từ các vùng trồng rau màu tại miền Bắc Việt Nam Đặc điểm hình thái, sinh học và phân tử của các mẫu Trichoderma sp đã được nghiên cứu kỹ lưỡng Qua đó, nghiên cứu đã tuyển chọn được loài nấm Trichoderma sp có khả năng ức chế nấm R solani gây bệnh lở cổ rễ và S sclerotinia gây bệnh thối hạch cây cải bắp Việc nhân sinh khối loài nấm Trichoderma spp cho thấy triển vọng trong việc phát triển chế phẩm phòng trừ bệnh lở cổ rễ và thối hạch cây bắp cải ngoài đồng ruộng Thí nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây cải bắp cũng đã được thực hiện trong điều kiện chậu vại Đồng thời, nghiên cứu cũng điều tra và đánh giá mức độ nhiễm bệnh lở cổ rễ và thối hạch cây bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai, cùng với thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh tại Lào Cai.
Hà Nội bằng chế phẩm nấm Trichoderma sp kết hợp với phân bón hữu cơ, phân bón Lục thần nông
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất và phân lập nấm Trichoderma
Mẫu đất được thu thập từ các ruộng rau màu ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, bao gồm Hà Nội, Hải Dương, Bắc Ninh, Cao Bằng và Hòa Bình, với độ sâu lấy mẫu từ 5-20 cm.
Phân lập nấm Trichoderma được thực hiện bằng cách hòa loãng đất trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 100 gram đất với 1000 ml nước cất Dung dịch này sau đó được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al (2017) Để xác định nấm Trichoderma sp., chúng tôi áp dụng phương pháp của Flegel (1980).
3.4.2 Phương pháp điều tra mức độ bệnh (tỉ lệ bệnh) lở cổ rễ và thối hạch bắp cải tại Hà Nội và Lào Cai
Điều tra bệnh hại cây trồng được thực hiện theo QCVN 01-38: 2010/BNN & PTNT, do Ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia biên soạn Cục Bảo vệ thực vật đã trình duyệt và Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành thông qua Thông tư số 71/2010/TT – BNNPTNT.
- Điều tra theo phương pháp 10 điểm chéo góc
- Mỗi điểm điều tra 5 cây
Tổng số cây bị bệnh
Tổng số cây điều tra
3.4.3 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.4.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Đĩa Petri, bình tam giác, ống nghiệm, ống đong, đũa thủy tinh, que cấy được sấy khử trùng ở 140 o C trong 2 giờ bằng tủ sấy
* Môi trường WA (Water agar):
Để điều chế môi trường, đầu tiên đun sôi nước cất và cho agar vào khuấy đều cho tan hoàn toàn Sau đó, đổ hỗn hợp vào bình tam giác và bịt kín miệng bằng giấy bạc Tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC và áp suất 1,5 atm trong 20 phút Khi môi trường nguội xuống 50 oC, rót vào đĩa Petri.
* Môi trường PDA (Potato Glucose Agar):
Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt vỏ và cắt hạt lựu Đun sôi trong 1000ml nước cất khoảng 20 phút, sau đó lọc lấy nước qua phễu có màng lọc và bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000ml Tiếp theo, cho từ từ agar vào và khuấy đều, sau đó thêm đường Glucose và khuấy cho tan Cuối cùng, môi trường được cho vào bình tam giác và đậy kín bằng giấy bạc trước khi hấp khử trùng.
121 o C, 1,5 atm trong khoảng 20 phút, để nguội 50 o C, sau đó rót vào đĩa Petri
* Môi trường PSA (Potato saccarose agar) và môi trường OMA (Oat meal agar): được điều chế giống môi trường PDA
3.4.3.2 Phương pháp phân lập nấm Trichoderma từ mẫu đất và nuôi cấy thuần
Các mẫu đất được thu thập, sau đó phơi khô và nghiền mịn Tiếp theo, đất được pha loãng theo tỷ lệ 100 gram đất với 1000 ml nước cất vô trùng Dung dịch pha loãng này được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al (2017) Cuối cùng, nấm Trichoderma sp được xác định theo phương pháp của Flegel (1980).
Kỹ thuật cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh kết hợp với kính hiển vi quang học trong Bộ môn bệnh cây, cùng với phương pháp cấy ria vi khuẩn, được áp dụng để thu hoạch nguồn nấm Tricoderma sp thuần, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Nguồn nấm thuần sau khi phân lập được bảo quản bằng hai phương pháp: thứ nhất, trong glycerol 50%; thứ hai, cấy trên môi trường WA và cho bào tử dính vào giấy thấm vô trùng, sau đó lưu trữ trong ống Eppendorf ở nhiệt độ -20 độ C.
3.4.3.3 Xác định tên loài nấm Trichoderma spp bằng kĩ thuật PCR và giải trình tự vùng rDNA-ITS
* Phương pháp xác định tên loài nấm Trichoderma spp
Vùng liên gien ITS (internally transcribed spacers) của cụm gien rDNA hiện đang được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu đa dạng và xác định nhiều loài nấm Các rDNA của nấm được tổ chức thành các đơn vị phiên mã, bao gồm các gen 18S-5.8S-28S, với hai vùng ITS là ITS4 (đầu 5’) và ITS5 (đầu 3’) nằm xung quanh gen 5.8S Các vùng ITS có tốc độ đột biến tương ứng với tốc độ biệt hóa loài, cho phép phân biệt mối quan hệ giữa các loài nấm, như đã được chứng minh đối với nấm Phytophthora (Duncan và Cooke, 2002).
- PCR và giải trình tự
DNA của nấm Trichoderma được chiết xuất từ mẫu nấm nuôi cấy trong 7 ngày bằng phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) theo quy trình của Doyle & Doyle (1987) Sau khi chiết, DNA được hòa trong 50 uL đệm TE và được bảo quản ở nhiệt độ -20 o C.
Cách chiết DNA bằng phương pháp CTAB:
+ Ủ đệm CTAB ở nhiệt độ 65 o C trong 30 phút
+ Cạo sợi nấm cho vào tube 1.5ml, cho 200àl CTAB vào rồi nghiền nhuyễn, cho thờm 500àl CTAB
+ Đem ủ ở nhiệt độ 65 o C trong 30 phút sau đó để nguội, ly tâm trong
+ Hỳt 700àl dịch trờn tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút
+ Hỳt 500 – 600àl dịch trờn tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương Chlorofom isoamyl (24:1) vào tube, lắc đều, ly tâm trong 5 phút
+ Hỳt 400àl dịch trờn tủa ra tube mới, bổ sung lượng tương đương isopeopanol vào tube, để lạnh ở -20 o C ít nhất trong 30 phút
+ Lấy ra ly tâm 15 phút, bỏ dịch thu cặn
+ Rửa với cồn ethanol 70 o 2 lần, spin hút cồn ra
+ Để khô trong không khí hoặc tủ cấy trong 30 phút
+ Bổ sung 30 - 50àl TEBf, hũa tan tủa và giữ ở nhiệt độ -20 o C
Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) được sử dụng để khuếch đại toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãng Fermentas, với chu trình PCR bao gồm 1 chu kỳ khởi động ở 94 o C trong 5 phút, sau đó 35 chu kỳ với các bước 94 o C trong 40 giây, 52 o C trong 40 giây, và 72 o C trong 1 phút, kết thúc bằng 1 chu kỳ ở 72 o C trong 5 phút, và dừng phản ứng ở nhiệt độ phòng.
+ Tinh sạch sản phẩm PCR:
Sản phẩm PCR được chiết xuất từ gel agarose sử dụng kít tinh chiết DNA Gel Extraction Kit (NORGER) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Nồng độ DNA được ước lượng thông qua phương pháp điện di agarose.
Các bước trong tinh sạch DNA từ agarose gel:
- Thờm 3 lần thể tớch Binding Buffer G vào 1 thể tớch gel (300 àl Binding Buffer G vào ống 1.5ml chưa 100mg gel)
- Ủ ở 55 o C trong thời gian 10 phút đảm bảo gel tan hoàn toàn Trong thời gian ủ, thỉnh thoảng đảo đều để gel được tan hoàn toàn
Chuyển 750 µl dung dịch vào cột tinh sạch DNA và ly tâm ở 8000 rpm trong 1 phút Sau đó, chuyển phần cồn của dung dịch và ly tâm tương tự.
- Thờm 500 àl dung dịch Wash Solution A, ly tõm ở 14000 rpm trong thời gian 1 phút Đổ phần dung dịch sau ly tâm và spin nhẹ
- Thờm 30-50 àl của Elution buffer B để thu lấy DNA
- DNA tinh sạch được giữ ở -20 o C sử dụng cho giải trình tự
The PCR product was sequenced in a single direction using PCR primers (ITS4 and ITS5) and the BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit from Applied Biosystems, with sequencing reactions performed by Macrogen Nucleotide sequences were edited and assembled using Seqman software (DNASTAR, LaserGene).
To prepare for gene sequencing, use an Eppendorf tube to mix 5 µl of DNA with 5 µl of either ITS4 or ITS5 primers (5 pmol/µl) Send the reaction tube to Macrogen for gene sequencing analysis.
- Phân tích trình tự và xác định tên loài
XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê sinh học theo phần mềm Irristart 5.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN
KẾT QUẢ THU THẬP, PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC CỦA NẤM TRICHODERMA SP
4.1.1 Kết quả thu thập mẫu đất để phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp tại một số tỉnh miền Bắc
Nấm Trichoderma sp thường có mặt trong đất tự nhiên, với nhiều chủng như Trichoderma viride, T harzianum, và T aperellum, có khả năng đối kháng với các tác nhân gây bệnh hại cây trồng từ đất như Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, và Fusarium sp Tại miền Bắc Việt Nam, việc xác định các loài nấm Trichoderma chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái Để nâng cao độ chính xác trong việc định danh và lựa chọn các chủng nấm Trichoderma có khả năng phòng trừ tốt, nghiên cứu này áp dụng kỹ thuật phân tử 18 mẫu đất từ các cánh đồng trồng cây hoa màu ở một số tỉnh miền Bắc đã được thu thập làm vật liệu để phân lập nấm Trichoderma sp.
Bảng 4.1 Danh sách mẫu đất đã được thu thập để phân lập nấm
Trichoderma sp trong nghiên cứu này
Ký hiệu mẫu Địa điểm Ruộng cây trồng
Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2015 02
Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình Mía 2015 02
Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh Đậu tương 2015 02
Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh, Hà Nội Cà chua 2015 02
Vn.05 Cao Bằng Diêm mạch 2016 02
Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà Nội Tỏi 2016 02
Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Ổi 2016 02
Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Rau cải 2017 02
Vn.09 Võ Cường, Bắc Ninh Cà chua 2017 02
Chú thích: mỗi địa điểm thu thập 02 mẫu (ví dụ mẫu Vn.01 được đánh số thứ tự Vn.01-1, Vn.01-2)
4.1.2 Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp tại một số tỉnh miền Bắc
Sau khi thu thập, các mẫu đất được phơi khô, nghiền mịn và hòa loãng trong nước cất vô trùng với tỷ lệ 100 gram đất : 1000 ml nước Dung dịch này được trang lên môi trường PDA theo phương pháp của Kannangara et al (2017) để xác định nấm Trichoderma sp theo phương pháp Flegel (1980) Để thuần nấm Trichoderma sp., kỹ thuật cấy đơn bào tử bằng kim thủy tinh dưới kính hiển vi và kỹ thuật cấy ria được áp dụng Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đất thu thập đều có nấm Trichoderma sp dựa trên đặc điểm hình thái trên môi trường nhân tạo PDA.
Bảng 4.2 Kết quả phân lập nấm đối kháng Trichoderma sp từ các mẫu đất đã thu thập
Ký hiệu mẫu Địa điểm thu thập Đặc điểm tản nấm trên môi trường PDA
Giám định dựa vào hình thái cho thấy các mẫu từ Vn.01 Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội; Vn.02 Lương Sơn, Hòa Bình; và Vn.03 Thuận Thành, Bắc Ninh đều có màu xanh và chứa nhiều bào tử Trichoderma sp.
Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh,
Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp
Vn.05 Cao Bằng Trắng, ít bào tử Trichoderma sp
Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà
Xanh, nhiều bào tử Trichoderma sp
Khu vực Vn.07 tại Kinh Môn, Hải Dương, Vn.08 ở Tiên Dương, Đông Anh và Vn.09 tại Võ Cường, Bắc Ninh đều có sự xuất hiện phong phú của bào tử Trichoderma sp.
Trong quá trình quan sát các mẫu nấm Trichoderma sp trên môi trường PDA, ban đầu nấm có màu trắng và dần chuyển sang màu xanh khi bắt đầu hình thành bào tử phân sinh Bào tử phân sinh có hình dạng cầu hoặc hình trứng, bề mặt trơn nhẵn, trong khi thể bình có dạng hình trụ Hầu hết các mẫu thu thập được đã hình thành nhiều bào tử phân sinh sau 3 ngày nuôi cấy, và đến ngày thứ 4 và thứ 5, nấm phát triển kín đĩa và chuyển sang màu xanh hoàn toàn.
Hình 4.1 Các mẫu nấm Trichoderma spp đã phân lập thuần trên môi trường PDA sau 5 ngày nuôi cấy a) VnTri 01, b) VnTri02, c) VnTri03, d) VnTri04, e) VnTri05, f) VnTri06, g) VnTri07, h) VnTri08 và i) VnTri09
Trong nghiên cứu về các mẫu Trichoderma phân lập từ đất, chúng tôi nhận thấy rằng hầu hết các mẫu có đặc điểm tản nấm và hình thái tương đồng Một mẫu mọc thưa thớt với ít bào tử và một mẫu có hình thái khác biệt đã được ghi nhận Để xác định chính xác tên các mẫu nấm Trichoderma, chúng tôi áp dụng phương pháp nhân vùng gen rDNA-ITS, sử dụng cặp mồi ITS4 và ITS5 sau khi nuôi cấy trên môi trường PDA từ 7-10 ngày Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit thương mại và DNA nấm được giải trình tự tại hãng Macrogen, Hàn Quốc Kết quả chi tiết được trình bày ở mục 4.1.3.
4.1.3 Kết quả xác định các mẫu nấm đối kháng dựa vào giải trình tự gene vùng rDNA-ITS
Vn.02 λDNA Vn.03 Vn.04 Vn.05 Vn.06
Hình 4.2 Sản phẩm điện di các mẫu nấm đối kháng Trichoderma Vn.01-
Vn.09 Kích thước sản phẩm PCR khoảng 600 bp
Bảng 4.3 Kết quả tìm kiếm chuỗi gần gũi trên ngân hàng gen của
VnTri1 Trichoderma asperellum 100 100 KY623504,KY582181,KX1
VnTri2 Trichoderma asperellum 100 100 KX681729, KY318472,
VnTri8 Trichoderma harzianum 100 100 KX381171,MF108889,KY76
4862 VnTri9 Trichoderma asperellum 100 100 KX681729, KY318472,
Nghiên cứu đã xác định 08 mẫu nấm Trichoderma sp., trong đó phổ biến nhất là Trichoderma asperellum, cùng với 01 mẫu Trichoderma harzianum Điều này cho thấy Trichoderma asperellum là loài nấm phổ biến trong đất trồng rau màu ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Do đó, trong các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi sẽ tập trung vào mẫu nấm Trichoderma asperellum Phân tích phả hệ các mẫu nấm Trichoderma spp cho thấy các mẫu nấm phân lập từ một số tỉnh miền Bắc thuộc 2 cụm T asperellum.
T harzianum (được bôi đen, đậm trong hình 4.3)
Hình 4.3 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của 09 mẫu nấm
Trichoderma Phân tích được thực hiện theo phương pháp Neighbor-Joining với 1000 lần lặp (MEGA 7.0) Các mẫu của miền Bắc Việt Nam thuộc 2 nhóm Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum
●1A9BZAA000-Trichoderma asperellum KY318472-Trichoderma asperellum KX681729-Trichoderma asperellum KU341014-Trichoderma asperellum
●1A9BZAA005-Trichoderma asperellum AY380909-Trichoderma asperellum EU732725-Trichoderma asperellum KX381171-Trichoderma harzianum KY764862-Trichoderma harzianum
AF456909- Trichoderma koningii DQ367683-Trichoderma koningii
ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC CỦA CÁC MẪU NẤM
4.2.1 Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma asperellum và Trichoderma harzianum
Sau khi xác định các mẫu nấm Trichoderma, bao gồm T asperellum và T harzianum, thu thập từ một số tỉnh miền Bắc, chúng tôi đã cấy nấm trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28-30 o C Kết quả cho thấy T asperellum phát triển nhanh hơn và tạo ra nhiều bào tử phân sinh hơn so với T harzianum.
T harzianum mọc đối xứng nhau và vuông góc với cành bào tử phân sinh (hình 4.4b), trong khi đó thể bình của nấm T asperellum mọc đối xứng và thành chùm 2-3 thể bình trên đầu cành bào tử phân sinh (hình 4.4a) Từ thể bình hình thành các bào tử phân sinh, bào tử phân sinh của 2 nấm đều tròn tròn hoặc bầu dục Kích thước bào tử trung bình 2,9-3,1 x 2,3-3,3 μm (hình 4.4c-d)
Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma
Ký hiệu mẫu Địa điểm Ruộng cây trồng
Năm 2015, tại các địa điểm khác nhau ở Việt Nam, đã thu thập các mẫu môi trường PDA với những đặc điểm nổi bật Tại Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội (Vn.01), mẫu môi trường có màu xanh và nhiều bào tử Tương tự, tại Lương Sơn, Hòa Bình (Vn.02), mẫu bã mía cũng cho thấy màu xanh và số lượng bào tử phong phú Cuối cùng, tại Thuận Thành, Bắc Ninh (Vn.03), mẫu đậu tương cũng mang đặc điểm xanh và nhiều bào tử.
Vn.04 Tiên Dương, Đông Anh,
Hà Nội Cà chua 2015 Xanh, nhiều bào tử
Vn.05 Cao Bằng Diêm mạch 2016 Trắng, ít bào tử
Vn.06 Đặng Xá, Gia Lâm, Hà
Nội Tỏi 2016 Xanh, nhiều bào tử
Vn.07 Kinh Môn, Hải Dương Ổi 2016 Xanh, nhiều bào tử
Vn.08 Tiên Dương, Đông Anh Rau cải 2017 Xanh, hơi vàng, nhiều bào tử Vn.09 Tiên Du Bắc Ninh Cà chua 2017 Xanh, nhiều bào tử
Cả 2 nấm T asperellum và T harzianum đều phát triển khá nhanh, sau 4-5 ngày nuôi cấy, tản nấm đều phát triển được 90mm Tuy nhiên, nấm T asperellum phát triển nhanh hơn và khả năng hình thành bào tử phân sinh nhiều hơn Như vậy, sẽ thuận lợi trong việc nhân sinh khối để tạo chế phẩm nấm Trichoderma a) b) c) d)
Hình 4.4 Đặc điểm hình thái của mẫu nấm a) Tản nấm trên môi trường PDA sau 10 ngày nuôi cấy và cành bào tử và bào tử phân sinh
T.asperellum b) Tản nấm trên môi trường PDA sau 10 ngày nuôi cấy và cành bào tử và bào tử phõn sinh T harzianum Thanh bar 10àm
Nấm T asperellum nổi bật với sự phổ biến và tốc độ phát triển nhanh chóng, đặc biệt là khả năng hình thành bào tử phân sinh Nghiên cứu lần đầu tiên xác định sự hiện diện của nấm này trong đất trồng rau màu tại một số tỉnh miền Bắc Do đó, nghiên cứu này tập trung vào T asperellum để khảo sát các đặc điểm sinh học, khả năng nhân sinh khối, và khả năng ức chế một số nấm gây bệnh Ngoài ra, nghiên cứu cũng thử nghiệm khả năng phòng trừ các bệnh hại quan trọng như bệnh lở cổ rễ cây con bắp cải và bệnh thối hạch bắp cải, nhằm so sánh với các nguồn nấm Trichoderma khác như T viride và T harzianum.
4.2.2 Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma asperellum
4.2.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Vi sinh vật, đặc biệt là nấm đối kháng, cần môi trường dinh dưỡng phù hợp để phát triển và sinh sản hiệu quả Nghiên cứu trước đây cho thấy nấm Trichoderma phát triển tốt trên môi trường PDA cũng như một số môi trường khác như PSA và PCA Do đó, nghiên cứu này tập trung khảo sát sự phát triển của nấm trong các điều kiện môi trường khác nhau.
T asperellum trên một số môi trường như PDA, PSA và OMA (bảng 4.5)
Bảng 4.5 Khả năng phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên một số môi trường
Môi trường Đường kính tản nấm (mm) sau cấy (ngày) Số bào tử /1 ml sau cấy 9 ngày
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05
Hình 4.5 Sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum trên một số môi trường
Nấm T asperellum cho thấy sự phát triển mạnh mẽ trên các môi trường PSA, PDA và OMA, với môi trường PDA là tốt nhất Sau 3 ngày nuôi cấy, đường kính tản nấm đạt 90mm, và khả năng hình thành bào tử phân sinh diễn ra nhanh chóng Cụ thể, sau 9 ngày trên môi trường PDA, số bào tử đạt cao nhất với 5464 x 10^5 bào tử/1ml Do đó, môi trường PDA được lựa chọn để nhân giống nấm từ giống cấp 1, phục vụ cho việc sản xuất sinh khối nấm Trichoderma.
4.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, đặc biệt là nấm đối kháng Hầu hết các vi sinh vật, đặc biệt là nấm gây bệnh, phát triển và gây hại trong khoảng nhiệt độ từ 25-30 độ C Một số loài nấm có khả năng phát triển ở nhiệt độ thấp hơn.
20 o C Các nghiên cứu trước đây cũng đã chỉ ra rằng nấm đối kháng Trichoderma phát triển tốt ở 25-30 o C, nhưng phạm vi nhiệt độ có thể phát triển được từ 15-
35 o C Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm sự phát triển của nấm T asperellum ở các nhiệt độ 20, 25, 30 và 35 o C (bảng 4.6, hình 4.6)
Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm
Trichoderma asperellum trên môi trường PDA
( o C) Đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy (mm)
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05
Nấm T asperellum phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 20 o C đến 35 o C Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp 20 o C, sự sinh trưởng của nấm diễn ra chậm hơn, với đường kính tản nấm chỉ đạt 30,8mm sau 3 ngày Ngược lại, ở nhiệt độ 25 o C, nấm có xu hướng phát triển nhanh hơn.
30 0 C, sau 3 ngày đường kính tản nấm đạt mức 90mm Nấm sinh trưởng phát triển chậm hơn ở nhiệt độ 35 o C
Hình 4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của T asperellum
4.2.2.3 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum
Nấm T asperellum sinh sống và phát triển trong môi trường đất, vì vậy pH của đất có ảnh hưởng quan trọng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tồn tại của loại nấm này.
T asperellum Đa số, các vi sinh vật trong đất đều phát triển tốt ở pH6-8 Trong nghiên cứu này đã thử nghiệm sự phát triển của nấm T asperellum ở các mức pH từ 4-8 (bảng 4.7) Sự phát triển của nấm T asperellum được đánh giá bằng cách đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3 và 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA Bảng 4.7 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy (PDA) đến sự phát triển của nấm Trichoderma asperellum pH Đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy (mm)
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 Chuẩn pH môi trường sử dụng HCl 1N và NaOH 1N bằng máy đo độ pH Milwaukee (Mỹ)
Hình 4.7 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của
Nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma asperellum có khả năng sinh trưởng trên môi trường PDA ở 5 mức pH từ 4 đến 8 Tuy nhiên, sự phát triển của nấm chậm lại ở pH 4 và pH 8, với đường kính tản nấm đạt 90mm sau 4 ngày nuôi cấy Ngược lại, ở pH 5-7, nấm phát triển rất tốt, đạt cùng đường kính tản nấm sau chỉ 3 ngày Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Romero-Arenas et al (2012).
T viride Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy rằng, khi ứng dụng nấm T asperellum để phòng trừ các bệnh nấm hại cây trồng có nguồn gốc trong đất cần chú ý ứng dụng trên các nền đất có pH5-7, không nên ứng dụng trên các nền đất có pH chua hoặc kiềm
4.3 NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI NẤM TRICHODERMA ASPERELLUM TRÊN MỘT SỐ CƠ CHẤT ĐỂ LÀM NGUỒN TẠO CHẾ PHẨM TRICHODERMA
4.3.1 Nhân sinh khối nấm Trichoderma asperellum
Việc nghiên cứu và chọn giá thể thích hợp để nhân sinh khối nấm
T asperellum phải đảm bảo được nguồn giá thể phải dễ tìm, giá thành rẻ và thuận lợi cho sự sinh trưởng, phát triển cà sinh sản của nấm Để nghiên cứu giá thể thích hợp nhân sinh khối nấm T asperellum chúng tôi tiến hành chọn các loại giá thể giá rẻ, thuận lợi cho việc nhân sinh khối với số lượng lớn (bảng 4.8)
Bảng 4.8 Sự hình thành bào tử của nấm Trichoderma asperellum trên các giá thể khác nhau
Ngày theo dõi Bã mía Bã cây diêm mạch Bột ngô Trấu cám Thóc luộc
Hình 4.8 Nhân nuôi nấm Trichoderma asperellum trên một số giá thể a) bã mía, b) bã diêm mạch, c) bột ngô, d) trấu cám và e) thóc luộc
Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 3 - 4 ngày, các sợi nấm phát triển với màu xanh nhạt và dần chuyển sang màu xanh đậm Mật độ bào tử có sự khác biệt giữa các công thức, trong đó môi trường thóc luộc có độ xốp cao, thoáng khí, cho mật độ bào tử cao nhất đạt 7,8 x 10^9 cfu/g sau 11 ngày Môi trường bột ngô và trấu cám lần lượt đạt mật độ 7,2 x 10^8 cfu/g và 7,0 x 10^8 cfu/g Điều này cho thấy rằng việc lựa chọn môi trường nhân tạo phù hợp là cần thiết, tùy thuộc vào mục đích sử dụng chế phẩm; nếu để bón gốc hay ủ phân chuồng, nên chọn môi trường thóc luộc hoặc trấu cám, còn nếu để pha dạng phun, môi trường bột ngô sẽ tạo ra bột mịn và dễ hòa tan hơn.
NGHIÊN CỨU SỨC SỐNG CỦA BÀO TỬ NẤM TRICHODERMA
Hiệu quả phòng trừ bệnh nấm hại cây trồng từ chế phẩm chứa nấm T asperellum sẽ được cải thiện khi kết hợp với phân bón hữu cơ Nghiên cứu này đã thực hiện phối trộn chế phẩm nấm T asperellum với phân bón hữu cơ lục thần nông, sau đó bảo quản hỗn hợp ở nhiệt độ phòng và kiểm tra định kỳ khả năng sống của bào tử nấm Mỗi ba tháng, chúng tôi tiến hành lấy mẫu nấm, cấy trên môi trường PDA, đo đường kính tản nấm và xác định số bào tử/ml, với kết quả được ghi chép cẩn thận.
Bảng 4.9 Khả năng phát triển của nấm Trichoderma asperellum sau khi bảo quản
Thời gian bảo quản Đường kính tản nấm (mm) sau cấy Số bào tử
/1 ml Sau khi cấy 9 ngày
Ghi chú: - Các chữ khác nhau a, b, c, d chỉ sự sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05
Hình 4.10 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến khả năng phát triển của nấm T.asperellum Kết quả ở bảng 4.9 cho thấy bảo quản chế phẩm Trichoderma sau thời gian
Nấm phát triển bình thường trên môi trường PDA trong khoảng thời gian từ 3 đến 12 tháng Sau 1 ngày cấy, đường kính tản nấm đạt từ 13,6mm đến 17,5mm Đến ngày thứ 5, nấm đã phát triển kín đĩa với đường kính tản nấm lên đến 90mm.
Từ ngày thứ 3 sau khi cấy, bào tử nấm đã bắt đầu hình thành, tuy nhiên số lượng vẫn còn ít Đến ngày thứ 9 sau khi cấy, chúng tôi ghi nhận số lượng bào tử nấm đạt từ 5012 x 10^5 cfu/1ml đến 5201 x 10^5 cfu/1ml, với tỷ lệ nảy mầm của bào tử dao động từ 74,8% đến 76,8%.
KẾT QUẢ ĐIỀU TRA MỨC ĐỘ BỆNH THỐI HẠCH VÀ LỞ CỔ RỄ BẮP CẢI TẠI HÀ NỘI VÀ LÀO CAI
4.5.1 Kết quả điều tra và thu thập bệnh thối hạch, lở cổ rễ tại Lào Cai
4.5.1.1 Kết quả điều tra và thu thập bệnh lở cổ rễ tại Lào Cai
Bệnh lở cổ rễ cây bắp cải, do nấm Rhizoctonia solani gây ra, chủ yếu xuất hiện trong giai đoạn vườn ươm Tại Lào Cai, nghiên cứu cho thấy đây là một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng nhất cho cây con Triệu chứng đặc trưng của bệnh bao gồm phần cổ rễ và gốc thân bị teo thắt, dẫn đến cây con bị chết rạp và đổ gục Khi bệnh phát triển nặng, mật độ cây con giảm đáng kể.
Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải (Rhizoctonia solani) tại Lào Cai Địa điểm Giai đoạn sinh trưởng Bộ phận bị hại Tỷ lệ bệnh
Bảo Thắng Cây con 2-3 lá cổ rễ 5,0
Bắc Hà Cây con 2-3 lá cổ rễ 1,0
Sapa Cây con 2-3 lá cổ rễ 3,0
Bảo Yên Cây con 2-3 lá cổ rễ 1,0
TP Lào Cai Cây con 2-3 lá cổ rễ 3,0
Kết quả điều tra cho thấy bệnh lở cổ rễ bắp cải do nấm R solani gây hại ở các vùng Bảo Thắng, Bắc Hà, Sapa, Bảo Yên và TP Lào Cai với tỷ lệ bệnh từ 1,0 – 5,0% Tại Bảo Thắng, tỷ lệ bệnh cao nhất đạt 5,0% do nông dân thường trồng rau màu trên cùng một chân đất mà ít luân canh với lúa nước Triệu chứng điển hình của bệnh xuất hiện ở giai đoạn cây con trong vườn ươm hoặc cây được 2 tuần tuổi.
3 lá thật, làm lở cổ rễ, rễ teo thắt, cây chết (hình 4.11) a) b) c)
Hình 4.11 Triệu chứng bệnh lở cổ rễ cải bắp a-b) triệu chứng lở cổ rễ cây con trong vườm ươm và c) triệu chứng lở cổ rễ trên ruộng trồng
Trong giai đoạn trải lá bàng, một số cây có thể bị bệnh hại ở vùng cổ rễ, với nấm R solani là nguyên nhân chính Kết quả phân lập cho thấy tản nấm phát triển nhanh trên môi trường PDA, có màu nâu, với sợi nấm đa bào, phân nhánh và gần vuông góc Nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra các biện pháp phòng trừ bệnh lở cổ rễ chủ yếu thông qua việc sử dụng chế phẩm sinh học.
Hình 4.12 mô tả đặc điểm hình thái của tản nấm và sợi nấm Rhizoctonia solani trên môi trường PDA Cụ thể, tản nấm R solani thể hiện rõ trên môi trường này, trong khi sợi nấm có cấu trúc phân nhánh, hình ống, với các điểm phân nhánh hơi thắt và có vách ngăn.
4.5.1.2 Kết quả điều tra và thu thập bệnh lở cổ rễ tại Lào Cai
Bệnh thối hạch bắp cải là một trong những bệnh phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất cây trồng, đặc biệt ở những khu vực có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao Để đánh giá mức độ bệnh này tại Lào Cai, chúng tôi đã tiến hành điều tra tỷ lệ bệnh tại các vùng trồng cải bắp như Bảo Thắng, Bắc Hà, Sapa và Bảo Yên.
TP Lào Cai Kết quả điều tra, thu thập bệnh thối hạch bắp cải được thể hiện qua bảng 4.11
Bảng 4.11 Tình hình bệnh thối hạch bắp cải tại Bảo Thắng - Lào Cai Địa điểm Giai đoạn sinh trưởng
(ngày sau trồng) Bộ phận bị hại Tỷ lệ bệnh
Bảo Thắng Trải lá bàng, cuốn bắp Lá, bắp 7,0
Bắc Hà Trải lá bàng, cuốn bắp Lá, bắp 3,0
Sapa Trải lá bàng, cuốn bắp Lá, bắp 4,0
Bảo Yên Trải lá bàng, cuốn bắp Lá, bắp 3,0
TP Lào Cai Trải lá bàng, cuốn bắp Lá, bắp 5,0
Tại Lào Cai, bệnh thối hạch bắp cải xuất hiện phổ biến trong các vụ trồng cải bắp, nhưng mức độ không nghiêm trọng do nông dân thường xuyên dọn dẹp tàn dư cây bệnh Việc này giúp hạn chế sự tích tụ nguồn hạch nấm cho các vụ bắp cải sau.
Kết quả điều tra cho thấy bệnh thối hạch bắp cải xuất hiện phổ biến ở các vùng trồng cải bắp tại Lào Cai, với tỷ lệ bệnh cao nhất ghi nhận ở Bảo Thắng (7,0%) và thấp nhất ở Bắc Hà cùng Bảo Yên (3,0%) Bệnh chủ yếu gây hại trong giai đoạn cuốn bắp, với vết bệnh thường xuất phát từ lá già tiếp xúc với đất, nơi nấm phát triển thành các mảng trắng trên bề mặt lá và lan lên bắp, dẫn đến tình trạng thối Hạch nấm có kích thước lớn, màu đen và rắn chắc, hình thành do sự kết hợp của các sợi nấm, thường bắt đầu với màu trắng trước khi chuyển sang màu đen Những hạch nấm này có khả năng rơi rụng trên đồng ruộng và tồn tại lâu trong đất, do đó việc thu dọn tàn dư cây bệnh là rất cần thiết để loại bỏ nguồn bệnh cho vụ tiếp theo.
Triệu chứng thối hạch cải bắp, do nấm Sclerotinia sclerotiorum gây ra, thể hiện rõ trên đồng ruộng với các dấu hiệu điển hình Nấm này phát triển trong môi trường PDA, và khi cắt ngang hạch nấm, có thể thấy sự phân hóa rõ rệt giữa ruột hạch và vỏ hạch.
Huyện Bảo Thắng – Lào Cai ghi nhận tỷ lệ bệnh thối hạch bắp cải cao nhất, đồng thời là khu vực trồng bắp cải nhiều nhất tỉnh Bệnh thối hạch do nấm S.sclerotiorum gây hại ở nhiều giai đoạn phát triển của cây, dẫn đến giảm năng suất và chất lượng thu hoạch Triệu chứng bệnh biểu hiện qua việc thối bắp từ ngoài vào trong và hình thành các hạch nấm trong điều kiện nhiệt độ thích hợp.
4.5.2 Kết quả điều tra và thu thập bệnh thối hạch và lở cổ rễ bắp cải tại
4.5.2.1 Kết quả điều tra và thu thập bệnh lở cổ rễ tại Hà Nội
Hà Nội là một trong những tỉnh có diện tích trồng rau lớn nhất Việt Nam, nhưng chế độ thâm canh cao dẫn đến sự xuất hiện thường xuyên của các loài dịch hại Bệnh lở cổ rễ ở bắp cải là một trong những bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng, đặc biệt trong giai đoạn cây con và cây mới trồng Theo kết quả điều tra năm 2016, bệnh lở cổ rễ đã gây hại đáng kể cho cây bắp cải tại Hà Nội.
Bảng 4.12 Tình hình bệnh Lở cổ rễ bắp cải tại Hà Nội Địa điểm
Giai đoạn sinh trưởng (ngày sau trồng)
Bộ phận bị hại Tỷ lệ bệnh
(%) Đông Anh Cây con 2-3 lá gốc rễ 12,0
Văn Đức – Gia lâm Cây con 2-3 lá gốc rễ 10,0 Đặng Xá – Gia Lâm Cây con 2-3 lá gốc rễ 13,3
Cổ Bi – Gia Lâm Cây con 2-3 lá gốc rễ 7,0 a) b) c)
Hình 4.14 Triệu chứng bệnh lở cổ rễ cải bắp a-b) triệu chứng lở cổ rễ cây con trong vườm ươm và c) triệu chứng lở cổ rễ trên ruộng trồng
Bệnh lở cổ rễ là mối nguy hại chính đối với cây bắp cải, đặc biệt trong giai đoạn cây con (2-3 lá) và khi mới trồng Kết quả điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh này cao ở các huyện thuộc TP Hà Nội, đặc biệt là tại xã Đặng Xá.
Tỷ lệ bệnh tại Gia Lâm lên tới 13,3%, ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng và hiệu quả kinh tế của vườn ươm Bệnh trở nên nghiêm trọng hơn trong điều kiện thời tiết mưa nhiều và độ ẩm cao.
4.5.2.2 Kết quả điều tra và thu thập bệnh thối hạch bắp cải tại Hà Nội Đối với cây bắp cải bệnh thối hạch S.sclerotiorum gây thiệt hại nghiêm trọng tới năng suất ở những vùng chuyên canh rau màu Chúng tôi đã tiến hành điều tra bệnh thối hạch trên địa bàn TP Hà Nội cho kết quả như bảng 4.13
Bảng 4.13 Tình hình bệnh thối hạch bắp cải tại Hà Nội Địa điểm Giai đoạn sinh trưởng Bộ phận bị hại Tỷ lệ bệnh
(%) Đông Anh Cuốn bắp Lá già và bắp 30,0
Văn Đức – Gia lâm Cuốn bắp Lá già và bắp 50,0 Đặng Xá – Gia Lâm Cuốn bắp Lá già và bắp 55,5
Cổ Bi – Gia Lâm Cuốn bắp Lá già và bắp 30,0
Kết quả điều tra cho thấy, tỷ lệ bệnh thối hạch cải bắp ở Văn Đức và Đặng
Xá – Gia Lâm ghi nhận tỷ lệ bệnh cao nhất lên tới 50,0% và 55,5% Quan sát cho thấy, nông dân thường không dọn dẹp tàn dư cây bệnh, dẫn đến tỷ lệ bệnh trên đồng ruộng gia tăng Số lượng lớn hạch nấm hình thành trên bề mặt cây bệnh trở thành nguồn bệnh sơ cấp cho vụ trồng tiếp theo.
Để hạn chế bệnh, một biện pháp hiệu quả là thu dọn tàn dư cây bệnh, tránh để hạch nấm vương vãi trên đồng ruộng Nếu tình trạng bệnh nặng kéo dài, có thể áp dụng phương pháp ngâm ngập nước ruộng trong khoảng một tháng hoặc luân canh với các cây trồng khác, đặc biệt là cây lúa nước, nhằm tiêu diệt nguồn hạch nấm trong đất.
KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM
TRICHODERMA ASPERELLUM ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH LỞ CỔ RỄ
VÀ THỐI HẠCH BẮP CẢI
4.6.1 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm
Rhizoctonia solani trên môi trường PDA
Một trong những biện pháp hiệu quả để phòng trừ bệnh hại cây trồng do nấm gây ra là sử dụng chế phẩm sinh học Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm T asperellum đối với nấm R solani, tác nhân gây bệnh lở cổ rễ cây cải bắp, trong điều kiện in vitro Thí nghiệm bao gồm 4 công thức: đối chứng với nấm đối kháng và nấm gây bệnh cấy riêng rẽ, công thức 1 cấy cả hai nấm cách nhau 2cm, công thức 2 cấy nấm T asperellum trước nấm R solani 24 giờ, và công thức 3 cấy nấm T asperellum sau nấm R solani.
T asperellum sau nấm R solani 24 giờ (bảng 4.14; hình 4.12)
Bảng 4.14 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm
Rhizoctonia solani trên môi trường PDA
Ngày sau cấy Đường kính tản nấm sau cấy (mm) Đối chứng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3
Tri R.s Tri R.s HLĐK Tri R.s HLĐK Tri R.s HL ĐK
Nghiên cứu cho thấy nấm T asperellum có khả năng phòng trừ nấm R solani hiệu quả cao nhất (100%) sau 4 ngày nuôi cấy, khi nấm T asperellum lấn át hoàn toàn nấm R solani Do đó, để đạt hiệu quả tối ưu, nên xử lý chế phẩm nấm Trichoderma bằng cách bón vào đất 2-3 ngày trước khi gieo hạt hoặc trồng cây.
T asperellum sẽ phát triển và ngăn chặn nấm gây bệnh khi hạt được gieo hoặc cây được trồng vào đất và sẽ cho hiệu quả phòng trừ bệnh cao Hơn nữa, khi xử lý chế phẩm trước, nấm T.asperellum có thể phát triển và tiêu diệt nấm gây bệnh
Hình 4.16 minh họa khả năng đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm Rhizoctonia solani trên môi trường PDA Các mẫu được trình bày từ trái sang phải và từ trên xuống dưới bao gồm: đối chứng với nấm Rhizoctonia solani, đối chứng với nấm T asperellum, T asperellum được cấy trước nấm R solani 24 giờ, T asperellum được cấy cùng lúc với nấm R solani, và T asperellum được cấy sau nấm R solani 24 giờ.
4.6.2 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm Sclerotinia sclerotiorum trên môi trường PDA
Bảng 4.15 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm Sclerotinia sclerotiorum trên môi trường PDA
Ngày sau cấy Đường kính tản nấm sau cấy (mm) Đối chứng Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Tri S.c Tri S.c HLĐK Tri S.c HLĐK Tri S.c HLĐK
Thí nghiệm thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm T asperellum đối với nấm
S sclerotinia được bố trí tương tự như nấm R solani (bảng 4.15; hình 4.13) Kết quả cũng tương tự khi nấm T asperellum cấy trước nấm S sclerotinia 24 giờ Hiệu lực ức chế đạt 100% sau 3 ngày nuôi cấy Tản nấm T asperellum cũng lấn át bao trùm hết tản nấm S sclerotinia (hình 4.13)
Hình 4.17 minh họa khả năng đối kháng của nấm Trichoderma asperellum đối với nấm Sclerotinia sclerotiorum trên môi trường PDA Trong hình, từ trái sang phải và từ trên xuống dưới, có các mẫu: đối chứng với nấm S sclerotiorum, đối chứng với nấm T asperellum, và mẫu T asperellum được cấy trước nấm S sclerotiorum 24 giờ.
T asperellum cấy sau nấm S sclerotiorum 24 giờ và
T asperellum cấy cùng nấm S sclerotiorum.
THỬ NGHIỆM PHÒNG TRỪ BỆNH LỞ CỔ RỄ (Rhizoctonia solani) VÀ THỐI HẠCH (Sclerotinia sclerotiorum) CÂY BẮP CẢI TRONG NHÀ LƯỚI VÀ NGOÀI ĐỒNG RUỘNG BẰNG CHẾ PHẨM
VÀ THỐI HẠCH (Sclerotinia sclerotiorum) CÂY BẮP CẢI TRONG NHÀ LƯỚI VÀ NGOÀI ĐỒNG RUỘNG BẰNG CHẾ PHẨM TRICHODERMA
4.7.1 Thử nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani) cây bắp cải trong chậu
Nấm Rhizoctonia solani chủ yếu tấn công cây bắp cải trong giai đoạn cây con tại vườn ươm Do đó, thí nghiệm phòng trừ bệnh lở cổ rễ cây bắp cải bằng chế phẩm Trichoderma đã được thực hiện trong chậu.
Bảng 4.16 Hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma sp trên nguồn đất nhiễm Rhizoctonia solani
Giai đoạn hạt Giai đoạn cây con
Tổng hạt Số hạt chết
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành ba thí nghiệm với các phương pháp khác nhau để kiểm tra hiệu quả của nấm đối kháng Trichoderma sp Đối chứng (CT1) không sử dụng nấm đối kháng Trong thí nghiệm CT2, 20g nấm Trichoderma sp được trộn vào 2 kg đất đã nhiễm nấm Rhizoctonia solani trước khi gieo hạt Còn trong CT3, nấm Trichoderma sp cũng được trộn vào đất tương tự, nhưng sau 48 giờ mới tiến hành gieo hạt.
Cây con bị nhiễm nấm và chết rạp, thối gốc
(không sử dụng chế phẩm T.asperellum.) Cây khỏe, không bị chết rạp, thối gốc (Sử dụng
T.asperellum + phân bón hữu cơ) c) d) e)
Hình 4.18 Hiệu lực của chế phẩm T asperellum phòng chống bệnh lở cổ rễ bắp cải trong điều kiện chậu vại (a)(c) không sử dụng chế phẩm
T asperellum (b)(e)Sử dụng chế phẩm + phân hữu cơ bón trước 48 giờ Ở các công thức thí nghiệm đều cho thấy chế phẩm Trichoderma bón vào đất trước khi gieo hạt hoặc chết phẩm phối trộn cùng với phân bón hữu cơ lục thần nông sẽ cho hiệu quả phòng trừ bệnh lở cổ rễ trong điều kiện chậu vại cao
4.7.2 Thử nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch cây bắp cải (Sclerotinia sclerotiorum) tại Lào Cai và Hà Nội bằng chế phẩm nấm Trichoderma
Bảng 4.17 Thử nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải tại
Gia Phú - Bảo Thắng - Lào Cai vụ thu đông 2016
Công thức (CT) Ngày điều tra/Tỷ lệ bệnh HLPT
Xử lý đất bằng chế phẩm
T.asperellum (0,5kg/100m 2 ) trước khi trồng 2 ngày bằng cách hòa nước tưới
Xử lý đất bằng chế phẩm
T.asperellum trộn với phân gà hoai mục trước khi trồng (0,5kg chế phẩm + 50 kg phân/100m 2 )
Xử lý đất trước khi trồng (bón lót) bằng chế phẩm T.asperellum + phân Lục thần nông (0,5kg chế phẩm + 50 kg phân/100m 2 )
Xử lý đất bằng chế phẩm
T.asperellum (0,5kg/100m 2 ) theo phương pháp tưới gốc - - 3,3 3,3 6,7 49,6 Đối chứng: (Không xử lý) - - 6,7 13,3 13,3 -
Ghi chú: Mỗi công thức có diện tích 100 m 2 ; HLPT: Hiệu lực phòng trừ Mỗi công thức điều tra 5 điểm, mỗi điểm 6 cây (tổng 30 cây/công thức)
Bệnh thối hạch bắp cải do nấm S sclerotiorum gây ra, lây lan từ vụ này sang vụ khác qua hạch nấm Để phòng trừ hiệu quả, biện pháp luân canh với cây trồng khác họ hoặc ngâm nước ruộng khoảng một tháng được khuyến nghị Tuy nhiên, việc luân canh gặp khó khăn trong các khu trồng độc canh như bắp cải Hiện nay, nghiên cứu và ứng dụng phòng trừ bệnh chủ yếu tập trung vào việc sử dụng chế phẩm chứa nấm đối kháng Trichoderma harzianum.
Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập loài nấm Trichoderma asperellum, cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ nấm S sclerotiorum trong điều kiện in vitro Kết quả này mở ra cơ hội phát triển chế phẩm đối kháng chứa nấm, góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát bệnh trong nông nghiệp.
T asperellum và sử dụng trong nghiên cứu này để phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải tại Lào Cai và Hà Nội (bảng 4.17; 4.18) a) b) c) d)
Bài viết mô tả bố trí thí nghiệm phòng trừ tại Bảo Thắng – Lào Cai, bao gồm các bước sau: a) Bón chế phẩm Trichoderma vào đất trước khi trồng 2 ngày, b) Xử lý đất bằng chế phẩm Trichoderma kết hợp với phân gà hoai mục, c) Xử lý đất bằng chế phẩm Trichoderma tưới vào gốc, và d) Phối trộn Trichoderma với phân bón lục thần nông và bón vào đất trước khi trồng.
Chế phẩm nấm T asperellum có hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải trên đồng ruộng, với tỷ lệ hiệu lực đạt 75,1% khi kết hợp với phân gà hoai mục hoặc phân Lục thần nông Trong khi đó, tỷ lệ bệnh ở công thức đối chứng chỉ là 13,3% Năng suất thực thu của cải bắp cũng tăng từ 10-15%.
Thử nghiệm mô hình phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải đã được thực hiện tại Văn Đức, Gia Lâm - Hà Nội, và kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.18.
Bảng 4.18 Thử nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải tại
Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội vụ xuân 2017
Công thức Phương pháp Ngày điều tra/Tỷ lệ bệnh HLPT
1 Xử lý đất bằng chế phẩm
T.asperellum (0,5 kg/100m 2 ) trước khi trồng 2 ngày bằng cách hòa nước tưới
2 Xử lý đất bằng chế phẩm
T.asperellum trộn với phân gà hoai mục trước khi trồng (0,5kg chế phẩm + 50 kg phân/100m 2 )
3 Xử lý đất trước khi trồng (bón lót) bằng chế phẩm T.asperellum
+ phân Lục thần nông (0,5kg chế phẩm + 50 kg phân/100m 2 )
4 Xử lý đất bằng chế phẩm
T.asperellum (0,5 kg/100m 2 ) theo phương pháp tưới gốc - - 6,7 13,3 20,0 53,8
Ghi chú: Mỗi công thức có diện tích 100 m 2
HLPT: Hiệu lực phòng trừ Mỗi công thức điều tra 5 điểm, mỗi điểm 6 cây (tổng 30 cây/công thức)
Kết quả thử nghiệm cho thấy chế phẩm T asperellum có hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh thối hạch cải bắp ở Gia Lâm khi được trộn với phân gà hoai mục hoặc phân Lục thần nông, tương tự như kết quả ở Lào Cai Việc phối trộn với phân bón hữu cơ không chỉ giúp tăng cường hiệu quả phòng trừ bệnh mà còn tạo điều kiện thuận lợi cho nấm Trichoderma phát triển và sinh sản nhiều bào tử, từ đó nâng cao khả năng ức chế nấm gây hại cho cây trồng Bên cạnh đó, tỷ lệ bệnh giảm đi đáng kể, đồng thời cây trồng cũng sinh trưởng và phát triển tốt hơn, với số lượng rễ tăng lên.
Hình 4.20 Thí nghiệm phòng trừ bệnh thối hạch bắp cải a) Đối chứng, b)
Xử lý đất trước khi trồng (bón lót) bằng chế phẩm T.asperellum + phân
Lục thần nông (0,5kg chế phẩm + 50 kg phân/100m 2 )
Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chế phẩm Trichoderma kết hợp với phân bón Lục thần nông hoặc phân gà hoai mục giúp cây bắp cải phát triển tốt hơn, với bộ lá xanh và cứng hơn, từ đó nâng cao năng suất so với các công thức không sử dụng chế phẩm Chế phẩm nấm Trichoderma không chỉ bảo vệ cây khỏi bệnh tật mà còn tăng cường năng suất Trong bối cảnh khó khăn trong việc phòng trừ bệnh bằng hóa chất do nguồn gốc nấm gây bệnh từ đất và nguy cơ ô nhiễm, việc áp dụng chế phẩm vi sinh trở nên cần thiết.