Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh Phú Thọ.
Thời gia nghiên cứu
Từ tháng 01 năm 2011 đến tháng 12 năm 2016.
Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
- Bệnh Dại trên đàn chó nuôi trên địa bàn tỉnh Phú Thọ
- Các mẫu xét nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y.
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Điều tra tình hình nuôi chó trên địa bàn tỉnh Phú thọ giai đoạn 2011–2016
Số liệu thu thập, xử lý, tổng hợp từ Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ
3.4.2 Điều tra tình hình tiêm phòng bệnh Dại cho chó trên địa bàn tỉnh Phú thọ giai đoạn 2011 – 2016
Số liệu thu thập, xử lý, tổng hợp từ Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ và Trung tâm y tế dự phòng tỉnh Phú Thọ
3.4.3 Điều tra tình hình bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú thọ giai đoạn
- Trong 05 năm giám sát (từ năm 2011 - 2015), thu thập số liệu; phân tích số liệu về bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú Thọ
- Trong năm 2016, tiến hành công tác giám sát chủ động bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú Thọ
- Hằng ngày theo dõi, tổng hợp các trường hợp người bị chó cắn (chó nghi nhiễm bệnh Dại) trên toàn bộ địa bàn tỉnh Phú Thọ
- Nhóm giám sát đến gặp trực tiếp người đó hoặc người thân để thu thập thông tin
- Tiến hành điều tra các trường hợp chó nghi bị bệnh Dại
3.4.4 Giám sát bệnh Dại trên địa bàn tỉnh Phú thọ năm 2016
Hằng ngày, chúng tôi thực hiện giám sát tổng hợp các trường hợp chó nghi nhiễm bệnh Dại tại ba địa phương đã nêu Tất cả thông tin được ghi chép theo biểu mẫu 1 trong phụ lục.
- Tiến hành đến các trường hợp chó nghi nhiễm bệnh Dại để điều tra, thu thập thông tin
- Nếu chó bị ốm hoặc xuất hiện dấu hiệu của bệnh Dại thì tiến hành lấy mẫu để xét nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
- Số liệu tổng đàn chó được tổng hợp từ mạnh lưới thú y cơ sở báo có về Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ
- Số liệu tiêm phòng được mạnh lưới thú y cơ sở ghi chép lại và tổng hợp báo cáo về Chi cục Thú y tỉnh Phú Thọ
Hằng ngày, nhóm giám sát tại tỉnh Phú Thọ tiếp nhận thông tin về các trường hợp điều trị dự phòng và theo dõi, tổng hợp các trường hợp người bị chó cắn, đặc biệt là chó nghi ngờ nhiễm bệnh Dại.
- Tìm kiếm thông tin từ các nguồn báo cáo khác (từ người dân báo, từ thông tin báo đài, từ điểm giết mổ chó…)
Tổ chức gặp gỡ trực tiếp người bị chó cắn hoặc người thân để thu thập thông tin, xác định thêm các trường hợp khác bị chó cắn và cung cấp tư vấn về phơi nhiễm điều trị dự phòng theo biểu mẫu 1 trong phụ lục.
Khi xác định chó nghi mắc bệnh Dại, cần tổ chức bắt chó và lấy mẫu gửi về Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để xét nghiệm Quy trình này phải được thực hiện trong vòng 48 giờ theo biểu mẫu 2 tại phụ lục.
Hình 3.1 Mô hình điều tra
Hình 3.2 Thời gian điều tra giám sát 3.5.2 Phương pháp xét nghiệm
3.5.2.1 Phương pháp xét nghiệm mẫu
Chó nghi mắc bệnh Dại được trợ tử và lấy mẫu bằng cách cắt phần đầu, sau đó đầu chó được bao gói cẩn thận qua 3 lớp nilon sạch và đặt trong hộp xốp có đá lạnh, dán kín Bề mặt ngoài hộp xốp được khử trùng trước khi chuyển mẫu về bảo quản trong tủ âm sâu tại Chi cục Thú y trong vòng tối đa 48 giờ Cuối cùng, mẫu được gửi đến Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để tiến hành xét nghiệm mô não.
Xét nghiệm DFA (Kháng thể huỳnh quang trực tiếp) được thực hiện tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, nhằm sàng lọc các mẫu dương tính với bệnh Dại.
- Gửi mẫu đến Trung tâm Dự phòng và Kiểm soát Bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) để phân tích chuyên sâu - nếu cần thiết
- Viết bút chì lên slide để ký hiệu mẫu gồm mã PTN của mẫu, ngày chuẩn bị, và loại mô não như minh họa dưới đây:
Vị trí làm tiêu bản mô não trong 3 ô tròn 16R3 08/3/16 ĐN
- Tiêu bản có thể được chuẩn bị từ mẫu não tươi vừa mổ hoặc mẫu não được bảo quản nhiệt độ âm
- Cắt mô não ở các phần Đại não (ĐN), Tiểu não (TN), và Cuống não
(CN) thành miếng nhỏ, kích thước khoảng 0.5 x 0.5 cm2
- Áp slide vào mẫu để mô não dính vào tạo thành 1 lớp mỏng Mỗi vị trí mô não tương ứng với 1 ô trên slide
- Để slide khô tự nhiên rồi chuyển vào ống chứa Acetone lạnh ở - 20C Cố định trong 2 -4 h
- Lấy 1 slide đối chứng dương và 1 slide đối chứng âm (đã chuẩn bị và cố định acetone) Lấy slide mẫu ra khỏi dung dịch cố định
- Rửa các slide 1 lần bằng dung dịch PBS, để khô
- Pha kháng thể gắn huỳnh quang thành dung dịch 1/40 trong nước cất
- Nhỏ kháng thể lên slide, mỗi tiêu bản nhỏ 60 – 100 uL
- Ủ trong hộp ẩm ở buồng tối, nhiệt độ 37C/30 phút hoặc nhiệt độ phòng trong 45 phút
- Sau khi ủ, rửa slide 3 lần với PBS, mỗi lần trong 5 phút
- Để khô slide, đậy coverslip bằng dung dịch Mounting medium
- Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang, bước sóng 450 nm
Đối chứng dương cho thấy sự hiện diện của hạt phát huỳnh quang màu xanh lá mạ trong bào tương tế bào Mật độ huỳnh quang được đánh giá từ 0 đến 4+, với điểm số cao hơn biểu thị mức độ virus nhiều hơn.
- Đối chứng âm: Không thấy hiện tượng phát huỳnh quang
- Mẫu được coi là dương tính khi hiện tượng phát huỳnh quang như đối chứng dương
- Mẫu được coi là âm tính nếu không có phát huỳnh quang như đối chứng âm
3.5.2.2 Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu thu thập được nhập và phân tích bằng chương trình Ms Excel
2010 và các phần mềm thống kê sinh học khác
- Sử dụng chương trình Quantum GIS 2.14 để vẽ bản đồ.