Xác định hàm lượng vitamin b2 bằng phương pháp trắc quang

Phương pháp quang phổ Phương pháp quang phổ có thể dùng để định tính hay định lượng thiamin trong các chế phẩm dược, đặc biệt trong thuốc tiêm.. Nghiên cứu khả năng mới định lượng các v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Giáo viên hướng dẫn: Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Thọ - 39A Hoá

Vinh, 5-2002

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với:

Thầy giáo hướng dẫn Thạc sĩ Nguyễn Quang Tuệ đã giao đề tài và hướng dẫn tận tình, chu đáo, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài

Để hoàn thành được đề tài này em còn được sự giúp đỡ và góp ý của các thầy cô giáo : TS Nguyễn Khắc Nghĩa; Ths Võ Thị Hoà; cô Phạm Thị Đức - cán

bộ phụ tá phòng thí nghiệm, cùng nhiều thầy cô giáo khác trong khoa.

Vinh, tháng 5 năm 2002

NGUYỄN VĂN THỌ

Sinh viên lớp 39 A - Hoá



MỞ ĐẦU

Có thể định nghĩa về vitamin một cách tóm tắt như sau: vitamin là một nhóm các hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử bé, có cấu tạo hoá học rất khác nhau và có các tính chất lí học cũng như hoá học rất khác nhau Chúng đều giống nhau ở chỗ là rất cần thiết cho hoạt động sống bình thường của bất kì một cơ thể nào Trong các cơ thể sinh vật, vitamin hoàn thành các chức năng xúc tác

Nhờ sự cố gắng của nhiều nhà hoá sinh học và nhiều nhà sinh lí học mà gần 100 năm này trong nhành vitamin học người ta đã chiết xuất và phân lập được trên 30 loại vitamin khác nhau Người ta cũng đã tổng hợp được một số lớn các vitamin bằng con đường tổng hợp hoá học trong phòng thí nghiệm Căn cứ vào tính hoà tan của vitamin mà ngày nay người ta chia vitamin ra làm các nhóm sau:

+ Các vitamin hoà tan trong nước (B1, B2, B5, B6, B12, C, B3, H )

+ Các vitamin hoà tan trong chất béo (A, D, E, K, Q, )

Việc cung cấp không đầy đủ các vitamin cho cơ thể sẽ có ảnh hưởng xấu không những đối với sự làm việc của hệ thần kinh mà còn đối với một số loại

cơ quan khác ở bên trong cơ thể Vì thế, trong khẩu phần ăn của con người phải

có giá trị hoàn chỉnh không những về phương diện calo, về phương diện chất đạm, mà còn về phương diện vitamin nữa

Đối với vitamin B1, B2 nói riêng cũng có vai trò rất quan trọng Để cung cấp đầy đủ và hợp lí đối với cơ thể thì vấn đề đặt ra là cần phải biết được hàm lượng của nó trong các mẫu thuốc, các loại thức ăn Do đó, cần phải tìm ra các phương pháp xác định hàm lượng của chúng

Vitamin B1, B2 có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp như: phương pháp sinh vật học, phương pháp hoá học, phương pháp lí học, Phương pháp định lượng vitamin B1, B2 hầu hết chỉ tiến hành bằng phương pháp hoá học

Trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm hiện nay, chúng tôi định lượng vitamin B2 bằng phương pháp trắc quang Phương pháp này khá phổ biến

vì có tính chính xác cao nếu như tìm được các thuốc thử thích hợp và xác định đưọc các điều kiện tối ưu cho phép phân tích

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi định lượng vitamin B2 theo 2 phương pháp:

+ Phương pháp dựa trên thiết bị quang phổ tử ngoại của TT Kiểm nghiệm Dược phẩm

+ Phương pháp cổ điển: xây dựng quy trình để định lượng hàm lượng vitamin B2 ở phòng thí nghiệm khoa Hoá học

Từ kết quả của 2 phương pháp có thể rút ra so sánh nên sử dụng phương pháp nào để định lượng vitamin, từ đó ứng dụng để định lượng vitamin B2trong một số thực phẩm và dược phẩm trên thị trường hiện nay

Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 PHÂN LOẠI VITAMIN B - NGUỒN GỐC VÀ VAI TRÒ CỦA CHÚNG

Vitamin B có nhiều loại, mỗi loại có vai trò riêng, có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự sống

1.1 Vitamin B 1 (Tiamin)

Công thức cấu tạo:

(dạng có vòng thiazon)

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Khi kết hợp với hai gốc photphat, vitamin B1 sẽ tạo thành tiamin pyrophotphat (TPP) Đó là coenzym của enzym đecacboxylaza và transxetolaza (các enzym này tham gia vào quá trình trao đổi gluxit)

Thiếu vitamin B1 sẽ ảnh hưởng đến sự trao đổi gluxit, viêm dây thần kinh,

bị bệnh tê phù (beri - beri) Khi mắc bệnh, hàm lượng axit piruvic và xetoglutaric trong máu cao hơn mức bình thường

-+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin B1 có nhiều trong thực vật như men bia, cám gạo, gạo chưa xát, ngô, đặc biệt nhiều hơn trong đỗ tương, lạc, ngoài ra còn có trong các loại rau như bắp cải, rau dền, xà lách Trong động vật, vitamin B1 có nhiều trong gan, sữa, lòng trắng trứng

Nhu cầu vitamin B1 của người lớn là 1,5 - 3mg, đối với trẻ em là 0,5 - 2mg

1.2 Vitamin B 2 (riboflavin, lactoflavin)

+ Công thức cấu tạo: (trang sau)

C CH

C N

N C C

H2

C

H2

CH2OH

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Vitamin B2 là thành phần cấu tạo nên các coenzym sau:

Flavin mono nucleotit (FMN)

Flavin ađenin đinucleotit (FAD)

Đó là các coenzym tham gia vào quá trình oxy hoá - khử Vì vậy, thiếu vitamin B2, sự sinh trưởng của cơ thể diễn ra không bình thường Ngoài ra nó còn ảnh hưởng đến sự phát triển của nhiều mô khác trong cơ thể như da, màng nhầy, bào thai, máu

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu: Vitamin B2 có nhiều trong nấm men, trong rau quả như rau dền, dưa hấu, hành tây, súplơ, đậu, thịt, sữa, gan, lòng đỏ trứng Nhu cầu vitamin B2 hàng ngày của người là 2 - 2,5mg Đối với động vật nhai lại, nhờ các vi sinh vật đường ruột có thể tổng hợp được vitamin B2 cung cấp cho cơ thể nên chúng không có nhu cầu hấp thụ B2 từ ngoài

1.3 Vitamin B 3 (axit pantoteric):

+ Công thức cấu tạo:

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Vitamin B3 là một thành phần cấu tạo của coenzym A tham gia vào sự chuyển hoá lipit trong cơ thể Thiếu vitamin B3 sẽ bị bệnh viêm da

+ Nguồn cung cấp: Trong thực vật, vitamin này có nhiều trong nấm men, trong lớp alơron của hạt lúa, trong chồi cây linh lăng, hạt lạc, đỗ tương, cà chua, gấc,

1.4 Vitamin PP (vitamin B 5 )

+ Công thức cấu tạo:

axit nicotinic (niaxin, vitamin B5, PP)

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Vitamin PP ngăn ngừa được bệnh da sần sùi Thiếu vitamin này da sẽ bị viêm loét, sẫn sùi, nhất là những nơi tiếp xúc nhiều với ánh sáng Vitamin PP là thành phần cấu tạo nên các coenzym:

Nicotinait ađenin đinucleotit (NAD+

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin PP có nhiều trong gan, thịt, trứng, hạt đậu đỗ, gạo, bánh mì, nấm men Nhu cầucủa người đối với vitamin PP trong một ngày khá cao: 15 - 25mg Tuy nhiên, một số loài vi sinh vật có thể tổng hợp được vitamin PP từ axit amin không thay thế là triptophan

1.5 Vitamin B 6 (piriđoxin)

+ Công thức cấu tạo:

piriđoxin piriđoxal piriđoxemin

+ Vai trò, chức năng sinh học:

NH 3

Khi piriđoxal được hoạt hoá bởi ATP để tạo thành photphopiriđoxal, nó sẽ tham gia vào nhóm ngoại của enzym aminotransferaza, xúc tác cho sự chuyển hoá nhóm NH2 từ axit amin đến axetoaxit Nhờ đó các xetoaxit mới và axit amin mới được tạo thành

Thiếu vitamin B6 sẽ biểu hiện các triệu chứng như viêm thần kinh, các bệnh ngoài da, nôn mửa, đau cơ, suy nhược

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Vitamin B6 có nhiều trong thịt, sữa, lòng đỏ trứng, cá, men bia và các hạt ngũ cốc Nhu cầu vitamin B6 hàng ngày của người lớn là 1,5 - 2,8mg, trẻ em là 0,5 - 2mg

1.6 Vitamin B 12 (cobalamin)

Cấu tạo của vitamin B12 rất phức tạp

+ Vai trò, chức năng sinh học:

Vitamin B12 có tác dụng chữa bệnh thiếu máu ác tính, nó giúp cho sự hình thành huyết cầu tố và hồng cầu, nó tham gia vào các quá trình sinh tổng hợp các nucleotit, giúp cho các phản ứng metyl hoá

+ Nguồn cung cấp, nhu cầu:

Có trong thịt, cá, trứng, sữa,

Ở người, vitamin B12 được dự trữ ở gan (vài mg), được tổng hợp nhờ hệ vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn này cũng thấy ở ao, hồ, trong nguồn nước thải nhà máy

Nhu cầu 10 - 20  /ngày

2 TÍNH CHẤT HOÁ HỌC CỦA THIAMIN - KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

2.1 Tính chất

+ Điểm nóng chảy: 246 - 2500C cho đến khi phá huỷ

+ Độ hoà tan:: 100g/100ml nước

1g/100ml etanol 960

không tan trong hexan, ete, axeton

+ Trong môi trường kiềm, thiamin rất dễ bị phá huỷ Phần thiazol trong phân tử rất dễ dàng bị phá huỷ Thiamin trong môi trường trung tính và đặc biệt

là trong môi trường axit tương đối vững bền

Ngoài không khí bình thường, thiamin trong dung dịch rất dễ bị oxy hoá

Sự oxy hoá dần dần phát sinh ra dạng đisunfua, có tác dụng về phương diện sinh vật học Bằng cách dùng các thuốc thử oxy hoá mạnh nhất phát sinh ra thiocrom là một chất có huỳnh quang xanh lơ rất rõ Phản ứng này coi như được dùng cơ bản cho phương pháp định lượng thiamin rất nhạy và tương đối đơn giản

2.2 Khái quát về phương pháp định lượng

Phương pháp định lượng thiamin có thể phân chia thành 3 nhóm:

+ Phương pháp định lượng sinh vật học và vi trùng học

+ Phương pháp hoá học

+ Phương pháp lý học

Phương pháp định lượng thiamin trên súc vật, trên cơ sở làm chứng (test)

về sự trưởng thành nhanh chóng Việc thiếu vitamin B1 ở chuột ốm gây nên một sự bại liệt phần dưới mà sau đó được điều trị bằng cách cho mẫu chuẩn đồng thời với mẫu thử Độ nhạy của phương pháp vi sinh vật giảm đi đáng kể, điều đó được xác định rằng đôi khi do ảnh hưởng của vi sinh vật tạo nên thiamin ở bộ máy tiêu hoá của chuột

Thực tế khi định lượng thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên hay trong các chế phẩm dược, hầu hết người ta dùng phương pháp định lượng hoá học Phương pháp hoá học để định lượng thiamin dựa trên sự đo huỳnh quang của sản phẩm oxy hoá của thiamin (thiocrom) Sau đó người ta dùng phương pháp so màu để định lượng Phương pháp này cho sản phẩm ngưng kết của thiamin với những amin thơm D.Melnik và H Field nghiên cứu phương pháp này dùng sản phẩm ngưng kết với p-aminoaxetophenon Màu phát sinh đem lắc với butanol, xylen hay axeton Nồng độ màu tăng lên khi có mặt etanol hay phenol Phương pháp này được cải tiến bằng cách dùng axit sunfanilic điazo hoá và kaliferixianua Công trình này làm tăng độ nhạy của phản ứng bởi vì sự

có mặt của kaliferixianua tác dụng với axit sunfanilic điazo hoá trong nguyên liệu có amin giao thoa với thiamin Từ nồng độ màu trước và sau khi cho ferixianua, có thể định lượng một cách tương đối chính xác lượng thiamin

Về các phản ứng màu khác đối với thiamin có thể cho biết một cách đơn

sơ Vitamin B1 với p- đimetylamino benzaldehyd tạo nên một kết tủa đỏ gạch

khi cho bốc hơi trong môi trường axit Với 2,6- đibromquinon clorimit trong môi trường dung dịch đệm borat pH 9,6 thiamin cho màu da cam

Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp cân có thể tiến hành theo B Naiman bằng cách tủa dung dịch thiamin với iodo bitmuto kali Tủa màu da cam tạo thành thực tế không tan trong nước Sau khi lấy được, đem sấy khô và cân Phương pháp này tuy vậy đôi khi dùng để định lượng thiamin trong các chế phẩm dược

Định lượng thiamin tự do bên cạnh dạng este hoá dựa trên độ hoà tan khác nhau của sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza với thiamin Từ môi trường kiềm thiocrom có thể lấy được hẳn để định lượng bằng cách lắc với izobutanol, trong khi đó, sản phẩm oxy hoá cocacboxylaza vẫn ở trong pha nước Định lượng thiamin đã được cân sẵn đáp ứng từ một lượng lớn cocacboxylaza được tiến hành trên cơ sở định lượng thiamin trước và sau sự thuỷ phân enzym

2.2.1 Phương pháp lý học để định lượng thiamin

2.2.1.1 Phương pháp quang phổ

Phương pháp quang phổ có thể dùng để định tính hay định lượng thiamin trong các chế phẩm dược, đặc biệt trong thuốc tiêm Quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại của thiamin rất đặc hiệu và chịu sự thay đổi đáng kể trong môi trường nước ỏ các pH khác nhau Sự thay đổi sâu xa về quang phổ theo pH rất điển hình với nhân pyrimidin Trong môi trường HCl 0,1N thiamin cho một quang phổ hấp thụ đơn giản với độ cực đại ở bước sóng 253nm Trong môi trường đệm axetat pH 3,5 có 2 cực đại ở các bước sóng 245 nm và 261nm Trong môi trường đệm photphat pH 6,6 có 2 cực đại ở cách xa nhau mà ở đó độ tắt của cực đại ở khoảng 265nm thấp xuống đáng kể

2.2.1.2 Phương pháp cực phổ

K Wiesner là người đầu tiên nghiên cứu định lượng thiamin bằng phương pháp cực phổ đã nhận thấy trong dung dịch thiamin có 2 loại sóng cực phổ: sóng xúc tác trong dung dịch đệm, và sóng anot trong môi trường kiềm Dung dịch đệm photphat pH 7,3 thích hợp cho việc định lượng Còn về độ nhạy, thì

pH này rất thích hợp bởi vì có thể dùng nồng độ thiamin ở mg/ml Tuy vậy, việc lựa chọn phương pháp này cũng rất ít vì tất cả chất gây tác nhân phát hiện hiđro trên điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt đều cho làn sóng giống nhau Vì thế chỉ

dùng phương pháp này cho việc định lượng các chế phẩm dược, trong khi khả năng định lượng trong các nguyên liệu thiên nhiên bị hạn chế

2.2.1.3 Phương pháp sắc kí định lượng thiamin

Phương pháp sắc kí là phương pháp rất căn bản để đạt tới việc định lượng thiamin trong các nguyên liệu thiên nhiên Và như vậy kể cả phương pháp sắc

kí hấp phụ trên cột đến phương pháp sắc kí mới nhất trên giấy

Trong sự chọn lọc các phương pháp định lượng thiamin trong nguyên liệu thiên nhiên, phương pháp trao đổi ion từ nhóm zeolit do L.R Cevecedo và D.J Henessy đã dùng chất này để chiết thiamin từ chất dược liệu

Trong thời gian gần đây, việc dùng phương pháp sắc kí trên giấy rất thích hợp và có giá trị đối với việc định lượng thiamin trong nguyên liệu thiên nhiên Phương pháp sắc kí giấy có khả năng dễ tách thiamin khỏi các cocacboxylaza Vấn đề này được đặt ra do A Baldantoni, M Spaoloni Dung môi được dùng là hỗn hợp izo- butanol, pyridin với nước, với tỷ lệ 1 : 1 : 1 và 1,1% axit axetic kết tinh được, người ta tiến hành phát hiện phản ứng thiocrom sau khi oxy hoá thiamin và cocacboxylaza bằng ferixianua kali Vị trí của vết thiocrom được phát hiện do huỳnh quang phát triển dưới ánh sáng tia tử ngoại Việc chuyển dạng thiocrom thường hay được dùng để phát hiện thiamin trong sắc kí giấy Nghiên cứu khả năng mới định lượng các vitamin bằng cách phối hợp các phương pháp lí học với sắc kí trên giấy thì cần sử dụng đến khả năng phân chia lớn của phương pháp sắc kí trên giấy, và độ nhạy đáng kể của một vài phương pháp lí học để định lượng một lượng nhỏ vitamin

2.2.1.4 Định lượng thiamin pyrophotphat bằng phương pháp manomet

Năm 1937 - 1938, A S Shultle, L Atkin và các đồng nghiệp đã công bố phương pháp định lượng thiamin rất nhạy và đặc hiệu dựa trên việc đo thể tích

CO2 phát sinh khi có sự lên men của glucoza trong giai đoạn đecacboxyl hoá axit pyrotactrric Nếu ta cho vào men cocacboxylaza (pyrophotphat thiamin) chất này sẽ kết hợp với thành phần anbumin của cacboxylaza (men ngoại lai) dựa trên chức năng hoạt động của cacboxylaza gây xúc tác cho sự khử cacboxyaxit pyrotactrric Đo bằng áp kế lượng CO2 phát sinh, và từ lượng đó xác định được lượng cocacboxylaza trong mẫu nguyên liệu đem thử G.K Westenbrink và các đồng nghiệp nghiên cứu phương pháp này để định lượng

thiamin pyrophotphat trong máu, trong các mô và các men Đó là một trong những phương pháp rất nhậy để định lượng vitamin

2.2.2 Phương pháp hoá học định lượng thiamin

2.2.2.1 Khái quát chung

Trong các phương pháp hoá học định lượng thiamin, phương pháp thiocrom được xếp lên hàng đầu Phương pháp này dựa trên sự đo cường độ huỳnh quang xanh lơ của sản phẩm oxy hoá của thiamin là thiocrom:

Thiocrom được phát sinh do thiamin bị oxy hoá trong môi trường kiềm Đạt được những điều kiện tốt nhất để đo huỳnh quang khi ta dùng tia tím - tử ngoại ở bước sóng vào khoảng 365nm B.C.P Jansen là người đầu tiên dùng phương pháp huỳnh quang để định lượng thiamin Jansen đã oxy hoá nước chiết có chứa thiamin bằng dung dịch muối màu đỏ máu Sau đó sản phẩm oxy hoá vừa được tạo ra đem lắc với izobutanol Nguyên tắc này nói chung là dùng cho phương pháp huỳnh quang Độ nhạy của phương pháp được nâng lên với thời gian

D.J Henessyt và các cộng tác viên đã dùng zeolit tổng hợp (pecmutit) để tách thiamin từ các nguyên liệu thiên nhiên, đã nghiên cứu nâng cao chủ yếu độ nhạy của phương pháp, và loại trừ ảnh hưởng của huỳnh quang của các chất phụ khác

Sự hấp phụ thiamin trên nguyên liệu này được tiến hành trong môi trường axit Henessy và cộng sự tiến hành giải phóng thiamin từ chất trao đổi ion bằng dung dịch amoni nitrat Tiếp theo là sự cải tiến phương pháp ban đầu của Jansen khi xác định rằng bên cạnh thiamin tự do còn có cả este của axit pyrophotphoric, ví dụ trong men bánh mì và trong một vài mô tế bào động vật Tác dụng vi sinh vật của thiamin pyrophotphat tương đương với tác dụng của thiamin tự do Khi định lượng bằng phương pháp thiocrom, cần phải lắc sản phẩm oxy hoá của cocacboxylaza từ môi trường kiềm với izo - butanol, do lí do trên nên cần phải tiến hành giải phóng thiamin khỏi liên kết của este Muốn

vậy, phải dùng một loại enzym khác để thuỷ phân như: photphataza, takadiastaza và amylaza cũng cho hiệu quả như nhau

2.2.2.2 Định lượng vitamin B 1 bằng phương pháp thiocrom theo "Hội những nhà hoá học về vitamin"

Phương pháp này tiến hành theo các bước sau:

+ Chiết: cân một mẫu có chứa khoảng 10 - 40mg thiamin, cho vào bình cầu 100ml, thêm 75ml dung dịch HCl 0,1N và đun sôi cách thuỷ 30 phút Một mặt trong môi trường axit thì ít nhất thiamin cũng bị oxy hoá, mặc khác có thể dùng phương pháp này để chiết toàn bộ thiamin vào dung dịch Đối với những mẫu thử không chứa thiamin liên kết thì có thể không cần thuỷ phân bằng enzym, mà tiến hành ngay sắc kí phân chia

+ Thuỷ phân bằng enzym: nhằm giải phóng thiamin khỏi dây nối este bằng axit pyrophotphoric Tiến hành thuỷ phân bằng cách dùng sản phẩm takadiastaza Sau khi thuỷ phân xong, để nguội ở nhiệt độ phòng, pha loãng cho vừa đủ 100ml nước cất, lắng và lọc li tâm để có được dung dịch trong

+ Sắc kí: để đẩy nước trong có lơ lửng chất pecmutit đã chuẩn bị sắc vào cột sắc kí ở dưới đáy có lót bông thuỷ tinh Dùng ống hút nhỏ 25 ml dung dịch lọc axit hay nước chiết để cho chảy từ từ Nước lọc chảy ra bỏ đi Rửa cột 3 lần, mỗi lần bằng 10ml nước nóng Trong điều kiện này thiamin được giữ trong cột trao đổi ion Thiamin giải phóng sau đó được tiến hành lấy bằng dung dịch KCl

Tiến hành chiết thiamin bằng cách rửa cột hai lần với 10ml dung dịch axit kaliclorua cho dung dịch chiết vào bình câù 25ml và đổ đầy dung dịch axit kali clorua đến ngấn

Hút 5ml dịch chiết axit vào 2 ống nghiệm có kích thước thích hợp Trong ống nghiệm thứ nhất, hút 3 ml dung dịch kiềm kali ferixianua, trộn thêm 15ml izobutanol và lắc mạnh trong 90 giây Bằng phương pháp oxy hoá này, có thể cho oxy hoá toàn bộ thiamin thành thiocrom và đem lắc vào trong lớp izobutanol Trong ống nghiệm thứ hai, hút 3 ml dung dịch NaOH vào mẫu trắng và sau đó 15ml izobutanol Lắc mạnh trong 90 giây; tiến hành những bước như vậy với dung dịch thiamin mẫu chuẩn

+ Tách dung dịch thiocrom: tiến hành phân chia izobutanol với lớp nước;

có thể dễ dàng phân tách 2 lớp ấy bằng ly tâm Rút lớp nước, thêm vào lớp chiết izobutanol 23g natri sunfat khan và lắc trong 30 giây

+ Đo huỳnh quang: để tiến hành định lượng, thường tiến hành xác định kết quả theo đường cong đồ thị Để tính được nồng độ thiamin trong mẫu cần phải biết kết quả của 4 lần đo

2.2.3 Định lượng thiamin bằng phương pháp so màu

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên việc đo màu sắc của dẫn xuất azo của thiamin phát sinh trong quá trình ngưng tụ thiamin với các thuốc thử điazo hoá khác nhau Năm 1934 H Kinersley và R Pekers dùng axit điazobenzen sunfonic làm các chất điazo hoá Chất azo được tạo nên màu đỏ và được đem lắc với butanol và đem so màu Phương pháp này tiếp tục được M Itvenberg và cộng sự cải tiến tốt hơn, và thực tế họ đã dùng phương pháp so màu này rất tốt để định lượng thiamin

2.2.4 Định lượng thiamin bằng phương pháp cân

Thiamin cho những hỗn hợp rất khó tan với axit silicovonframic D.Adamson và J Handisyde đã dùng phản ứng này để định lượng thiamin bằng phương pháp cân trong các chế phẩm dược Thiamin tạo nên một tủa rất khó tan với reineckat amoni như một vài chất amin dự phòng và các muối bậc 4 Phản ứng này do B J Bandelin đầu tiên dùng để tách thiamin ra khỏi các chế phẩm dược Người ta cân trọng lượng các kết tủa này để định lượng thiamin

3 TÍNH CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RIBOFLAVIN (VITAMIN B 2 )

3.1 Tính chất

+ Độ hoà tan: trong nước ở 250

C: 0,012g trong 100ml

trong cồn etylic tuyệt đối: 0,0045g trong 100ml

trong ete: không tan

trong benzen: không tan

trong hexan: không tan

càng làm phá huỷ nhanh Các chất khử như H hoạt động, NaHSO3, TiCl2 khử

nó một cách thuận nghịch thành hợp chất leuco(II) theo công thức dưới Riboflavin dưới ảnh hưởng của ánh sáng bị phân huỷ

Trong môi trường kiềm, phần lớn tạo ra lumiflavin (III) là 6,7,9- trimetylizoalloxazin trong môi trường axit tạo ra lumicrom (IV) 6,7- đimetylizoalloxazin Huỳnh quang màu vàng xanh là tính chất đặc biệt của riboflavin, là được dùng làm phương pháp định lượng trong các nguyên liệu thiên nhiên R Kuhn và G Moruzzi xác định bằn huỳnh quang của riboflavin phụ thuộc rất đáng kể vào việc dùng dung môi và pH của dung dịch Mức tối đa của huỳnh quang nằm trong giới hạn pH từ 6 - 7

3.2 Các phương pháp định lượng riboflavin

Phương pháp định lượng riboflavin hầu hết chỉ tiến hành bằng phương pháp hoá học, vì phương pháp sinh vật học phụ thuộc một cách đáng kể vào tính chất của động vật và tương đối ít chính xác

+ Phương pháp sinh vật: người ta hay dùng nhất là thí nghiệm sự lớn trên chuột ốm Phương pháp vi sinh vật học trong những năm gần đây thường được dùng dể định lượng riboflavin trong những nguyên liệu hiếm về yếu tố đó E E Snell và F.M Strong và các đồng nghiệp đã viết về phương pháp dựa trên việc

theo dõi sự phát triển của việc nuôi cấy lactobacillus casei M F Clark và đồng nghiệp đã nghiên cứu một trong những cải tiến sau này của phương pháp đó + Về phương pháp lí học, dùng quang phổ tử ngoại và cực phổ để định lượng riboflavin Ý nghĩa của phương pháp này đến nay cũng chưa được đánh giá đầy đủ

+ Phương pháp so màu dựa trên sự đo màu của dung dịch riboflavin cũng

là phương pháp phổ biến, tuy nhiên độ nhạy thực tế rất ít

+ Phương pháp định lượng riboflavin bằng huỳnh quang dựa trên sự đo huỳnh quang màu của chất đó Như vậy, cần phải loại trừ ảnh hưởng do các chất huỳnh quang mang lại, có thể tiến hành bằng phân tách và sắc kí hoặc định lượng riêng biệt từng phần huỳnh quang trước và sau khi khử riboflavin Phương pháp huỳnh quang rất nhạy và tương đối đặc biệt rõ rệt Vì vậy, người

ta dùng để định lượng riboflavin trong một nguyên liệu thiên nhiên Phương pháp định lượng lumiflavin dựa trên sự chuyển riboflavin trong môi trường kiềm bằng những nguồn chiếu sáng mạnh thành những sản phẩm quang học có huỳnh quang màu vàng rất dễ tan trong clorofoc, khác với riboflavin không tan trong dung môi này Phương pháp này rất đặc hiệu, nhưng cũng có phần thiếu sót rất cơ bản là sự phân tích bằng ánh sáng không xảy ra hoàn toàn được và hơn thế nữa sản phẩm phân tích do ánh sáng lumichrom và lumiflavin sẽ bị phân huỷ tiếp ở ánh sáng như phương pháp sắc kí giấy đã chứng minh

Sau đây là các phương pháp lí học và hoá học để định lượng riboflavin

3.2.1 Phương pháp lí học để định lượng riboflavin

Trong các phương pháp lí học có thể dùng chủ yếu là các phương pháp quang phổ trong vùng tia tím tử ngoại và phương pháp cực phổ để định lượng riboflavin

3.2.1.1 Phương pháp quang phổ

R Kuhn và đồng nghiệp là những người đầu tiên đã đo quang phổ hấp thụ của riboflavin và tìm thấy trong dung dịch nước riboflavin 4 cực đại hấp thụ, cực đại chính trong vùng 265nm đến 267nm C Daglish, M Baxter xác định rằng quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của riboflavin phụ thuộc một cách đáng

kể vào pH, và khi xác định kết quả về định lượng cần phải đo quang phổ của mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng một chất đệm như nhau

Để chuẩn bị cho dung dịch riboflavin đo quang phổ, cần phải đảm bảo điều kiện mẫu phải sấy thật khô (sấy khô trên P2O5 hay ở 1000C trong tối), đem cân và đem hoà tan trong 1ml axit axetic kết tinh, thêm 100ml nước nóng, thêm nước vừa đủ 1000ml Pha loãng dung dịch để đo quang phổ bằng HCl 0,01N làm sao để có pH khoảng 3,0 Nồng độ thích hợp để ghi quang phổ là khoảng 4mg% Để xác định trị số về định lượng, tốt nhất là đo ở bước sóng cực đại 267nm Quang phổ hấp thụ vùng tím tử ngoại là tiêu chuẩn cần thiết của dung dịch riboflavin tinh khiết, được dùng khi định lượng bằng phương pháp sinh vật học và phương pháp hoá học Sau này phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại được dùng coi như một phương pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệu riboflavin cũng như các dược phẩm

3.2.1.2 Cực phổ

Việc nghiên cứu định lượng vitamin B2 bằng cực phổ đã bổ sung rất tốt tính chất đặc hiệu về hoá học của nó R.Brolica và E Knobloch là người đầu tiên nghiên cứu phương pháp cực phổ để định lượng riboflavin và đã nghiên cứu sự phụ thuộc của việc khử riboflavin vào pH Trong phương pháp cực phổ các tác giả đã nghiên cứu theo dõi sự khử của riboflavin thành dạng leuco trong môi trường kiềm có dùng NaHSO3 Trong môi trường axit dùng chất TiCl2 Công tác nghiên cứu cực phổ xác nhận rằng riboflavin là một chất khử oxy hoá thuận nghịch Khi khử riboflavin thành một chất leucolactoflavin cũng không làm thay đổi thế oxy hoá khử cực, do vậy nên các đường cong cực phổ đều là những đường cong điện thế tương đối hoàn chỉnh

Trên đường cong cực phổ của riboflavin, người ta theo dõi những bước đầu đặc biệt mà không thấy có ở phương pháp điện thế Phương pháp cực phổ được coi như để nghiên cứu sự phân tích do ánh sáng của riboflavin Lumiflavin được khử ở điện thế giống như riboflavin, do vậy, hai chất này không thể định lượng cạnh nhau được bằng phương pháp cực phổ Lumicrom

bị khử trên điện cực thuỷ ngân nhỏ giọt ở thế âm hơn riboflavin và cũng vì vậy

có thể định lượng nó bằng phương pháp cực phổ cạnh riboflavin

Phương pháp cực phổ được dùng có hiệu quả để định lượng riboflavin trong các dược phẩm Phương pháp này không phù hợp để định lượng riboflavin trong các nguyên liệu sinh vật học, một mặt là vì riboflavin có trong

các nguyên liệu thiên nhiên với nồng độ rất nhỏ, một mặt khác riboflavin ở đó dưới dạng kết hợp, nên phương pháp cực phổ không có tác dụng

Khi dùng phương pháp cực phổ để định lượng các chế phẩm dược, vì riboflavin ít hoà tan trong nước, nên cần cho thêm một chất làm tăng sự hoà tan của nó Chẳng hạn dung dịch natri salixilat 10% làm tăng sự hoà tan của riboflavin, sự có mặt của chất này không làm ảnh hưởng đến việc định lượng riboflavin bằng phương pháp cực phổ

Việc dùng phương pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lượng riboflavin có trong chế phẩm polivitamin, trong đó có thể tiến hành định lượng thẳng hỗn hợp vitamin nhóm B còn lại Để dịnh lượng riboflavin bằng phương pháp cực phổ, việc chuẩn bị mẫu chuẩn so sánh là rất cần thiết Trong thí nghiệm dùng phương pháp cực phổ để định lượng riboflavin một cách chính xác và đặc hiệu nhất trong công nghiệp dược thì dùng 100% mẫu chuẩn

3.2.1.3 Sắc ký

Phương pháp sắc ký có một giá trị để định lượng riboflavin trong các nguyên liệu thiên nhiên, gồm cả phương pháp pháp sắc ký hấp phụ, và sắc ký phân chia Trong đó phương pháp sắc ký trên giấy có giá trị đặc biệt nhất F Weygemel và K Wacker dùng frankonit làm chất hấp phụ để định lượng riboflavin trong nước tiểu W Neuweiler dùng đất sét nung để định lượng trong sữa Trong những chất hấp phụ khác nhau còn dùng sunfua chì, floridin và một vài loại đất sét hấp phụ khác dùng trong kỹ nghệ (đất sét dùng trong kĩ nghệ chất béo) Để định lượng riboflavin cạnh thiamin R.T Conner và G.J Straub dùng sự phân chia thành 2 hệ hấp phụ, pecmutit (thiamin) và floridin (riboflavin) Huỳnh quang màu vàng xanh đậm của riboflavin được coi như chất phát hiện trong phương pháp sắc kí Để nghiên cứu việc tìm chất flavin-ađenin nucleotit trong các tế bào động vật, J L Clamen lần đầu tiên dùng kĩ thuật sắc kí giấy để làm phương pháp phân tích riboflavin Sau đó phương pháp này được tiếp tục để định lượng riboflavin trong các nguyên liệu thiên nhiên dạng kết hợp khác nhau và trong các môi trường nuôi cấy vi trùng Vấn đề thuận lợi là có thể theo dõi bằng phương pháp sắc kí trên giấy sản phẩm phân huỷ bằng ánh sáng của riboflavin, bởi vì một trong những sản phẩm phân huỷ chính có một huỳnh quang (xanh lơ) khác riboflavin

3.2.2 Phương pháp định lượng riboflavin bằng huỳnh quang và so màu