Đặc điểm sinh học, sinh thái học nấm isaria javanica và đánh giá khả năng sử dụng trong phòng trừ sâu khoang, rệp muội và sâu xanh bướm trắng luận văn thạc sỹ nông lâm ngư

Có nhiều loạichế phẩm sinh học đã được sản xuất từ nấm ký sinh côn trùng như chế phẩm Biovip có nguồn gốc từ nấm Beauveria bassiana, chế phẩm Ometar có nguồn gốc từ nấ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của cán bộ, các thầy cô giáo và các bạn học viên, sinh viên Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh.

Trước tiên, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành tới thầy giáo hướng dẫn

khoa học PGS TS Trần Ngọc Lân đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm

luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa Nông Lâm Ngư, Bộ môn Bảo vệ thực vật, các quý Thầy cô giáo trong toàn khoa đã quan tâm và đóng góp ý kiến quý báu trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp của tôi.

Chân thành cám ơn các bạn sinh viên đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng rất biết ơn những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ về cả vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Tác

giả luận văn

Hà Thị Thanh Hải

MỤC LỤC

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của việc nghiên cứu đề tài 1

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 41.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới 41.2 Nghiên cứu cơ chất và công nghệ nhân nuôi nấm ký sinh côn

1.4 Tình hình nghiên cứu về nấm Isaria javanica 1

41.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng phòng trừ

sâu hại ở trong nước

15

2

72.3.1 Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA 2

72.3.2 Phương pháp nhân sinh khối nấm trên các môi trường rắn 2

12.3.6 Phương pháp bố trí, phân tích và xử lý số liệu 3

2

2.4 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 3

3

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3

4

3.1 Đặc điểm sinh học của Isaria javanica trên môi trường PDA 34

3.1.1 Đặc điểm hình thái nấm Isaria javanica 3

4

3.1.2 Khả năng sinh trưởng của nấm Isaria javanica trên môi trường

PDA

35

3.2 Khả năng sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên các môi

trường rắn

40

3.3 Kỹ thuật sản xuất chế phẩm nấm Isaria javanica 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CT1: Công thức 1

CT2: Công thức 2

CT3: Công thức 3

BQT: Bảo quản tươi

BQK: Bảo quản khô

Bb: Beauveria bassiana

Ma: Metarhizium anisopliae

ĐKKl: Đường kính khuẩn lạc

ĐDKL: Độ dày khuẩn lạc

MĐBT: Mật độ bào tử

MEA: Maltose Extract Agar

PDA: Potato Dextrose Agar

SDAY: Sabouraud Dextrose Agar Yeast extract

Bảng 3.3 Mật độ bào tử nấm Isaria javanica trên môi trường PDA theo

thời gian theo dõi

39

Bảng 3.4 Số lượng bào tử nấm Isaria javanica nuôi cấy trên môi trường

rắn theo thời gian

40

Bảng 3.5 Nồng độ bào tử của chế phẩm nấm Isaria javanica theo 2 cách

bảo quản: khô và tươi

43

Bảng 3.6 Hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm từ nấm Isaria

javanica trong phòng thí nghiệm (Aboott, 1925)

46

Bảng 3.7 Tỷ lệ sâu khoang bị nhiễm nấm Isaria javanica sau khi phun

chế phẩm ở các công thức thí nghiệm

48

Bảng 3.8 Hiệu quả phòng trừ của chế phẩm nấm Isaria javanica đối với

rệp hại lạc trong phòng thí nghiêm ở 3 nồng độ

Bảng 3.11 Hiệu lực phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) của

Isaria javanica ở các tuổi sâu khác nhau

58

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1: Chu trình xâm nhiễm nấm lên côn trùng 9Hình 3.1 Hình ảnh nấm Isaria javanica trên vật chủ và trên môi trường PDA 36

Hình 3.2 Đường kính khuẩn lạc nấm Isaria javanica trên môi trường PDA 37

Hình 3.3 Độ dày khuẩn lạc nấm Isaria javanica trên môi trường PDA

Hình 3.4 Đặc điểm hình thái của nấm Isaria javanica trên môi trường PDA

3737

Hình 3.5 Nồng độ bào tử của chế phẩm nấm Isaria sp3 sau các tháng bảo

quản bằng hai phương pháp

44

Hình 3.6 Hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm nấm Isaria javanica 46

Hình 3.7 Tỷ lệ sâu khoang bị nhiễm nấm Isaria javanica sau khi phun chế

phẩm nấm Isaria javanica trong phòng thí nghiệm theo 3 nồng độ

Hình 3.10 Tỷ lệ rệp mọc nấm sau khi xử lý chế phẩm nấm Isaria javanica

trong phòng thí nghiệm trên ba nồng độ A(3,11x108), B(3,11x107),

Hình 3.13 Rệp muội bị nhiễm nấm Isaria javanica ở ngoài đồng ruộng 57

Hình 3.14 Hiệu lực phòng trừ sâu non sâu xanh bướm trắng của nấm Isaria

javanica

59

MỞ ĐẦU

1 Tầm quan trọng và ý nghĩa của việc nghiên cứu đề tài

Trong những năm qua nền nông nghiệp nước ta đã đạt được nhiều thànhtựu to lớn, đảm bảo an ninh lương thực, phát triển kinh tế, ổn định chính trị,nâng cao đời sống nhân dân Tuy vậy, với việc thâm canh tăng vụ, chuyển đổi

cơ cấu cây trồng, sử dụng nhiều giống mới tăng năng suất đã làm cho sâu hạiphát triển mạnh, khó kiểm soát Việc lạm dụng các hóa chất bảo vệ thực vật đểgiải quyết vấn đề trên đã gây nên tình trạng báo động về sự kháng thuốc củanhiều loài sâu hại, sự nhiễm độc nghiêm trọng đối với con người và môi trường.Chính vì vậy xu hướng phát triển nền nông nghiệp hữu cơ với việc sử dụng chếphẩm sinh học trong phòng trừ sâu hại là hướng đi đúng đắn cho việc phát triểnnông nghiệp an toàn, nông nghiệp xanh và bền vững của nước ta Có nhiều loạichế phẩm sinh học đã được sản xuất từ nấm ký sinh côn trùng như chế phẩm

Biovip có nguồn gốc từ nấm Beauveria bassiana, chế phẩm Ometar có nguồn gốc từ nấm Metarhizium anisoplie, Prabhapeacilon có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces lilacinus, có khả năng phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng Tuy

vậy việc nghiên cứu và ứng dụng nấm ký sinh côn trùng vào thực tiễn sản xuất ởnước ta còn nhiều hạn chế Hiện nay mới chỉ có hai loại chế phẩm sinh học dùng

để phòng trừ sâu hại được sản xuất từ hai loài nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisoplie của Viện bảo vệ thực vật

Nấm ký sinh côn trùng Isaria là loại nấm phát triển nhanh, có số lượng bào

tử nhiều, dễ phân lập và nhân nuôi Chúng đã được nghiên cứu và ứng dụng vàophòng trừ một số đối tượng sâu hại thuộc các bộ Lepidoptera, Diptera,Coleoptera ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazin với kết

quả rất khả quan [29], [34], [40] Nấm ký sinh côn trùng Isaria javanica thu thập

được ở Vườn Quốc gia Pù Mát được đánh giá là rất có triển vọng trong việcứng dụng để phòng trừ sâu hại phá hoại mùa màng [12].

Sâu khoang, rệp muội, sâu xanh bướm trắng là những loài sâu gây hại trênnhiều đối tượng cây trồng, từ những loại cây lương thực như lúa, ngô đến cácloại rau màu như rau họ thập tự, lạc, đậu tương Do vậy kiểm soát được các loạisâu hại nguy hiểm này rất có ý nghĩa trong hướng xây dựng một nền nôngnghiệp sạch

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, để góp phần phục vụ công tác phòng

trừ sâu hại theo hướng bền vững, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Đặc điểm sinh

học, sinh thái học nấm Isaria javanica và đánh giá khả năng sử dụng trong

phòng trừ sâu khoang, rệp muội và sâu xanh bướm trắng

2 Mục đích nghiên cứu

Trên cơ sở nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh thái của nấm Isaria javanica

và đánh giá khả năng phòng trừ của nó đối với sâu khoang, rệp muội và sâu

xanh bướm trắng nhằm ứng dụng nấm Isaria javanica để phòng trừ sâu hại cây

trồng

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu

Nấm Isaria javanica: đặc điểm hình thái, khả năng sinh trưởng trên môi

trường PDA, và các môi trường rắn khác nhau, hiệu lực phòng trừ của chế phẩm

từ nấm Isaria javanica trên các đối tượng sâu hại

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius)

Rệp muội (Aphis)

Sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae L.)

 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu về tác nhân phòng trừ sâu hại (nấm Isaria javanica) và các loài

sâu hại chính (sâu khoang, rệp muội, sâu xanh bướm trắng)

 Nội dung nghiên cứu

1) Đặc điểm sinh học của nấm Isaria javanica

2) Nghiên cứu khả năng sinh trưởng phát triển của nấm Isaria javanica trên

môi trường PDA, môi trường rắn

3) Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất chế phẩm từ nấm Isaria javanica và các

phương pháp bảo quản chế phẩm

4) Đánh giá hiệu lực phòng trừ của chế phẩm từ nấm Isaria javanica trên

các đối tượng sâu hại

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Trên cơ sở xác định chủng nấm Isaria javanica, đánh giá sự đa dạng sinh

học trong hệ sinh thái, cung cấp những tư liệu khoa học, làm cơ sở cho việc tiếnhành bảo vệ và nhân nuôi đạt hiệu quả cao

Kết quả bước đầu của đề tài, cung cấp các dẫn liệu về việc nhân sinh khối

nấm Isaria javanica trên các môi trường rắn ở điều kiện nhiệt độ phòng, từ đó

xác định kỹ thuật để sản xuất chế phẩm theo quy mô nhỏ

Sử dụng và đánh giá khả năng phòng trừ của chế phẩm tạo ra từ nấm Isaria javanica trên các loài sâu hại, từ đó cung cấp dẫn liệu để có biện pháp ứng dụng

trên đồng ruộng

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng trên thế giới

 Khái niệm nấm ký sinh côn trùng

Khái niệm “Nấm ký sinh côn trùng – Entomology pathogenic fungi (EPF)”hay “Nấm côn trùng – Insect fungi” được các nhà khoa học sử dụng như cácthuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật (nấm) ký sinh gây bệnh cho côntrùng

Theo Evans (1988) [31], nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm:Ký sinh trong: là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn trùngký chủ; (2) Ký sinh ngoài: là nấm phát triển ở tầng cuticun ngoài vỏ cơ thểcủacôn trùng và gây bệnh hại cho côn trùng; (3) Nấm mọc trên côn trùng: là nấmtrực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng; (4) Cộng sinh:là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùngchung sống

Nấm ký sinh côn trùng còn được chia thành ký sinh sơ cấp (primerypathogen) và ký sinh thứ cấp (secondery pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm kýsinh sơ cấp thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đógiết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trênnhững côn trùng bị yếu hoặc côn trùng bị thương Các mầm bệnh ký sinh trêncôn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặcký sinh không chuyên tính; loại ký sinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông quasự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng Các ký sinh trên côn trùng

bị thương gọi là bệnh lây qua vết thương, chỉ có thể xâm nhập vào côn trùng quavết thương

Như vậy nấm ký sinh côn trùng được dùng để mô tả hiện tượng nấm kýsinh trên hoặc trong cơ thể ký chủ côn trùng Khái niệm này cũng được dùng

cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là hai lớp trong ngành độngvật chân khớp và chúng có cùng một kiểu sinh thái là ăn thực vật hoặc ăn thịt vàsinh sống chủ yếu trên cây.

 Cơ chế tác động của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua conđường hô hấp, tiêu hoá hoặc cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua vỏ cuticuncủa chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thể vật chủ.Bào tử nấm bám vào cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào tử mọc mầm vàxâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp kitin Để vượt qua lớp biểu bìngoài là nhờ áp lực cơ giới, còn qua lớp biểu bì trong là do hoạt động men củanấm [10]

Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ kitin và tạo thành một lỗ thủng tạinơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng đó mầm của bào tử xâm nhập vào bên trong

cơ thể côn trùng Vì nấm có khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùngqua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh được côn trùng chích hút và ký sinhđược qua những pha phát triển mà các sinh vật khác không ký sinh được nhưtrứng, nhộng Bào tử nấm cũng có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinhdục để vào bên trong cơ thể côn trùng, những trường hợp này rất ít [1]

Các bộ côn trùng dễ bị nhiễm nấm bao gồm: Coleoptera, Diptera,Homoptera, Hymenoptora và Lepidoptera Việc các loài côn trùng bị nấm xâmnhiễm là một cơ sở chứng tỏ mối quan hệ bền chặt giữa côn trùng và thực vật.Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua 3 giai đoạn chính:

* Giai đoạn xâm nhập:

Bào tử sau khi phát triển hoàn thiện thì lộ ra khỏi bề mặt của cơ thể vật chủđã bị nhiễm nấm Bào tử phát tán ra ngoài môi trường, chờ cơ hội gặp vật chủthích hợp để ký sinh

Trong điều kiện phù hợp và gặp được vật chủ thích hợp thì bào tử sẽ bámchặt vào lớp vỏ côn trùng để bắt đầu giai đoạn ký sinh.

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vàotrong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầmbệnh, nó giải phóng các enzim ngoại bào tương ứng với các thành phần chínhcủa lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân huỷ lớp vỏ này như: Protease,chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N-axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzim này được tạo ra một cách nhanhchóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trongmột loài

Enzim protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phânhuỷ lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein).Lipase, cenlulase và các enzim khác cũng là những enzim có vai trò không kémphần quan trọng Nhưng quan trọng hơn cả vẫn là enzim phân huỷ protein(protease) và kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzim này có liên quan trựctiếp đến hiệu lực tiêu diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng [14], [1], [27],[35], [38]

* Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết:

Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấmtiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hìnhthành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá huỷ các tế bàomáu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâmnhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động củacôn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bênngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đếnchết [11], [28]

* Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết:

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết lànguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bêntrong cơ thể côn trùng sẽ bị phân huỷ bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài

của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp.,Penicillium spp và Fusarium spp định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ

thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tínhnhư thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nênchúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xácvật chủ không bị phân huỷ

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơthể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử Trong điều kiện môitrường thích hợp, sợi nấm sinh trưởng ra ngoài tạo ra các cấu trúc sinh sản vàphát tán các bào tử sang các ký chủ mới Trong điều kiện môi trường khôngthích hợp, hầu hết các loài nấm ký sinh côn trùng có thể tạo ra dạng bào tử nghỉnhư chlamydospore, zygospore và oospore hoặc tạo ra dạng bào tử hữu tính nhưascospore Những dạng bào tử này cho phép nấm qua đông hoặc chống chịu lạivới các điều kiện bất thuận [30]

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng cácenzim ngoại bào để phân huỷ lớp vỏ citicun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạnnấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơhọc Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vậtchủ Nhiều côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử,vì vậy mà rất khó hoặc không thể xác định được các vật chủ [34]

Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trưởng phát triển để hoàn thànhmột chu kì sống của chúng: Từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới.Nấm gây bệnh côn trùng có thể là chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc

một giai đoạn nhất định của vật chủ Nhưng nhiều trường hợp chúng là ký sinhcó tính chuyên hoá thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loại côn trùng thuộc cácgiống, họ, bộ khác nhau.

Khi bào tử tiếp xúc với côn trùng để chuẩn bị xâm nhập, cơ thể côn trùng sẽxảy ra một sự kháng cự hay phòng thủ hoặc có một hệ thống miễn dịch để chốnglại sự xâm nhiễm Nếu như các enzym của nấm chiến thắng được sự phòng thủcủa côn trùng thì quá trình xâm nhiễm coi như đã thành công

Tỷ lệ nảy mầm và xâm nhập vào da của côn trùng cho thấy có sự liên quanvới tính độc của nấm và sự nhạy cảm của vật chủ [30] Nghiên cứu này cho thấysự quan sát ở các giai đoạn khác nhau của chu trình lây nhiễm và giải thích rõhơn tầm quan trọng của việc nắm bắt được đặc điểm của các giai đoạn để lựachọn chủng nấm thích hợp cho việc sử dụng biện pháp phòng trừ sinh học đốivới côn trùng

Các chế phẩm từ nấm được sản xuất bao gồm bào tử nấm và các giá thể.Khi phun, những bào tử nấm dính vào cơ thể côn trùng, khoảng 24 giờ sau gặpđiều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm xuyên qua lớp vỏ kitincủa chúng Bào tử nấm phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuấthiện các tế bào nấm đầu tiên rồi tiếp tục phân nhánh tạo nên một mạng sợi nấmchằng chịt Chính trong quá trình bào tử nảy mầm đã tiết ra một phức hệ enzymngoại bào phân giải kitin, protein và lipit Đồng thời, nấm tiết ra độc tố làm cáctế bào bị phân huỷ, côn trùng bị tê liệt rồi chết Nấm vẫn tiếp tục phát triển trênxác côn trùng, sợi nấm chui qua lớp vỏ kitin, hình thành một lớp bào tử xanh

(Metarhizium anisopliae), trắng (Beauveria bassiana) như hiện tượng của bệnh

tằm vôi Sau đó bào tử nấm tiếp tục lây lan, phát tán sang các con côn trùngkhác và thực hiện những chu trình mới Mỗi chu trình thường kéo dài và kếtthúc trong vòng 7 – 10 ngày

Có thể mô tả chu trình xâm nhiễm nấm lên côn trùng theo hình 1

Hình1 Chu trình xâm nhiễm nấm lên côn trùng[26]

1.2 Nghiên cứu cơ chất và công nghệ nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng

Cơ chất tự nhiên của nấm ký sinh côn trùng chính là các cơ thể côn trùng.Như vậy để nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng thì hoặc là nhân nuôi côn trùng đểlàm cơ chất hoặc nghiên cứu một số môi trường nhân tạo khác Nấm côn trùngcó thể sử dụng các nguồn thức ăn rất khác nhau, hầu như không có loại hợp chấthữu cơ nào mà không được nhóm nấm khác sử dụng Nhiều loài nấm còn có khảnăng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiềuloài sinh vật khác (các chất n – alcan, alcaloit, phenol, nhiều chất kháng sinh,nhiều độc tố…) Chúng có khả năng sử dụng nhiều loại hợp chất cacbon khácnhau, nhưng cũng có loại hợp chất này được đồng hoá tốt hơn loại hợp chất cácbon khác Có rất nhiều trường hợp ở trong môi trường nuôi cấy có mặt vàinguồn cácbon khác nhau, nấm sẽ phát triển mạnh hơn khi chỉ có riêng từng loại.Các công trình nghiên cứu của Hegendus và cs đã xác định môi trường tốt nhất

để phân lập nấm M.anisopliae và B bassiana là môi trường có chứa kitin làm

nguồn cacbon [20]

Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau, nấm thường có những nhucầu về các nguồn cacbon khác nhau Hegendus và cs ; Dorta và cs cho biết nấm

M.anisopliae khi nuôi cấy chìm nếu được bổ sung thêm kitin hoặc hexosamines

và glucoza thì thu được lượng bào tử là cao nhất Theo các tác giả thì nhu cầukhông giống nhau về nguồn gốc thức ăn cacbon nhưng các loại đường này rấtthích hợp cho việc hình thành hệ sợi nấm, song chưa chắc đã là thích hợp choviệc hình thành các cơ quan sinh sản hoặc việc tích luỹ những chất chuyên hoákhác Trên nguồn thức ăn phức tạp như tinh bột, xenluloza, kitin, đầu tiên nấmphải sinh ra các enzym để thuỷ phân các hợp chất này thành các hợp chất đơnphân tử sau đó mới đồng hoá được chúng [20] Tuỳ từng loại nấm mà có mốiquan hệ khác nhau đối với nguồn thức ăn cacbon Khi nuôi cấy các chủng nấm

Beauveria basiana và chủng Metarhizium anisopliae trên môi trường có nguồn

cacbon khác nhau, người ta thấy chúng đồng hoá tốt các loại đường glucoza,maltoza, sacaroza nhưng lại đồng hoá đường rafinoza rất yếu Mối quan hệ giữanguồn thức ăn cacbon với sự hình thành và phát triển của bào tử nấm

Metarhizium flavoviride đã được tác giả Jenkins và Prior xác định được tỉ lệ thích hợp giữa sacarozo và pepton trong dịch nuôi cấy nấm Metarhizium flavoviride có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và hình thành bào tử nấm [35]

Vi nấm có mối quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chấtsinh trưởng Ngoài tác dụng kích thích nảy mầm của bào tử, sinh trưởng và tăngtrưởng của hệ sợi nấm , cũng có loại vitamin kìm hãm hoặc hạn chế sự sinhtrưởng của nấm Trường hợp bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy người tathấy có sự ức chế khẳng 30 – 40% của quá trình sinh trưởng và phát triển của

nấm côn trùng Các chủng nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae nếu bổ sung thêm kitin tự nhiên của châu chấu di cư Locusta migration vào môi

trường nuôi cấy sẽ làm tăng khả năng sinh bào tử Các tác giả cũng nhận thấytrong số các loại ngũ cốc sử dụng làm nguồn cacbon thì gạo là phù hợp hơn cả

Basto Cruz và cs khi nuôi nấm Metarhizium anisopliae để sản xuất chế phẩm

nhận thấy, trên môi trường gạo cho số lượng bào tử hình thành nhiều gấp ba lầnvà thời gian hình thành các bào tử cũng nhanh hơn so với môi trường đậu tươngngâm [20] Ngoài ra các tác giả đó còn sử dụng các loại cám, trấu, nước dừa và

cùi dừa để sản xuất ra sinh khối nấm Metarhizium anisopliae Tại CuBa , những

năm 1970 – 2002, viện công nghệ sinh học Lahabana đã nghiên cứu công nghệ

sản xuất chế phẩm nấm B bassiana và M anisopliae trên môi trường tấm gạo

với dung dịch cacbonat canxi 0.5%, bằng phương pháp luộc tấm gạo rồi sấy khôsau đó nhân giống thuần Tuy vậy, phương pháp này áp dụng không thành công

ở Việt Nam vì sản phẩm thu được không ổn định, mất nhiều thời gian và giá

thành cao Cũng có thể nhân nuôi nấm B.bassiana trên môi trường rắn như cám

– ngô, môi trường hạt ngô nảy mầm [20]

Năm 2008, các tác giả K Sahayaraj và S Karthick Raja Namasivayam đãthử nghiệm các môi trường dạng hạt như gạo, lúa mì, kê, ngô, lúa miến, môitrường lỏng như nước dừa, nước gạo, nước cơm, nước bột mì và môi trường rắn

như bột cà rốt, bột bánh xốp, cám, mùn cưa đối với 3 loài nấm là Baeuveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus và Verticillium lecanii Đối với môi trường hạt thì lúa mì cho lượng bào tử lớn nhất đối với nấm B bassiana trong khi lúa miến lại cho lượng bào tử lớn nhất đối với P fumosoroseus và V lecanii.

Còn môi trường lỏng thì nước dừa đem lại lượng bào tử lớn nhất cho cả 3 loàinấm trên Môi trường rắn thì tương ứng với các loại bột cà rốt, bột bánh xốp cholượng bào tử lớn nhất khi thử nghiệm với 3 loài nấm trên [37] Theo các tác giảRombach, Basto Cruz và cs, Jenkins và Prior thì sử dụng phương pháp nuôi cấychìm để sản xuất nấm côn trùng sẽ thu được những kết quả tốt, vì trong nuôi cấychìm người ta đã xác định được khả năng sinh bào tử chồi và lượng sinh khối

thu được từ hai chủng nấm B bassiana và M anisopliae là rất cao [36][45]

Việc nuôi cấy nấm bạch cương Beauvaria brumpli theo công nghệ lên

men chìm được thực hiện lần đầu bởi J Maran (1948) và gần đây công nghệ sảnxuất nấm côn trùng đã phát triển rất mạnh ở một số nước có nền kinh tế pháttriển [20]

1.3 Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu hại

Vào năm 1815, Agostino Bassi đã mô tả khá tỉ mỉ về bệnh nấm trắngMuscardin gây bệnh trên tằm và đã đưa ra biện pháp ngăn ngừa Thời gian ấy tuyBassi chưa có đầy đủ kiến thức về ngành nấm học để phân loại, nhưng tác giả cóthể phân biệt được mô của ký chủ với nấm ký sinh bằng cách đưa ra phương pháplan truyền cũng như điều kiện lây bệnh và chính tác giả đã đề xuất ra biện phápphòng trừ Như vậy có thể coi Agosstino Bassi là nhà bệnh lý học côn trùng đầutiên Sau Bassi thì càng ngày càng xuất hiện rất nhiều công trình nghiên cứu và ứngdụng nấm côn trùng để phòng trừ các loài sâu hại cây trồng [41]

Từ những năm 80 của thế kỷ trước (1880 - 1886) Metschnhikov cùng họctrò của mình là Isac Craxinstic đã nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy

nấm M.anisopliae và đã sản xuất thử hàng nghìn kg nấm để tách bào tử thuần

khiết, sau đó dùng bào tử nấm trộn với đất bột đem tung ra đồng ruộng, theo cáctác giả thì sau 10 -14 ngày thí nghiệm cả sâu non và dạng trưởng thành của bọđầu dài hại củ cải đường chết với tỉ lệ 55 – 80% Tiếp sau đó nhà bác học Snoi

cũng đã tiến hành một loạt thí nghiệm với nấm trắng Beauveria globuliera để gây bệnh trên bọ xít (Bliscus lencoptera Say) hại lúa mì Các nhà khoa học

trường đại học tổng hợp Kanzac đã thiết lập một trạm tuyên truyền để phổ biến

vai trò của nấm Beauveria với việc lây bệnh trên côn trùng và đã gửi hơn 500

kiện nấm này đến các trang trại để phòng trừ sâu hại củ cải đường [20]

Lần đầu tiên vào năm 1892 F Tang đã nuôi cấy nhân tạo nấm bạch cương

(Beauveria bassiana) rồi dùng bào tử của chúng để thử nghiệm diệt sâu róm

(Porthetria disper) Sau đó vào năm 1983 S.A.Forbes và S H Snow vào năm

1986 đã sử dụng nấm Beauveria densa để diệt trừ loài rệp Blissus leucoplerus.

Tại Nhật Bản vào năm 1988, một số nhà khoa học đã phòng trừ ròi hại rễ củ cải

bằng nấm Beauveria và Metarhizium Thí nghiệm được tiến hành như sau: Dùng

một bó củ cải có 10 trứng ròi hại rễ để trong một lọ Trứng được sắp xếp xungquanh củ cải với khoảng cách đều nhau 3cm Nồng độ mỗi loại nấm đưa vào lọlà 0,5x109bào tử/ml với 5 lần lặp, kết quả cho hiệu lực rất cao trên 75% trongđiều kiện nhiệt độ là 23oC và độ ẩm không khí trên 70% sau 10 ngày thí nghiệm.Tại Úc vào năm 1995, Richard Miller đã tách được vài trăm chủng nấm

M.anisopliae từ một nhóm côn trùng sống trong đất dưới gốc mía Trong số 95

chủng thử nghiệm trực tiếp, tác giả chỉ chọn được hai chủng có khả năng diệt

sâu là Lepidota frenchi và L consobrina hại rễ mía và một chủng diệt sâu Antitrogus parvulus với nồng độ là 1 – 5x104 bào tử/gam Hanel đã chọn từ 22

chủng vi nấm, chỉ có một chủng M anisopliae là phù hợp cho phương pháp phòng trừ sinh học đối với loài mối Masutitermes exitiosus (Hill) Năm 1990, tại

Trung Quốc tác giả Goettel và cs đã thử nghiệm thành công phòng trừ sâu róm

thông (Dendrolimus spp) trên 110ha rừng thông bằng 2100kg chế phẩm nấm Beauveria bassiana [40] Năm 2000, các tác giả Govindan Sheeba, Sundaram

Seshadri và cs ở Ấn độ cũng thành công trong việc ứng dụng loài nấm này vàoviệc kiểm soát mọt hại ngũ cốc Thí nghiệm được tiến hành như sau: 25 cá thểmọt trưởng thành và chế phẩm nấm B.bassiana đem trộn với 50 g gạo bỏ vào lọthuỷ tinh ở điều kiện nhiệt độ 28± 2oC và độ ẩm 70% Thí nghiệm được theo dõi

5 ngày một lần và thực hiện trong 25 ngày liên tục Ở nồng độ 7.6 log bào tử/ml,hiệu quả phòng trừ rất cao 75.8% [32] Bên cạnh đó các tác giả Phillip E.Kaufman và cs, Jenifer K Ketzis và James J Arends đã ứng dụng loài nấm

B.bassiana để phòng trừ ruồi nhà (Musca domestica) ở Mỹ(2005) [44] Và năm

2008, hai tác giả Olivia Afa.A và Pierre R T ở Cameroon đã sử dụng nấm

Beauveria bassiana phòng trừ muỗi Anopheles gambiae s.i trưởng thành ở cả

muỗi cái và muỗi đực Kết quả rất tốt, có tới 80% muỗi bị nhiễm nấm và tỉ lệmuỗi chết tăng tới 87% khi tăng nồng độ bào tử nấm dùng cho thử nghiệm[43]

Như vậy có thể nói, cho tới nay các nhà khoa học trên thế giới vẫn chưaxác định được một loài vi nấm nào khác có hiệu lực cao và phổ tác dụng rộng rãi

như hai chủng nấm M anisopliae và chủng B bassiana Bên cạnh đó cũng có

một vài loài nấm ký sinh côn trùng khác có vai trò trong việc phòng trừ côn

trùng gây hại nhưng phổ tác dụng hẹp hơn nhiều như Lagenidium giganteum ký sinh trên muỗi, Paecilomyces fumosoroseus ký sinh trên ruồi trắng và Verticillium lecanii ký sinh trên sâu đục thân và rệp vừng Do vậy các chủng

nấm trên đã được nghiên cứu khá sâu và đã sản xuất thành công các chế phẩmthương mại để ứng dụng rộng rãi trong phòng trừ các loài côn trùng gây hại chocây trồng và đời sống con người

1.4 Tình hình nghiên cứu về nấm Isaria javanica

Nấm Isaria javanica thu được trên loài sâu bướm ở Brazil được mô tả lần

đầu tiên vào năm 1957 bởi tác giả (Friederichs & Bally) AH Brown & G Smith

và có tên gọi ban đầu là Paecilomyces javanicus Các tác giả Luangsa-ARD, JJ;

Hywel-Jones, NL, Manoch, L.; Samson, RA, mô tả và định loại lại vào năm

2005 như sau: Cuống bào tử đính dạng đơn, mọc thẳng đứng, sinh ra chủ yếu từcác khuẩn ty nằm phía trên, có chiều dài 50 µm và rộng 1,5-2,5µm Chúng phânnhánh dưới dạng các vòng, không đều, mỗi vòng gồm 2 – 3 thể bình Thể bìnhbao gồm một phần cơ bản hình trụ thon dần thành một cổ mỏng Bào tử đínhthường tạo thành dạng chuỗi dài đính trên các thể bình Bào tử chủ yếu hình trụ,đôi khi hình thoi Thành bào tử trơn nhẵn, trong suốt Kích thước bào tử 4,0-7,4 x 1,2-1,7µm Trên môi trường MEA, khuẩn lạc phát triển chậm, ban đầu cómàu trắng sau trở thành màu vàng kem tuỳ theo độ tuổi [39] Năm 2008, các tácgiả Mitsuaki Shimazu và Jun Takatsuka tại viện nghiên cứu các sản phẩm lâm

nghiệp và rừng của Nhật bản đã phân lập thành công loài nấm Isaria javanica trên ấu trùng loài bướm đêm Lymantria dispar Cuống bào tử phân nhánh dạng

vòng ngang mang các thể bình Bào tử cấu thành dạng chuỗi trên các thể bình,bào tử có dạng hình thoi hoặc hình ôvan với kích thước chiều dài và đường kínhlần lượt là 3.0–4.3–6.3 µm ×1.4–2.0–3.2 µm Trên môi trường SDAY, khuẩn lạcsinh trưởng trung bình ở nhiệt độ 10 – 30oC, nhiệt độ tối ưu là 25oC [42] Vàcũng năm 2008, tại Texas các tác giả H. Enrique Cabanillas và Walker A. Jonesđã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường đến sự tăng trưởng của sợi

nấm và khả năng sinh bào tử của nấm Isaria javanica Các tác giả cho thấy trên

môi trường SDAY, nấm sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện 25oC và cho lượng bào

tử nhiều nhất là 1,2 x 108bt/cm2, sinh trưởng chậm nhất ở nhiệt độ 20oC vàngừng sinh trưởng ở nhiệt độ 35 – 40oC [33]

Như vậy nấm Isaria javanica cũng bước đầu có những nghiên cứu cơ bản và có

phân bố rộng, tuy vậy việc ứng dụng nó vào công tác phòng trừ côn trùng gâyhại chưa được tác giả nào đề cập đến

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng phòng trừ sâu hại ở trong nước

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có nguồn đa dạngsinh học cao, nhưng việc nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng cũng như khảnăng phòng trừ của chúng để ứng dụng trong thực tiễn đang còn nhiều hạn chế

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các chế phẩm vinấm gây  bệnh côn trùng ở một số Viện và các Trung tâm khoa học đã được tiếnhành từ những năm 70 của thế kỷ XX Đến những năm 90, công nghệ sản xuấtthành chế phẩm phòng trừ một số sâu hại cây trồng như sâu xanh bướm trắng,sâu tơ hại rau, sâu đo hại đay, rầy nâu hại lúa, châu chấu hại ngô - mía, bọ xíthại nhãn, vải, sùng hại mía, sâu róm hại thông và bọ hại dừa đã dần được hoàn

thiện Đến nay, các chế phẩm phòng trừ dịch hại được sản xuất từ Bb và Ma của

Viện Bảo vệ thực vật Việt Nam với tên thương mại là Boverit và Mat đã trở nênrất quen thuộc và đáng tin cậy với bà con nông dân Tuy nhiên ở nước ta, đến

nay mới chỉ tập trung nghiên cứu và ứng dụng hai loài nấm là Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae

Côn trùng thường bị chết bởi các loại bệnh khác nhau do nhiều loại vi sinhvật khác nhau gây nên như nấm, vi khuẩn, virus, nguyên sinh động vật, tuyếntrùng, bệnh do vi sinh vật gây chết côn trùng có thể chiếm tới 80 – 90% [12].Trong đó nấm gây bệnh côn trùng có vai trò quan trọng trong việc hạn chế sốlượng côn trùng gây hại Chúng được xem là phương thức kiểm soát dịch hại cótính chiến lược

Các công trìch nghiên cứu và sử dụng hai loài nấm trên để phòng trừ sâuhại đã và đang được ứng dụng rộng rãi và tiếp tục nghiên cứu

Ở Hưng Yên, năm 1993 đã sử dụng nấm xanh để phòng trừ sâu đo chỉ sau 7– 10 ngày hiệu quả khoảng 70 – 89% Tại Tiền Giang, Sóc Trăng, Bạc Liêu đã

sử dụng Metarhizium anisopliae để phòng trừ rầy nâu, bọ xít, sâu cắn gié, bọ

cánh cứng hại dừa đạt hiệu quả cao Tại Cần Thơ, từ năm 2005-2007 đã sử dụng

nấm Metarhizium anisopliae để phòng trị sâu ăn tạp, rầy mềm đạt hiệu quả khá

cao trên 70% sau 7-12 ngày [25]

Vụ hè thu năm 2003, tai Hà Tĩnh, sử dụng Beauveria và Metarhizium với

nồng độ 5x108 bào tử/ ml để phòng trừ sâu xanh đục quả đậu xanh cho tỷ lệ chết

là 69,8% đối với Beauveria và 71,7% đối với Metarhizium Sử dụng hai loại

nấm trên để phòng trừ sâu khoang và sâu keo da láng ăn đậu tương DT84 cho tỷ

lệ chết là 61,1% đối với Beauveria và 68% đối với Metarhizium [11] Sử dụng nấm Metarhizium để phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa Brontispa sp ở Hải Phòng

năm 2004, cho tỷ lệ chết ở pha sâu non là 76,5% - 85,8% sau 30 ngày phun và ởpha trưởng thành trong điều kiện nhiệt độ trung bình là 31,1oC, độ ẩm 78,5 –89,6% sau 10 ngày thử nghiệm và 85,4 – 95,4% sau 30 ngày thí nghiệm [18]

Kết quả điều tra từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 5 năm 2008 của Trần NgọcLân và nnk đã thu thập được 690 mẫu nấm ký sinh côn trùng ở VQG Pù Mát -Nghệ An Định loại xác định được 63 loài thuọc 17 giống, 3 bộ nấm ký sinh côn

trùng Trong các giống thu thập được, giống Aschersonia có nhiều loài nhất là

16 loài với 163 mẫu, chiếm 23,62% trong tổng số mẫu thu thập được Giống

Hypocrella có 7 loài với 64 mẫu chiếm 9,28% trong tổng mẫu thu thập Hai

giống này ký sinh chủ yếu trên rầy, rệp thuộc bộ Homoptera Các giống khác cósố loài giao động từ 1 đến 6 loài [12]

Nghiên cứu đặc tính sinh học và hiệu lực diệt côn trùng có hại của nấm

Metarhizium anisopliae Sorokin (Phạm Thị Thuỳ, Ngô Tự Thành, 2005) cho kết

quả như sau: Đối với sâu tơ, sau 8 ngày phun ở 2 nồng độ 2x108 bào tử/ ml và4x 108 bào tử/ ml tỷ lệ sâu chết đạt lần lượt là 72,2% và 83,4% Đối với sâu xanhbướm trắng, tỷ lệ sâu chết đạt thấp hơn, sau 12 ngày phun với nồng độ 3x108bào tử/ ml, tỷ lệ sâu chết đạt 61,8% còn với nồng độ 6x108 bào tử/ml thì tỷ lệ

chết là 70,3% Đối với mối nhà, nấm Metarhizium anisopliae cho hiệu lực

phòng trừ rất cao, tỷ lệ mối chết đạt 100% sau 7 ngày xử lý ở nồng độ 5x108 bàotử/ml [18]

Nguyễn Xuân Thanh, Phạm Thị Thuỳ, nghiên cứu năm 2005 cho biết chế

phẩm nấm Metarhizium anosopliae có khả năng phát triển và ký sinh gây bệnh

trên rệp sáp hại rễ cây cà phê rất tốt trong điều kiện tự nhiên ở Daklak Thínghiệm ở nồng độ dịch bào tử nấm 108 bào tử/ml, phun lên hỗn hợp phân hữu cơxốp bán quanh gốc và giữ ẩm, hiệu quả trừ rệp sau phun 45 ngày đạt 90%, sau

12 tháng đạt trên 70% [16]

Theo kết quả điều tra thực tế ngoài đông ruộng tại ruộng rau cải và cải bắp

thuộc xã Mai Dịch - Từ Liêm – Hà Nội cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm Metarhizium

tự nhiên trên sâu tơ là 5,5 – 6,6%, sâu xanh bướm trắng là 12,5 – 14,5% Trong

điều kiện phòng thí nghiệm, dịch bào tử nấm Metarhizium có hiệu quả diệt sâu

tơ là 83,4% sau 8 ngày phun, sâu xanh bướm trắng là 70,3% sau 12 ngày phun,bọ xít đen là 69,2% sau 15 ngày phun và mối nhà là 100% sau 7 ngày thínghiệm Trong điều kiện chậu vại, sâu tơ là 60 – 76% sau 12 ngày xử lý [19] Sử

dụng nấm Metarhizium để phòng trừ mối nhà Coptotermes formosanus Shizaki

cho tỷ lệ chết là 88% ở hàm lượng chế phẩm 0,005; 92% ở hàm lượng 0,01;96% ở hàm lượng 0,02 trong điều kiện phòng thí nghiệm rắc trên mặt đất cho tỷlệ chết là 86,9% ở hàm lượng 0,005; 91,3% ở hàm lượng 0,01; 96% ở hàmlượng 0,02 [5]

Nấm Metarhizium được dùng để phòng trừ bọ nhảy ở nồng độ trong điều

kiện phòng thí nghiệm cho tỷ lệ chết và mọc nấm theo mức tăng của nồng độ vàthời gian xử lý Ở nồng độ 3% bào tử/ml tác giả thu được 22,22% số bọ nhảy bịchết và 16,05% số bọ nhảy mọc nấm sau 7 ngày phun Nồng độ 5% bào tử/ml có30,86% số bọ nhảy chết và 23,46% bọ nhảy mọc nấm Nồng độ 7% bào tử/mlcho tỷ lệ chết là 33,33% với tỷ lệ mọc nấm là 25,93% Tác giả Đinh Thị Hiền xử

lý nấm Metarhizium sp Trên sâu non bọ nhảy thu được kết quả khả quan hơn rất

nhiều so với trưởng thành: Nồng độ 3% bào tử/ml cho tỷ lệ chết là 62,96%, tỷ lệmọc nấm là 42,42%; nồng độ 7% bào tử/ml cho tỷ lệ chết là 70,37%, tỷ lệ mọcnấm là 62,96% [7] Bên cạnh đó Đinh Thị Hiền còn dùng nấm Metarhizium sp

để phòng trừ sâu tơ trong điều kiện nhiệt độ phòng bán tự nhiên trung bình là22,5oC, ẩm độ trung bình là 82,5% cho kết quả rất khả quan Nồng độ 2x108 bàotử/ml cho tỷ lệ chết 50%, tỷ lệ mọc nấm là 20,99% Nồng độ 4.108 bào tử/ml cótỷ lệ chết là 66,67%, tỷ lệ mọc nấm là 30,77% Nồng độ 6.108 bào tử/ml cho tỷlệ chết là 71,79%, tỷ lệ mọc nấm là 39,74%; Tất cả các số liệu trên đều theo dõitrong 7 ngày [7]

Phan Văn Khang (2007) sử dụng Metarhizium sp phòng trừ sâu tơ cho tỷ lệ

chết 66,67% và tỷ lệ mọc nấm là 33,33% ở nồng độ 8.108 bào tử/ml sau 7 ngàytheo dõi [3]

Trường đại học Cần Thơ đã đưa ra 3 loại nấm Metarhizium, Paecilomyces, Verticillium vào nuôi cấy và chế thành chế phẩm sinh học phun trên cây trồng

để diệt trừ côn trùng gây hại Sau 2 năm thử nghiêm, nấm Metarhizium cho kết

quả: diệt được từ 50% trở lên đối với ấu trùng sâu ăn tạp trên hoa màu; 80% rầymềm trên bí, dưa; 80% bộ cánh cứng phá hại trên dừa Nấm Paecilomyces vàVertcillium diệt được 70% ấu trùng sâu bệnh gây hại nhiều loại cây trồng

Vào cuối năm 2006, khi dịch rầy nâu bùng phát khắp nơi tại Đồng BằngSông Cửu Long, gây ra bệnh vàng lùn - lùn xoắn lá đã làm giảm thiệt hại đếnnăng xuất đáng kể của người dân trồng lúa, dịch rầy nâu bùng phát Trong thờigian này Tổ Phòng trừ Sinh học của Bộ môn Bảo vệ Thực vật Trường Đại họcCần Thơ đã được Dự án Nâng cao Chất lượng Cây trồng Vật nuôi của Tỉnh SócTrăng hỗ trợ kinh phí, và kết hợp với Chi cục Bảo Vệ Thực Vật Sóc Trăng đãcải tiến và đưa ra quy trình sản xuất chế phẩm nấm xanh từ gạo do chính nôngdân sản xuất để phun xịt phòng trị rầy nâu gây hại lúa Với diện tích phun xịthơn 500 ha đã giảm mật độ đáng kể của rầy nâu trên ruộng lúa

Ngoài ra nấm Metarhizium anosopliae còn được ứng dụng trong phòng trừ

bọ xít hại cây trồng Sau 10 ngày thí nghiệm ở nồng độ 9x109 bào tử/ml, tỷ lệ bọxít non hại nhãn vải chết đạt 72,5%, bọ xít xanh hại lúa chết đạt 53,2% và bọ xítđen hại lúa chết 43,8% [5]

Cùng với Phạm Thị Thuỳ thì Tạ Kim Chỉnh cũng là tác giả của nhiều đề tài

được công bố và đã được ứng dụng vi nấm thuộc giống Paecilomyces, Metarhizium và Beauveria diệt trừ mối Mới đây nhất, trung tâm nghiên cứu

phòng trừ mối đã cho ra đời ba chế phẩm Metavina 90DP, Metavina 10DP và

Metavina 80LS từ Metarhizium cùng thực hiện một mục tiêu chung là diệt trừ

mối tận gốc mà không gây độc hại, giá thành lại rẻ so với các phương pháp

trước đây, đó là ứng dụng các kết quả nghiên cứu của nấm Metarhizium đối với mối Các chế phẩm phòng phòng trừ dịch hại được sản xuất từ Bb và Ma của

Viện Bảo vệ thực vât Việt Nam với tên thương mại là Boverit và Mat đã dần trởnên quen thuộc và đáng tin cậy với bà con nông dân

Tại Nghệ An và Hà Tĩnh cũng đã có những nghiên cứu và ứng dụng chế

phẩm từ Beauveria trong diệt trừ sâu róm hại thông nhưng kết quả chưa cao

Có thể nói, việc nghiên cứu và sử dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòngtrừ sâu hại cây trồng vẫn là hướng nghiên cứu khá mới lạ và ít được quan tâm ở

nước ta Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở một số nấm như Beauveria, Metarhizium và Paecilomyces Mặc dù vậy, những kết quả nghiên cứu đó đóng

vai trò rất lớn, đã mở ra một hướng đi mới trong công tác diệt trừ côn trùng gâyhại, bảo vệ được cây trồng và thực sự “thân thiện với môi trường”

Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu từ tháng 2/2011 đến tháng 11/2011

 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm thu thập mẫu nấm: tại vườn quốc gia Pù Mát

- Địa điểm thu thập sâu hại: tại Nghi Lộc, Hưng Đông, Hưng Nguyên

- Địa điểm phân lập, nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng được tiến hành tạiphòng công nghệ nấm ký sinh côn trùng

- Địa điểm tiến hành các thí nghiệm sử dụng chế phẩm từ nấm Isaria javanica để phòng trừ sâu hại được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ

nấm ký sinh côn trùng và trại thực nghiệm nông học

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Nấm ký sinh côn trùng Isaria javanica

Giới: Nấm - T.l Jahn & F.f Jahn, 1949 Ex R.t Moore, 1980 – Fungi Giới phụ: Dikarya - D.s Hibbett Et Al., in D.s Hibbett Et Al., 2007

Ngành: Ascomycota - H.c Bold, 1957 Ex T Cavalier-Smith, 1998 - Sac Fungi

Ngành phụ: Pezizomycotina - O.e Eriksson & K Winka, 1997

Lớp: Ascomycetes - (Tehler, 1988) Ex O.e Eriksson & K Winka, 1997

Lớp phụ: Eurotiomycetidae - Tehler, 1988 Ex D.m Geiser & F Lutzoni, 2007

Bộ: Onygenales - Cif., 1957 Ex Benny & Kimbr., 1980

Họ: Clavicipitaceae - Berk., 1857

Giống: Isaria

Tên khoa học: Isaria javanica – Luangsa-ard, J.J.; Hywel-Jones, N.L.;

Manoch, L.;Samson, R.A., 2005, Mycological research 109(5): 588 [38].

2.2 2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài sâu hại

2.2.2 1 Đặc điểm sinh học, sinh thái sâu khoang (Spodoptera litura F.)

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) thuộc họ Ngài đêm

(Noctuidae) bộ Cánh vảy (Lepidoptera) Đây là loài phân bố rộng ở các nướcChâu Âu, Châu Mỹ, Châu Á, Bắc Phi

Để hoàn thành vòng đời, sâu khoang trải qua 4 pha phát triển:

Ngài thân dài 16 – 21 mm, sải cánh 37 – 42 mm, cánh trước màu nâuvàng, phần giữa từ mép cánh trước tới mép cánh sau có một vân ngang rộngmàu trắng, trong đường vân trắng có hai đường vân màu nâu, cánh sau màu nâuloáng, phản quang màu tím

Trứng hình bán cầu, đường kính 0,5 mm bề mặt trứng có những đườngkhía dọc từ đỉnh xuống đáy trứng và những đường khía ngang tạo nên những ônhỏ Trứng mới đẻ có màu vàng sau chuyển sang màu xám, sắp nở có màu xám.Trứng đẻ thành từng ổ, bên ngoài được phủ bằng lớp lông màu nâu vàng

Sâu non đẩy sức dài 38 - 51 mm, có màu nâu đen hoặc nâu tối, một số ítcó màu xanh lục Vạch lưng và vạch phụ lưng có màu vàng, trên mỗi đốt dọctheo vạch lưng có vệt đen hình bán nguyệt, vệt ở đốt bụng thứ nhất và thứ támlớn nhất

Nhộng dài 18 - 20 mm hình ống tròn, màu nâu tươi hoặc nâu tối Méptrước đốt bụng thứ tư và vòng quanh các đốt bụng thứ năm, sáu, bảy có nhiềuchấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn

Trong 4 pha phát triển của sâu khoang thì ở pha sâu non chúng gây hạimạnh nhất Sâu non tuổi nhỏ tập trung thành từng đám gặm ăn lá, chừa lại biểubì trên và gân lá Khi sâu lớn thì ăn phân tán, ăn thủng lá chỉ trừ lại gân lá, cóthể cắn trụi hết lá, cành, hoa, chui vào đục khoét trong quả, nụ hoa,… Khi sâukhoang phát sinh thành dịch chúng gây thiệt hại đáng kể cho cây trồng Rau ănlá thì bị giảm sút sản lượng và giá trị sản phẩm, với cây lấy quả như cà chua thì

hoa nụ bị hại sẽ rụng, quả cũng sẽ rụng sớm hoặc bị thối khi trời mưa Sâukhoang phát sinh thành dịch gây nhiều thệt hại đáng kể cho cây trồng, nó có thểlàm cho cây trồng bị chết (khi cây còn nhỏ) ảnh hưởng tới mât độ cây trồng trênmột đơn vị diện tích Cây bị sâu khoang cắn phá lá không những làm giảm khảnăng quang hợp cho cây mà còn làm mất đi một khối lượng sản phẩm có giá trị(những cây thu hoạch lá) Đối với những cây bị sâu khoang cắn phá nụ hoặc đụcphá quả cũng gây nhiều tác hại tương tự Hoa, nụ bị hại thì quả cũng bị rụngsớm hoặc không đậu quả, thối, kém phẩm chất.

Ở Việt Nam thời tiết khí hậu rất thuận lợi cho sự phát triển của sâukhoang Song sâu khoang thường phát sinh phổ biến, gây hại nặng vào các tháng4-10 (tháng nóng ẩm), dịch sâu khoang thường xuất hiện từ tháng 5-6, ở cáctháng khác có thể gây hại tuỳ mức độ nặng nhẹ khác nhau, tuỳ thuộc vào thờitiết, cây trồng của từng địa phương Sâu khoang có phạm vi ký chủ rộng nhưngsâu thường xuyên xuất hiện và gây hại nặng trên cây lạc [17]

Ở Nghệ An, sâu khoang phát sinh ngay từ đầu tháng 3 (20-30 ngày saugieo) trên trà lạc xuân ra hoa với mật độ tương đối cao, trung bình 9-12 con/m2,nơi cao đến 40 con/m2 Sau đó tiếp tục phát sinh lứa mới gây hại trên nhiều diệntích rộng hơn ở hầu khắp các vùng trồng lạc khắp toàn tỉnh Tổng diện tíchnhiễm trong tháng 4 là 3000 ha với mật độ trung bình từ 5-7 con/m2, nơi cao 10-

15 con/m2, cục bộ tại huyện diễn Châu Nghệ An, Nghi Lộc lên đến 50 con/m2

Vụ đông xuân 2002, ở Nghệ An có 4129 ha lạc bị sâu khoang gây hại (chiếm21%), trong đó có 1520 ha bị hại nặng Vụ Đông Xuân 2003, tỷ lệ này tươngứng là 4880 (24,78%) và 1285 ha Vụ hè thu diện tích trồng lạc ít hơn (khoảng

3317 ha/cả tỉnh) nhưng tỷ lệ bị hại trung bình 24 - 25% [17]

Sâu khoang (Spodoptera litura F.) là một đối tượng gây hại chính, phổ

biến và nguy hiểm trên các vùng trồng hoa màu ở Nghệ An cũng như trong cảnước Đây cũng là loài sâu hại có khả năng quen thuốc rất cao Theo Hồ Khắc

Tín sâu khoang là loài gây hại quan trọng nhất trên cây lạc chúng có thể gây hại

từ 70-80% diện tích lá và phát triển thành dịch ở nhiều vùng trồng lạc ngoài câylạc chúng cũng phá hại nhiều loài cây trồng khác Là 1 trong 10 loài gây hạiphổ biến trên đậu tương và đã gây hại thành dịch ở những vùng trồng đậu tương[22] Để đảm bảo năng lực cây trồng bà con không ngừng sử dụng thuốc hoáhọc để phòng trừ sâu khoang

2.2.2.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của rệp muội (Aphis)

Rệp muội (Aphididae) là nhóm côn trùng chích hút có tác hại rất lớn và

sâu xa đến năng lực và phẩm chất nhiều loại cây trồng thông qua việc gây hạitrực thiếp cũng như vai trò là môi giới truyền bệnh virus của chúng

Họ rệp muội là họ lớn nhất trong tổng họ Aphididae thuộc Bộ cánh giống(Homoptera) được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu TheoVan Emden, H.E (1972) trên thế giới có 3805 loại rệp muội gây hại trên tất cảcác loài cây trồng tự nhiên Đến năm 1976 Ghosh A K đã công bố trên thế giớicó hơn 4000 loài rệp muội đã được mô tả, trong đó vùng Đông Nam Á có hơn

1000 loài và có đầy đủ các nhóm trong tổng họ Aphidoide (Blackman và Eastop,1984)

Theo kết quả điều tra có tới 2500 loài rầy xanh, rệp phá hoại lạc và trên

hầu hết các loại cây trồng Tại Ấn Độ loài Empoasca kerri (Pruthi) là loài sâu hại lạc và cây trồng nông nghiệp quan trọng Ở Mỹ loài E fabae là loài gây hại

có vai trò kinh tế cho các vùng trồng lạc và cây trồng nói chung ở phía Nam Ở

Châu Phi là loài E dolichi (Paoli), Orosius argentatus là loài có vai trò quan

trọng bởi nó chính là vector truyền các bệnh virus cho cây trồng

Ranga Rao và Wightman cho biết sâu chích hút họ bọ rầy (Jasidae) có thểtruyền 14 loại virus khác nhau, họ rệp muội (Aphididae) truyền 48 loại viruskhác nhau, họ Aleyrodidae truyền 18 loại chúng gây các bệnh nguy hiểm cho

cây trồng nông nghiệp.Mỗi con rệp trung bình một ngày hút được lượng nhựacây gấp 8 - 10 lần trọng lượng cơ thể chúng [4].

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần rệp muội của Quách Thị Ngọ(2002), trong 5 năm 1996 - 2000 đã điều tra trên 30 loại cây trồng, thu thập được

45 loài rệp muộivà đã xác định tên được 32 loài thuộc 5 họ phụ Trong số cácloài đã xác định được tên thì hầu hết thuộc họ phụ Aphididae với 28 loài chiếm

90%, trong đó có 7 loài rất phổ biến: Aphis craccivora Koch, Aphis glycines Mats trên cây họ Đậu; Aphis gossypii Glover trên nhiều loại cây như dưa chuột, bông, cam, quýt, bầu bí, hoa thược dược ; Maidis trên cây ngô; Brevicoryne brasiceae Linnaeus trên các cây rau hoa thập tự, rệp đào Myzus persicae Sulzer

trên nhiều loại cây trồng như rau hoa thập tự, khoai tây, thuốc lá,…Trên cây rau

họ Thập tự đã thu được nhiều loài như : Aphis craccivora Koch, Aphis gossypii Glover, Brevicoryne brasiceae Linnaeus, Myzus persicae Sulzer Trong 4 loài này thì Aphis craccivora Koch và Aphis gossypii Glover gây hại không đáng kể

[13]

Nguyễn Quốc Cường, Bùi Tuấn Việt và ctv (2008) đã nghiên cứu vềphòng trừ sinh học rệp muội trên cây rau thập tự trong 2 vụ liên tiếp: Vụ Đôngvà Vụ Đông Xuân Qua nghiên cứu các tác giả cho biết: rệp muội có khả năngphát tán di chuyển và sinh trưởng phát triển nhanh trong một thời gian ngắn.Trong cùng 1 công thức, rệp muội xuất hiện sớm trên cây rau ngay từ giai đoạncây con, sau đó mật độ rệp tăng dần và đạt đỉnh cao thứ nhất là 137 con/ m2 Mậtđộ rệp liên tục có sự biến động theo thời gian và đạt đỉnh cao thứ hai là 313,8con/m2 Cuối vụ rau mật độ rệp tăng cao với 660.4 con/m2 [2]

2.2.2.3 Đặc điểm sinh học, sinh thái của sâu xanh bướm trắng(Pieris rapae L.)

Đặc điểm sinh học

Sâu xanh bướm trắng là loài côn trùng thuộc loại biến thái hoàn toàn trảiqua 4 pha phát dục: Trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành trong đó pha sâu noncó 5 tuổi Trứng được đẻ rải rác rời rạc từng quả và thường ở mặt dưới của lá, sovới trứng của các loài sâu hại khác thì trứng của sâu xanh bướm trắng khá lớn.

Từ đỉnh có các khía hình quả khế kéo dài xuống cuối quả trứng, giữa các khía cócác vân nối tạo thành các hình ô lưới

Trứng mới đẻ có màu vàng nhạt, đến khi gần nở chuyển sang màu vàngđậm và phía trên đỉnh trứng xuất hiện chấm đen Hình dạng của trứng đôi khiđược mô tả như hình viên đạn

Sâu non có màu xanh đặc trưng của màu xanh lá rau ( rau cải xanh, cảibắp, ) Cơ thể sâu bao phủ nhiều lông , số lượng và màu sắc của lông phụthuộc vào các giai đoạn phát dục của sâu non Dọc sống lưng từ gáy kéo dàixuống hậu môn có một đường vân màu vàng mờ, cơ thể có 13 đốt, mỗi đốt thâncó một chấm vàng và chấm đen xen lẫn ở dọc hai bên hông Sâu non có 5 cặpchân giả, hoạt động chậm chạp và ít di chuyển nhưng bám rất chắc vào lá cây.Cấu tạo phần phụ miệng của sâu non theo kiểu gặm nhai Nhộng sâu xanh bướmtrắng thuộc nhộng màng, khi mới hoá nhộng có màu xanh lá cây sau đó chuyểnsang màu xanh hơi vàng, gần vũ hoá có màu nâu xám hoặc màu xám đen lộ rõ 2cánh và các vệt đen trên cánh Hình dạng của nhộng được mô tả như chiếc tàungầm, phần đầu và phần cuối thuôn nhọn Phía trên lưng nhô lên và nhọn, haibên cánh xếp lại với nhau trông như mạn thuyền, phía dưới bụng nhộng có mộtđường vân kéo dài từ đầu nhộng đến cuối hậu môn, ở giữa phần bụng nhộng cóhai mấu gai nhọn đối xứng hai bên qua đường vân Trong quá trình hình thànhnhộng, sâu nhả tơ mỏng để dính kết nhộng và thân (lá) cây

Sâu xanh bướm trắng trưởng thành có kích thước khá lớn Cơ thể hầu hếtmàu trắng, phía đỉnh cánh trước phủ phấn đen, phần lưng ngực màu đen Trưởng

thành có 3 cặp chân, mắt hình cầu nhô ra, râu đầu hình dùi đục có khoang đentrắng [9].

Đặc điểm sinh thái

Bướm hoạt động ban ngày, thường bay lượn và hút mật hoa, giao phối

và đẻ trứng vào buổi sáng Hoạt động mạnh nhất vào buổi sáng (từ 7h - 10h) vàbuổi chiều (3h - 6h) Hoạt động giao phối và đẻ trứng thường diễn ra vào buổisáng kéo dài khoảng 2 -3 h Trứng đẻ rải rác ở mặt dưới lá rau Mỗi bướm cái đẻvào khoảng 120 - 140 trứng [15] Sâu non có 5 tuổi, hoạt động rất chậm chạp,nhưng bám vào lá rất chắc.Thời gian hoá nhộng của sâu tuổi 5 thường kéo dàitrong khoảng 12h - 24h còn hoạt động vũ hoá của nhộng thì diễn ra rất nhanh (2-5 phút) Khi ruộng rau mới trồng sâu thường chui vào phần ngọn cây làm các lákhi lớn bị cong queo, thủng lỗ chỗ [8]

Trong năm, sâu xanh bướm trắng thường có 15 đỉnh cao mật độ Quần thểsâu đạt đỉnh cao mật độ vào tháng 9 – 10 hại xu hào, bắp cải vụ Đông Xuân sớmvà vào các tháng 2 – 5 hại rau vụ Xuân muôn Mật độ sâu phát sinh trên đồngruộng có liên quan chặt chẽ với nhiệt độ, độ ẩm không khí và lượng mưa Mưaphùn nhẹ hoặc độ ẩm cao kết hợp với nhiệt độ 25 – 28 0C và có nắng nhẹ là điềukiện thuận lợi cho sâu xanh bướm trắng phát triển và gây hại nặng trên rau họhoa Thập tự [23]

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập và nhân nuôi nấm trên môi trường PDA

2.3.1.1 Phương pháp phân lập

Sau khi thu thập nấm trong môi trường tự nhiên thì tiến hành phân loại sơ bộloài Các loài được định loại dựa vào đặc điểm hình thái bên ngoài, màu sắc, cấutrúc của dạng sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Cũng có thể phân loại theocôn trùng bị nhiễm nấm Tiến hành quan sát bào tử để định dạng chính xác Dựa

vào cấu trúc bào tử (kích thước và hình dạng), quả thể, sợi nấm và màu sắc ởbên ngoài.

Phân lập nấm ký sinh côn trùng theo phương pháp của Goettel và Inglis

(1997) và nhân nuôi sơ cấp chủng nấm Isaria javanica trên môi trường PDA

theo phương pháp của Brown và Smith và Luangsa-ard J.J và cs (2005)

Từ mẫu nấm gốc đã thu thập được tiến hành phân lập trên môi trường PDA.Mỗi đĩa môi trường tiến hành cấy 3 – 5 điểm

Từ các đĩa petri đã được phân lập thành công tiến hành cấy chuyển sangnhiều đĩa môi trường PDA để theo dõi khả năng sinh trưởng, phát sinh bào tử vàlàm nguyên liệu để nhân nhanh sinh khối trên các môi trường rắn

Mỗi đĩa petri tiến hành cấy 5 điểm đều nhau

Các thao tác được tiến hành một cách vô trùng và được tiến hành trongbuồng cấy vô trùng

Các đĩa đã được cấy nấm được nuôi trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC, ẩm độ75% RH

2.3.1.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường PDA

Phương pháp chuẩn bị môi trường theo Nguyễn Xuân Thành và cs[24]

* Chuẩn bị môi trường PDA:

- Thành phần: Khoai tây (potato): 200g

Dextrose (Glucose): 20 gam

+ Lọc lấy dịch nước khoai tây (qua vải lọc), cho lượng agar,đường đã cân vào khuấy đều, cho thêm nước cất để đủ 1000ml Đun sôi và đemhấp tiệt trùng ở 121oC (1,5atm) trong thời gian 30 phút Để nguội tới 55 – 60oCtrước khi phân phối vào các dụng cụ phân lập hay nuôi cấy.

* Đổ môi trường PDA ra các đĩa petri

Các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt trùng

Thao tác đổ thạch phải hết sức khẩn trương, khéo léo và được tiến hành trong tủ

vô trùng nhằm hạn chế sự nhiễm khuẩn

- Đổ môi trường vào đĩa, đậy nắp đĩa, để đông tự nhiên

- Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm

- Sau khi đổ môi trường vào đĩa pêtri, 1 - 2 ngày sau khi kiểm tra lại xem môitrường có bị nhiễm khuẩn không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập

- Viết vào nhãn: Tên môi trường

Khử trùng ngày tháng năm

- Để vào nơi cất giữ môi trường để tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản

2.3.2 Phương pháp nhân sinh khối nấm trên các môi trường rắn

Tiến hành nhân sinh khối nấm trên các môi trường rắn theo 3 công thứcsau:

CT1: Cám gạo, bột mì, nước, trấu theo tỉ lệ 3:1:2:1

CT2: Cám gạo, bột ngô, nước, trấu theo tỉ lệ 3:1:2:1

CT3: Cám gạo, nước, trấu theo tỉ lệ 4:2:1

Hỗn hợp của từng công thức được cho vào bình thuỷ tinh, được đậy nắpkín, mỗi bình cho 100g môi trường (tương đương 1/3 thể tích bình)[21]

Với mỗi công thức tiến hành lặp lại 3 lần

Các bình môi trường được hấp trong 60 phút ở điều kiện 121oC

Sau khi hấp môi trường xong lấy ra để nguội