Thực nghiệm khả năng sinh trưởng của cordyceps sp1 trên môi trường lên men xốp và hạt ngũ cốc

trên bề mặt môi trường nước đậu nành ở các mức thể tích khác nhau 44 3.5 Khả năng phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1.. trên các độ dày môi trường nước đậu nành sau 12 ngày nuôi 45 3.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ

- -THỰC NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA Cordyceps sp1 TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN XỐP VÀ HẠT NGŨ CỐC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY

VINH - 1.2009 LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này làhoàn toàn trung thực, có được qua các thí nghiệm do bản thân tiến hành và chưatừng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong khóa luận đã đượcchính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Công nghệ sinh họcNông nghiệp và phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật, khoa Nông Lâm Ngư, trườngĐại học Vinh với sự đồng ý và hướng dẫn của PGS TS Trần Ngọc Lân - giáo viênhướng dẫn và các kỹ thuật viên phụ trách phòng thí nghiệm

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh, ngày 12 tháng 12 năm 2008 Tác giả

Cao Thị Thu Dung

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình tiến hành làm khóa luận tốt nghiệp ngành kỹ sư Nônghọc, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía các thầy cô giáo, bạn bè,người thân…

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lờicảm ơn tới PGS TS Trần Ngọc Lân, người đã dìu dắt và hướng dẫn cho tôi từnhững bước đầu tiên làm quen với nghiên cứu khoa học, là người thầy đã rất tậntâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo trong tổ bộmôn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệm

đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như những sự hướng dẫn, giúp đỡ vàgóp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, họ hàng vàtất cả bạn bè, những người đã có sự hỗ trợ thiết thực cho tôi cả về mặt tinh thần,vật chất và công sức để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận của mình

Xin chân thành cảm ơn

Vinh, ngày 12 tháng 12 năm 2008 Tác giả

Cao Thị Thu Dung

iii

1 Sự cần thiết và ý nghĩa của nghiên cứu ứng dụng Cordyceps 1

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Cordyceps trên thế giới 111.2.1 Nghiên cứu các loài nấm ký sinh côn trùng nhóm Cordyceps 11

1.2.3 Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm từ Cordyceps 13

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam 16

1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps 17

1.4 Nhân nuôi sinh khối nấm ký sinh côn trùng 18

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.4.3 Phương pháp xác định số lượng bào tử Cordyceps 27

2.6.1 Trang thiết bị dùng để thu thập nấm ký sinh côn trùng 332.6.2 Trang thiết bị dùng để phân lập và nhân nuôi nấm ký sinh côn 33

iv

2.6.3 Các hoá chất và nguyên liệu để pha chế môi trường 34

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Đặc điểm hình thái nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1 37

3.2 Sự sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1 trên môi

3.2.2.2 Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến khả năng phát sinh

bào tử của Cordyceps sp1.

42

3.3. Khả năng sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1 trên

môi trường nước đậu nành

43

3.3.1 Ảnh hưởng của độ dày môi trường đến sự sinh trưởng và phát

triển của nấm Cordyceps sp1.

trưởng của nấm Cordyceps sp1 trên môi trường lên men xốp

47

3.4.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng phát sinh

bào tử của nấm Cordyceps sp1 trên môi trường lên men xốp

50

3.5 Sự sinh trưởng, phát triển của Cordyceps sp1 trên hạt ngũ cốc 513.5.1 Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1 trên hạt ngũ cốc 513.5.2 Khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1 trên các loại hạt

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

Bảng Tên bảng Trang

3.1 Sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1 trên môi

trường PDA theo thời gian

39

3.2 Ảnh hưởng của độ dày môi trường lên sự sinh trưởng của nấm

Cordyceps sp1 trên môi trường PDA

40

3.3 Nồng độ bào tử của nấm Cordyceps sp1 ở các độ dày môi

trường PDA khác nhau

42

3.4 Khả năng sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1 trên bề mặt môi

trường nước đậu nành ở các mức thể tích khác nhau

44

3.5 Khả năng phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1 trên các độ

dày môi trường nước đậu nành sau 12 ngày nuôi

45

3.6 Khả năng tăng trưởng về độ dày của hệ sợi nấm trên bề mặt

môi trường nước đậu nành ở 3 mức thể tích sau 12 ngày nuôi

3.9 Nồng độ bào tử của Cordyceps sp1 trong môi trường lên men

xốp có các thành phần dinh dưỡng khác nhau

1.1 Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn trùng 6

2.2 Trang thiết bị dùng để thu thập EPF ngoài tự nhiên 33

vii

2.3 Thiết bị dùng để phân lập và nuôi cấy nấm ký sinh côn trùng 33

lỏng ở các thể tích khác nhau

44

3.8 Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên bề mặt môi trường lên men

xốp

48

3.9 Độ ăn sâu của hệ sợi nấm vào trong khối môi trường lên men xốp 483.10 Tỷ lệ sợi nấm trên thể tích khối môi trường lên men xốp 483.11 Nuôi cấy Cordyceps sp1 trên môi trường lên men xốp 513.12 Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm trên bề mặt môi trường hạt ngũ

cốc

54

3.13 Độ ăn sâu của hệ sợi nấm vào trong khối môi trường hạt ngũ cốc 543.14 Tỷ lệ sợi nấm trên thể tích khối môi trường hạt ngũ cốc 543.15 Sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1 trên 5 loại hạt ngũ cốc 56

MỞ ĐẦU

1 Sự cần thiết và ý nghĩa của nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng

Cordyceps

Cordyceps là một giống nấm ký sinh côn trùng thuộc lớp nấm túi

(Ascomycetes), bộ Clavicipitales, họ Clavicipitaceae Tất cả các loài Cordyceps

ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh trên các

loài nấm khác Loài được biết đến nhiều nhất của giống là Cordyceps sinenesis

-nấm phát sinh trên sâu bướm thực vật, một thành phần quý giá trong các vị thuốc

cổ truyền của Trung Hoa (http://en.wikipedia.org) [61]

Trên thế giới hiện có 400 loài của giống nấm Cordyceps đã được mô tả,

trong khi đó ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài, nhưng cho đến nay mới chỉ tập

trung nghiên cứu 2 loài (Cordyceps sinensis (Beck.) Sacc - Đông trùng Hạ thảo

và Cordyceps militaris (L ex Fr.) Link - Nhộng trùng thảo)

(http://www.sgtt.com.vn) [21]

viii

Giống nấm Cordyceps là một giống đặc biệt, có nhiều ứng dụng để sản xuất

các hoạt chất sinh học, sản xuất thuốc chữa bệnh, các thực phẩm chức năng tăngcường sinh lực của con người

Các nghiên cứu y học và dược học đã chứng minh nấm ký sinh côn trùng

loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) có tới 25 tác dụng về các chức

năng và bệnh thuộc thận, huyết áp, tim mạch, miễn dịch, nội tiết tố, ung thư, anthần… (Nguyễn Lân Dũng, 2005) [11]

Các nghiên cứu phân tích hóa sinh cho thấy trong sinh khối (biomass) của

nấm ký sinh côn trùng, như Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có 17 axit

amin khác nhau, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na…), các loại vitamin(như vitamin B12, A, C, B2…) và quan trọng nhất là có nhiều chất hoạt tính sinhhọc có giá trị dược liệu thần kỳ (như HEAA - Hydroxy ethyl adenosine analogs,cordyceptic acid, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl - adenosine,…) [10] Loài

nấm ký sinh côn trùng Cordyceps unilateralis có các dẫn xuất của napthoquinone

có hoạt tính sinh học cao như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4 O methyl erythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrosstominol và đặc biệt

là 3,5 β trihydrooxy 6 methoxy 2 (5 oxyohexa 1,3 dienyl) 1,4 naphthoquinone được xem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét(malaria) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [18, tr 1 - 2]

-Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên sinh học đa dạng cao vàphong phú Về thực tiễn (Đề tài B2007 - 27 - 25) cho thấy, ở Vườn Quốc gia PùMát nhóm nấm ký sinh côn trùng có tính đa dạng về thành phần và nguồn lợi, có

những loài đặc hữu có chứa các hoạt chất sinh học cao thuộc nhóm Cordyceps

(Trần Ngọc Lân và cộng sự, 2008) [18]

Đối với Việt Nam, công nghệ nấm ký sinh côn trùng là một lĩnh vực rất mới,đặc biệt đối với các loài nấm ký sinh côn trùng có các hoạt chất sinh học và dùnglàm dược liệu Cho đến nay ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu

ứng dụng nấm ký sinh côn trùng như Beauveria và Metarhizium, trong tự nhiên

còn rất nhiều loài nấm ký sinh côn trùng chúng ta chưa được biết đến Nghiên cứu

ix

ứng dụng nấm ký sinh côn trùng rất cần những công nghệ như phân lập, phân loạinấm ký sinh côn trùng, chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học cao và công nghệnhân nuôi trên môi trường lên men rắn và lên men lỏng.

Tháng 1 năm 2008, nhóm nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và ứngdụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Vinh (CRABTA - VU)

đã thu thập được trên lớp đất mặt của rừng nguyên sinh thuộc Vườn quốc gia Pù

Mát - Nghệ An mẫu nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1 ở độ cao 800 - 1000 m

so với mực nước biển

Qua nghiên cứu cho thấy rằng, loài Cordyceps sp1 có những điểm giống

và cũng có những điểm không giống với loài Cordyceps sinensis (Đông trùng

-Hạ thảo) của Trung Quốc

Việc tiến hành thu thập và tìm ra được mẫu nấm Cordyceps sp 1 đã mang

đến triển vọng mới, hứa hẹn ở các nghiên cứu một “Đông trùng - Hạ thảo” của

Việt Nam Tuy nhiên, để chứng minh được tác dụng của Cordyceps sp1 thông

qua các chất có hoạt tính sinh học cao và đi đến một sự định loại cuối cùng đòihỏi phải tiến hành rất nhiều nghiên cứu, nhiều phân tích tỉ mỉ Trong khi đó, sau

nhiều đợt thu thập thì mẫu vật Cordyceps sp1 có được vẫn mới chỉ dừng lại ở

con số là một mẫu Chính vì vậy, những nghiên cứu ban đầu nhằm tìm ra phương

pháp nhân nhanh sinh khối nấm Cordyceps sp1 để phục vụ cho các nghiên cứu

sâu hơn là hết sức cần thiết Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:“Thực

nghiệm khả năng sinh trưởng của Cordyceps sp1 trên môi trường lên men xốp và hạt ngũ cốc”.

2 Mục đích nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng,

phát triển của nấm Cordyceps sp1 trên các loại môi trường khác nhau, từ đó tìm

ra loại môi trường và phương pháp nhân sinh khối thích hợp nhất để nhân nhanh

sinh khối nấm Cordyceps sp1 phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn.

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu

x

Loài Cordyceps sp1 được nhóm nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và

ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Vinh (CRABTA VU) thu thập trên đất mặt của rừng nguyên sinh thuộc vườn Quốc gia Pù Mát -Nghệ An vào tháng 1 năm 2008

- Phạm vi nghiên cứu

Các thí nghiệm chỉ tập trung nghiên cứu về khả năng sinh trưởng, phát triển

và sự phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1 Các nghiên cứu được tiến hành

tại vườn Quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An và phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật,phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư,trường Đại học Vinh trong thời gian từ tháng 1 năm 2008 đến tháng 12 năm2008

 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành với các nội dung như sau:

1 Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1 trên

các độ dày môi trường PDA khác nhau

2 Thử nghiệm khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1.

trên môi trường nước đậu nành

3 So sánh khả năng sinh trưởng phát triển của nấm Cordyceps sp1 trên

môi trường lên men xốp với các thành phần cơ chất khác nhau

4 So sánh khả năng sinh trưởng phát triển của nấm Cordyceps sp1 trên các

loại hạt ngũ cốc

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn loài nấm ký sinh

côn trùng Cordyceps sp1., đồng thời cung cấp những dẫn liệu về nhân sinh khối

các loài nấm dược liệu cho khoa học nấm ký sinh côn trùng Việt Nam

xi

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học

1.1.1 Nấm ký sinh côn trùng

“Nấm ký sinh côn trùng - Entomology pathogenic fungi (EPF)” hay “nấmcôn trùng - Insect fungi” là khái niệm được các nhà khoa học sử dụng như là mộtthuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật (nấm) ký sinh gây bệnh cho côntrùng

Nấm ký sinh côn trùng vừa là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao (trênthế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó ở Thái Lan có khoảng 70000 -

150000 loài nấm và 2000 loài nấm ký sinh côn trùng) vừa có vai trò quan trọngtrong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng và trong y dược [18, tr 1]

Theo Evan (1988), nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm chính:(1) Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn

xii

trùng ký chủ; (2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thểcôn trùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ; (3) Nấm mọc trên côn trùng tức lànhững nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côntrùng (Samson et al., 1988); (4) Cộng sinh, có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùngmang lại những lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống.

Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinhthứ cấp (secondary pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễmvào ký chủ côn trùng khỏe mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng Trongkhi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng bị yếu hoặccôn trùng bị thương Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côntrùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại kýsinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơthể của côn trùng Các nấm ký sinh trên côn trùng bị thương gọi là bệnh lây quavết thương Sự khác nhau của ký sinh cơ hội và ký sinh qua vết thương đó là kýsinh qua vết thương chỉ có thể xâm nhập vào côn trùng qua vết thương

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượng nấm

ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng Theo Tzean và cs (1997), khái niệmnày cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là 2nhóm (lớp) trong một ngành (phyllum) Động vật chân khớp (Arthropoda) vàchúng có cùng kiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trêncây (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [18, tr 5]

Đề tài chỉ tập trung nghiên cứu loài nấm ký sinh côn trùng ký sinh trên cơthể côn trùng dưới đất (dạng telemorph - sinh sản hữu tính)

1.1.2 Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua conđường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp

vỏ cuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơthể vật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm

xiii

độ bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớpcuticun.

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm chung của nấm ký sinh côn trùng(Nguồn: Cheah, C., M E Montgomery, S, Salom, B L Parker, S

Costa, and M Skinner, 2004)Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vàotrong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh,

nó giải phóng các enzym ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏcuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease, chitinase, lipase,aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase,cenlulase Các enzym này được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độkhác nhau giữa các loài và thậm chí ngay trong một loài

Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phânhủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein).Lipase, cenlulase và các enzym khác cũng là những enzym có vai trò không kémphần quan trọng Nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease)

xiv

và enzym phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzym này có liên quantrực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Lerger R J et al.,1986; Charley A K et al., 1991; Eguchi M., 1992; Tạ Kim Chỉnh và cs., 2005; HàThị Quyến và cs., 2005; Janet Jennifer et al., 2006) [6, 17, 26, 31, 38, 47].

(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết

Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng nấmtiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấm được hìnhthành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bàomáu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâmnhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp Hoạt động củacôn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bênngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết(David Pramer, 1965; Phạm Văn Lầm, 2000) [15, 30]

(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết lànguồn dinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bêntrong cơ thể côn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài

của cơ thể côn trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và

Fusarium spp định cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ

thể côn trùng Do nấm côn trùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tínhnhư thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nênchúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xácvật chủ không bị phân hủy

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơthể côn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng cácenzym ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạnnấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học.Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ Nhiều

xv

côn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vì vậy mà rấtkhó hoặc không thể xác định các vật chủ (Janet Jennifer et al., 2006) [36].

Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiệntrên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên

trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beauveria bassiana thường có vệt

chấm đen hình dạng bất định

Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngày trước thờiđiểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do nấm

Beauvera thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết.

Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồngnhạt Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lácây hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh ngày càng trở nên hóa cứng

Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị tan nát, màthường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thểsâu chết bệnh chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơthể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu chết bệnh Đây là đặc điểmrất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác(Phạm Văn Lầm, 2000) [15]

Thomas M B., Read A F (2007), nêu sơ đồ xâm nhiễm của nấm ký sinhcôn trùng vào cơ thể vật chủ (hình 1.2) [56]

Theo Thomas M B., Read A F., chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai

đoạn: Bào tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầm

và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác độngcủa enzym phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơthể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ bị chết Tầng cuticun của

vỏ cơ thể vật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâmnhiễm của nấm và nó có vai trò quyết định tính chuyên hóa đặc hiệu của nấm

xvi

Nếu nấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụthuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côntrùng của nấm Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này củanấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt độngmiễn dịch càng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâmnhập Các loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phảnứng tự vệ của vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm

ẩn là sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sảnxuất ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thốngbảo vệ

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

(Nguồn: Thomas M.B & Read A.F., 2007)

Nếu một nấm Cordyceps tấn công vật chủ thì thể sợi nấm xâm chiếm và

dần dần thay thế các mô trong cơ thể vật chủ, vào lúc hình thành dạng quả thểthon dài (chất đệm) có thể có hình trụ, phân nhánh hay tập hợp nhiều hình thùkhác nhau [61]

Một số loài Cordyceps có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ sâu bọ.

Cordyceps unilateralis gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo lên cây và bám ở

xvii

đó trước khi chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thểcôn trùng đã chết [61].

1.1.3 Giả thuyết khoa học

 Câu hỏi nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nhằm trả lời cho các câu hỏi sau:

1 Nấm Cordyceps sp1 sinh trưởng, phát triển được trên cơ thể côn trùng

vậy có thể sinh trưởng và phát triển trên các môi trường nhân tạo khác không?

2 Các nguồn dinh dưỡng nào phù hợp cho nấm Cordyceps sinh trưởng,

phát triển? Các nguồn lương thực, thực phẩm cung cấp dinh dưỡng cho con

người liệu có phù hợp cho nấm Cordyceps sp1 hay không?

 Giả thuyết khoa học

Các giả thuyết được đưa ra là:

- Nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1 có khả năng sinh trưởng, phát triển

trên nhiều môi trường khác nhau (động vật - thực vật, tự nhiên - nhân tạo)

- Các nguồn dinh dưỡng có lợi cho con người thì cũng có lợi cho nấm kýsinh côn trùng

- Trên các loại môi trường sống khác nhau thì nấm ký sinh côn trùng sẽ cókhả năng sinh trưởng, phát triển khác nhau

1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Cordyceps trên thế giới

1.2.1 Nghiên cứu các loài nấm ký sinh côn trùng nhóm Cordyceps

Theo Steinhaus (1956, 1975), bức tranh minh họa về nấm ký sinh côn trùng

được xuất bản năm 1726 và có thể bức tranh đó mô tả loài Cordyceps sinensis

(Berk.) Sacc ký sinh trên ấu trùng bộ Lepidoptera Theo Pu & Li trong cuốn

“Shennong ben cao jing” ứng dụng nấm ký sinh côn trùng (Beuaveria sp.) như

một loại thuốc được mô tả gần khoảng 200 năm trước công nguyên ở Trung

Quốc Đến Triều đại Nhà Minh (1578), loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ

thảo) được xác định bởi Li Shin - Zhen là có giá trị trong y dược và được mô tảtrong cuốn “Compendium of Chinese Materia Medica” (Dẫn theo Trần NgọcLân, 2008) [18, tr 5]

xviii

Theo Hywel - Jones N (1995) [35], năm 1749 Torrubia đã ghi nhận một loài

cánh màng (có thể là Polistes) bị chết do nấm Cordyceps sphecocephala.

Các nhà khoa học BIOTEC đã phân loại về hình thái, sinh học các loài

Cordyceps bằng sinh học phân tử DNA (Gi - Ho Sung, Nigel L Hywel - Jones et

all., 2007) [32], nghiên cứu các loài EPF mới Cordyceps khaoyaiensis,

Cordyceps pseudomilitaris (Hywel - Jones N., L., 1994) [34] Nghiên cứu ứng

dụng các loài EPF có giá trị dược liệu, như Cordyceps unilateralis (K Kocharin,

P Wongsa, 2006; Panida Unagul, P Wongsa et all., 2005; Patcharaporn Wongsa

et all., 2005; ) [45, 51, 52], loài Cordyceps nipponica (Isaka M., Tanticharoen

M et all., 2001; )[37], loài Cordyceps pseudomilitaris (Isaka M., Tanticharoen

M et all., 2000; )[36]

1.2.2 Các hoạt chất sinh học có trong nấm Cordyceps

Cordyceps rất giàu nguồn hợp chất có hoạt tính sinh học cao với cấu trúc đa

dạng, có tới 400 loài thuộc giống Cordyceps phân bố ở các nước Trung Quốc, Hàn

Quốc, Nhật Bản, Thái Lan Tuy nhiên cho đến nay, các công trình nghiên cứu về

EPF đều tập trung nghiên cứu hai loài có giá trị dược liệu cao Cordyceps sinensis (Berk.) (Đông trùng - Hạ thảo) và Cordyceps militalis (Nhộng trùng thảo - ký sinh sâu hại sồi ở Nhật Bản) Loài Cordyceps sinensis ký sinh ấu trùng của một loài côn trùng thuộc giống Hepialus (Lepidoptera) là loại sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh

học rất cao (Richard A.M., 2005; Chen Y.Q et all., 2004; Chiou W.F et all., 2000;Chen Y.J et all., 1997; Zhu J.S et all., 1998; ) [24, 25, 27, 53, 60]

Dịch chiết C sinensis có hoạt tính chống oxi hoá (antioxidation), miễn dịch

(immunomodulatory), hypoglycemic, hạ huyết áp (hypotensive) và vasorelaxant,

và các hoạt tính chống khối u ung thư (antitumor activities) (Yamaguchi Y etall., 2000; Kuo Y.C et all., 2001; Chiou W.F et all., 2000; Chen Y.J et all.,1997; Bok J.W et all., 1999) [22, 24, 27, 46, 59] Nghiên cứu thành phần hoá

học của loài C sinensis chứa các polysaccharit và các sterols (Bok J.W et all.,

1999; Kiho T et all., 1986) [22, 40] Ngoài ra còn có 17 axit amin khác nhau, cólipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na,…) và các loại vitamin Nhiều

xix

hợp chất có hoạt tính sinh học cao đang được phát hiện nhờ sự tiến bộ của ngành

hoá học các hợp chất thiên nhiên Loài C sinensis đã được sử dụng trong y học

cổ truyền của Trung Quốc cách đây 2000 năm (Zhu J - S et all., 1998a, b) [60].Trong 15 năm gần đây sự quan tâm nghiên cứu được phát triển mạnh Ngày nay

ở Trung Quốc đã có nhiều chế phẩm được bán rộng rãi trên thị trường

Loài Cordyceps unilateralis, được thu mẫu ở Vườn Quốc gia Khao Luang

(Thái Lan) đã phân lập được các dẫn xuất naphthoquinone mới Điều đáng quantâm là các naphthoquinone này có hoạt tính antimalarial với liều IC50 2,5 - 10,1

g/ml (Kittakoop et all., 1999) [44]

Loài Cordyceps nipponica có nguồn gốc ở Nhật Bản và cũng được tìm thấy

ở Thái Lan Hai N - hydroxy - 2 - pyridones, cordypyridon A và B và haitricyclic N - methoxy - 2 - pyridon, cordypyridon C và D đã được phân lập từ

loài Cordyceps nipponica BCC (mẫu thu ở vườn Quốc gia Khao Yai, Thái Lan).

Cordypyridon A và B có hoạt tính chống sốt rét với liều IC50, 0,066 và 0,037 g/

ml tương ứng (Isaka M., Tanticharoen M et all., 2001) [37]

Loài Cordyceps pseudomilitaris chỉ phát hiện được ở Thái Lan và cho đến

nay chỉ tìm thấy tại vườn Quốc gia Sam Lan, khi nó ký sinh trên ấu trùngLepidoptera từ tháng 8 đến tháng 10 (Hywel - Jones N L., 1994) [34]

Cordyanhydride A và B, hai anhydride đơn, được phân lập từ loài Cordyceps

pseudomilitaris BCC 1620 Quan trọng nhất là cordyanhydride B là lần đầu tiên

tìm thấy trong tự nhiên nonadride chứa 3 đơn vị C - 9 Tuy nhiên, các anhydridenày cho thấy kết quả âm tính về antimalarial, antituberculous và cytotoxicityassays (Isaka M., Tanticharoen M et all., 2000) [36]

Một phần từ Cordyceps, dịch chiết của sợi nấm và thân quả của nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Paecilomyces đã phân lập được các hợp chất có hoạt

tính sinh học Các hợp chất trichothecane mới, paecilomycine A, B và C được

tách ra từ loài Paecilomyces tenuipes (trạng thái vô tính của Cordyceps

takaomontana), là một loại nấm được sử dụng rộng rãi như là một thực phẩm

thuốc ở các nước Bắc Á (Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản) Từ thân quả nuôi

xx

cấy của loài nấm này, đã phân lập được các trichothecane, tenuipesine A vàspirotenuipesine A và B Các công trình nghiên cứu hoạt chất sinh học về nấm kýsinh côn trùng đã được tổng kết (Kikuchi H et all., 2004a, b; Masahiko I et all.,2005) [41, 49].

1.2.3 Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm từ nấm Cordyceps

Ở một số nước như Hoa Kỳ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc

đã nghiên cứu thành công và triển khai nhân nuôi sản xuất nấm ký sinh côn trùng

ở quy mô nông hộ, quy mô thủ công nghiệp và quy mô công nghiệp

Nhiều công trình đã nghiên cứu nuôi nhân sinh khối loài Cordyceps

sinensis để chiết xuất lấy các hoạt chất làm dược liệu (Cleaver Phillip D., John

C., 2006; Weiyun Zhang et all., 2005; Richard Alan Miller, 2005; Chen Y.Q., etall., 2004; Jonh Holliday et all., 2004; Sun S et all., 2003; ) [25, 29, 39, 54, 57]

Nghiên cứu nuôi nhân sinh khối loài Cordyceps militaris để chiết xuất lấy các

hoạt chất làm dược liệu (Sung - Hom Yeon et all., 2006; Mina Masuda et all.,2005; Kim S.W et all., 2003; Hiroki Sato et all., 2002; ) [33, 43, 50, 55]

Nhộng Trùng Thảo (Cordyceps militaris) được Xí nghiệp dược phẩm tỉnh

Cát Lâm (Trung Quốc) phân lập được từ năm 1986, năm 1990 đã được nuôi cấythành công trong nồi lên men Năm 1994 đã được đưa vào sản xuất lớn trênnhộng tằm, sau đó lại thành công trong việc nuôi cấy trên các môi trường nhântạo như gạo, tiểu mạch, ngô [12]

Việc nuôi cấy nhân tạo Nhộng Trùng Thảo đã được mở rộng tại TrungQuốc và nhiều nước khác Có thể dùng phương pháp lên men chìm (submergedfermentation) trong các nồi lên men (fermentor) hay lên men chìm (solidfermentation) trên môi trường đặc (cơm hay nhộng tằm) trong các chai thủy tinhmiệng rộng hay trong các bao màng mỏng (PP) Nhộng trùng thảo thích hợp pháttriển nhất ở 22 - 260C, ra quả thể ở 20 - 250C Trên môi trường xốp độ ẩm thíchhợp là 60 - 70%, độ ẩm tương đối của không khí thích hợp cho sự phát triển củasợi nấm là 50 - 60% nhưng thích hợp trong giai đoạn ra quả thể là 80 - 85% pHthích hợp là 5,4 - 6,8 Khi chuẩn bị môi trường nên sử dụng pH 7 - 8 và dùng

xxi

thêm 0,2% KH2PO4 và K2HPO4 hoặc CaCO3 để làm chất đệm, giữ cho pH ổnđịnh Giai đoạn sợi nấm phát triển không cần ánh sánh, nhiều ánh sáng sẽ bất lợicho sinh trưởng của sợi nấm, nhưng lúc bắt đầu phân hóa ra quả thể nên chiếusáng cường độ thấp (khoảng 100 - 200 lux), không chiếu sáng ban đêm Cần độthoáng khí thích hợp để giải tỏa CO2 sinh ra và cung cấpO2 cho nấm phát triển(nhất là giai đoạn sinh quả thể) [12].

Nghiên cứu nuôi cấy chìm Cordyceps militaris trong môi trường truyền

thống của Trung Quốc cho thấy nguồn các bon và tỷ lệ C/N có ảnh hưởng tớinồng độ cordycepin thu được Nguồn C thích hợp nhất cho tế bào sợi nấm pháttriển là galactozơ, tuy nhiên nguồn C tốt nhất cho việc sản xuất cordycepin trongmôi trường lên men là glucozơ Với tỷ lệ C/N là 42,0 gam glucozơ/lít và 15,8gam peptone/lít thì nồng độ cordycepin cao nhất trong môi trường nuôi cấy đạt345,4 + 8,5 mg/l, và khả năng sản xuất cordycepin cao nhất là 19,2 + 0,5mg/lít/ngày [58]

Nghiên cứu sản xuất quả thể của nấm Cordyceps militaris bằng cách lây

nhiễm các thể sợi nấm vào cơ thể côn trùng - vật chủ thay thế cho thấy, nấm

Cordyceps militaris đã giết chết những cá thể nhộng của cả 4 loài côn trùng thử

nghiệm bao gồm 3 loài nhộng thuộc bộ cánh phấn (Mamestra brassicae,

Spodoptera litura, Bombyx mori) và 1 loài nhộng cánh cứng (Tenebrio molitor)

nhưng nhộng bộ cánh phấn vẫn phù hợp hơn cho việc thu nhận các túi bào tử.Quả thể trưởng thành được tạo ra ở cường độ ánh sáng 20 lux và 50 lux, nhiệt độ

200C và 250C, ở 250C giai đoạn trưởng thành ngắn hơn [33]

Nghiên cứu nuôi cấy bề mặt Cordyceps militaris NBRC 9787 cho thấy

khoảng 98% cordycepin được tạo ra bằng phương pháp sinh tổng hợp bởi

Cordyceps militaris đã tiết ra trong môi trường nuôi cấy Nguồn nitơ thích hợp

hơn cho việc sản xuất cordycepin là sự pha trộn của peptone và yeast extract, với

tỷ lệ 75% yeast extract hoặc lớn hơn Tỷ lệ tối ưu về trọng lượng của C/N là 2/1khi glucozơ được sử dụng làm nguồn C Độ dày môi trường thấp hơn dẫn đếnmột khả năng sản xuất cao hơn qua phạm vi của thí nghiệm hiện tại là từ 1,8 đến

xxii

5,3 cm Dưới những điều kiện tối ưu, nồng độ cordycepin cao nhất trong môitrường nuôi cấy đạt 640 mg/l, và khả năng sản xuất cordycepin cao nhất là 32mg/lít/ngày) [50].

Ở châu Âu đã có những nghiên cứu nhân sinh khối nấm Cordyceps để sản

xuất chế phẩm trên môi trường là các loại hạt ngũ cốc, trên mùn cưa, trên thâncây gỗ…

1.3 Tình hình nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

1.3.1 Nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam

Nấm ký sinh côn trùng và công nghệ nấm - côn trùng là lĩnh vực mới đốivới Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam mới chỉ nghiên cứu về một vài loài nấm

ký sinh côn trùng ở hướng nghiên cứu sử dụng phòng trừ sâu hại cây trồng và chỉ

tập trung nghiên cứu ứng dụng hai loài nấm là Beauveria, Metarhizium, được

tiến hành từ năm 1993

Phạm Thị Thùy, Hồ Khắc Tín, Manisay Udom (1993), điều tra về thànhphần nấm xanh Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ xít đen hại lúa cho thấytrong vụ Mùa năm 1993 nấm xanh tự nhiên ký sinh bọ xít xuất hiện đạt 3 đỉnhcao và thí nghiệm trong phòng ở điều kiện tủ định ôn nhiệt độ 250C, độ ẩm 75%cho kết quả là ở nồng độ từ 12 triệu bào tử trở lên hiệu quả của nấm đối với bọxít đen hại lúa đạt tới 66 - 73% [9]; Nguyễn Xuân Niệm (2003), nghiên cứu hiệu

lực phòng trừ bọ cánh cứng hại dừa (Brontispa spp.) của chế phẩm sinh học tại tỉnh Kiên Giang, kết quả cho thấy các loại chế phẩm nấm M a có hiệu lực phòng

trừ trưởng thành BCCHD từ 22,2% - 46,7%, hiệu lực phòng trừ ấu trùng BCCHD

từ 22,8% - 29,2% [13]; Đàm Ngọc Hân, Phạm Thị Thùy, (2007) ứng dụng chế

phẩm nấm M a để phòng trừ bọ xít hại cây trồng cho thấy chế phẩm M a có hiệu

lực cao với bọ xít hại nhãn vải, ở nồng độ 9 x 109 bt/ml sau 10 ngày phun tỷ lệ bọxít non chết đạt 72,5%, bọ xít trưởng thành chết đạt 45,1% [2]

xxiii

Đồng thời với nghiên cứu sử dụng chế phẩm phòng trừ sâu hại cây trồng,

Tạ Kim Chỉnh, Hồ Thị Loan, Nguyễn Thị Hà Chi (2005) đã nghiên cứu qui trìnhkiểm tra chất lượng và thu hồi chế phẩm, hoàn thiện qui trình sản xuất chế phẩm

nấm M a lên men trên môi trường xốp [7, 16].

Kết quả điều tra nghiên cứu từ tháng 07 năm 2007 đến tháng 05 năm 2008 củaTrần Ngọc Lân và nnk đã thu thập được 690 mẫu nấm ký sinh côn trùng ở VQG PùMát Nghệ An Định loại xác định được 63 loài thuộc 17 giống, 3 bộ nấm ký sinh côn

trùng Trong các giống thu thập được, giống Aschersonia có nhiều loài nhất là 16 loài

với 163 mẫu, chiếm 23,62 % trong tổng số mẫu thu thập được, tiếp đến là giống

Hypocrella có 7 loài với 64 mẫu, chiếm 9,28% tổng số mẫu thu thập Hai giống này

ký sinh chủ yếu trên các loài rầy rệp thuộc bộ Homoptera Các giống khác có số loài

dao động từ 1 đến 6 loài Một số giống nấm ký sinh côn trùng khác như Ophio

Cordyceps, Paecilomyces có số loài tương ứng là 3 và 4 loài Tuy nhiên đây là những

giống tương đối phổ biến tại Vườn Quốc gia Pù Mát với tần suất bắt gặp tương ứng là13,48 % (58 mẫu được thu thập) và 22,90 % (158 mẫu được thu thập) [18]

1.3.2 Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps

Các kết quả nghiên cứu và thành tựu đạt được về Cordyceps ở Việt Nam

còn rất ít và mới chỉ là những nghiên cứu ban đầu Hiện tại, đã có các chươngtrình hợp tác với nước ngoài về Đông trùng - Hạ thảo như hợp tác giữa Công tyShanghai Grace Biotech Co, Ltd Hàn Quốc và công ty cổ phần dược Trung ươngMediplantex về sản xuất Đông trùng - Hạ thảo theo một chu trình khép kín; hai

dự án hợp tác đầu tư 100% vốn nước ngoài vào tỉnh Lâm Đồng của 4 nhà đầu tưngười Pháp để sản xuất Đông trùng - Hạ thảo với qui mô 12 tấn/năm và công tyKorea Beneficial Insect Lab Hàn Quốc tại khu công nghiệp cao Lạc Dương dựkiến sản xuất 6 tấn côn trùng dạng kén, 300 kg trứng/năm để phục vụ khoa học

và thị trường [1]

Theo Đỗ Tất Lợi (1999) [5], người dân Việt Nam hiện đã, đang sử dụng hailoại EPF làm dược liệu, một loại nhập từ Trung Quốc và một loại của Việt Nam.Hàng năm tại Thất Khê (Lạng Sơn), Hoà Bình, Lào Cai nhân dân khai thác một

xxiv

loại Đông trùng - Hạ thảo, loại này có tên khoa học Brihaspa atrostigmella thuộc

bộ cánh vảy (Lepidoptera), nó sống trong thân cây đót (Thysanoloena maxima O.

Kuntze) thuộc họ Hòa thảo (Gramineae) “Đông trùng - Hạ thảo” Việt Nam được

nhân dân thường dùng là “Đông trùng - Hạ thảo” loài Cordyceps sinensis được

nhập từ Trung Quốc Trong y học cổ truyền là một vị thuốc bổ, chữa thần kinhsuy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận

Đái Huy Ban, Trần Đinh Toại, Lưu Tham Mưu (2007) đã công bố nghiên

cứu về một loài Đông trùng - Hạ thảo Asaria sp Tiêu bản Đông trùng - Hạ thảo

đã được phát hiện ở Tuyên Quang; Đông trùng - Hạ thảo Asaria sp có 17 axit

amin, trong đó, aspartic và glumatic có hàm lượng rất cao [19]

Theo Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp, Phạm Thế Hải (2005) cácnghiên cứu y học và dược học đã chứng minh được các tác dụng của ĐTHT:Chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận; Bảo vệ thận trong trườnghợp gặp tổn thương do thiếu máu; Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp; Giữ ổnđịnh nhịp đập của tim; Làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể; Hạn chế bệnh tậtcủa tuổi già; Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể; Tăng cường tác dụnglưu thông máu trong cơ thể [11]

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và nnk (2008) ở Vườn Quốc gia Pù

Mát, giống nấm ký sinh côn trùng Cordyceps có 6 loài khác nhau, bao gồm

Cordyceps unilateralis, Cordyceps irrangensis, Cordyceps sp1., Cordyceps sp2., Cordyceps sp3., Cordyceps sp4 Trong đó loài phổ biến nhất là loài Cordyceps unilateralis với 88 mẫu thu được (chiếm 92,63%) và 3 loài (C unilateralis (Tull.)

Sacc, Cordyceps sp1., Cordyceps sp2.) có khả năng cho các hoạt chất sinh học làm

dược liệu [18]

Hiện tại, chưa có công trình nghiên cứu nào tập trung vào nhân sinh khối các

loài EPF có giá trị dược liệu, đặc biệt là các loài Cordyceps spp mới được phát hiện.

1.4 Nhân nuôi sinh khối nấm ký sinh côn trùng

xxv

Nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng là 1 trong 4 phương pháp tiếp cận công

nghệ sinh học hiện đại và phù hợp Trên thế giới đã và đang nghiên cứu ứng dụng

nhân nuôi sinh khối nấm ký sinh côn trùng (Cordyceps) theo 3 hướng chủ yếu:

- Phương pháp lây nhiễm bào tử nấm vào cơ thể côn trùng (vật chủ thay

thế) để thu hồi quả thể

Phương pháp này sử dụng các vật chủ thay thế như: Ấu trùng mọt bột

vàng Tenebrrio molitor; sâu non và nhộng sâu khoang Spodoptera litura; nhộng tằm Bombyx mori Để lây nhiễm bào tử nấm vào cơ thể côn trùng có thể sử

dụng phương pháp lây nhiễm bằng ngâm côn trùng trong dung dịch chứabào tử nấm Hoặc sử dụng phương pháp tiêm dung dịch bào tử nấm trựctiếp vào cơ thể côn trùng

Phương pháp ngâm vật chủ đã được Harata và cộng sự nghiên cứu năm

1995 Trong nghiên cứu của mình, Harada đã sử dụng nhộng loài M Brassicae

để ngâm vào dung dịch chứa bào tử của nấm C militaris Kết quả là 30 ngày sau khi nhộng M Brassicae chết hệ sợi nấm xuất hiện và khoảng 80 ngày sau khi

ngâm các thể quả trưởng thành xuất hiện (Harada và cộng sự, 1995) Trongphương pháp ngâm, các bào tử túi phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển củanấm sau khi lây nhiễm như: sự nảy mầm, sự xuyên qua lớp vỏ cuticun và sự sảnxuất các bào tử nấm trong khoang máu của côn trùng

Khác với phương pháp lây nhiễm ngâm vật chủ, phương pháp lây nhiễmtiêm trực tiếp dịch bào tử nấm vào xoang cơ thể côn trùng không trải qua giaiđoạn đâm xuyên qua lớp vỏ cuticun Bằng cách tiêm các bào tử vào trong cơ thểcôn trùng, có trên 76% cơ thể vật chủ đã sản xuất thể quả và số thể quả trưởngthành đạt trên 64% Kết quả đạt được tốt nhất là trong trường hợp nhộng của loài

M brassicae ở nhiệt độ 250C, sau đó là S litura, B mori và T molitor (Hiroki

Sato và Mitsuaki Shimazu, 2002) [33]

- Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Nuôi cấy nấm theo phương pháp bề mặt để sản xuất sinh khối thường dùngmôi trường rắn, một số trường hợp có thể dùng môi trường lỏng

xxvi

Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, đôi khi dùnggạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô… hoặc hỗn hợp nhữngnguyên liệu này Môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch thủy phân từ thócmầm, nước bã rượu, nước đậu nành… có pha thêm muối khoáng

Trong nuôi cấy bề mặt, nấm mọc trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng Cácmôi trường rắn trước khi nuôi cấy nấm cần được làm ẩm Nấm phát triển sẽ lấynhững chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxygen phân tử của khôngkhí để hô hấp (Dẫn theo Nguyễn Hoàng Lộc, 2005) [10]

Trên thế giới phương pháp nuôi cấy bề mặt được Mina Masuda và cộng sự

sử dụng để sản xuất cordycepin từ nấm ký sinh côn trùng Cordyceps militaris.

Dưới những điều kiện tối ưu, nồng độ cordycepin cao nhất trong môi trường nuôicấy đạt 640 mg/l, và khả năng sản xuất cordycepin cao nhất là 32 mg/lít/ngày [50]

- Phương pháp nuôi cấy chìm (Công nghệ lên men)

Năm 2004, Xian - Bing Mao và Jian - Jiang Zhong, đã phát triển phương

pháp nuôi cấy chìm C militaris cho việc sản xuất cordycepin với quy mô thương

mại sử dụng sự điều chỉnh 2 giai đoạn hòa tan khí oxy và đã cải thiện rõ rệt hiệuquả sản xuất cordycepin Môi trường nuôi cấy được sử dụng để nghiên cứu baogồm 40 g/l Gluczơ; 10 g/l Pepton; 0,5 g/l KH2PO4; 0,5 g/l K2HPO4.3H2O và 0,5g/l MgSO4.7H2O [58]

xxvii

Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Quy trình nghiên cứu

Bảo quản mẫu thu thập và mẫu nuôi cấy

- Để mẫu thu thập khô ở điều kiện nhiệt độ phòng

- Lưu giữ mẫu thu thập

- Lưu giữ mẫu phân lập và nuôi cấy

- Chụp ảnh trên slide và trên đĩa petri

Phân lập, nuôi cấy

- Phân lập mẫu nấm trên môi trường PDA

- Nuôi cấy mẫu nấm trên môi trường PDAThu thập nấm ký sinh côn trùng trên và trong đất

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1 năm 2008 đến tháng 12 năm 2008

- Địa điểm nghiên cứu: Rừng nguyên sinh thuộc Vườn Quốc gia Pù Mát,Phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và phòng thí nghiệm Vi sinh - Công nghệ sinhhọc nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Loài nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1

- Môi trường lên men rắn với các thành phần: trấu, cám gạo, bột gạo, bộtngô, nước…

- Môi trường hạt: lúa, ngô, y dĩ

- Môi trường PDA và môi trường nước đậu nành

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu thập nấm ký sinh côn trùng

2.4.1.1 Đặc điểm của nơi thu thập

EPF có thể sinh trưởng và phát triển bình thường trong điều kiện môitrường có thời tiết ẩm ướt (khi nhiệt độ dao động từ 150C - 300C và độ ẩm daođộng từ 75 - 100%) Nơi thu thập thường là những khu rừng nguyên sinh pháttriển trên núi đất, có nhiều cây lớn, trên mặt đất có ít cây nhỏ để tạo điều kiện chocác lá từ cây lớn có thể rơi xuống trên bề mặt đất Nếu thu thập trong mùa khô,

có thể thu thập tại các khu rừng có sông suối

Nơi thu thập thường là những khu rừng bằng phẳng hoặc độ dốc không quálớn, nơi có đất tơi xốp Nếu rừng phát triển trên đất sét thì rất khó để tìm thấy EPF

2.4.1.2 Phương pháp thu thập

xxix

Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của nấmtrên một số loại môi trường

- Môi trường PDA

- Môi trường nước đậu nành

- Môi trường lên men xốp

- Các loại hạt ngũ cốc

 Lá hoặc thân cây

EPF có thể tồn tại trên các sinh cảnh (môi trường sống) khác nhau Nó cóthể tồn tại trên thân cây (cây đang sống hoặc cây chết) hoặc mặt dưới của các lácây (chủ yếu là các lá già) Trên mặt lá rất ít khi chúng ta tìm thấy EPF Một vàiloại EPF có thể tìm thấy trên rêu tồn tại trên vỏ cây rừng

Để thu được EPF, chúng ta phải lật các lá cây để quan sát phía mặt dưới.EPF dễ dàng nhận biết được do có màu sắc tương đối sáng Dùng tay hoặc dao,kéo để cắt lá có EPF bỏ vào hộp đựng mẫu phù hợp với kích thước mẫu vật Nếutrên một chiếc lá to có mẫu vật nhỏ thì ta cắt cho mẩu lá có EPF nhỏ lại vừa vớikích thước hộp, chú ý không cắt quá sát mẫu Lấy 1 mẩu lá khác (tốt nhất là cùngloài với lá có mẫu vật) để trên miệng hộp đựng mẫu và đậy nắp lại Mục đích củaviệc này là để giúp tăng độ ẩm cho mẫu, giữ cho nắp hộp chặt hơn và có thể căn

cứ để xác định loài cây mà có mẫu EPF thu thập

* Nguyên tắc thu thập:

Nếu phát hiện được EPF ở một điểm thì phải tìm ở nhiều điểm xung quanh nó.Thu ở nhiều loài cây khác nhau, nhiều địa thế khác nhau

Thu nhầm hơn bỏ sót

* Cách phân biệt giữa nấm bệnh thực vật với EPF:

Nếu lá có nấm bệnh thực vật thì vết bệnh sẽ biểu hiện cả 2 bề mặt lá

Nếu lá có EPF thì thì ta chỉ thấy mẫu nấm ở một bề mặt lá, thường là mặt dưới

* Cách phân biệt EPF với côn trùng:

Một số loài côn trùng ở dạng ấu trùng, trứng hoặc nhộng có cấu tạo bề mặtphía ngoài rất giống EPF Khi thu được mẫu vật nghi ngờ, ta dùng tay hoặc mộtcái que nhỏ ấn vào mẫu vật, mẫu EPF thường cứng, bám rất chắc vào lá hoặcthân cây, nếu là côn trùng thì mềm và nếu ấn mạnh sẽ có dịch sinh học (dịch cơthể) chảy ra

 Trong đất

xxx

Đất là môi trường của nhiều loại côn trùng sinh sống Khi thu thập chúng taphải quan sát cẩn thận trên mặt đất Khi tìm thấy các loại EPF trong đất chúng taphải đào cẩn thận để tránh làm hỏng mẫu thu thập Dùng các dụng cụ như xẻngcầm tay, dao đào xung quanh, cách mẫu khoảng 8 - 10 cm Các mẫu EPF trongđất thường ở độ sâu từ 5 - 10 cm so với bề mặt đất Một số loài có thể sâu đến 20

cm như các loài Cordyceps trên mối đất (termite), ong đất.

 Trên các tàn dư cây cỏ

Trên các tàn dư cây cỏ có rất nhiều loài côn trùng sinh sống, đó là môi trườngthuận lợi để EPF phát triển Khi tìm thấy EPF trên tàn dư thực vật chúng ta phảihết sức cẩn thận vì rất dễ làm hỏng mẫu thu thập

2.4.1.3 Thời gian thu thập

Thu thập mẫu côn trùng bị nấm ký sinh thường được tiến hành vào buổisáng, mỗi ngày thu thập từ 3 - 4 giờ/1 khu vực cụ thể Khi thu thập càng nhiềungười tham gia thì khả năng thu được EPF càng cao Tiến hành thu thập tự dotheo phương châm càng nhiều điểm điều tra càng tăng thêm cơ hội bắt gặp EPF.Cần phải chụp ảnh, thu mẫu, đánh số thứ tự mẫu và các ghi chép thực địa khác đểtiến hành mô tả các đặc điểm hình thái, sinh thái của nấm ký sinh và côn trùng bịnấm ký sinh, kết hợp với điều tra định kỳ (thường 10 ngày/1 lần) trên một khuvực điều tra cố định để theo dõi sự xuất hiện và biến động số lượng của EPF

2.4.2 Phương pháp bảo quản giống và cấy truyền

2.4.2.1 Phương pháp bảo quản giống

Bảo quản nấm ký sinh côn trùng là điều rất quan trọng Để bảo quản ngắnhạn có thể bảo quản ở nhiệt độ 50C đến - 200C, nếu có thể Để bảo quản dài hạn,

có thể bảo quản trong điều kiện - 200C (môi trường nitơ lỏng) Các giống nấmphải được nhận dạng thích hợp

Việc duy trì tính độc của các giống trong quá trình bảo quản là vô cùngquan trọng Nấm có thể bị mất tính độc nếu cấy truyền quá nhiều trên môi trườngnhân tạo Để tránh mất độc tính của nấm, chúng ta có thể sử dụng môi trường

xxxi

nuôi cấy từ hệ thống bảo quản vacxin hoặc chúng ta có thể phân lập lại EPF từcác côn trùng được lây nhiễm nhân tạo.

Cùng với việc bảo quản mẫu nấm được phân lập, việc bảo quản các mẫuthu thập cũng rất quan trọng

Các bước cụ thể để bảo quản EPF như sau:

Bước 1: EPF được nuôi cấy trên môi trường agar trong slope có ít dinhdưỡng như (PDA, PCA,…); hoặc có thể cấy EPF trên đĩa petri hoặc chai lớn vàbảo quản chúng trong tủ lạnh ở nhiệt độ 50C Tiến hành quan sát thường xuyên từbên ngoài để loại bỏ những mẫu bị nhiễm vi khuẩn hoặc các loại nấm khác.Bước 2: Nếu EPF được nuôi trong chai có diện tích bề mặt 30 ml nên để cổchai hướng xuống dưới và có thể bảo quản chúng ở nhiệt độ 50C trong tủ lạnhtrong thời gian vài tháng

Bước 3: Để bảo quản dài hạn, tiến hành phủ paraffin vô trùng vào đầu cổchai và siết nhẹ nắp chai Việc bảo quản như thế này có thể bảo quản được giốngEPF trong thời gian từ 1 đến 3 năm

Chú ý: Mỗi một mẫu phân lập nên nhân nuôi và bảo quản trong khoảng 3

chai hoặc slope

Bước 4: Nấm được phân lập từ côn trùng bị lây nhiễm có thể được bảo quảntrong tủ lạnh trong xác chết khô của côn trùng trong thời gian từ 1 đến 3 năm.Bước 5: Bảo quản các mẫu nấm ký sinh côn trùng thu thập trên thực địatrong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 đến 100C

Chú ý: Ánh sáng tử ngoại (UV) có thể làm tổn thương đến bộ nhiễm sắc thể

của các bào tử vô tính của nấm

Mỗi loại EPF khác nhau có cách thức bảo quản khác nhau

Việc bảo quản các bào tử vô tính nên tiến hành trong điều kiện lạnh và khô

- Phương pháp chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (slope) để bảo quản mẫunấm

xxxii

Sử dụng ống nghiệm có thể tích 15 hoặc 30 ml có nắp nhựa hoặc không cónắp nhựa Đối với ống nghiệm không có nắp nhựa, dùng bông sạch để làm nút.Bước 1: Hấp tiệt trùng ống nghiệm, nút bông, nắp nhựa ở 1210C trong 20phút Chuẩn bị môi trường PDA.

Bước 2: Rót môi trường PDA (khi chưa bị đông đặc) vào các ống nghiệmvới mức 5 ml (ống nghiệm 15 ml) và 10 ml (ống nghiệm 30 ml)

Bước 3: Đậy nút bông hoặc nắp nhựa (nắp nhựa không được vặn quá chặt),cho vào nồi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút (Chú ý để đứng ống nghiệm,tránh làm đổ môi trường ra ngoài)

Bước 4: Sau khi kết thúc chế độ là việc của nồi hấp tiệt trùng (ở nhiệt độ

700C), lấy các ống nghiệm ra ngoài để nằm nghiêng khoảng 450

Vặn chặt nắp nhựa, chờ môi trường nguội và đông đặc lại, ta được môitrường thạch nghiêng (slope)

Bước 5: Tiến hành cấy chuyển mẫu nấm vào các slope trong tủ hốt vôtrùng

Bước 6: Để các slope đã cấy nấm trong các tủ nuôi ở nhiệt độ từ 22 đến

240C, theo dõi 2 - 3 ngày để phát hiện và loại bỏ các slope bị nhiễm vi khuẩn vànấm khác

Các mẫu đạt yêu cầu chuyển sang bảo quản ở chế độ thích hợp

2.4.2.2 Phương pháp cấy truyền

- Cấy truyền được tiến hành trong các trường hợp sau:

Ở điều kiện bảo quản và nuôi cấy bình thường trong tủ colifom, sau mộtthời gian, môi trường trong đĩa Petri hay slope đã được nấm sử dụng hết, phảicấy truyền sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng, phát triển của nấm.Khi cần lượng sinh khối nấm trên các loại môi trường (PDA, SDY, môitrường lên men xốp…) thì chúng ta cũng tiến hành cấy truyền ra từ một mẫu gốcsạch ban đầu

- Cấy truyền từ môi trường PDA sang môi trường PDA

Chuẩn bị môi trường PDA trong đĩa Petri hoặc trong slope

xxxiii

Dùng que cấy có cán nhựa hoặc dùi nhọn lấy 1 lượng rất nhỏ nấm từ đĩagốc (một phần sợi nấm hoặc bào tử) cấy chuyển sang đĩa petri hoặc slope có môitrường PDA.

Dùng nhãn dính ghi các thông tin bao gồm: tên nấm, ngày cấy, số thứ tựcủa đĩa hoặc slope, tên người cấy

Dùng paraffin hoặc giấy bọc đĩa tiệt trùng quấn quanh miệng đĩa (đậy nắp slope).Chuyển các đĩa hoặc slope đã cấy vào nuôi hoặc bảo quản ở nhiệt độ thíchhợp

Chú ý: Các thao tác tiến hành trên ngọn lửa đèn cồn trong tủ hốt vô trùng

- Cấy truyền từ môi trường PDA sang các môi trường khác (môi trường lênmen xốp, môi trường hạt)

Mẫu nấm trên môi trường PDA được chuẩn bị để cấy truyền sang các môitrường khác thường sử dụng slope hoặc đĩa petri có kích thước đường kính là 6 cm.Môi trường lên men rắn hoặc môi trường hạt tiệt trùng được chuẩn bị trongcác bình tam giác có nút bông

Dùng các dụng cụ (thìa sắt loại nhỏ, dao tiểu phẫu hoặc dùi nhọn) lấynguyên cả khuẩn lạc của nấm ở mẫu gốc chuyển sang các bình tam giác có chứamôi trường lên men xốp hoặc môi trường hạt

Chú ý: Các thao tác phải tiến hành nhanh chóng, trên ngọn lửa đèn cồn và

trong tủ hốt vô trùng

Dùng nhãn dính để ghi chú các mẫu nuôi cấy

2.4.3 Phương pháp xác định số lượng bào tử có trong 1 gam nguyên liệu

Nồng độ bào tử được xác định bằng buồng đếm hồng cầu

1 Buồng đếm bào tử

- Cấu tạo buồng đếm: 1 lam kính dày (kích thước 7 cm x 3 cm x 0,5 cm), có

4 rãnh ngang và 1 rãnh dọc, có 225 ô vuông lớn Trong đó có 25 ô lớn được chiathành các ô vuông nhỏ (1 ô lớn có 16 ô nhỏ)

- Kích thước của mỗi ô nhỏ: mỗi cạnh bằng 1/20 mm và sâu 1/10 mm

xxxiv

Đối với môi trường lên men rắn là môi trường hạt: Lấy 1 gam hỗn hợp cả

cơ chất môi trường và nấm, cho vào cốc đong nhỏ với 10 ml nước cất 2 lần.Dùng đũa thủy tinh đánh đều

Sau đó, dùng lưới lọc (tấm lưới lọc của Nhật Bản) lọc hỗn hợp dung dịchvừa pha chế để đảm bảo chỉ có bào tử được lọt qua

Nhỏ vào dịch lọc 1 - 2 giọt hỗn hợp gồm Tween 80 và cồn 960 với tỷ lệ 1 : 1,khuấy đều Hỗn hợp này có tác dụng giúp ổn định các bào tử trong dịch lọc để dễdàng hơn cho việc đếm

kẻ của buồng đếm

- Đếm số lượng bào tử trong 5 ô lớn, mỗi ô lớn có 16 ô nhỏ

- Chọn 4 ô, ở 4 góc và một ô chính giữa buồng đếm

- Đếm 3 lần lấy giá trị trung bình

- Cho n là số lần pha loãng và C là

số bào tử tập trung trong nguồn gốc dung

dịch: C = c x n

Hình 2.1 Các ô vuông trên buồng

đếm bào tử

2.4.4 Môi trường nuôi cấy

2.4.4.1 Môi trường PDA

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bao gồm các thành phần sau:

Bước 2: Khoai tây rửa sach, gọt vỏ, cân 200 gam

Bước 3: Cắt thành miếng có kích thước 12 mm

Bước 4: Cho vào nồi đun sôi cùng với 1000 ml nước

Bước 5: Đun sôi cho đến khi khoai tây mềm ra (khoảng 15 - 20 phút).Bước 6: Dùng 1 chiếc rây bột và 1 tấm gạc để lọc lấy phần nước dịch khoai tây.Bước 7: Cho nước khoai tây vào cốc đong có chứa Agar và Glucozơ đủ thểtích 1000 ml, khuấy đều

Bước 8: Cho toàn bộ hỗn hợp trên vào nồi đun sôi để hòa tan Agar

xxxvi