Thử nghiệm tính kháng nấm saprolgnia của nước ép lá hẹ ( AALIUM TUBEROSUM ) trên cá chép ( CYPRIUS CAPRPIO )

* Sinh sản vô tính Trong quá trình sinh sản vô tính bắt đầu từ túi bào tử hình thành các bào tử động riêng biệt được giải phóng ra ngoài bơi, vận động tự do trong môi trường có hình ovan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

  

Lê Thị Quỳnh Nga

THỬ NGHIỆM TÍNH KHÁNG NẤM (SAPROLEGNIA) CỦA

NƯỚC ÉP LÁ HẸ (ALLIUM TUBEROSUM) TRÊN CÁ CHÉP

(CYPRIUS CARPIO)

TÓM TẮT KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN

VINH – 2009

lời cảm ơn

Để hoàn thành khoá luân tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi còn nhận được nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể trong

và ngoài trường.

Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn TS Trần

Ngọc Hùng, người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS Lê Văn Khoa, Ks Nguyễn Thị

Nguyện đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc tại Trung

tâm quan trắc Bệnh và Môi trường Qua đây tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trường Đạì HọcVinh, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, các anh chị đã góp ý động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Cuối cùng con xin cảm ơn gia đình bố mẹ đã sinh thành dạy dỗ con, luôn cổ vũ động viên con để con có được ngày hôm nay.

Vinh, tháng 12/2008 Sinh viên thực hiện:

Lê Thị Quỳnh Nga

Số bảng Tên bảng Trang Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá

Bảng 3.6 Phân tích anova của yếu tố nhiệt độ ảnh

hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm

38

Bảng 3.7 Kết quả phân tích anova của các nồng

độ NaCl ảnh hưởng đến sự phát triển của khuẩn lạc nấm Saprolegnia

39

Bảng 3.8 Kết quả phân tích anova của yếu tố muối

KCl ảnh hưởng tới sự phát triển của khuẩn lạc nấm Saprolegnia

Số hình ảnh Tên hình ảnh Trang

Hình 3.1 Hiệu quả diệt nấm Saprolegnia sp

của nước ép lá hẹ ở 14.000 ppm

29

Hình 3.2 Hiêụ quả diệt nấm Saprolegnia sp

của xanh malachite 0,15%

29

Hình 3.3 Sự phát triển của nấm Saprolegnia

sp không ngâm qua nước ép lá hẹ

30

Hình 3.4 Sự phát triển của nấm Saprolegnia

sp sau 48h với nước ép lá hẹ ở

32

Hình 3.13 Sự tập trung nguyên sinh chất dày

đặc trong túi bào tử.(x100)

Hình 3.16 Các bào tử phân chia rõ rệt, chuyển

động trong túi bào tử

37

Hình 3.17 Các bào tử chuẩn bị được giải

phóng ra khỏi túi bào tử.

37

Hình 3.20 Tốc độ sinh trưởng của nấm ở các

nhiệt độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar

38

Hình 3.21 Tốc độ sinh trưởng của nấm sau 3

ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar chứa các nồng độ NaCl khác nhau

39

Hình 3.22 Tốc độ sinh trưởng của khuẩn lạc

nấm sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường GY agar chứa các nồng độ muối KCl khác nhau

40

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Danh mục các chữ viết tắt ii

Danh mục các bảng iii

Danh mục các hình ảnh iv

Mục lục vi

Mở đầu 1

Chương 1 Tổng quan 3

1.1 Vài nét về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Cá Chép (Cyprinus carpio) 3

1.1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.1.2 Phân bố 3

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái 3

1.1.1.4 Đặc điểm sinh sản và sinh trưởng 4

1.1.2 Nấm Saprolegnia 4

1.1.2.1 Hệ thống phân loại 4

1.1.2.2 Đặc điểm của nấm Saprolegnia 5

1.1.2.2.1 Hình thái cấu tạo 5

1.1.2.2.2 Hình thức sinh sản 5

1.1.3 Hẹ (Allium tuberosum ) 6

1.1.3.1 Hệ thống phân loại 6

1.1.3.2 Đặc điểm sinh học 7

1.1.3.3.Thành phần hoá học 7

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh nấm ở động vật thủy sản 8

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 11

1.3 Tình hình nghiên cứu thảo dược phòng trị bệnh thuỷ sản 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

1.4 Một số nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nấm cho động vật thuỷ sản 17

Chương 2 Đối tượng, vật liệu, địa diểm, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2.1 Lá hẹ (Allium tuberosum) 19

2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 19

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Phương pháp tách chiết he (Allium tuberosum) 21

2.4.2 Phương pháp thử nghiệm nước ép lá hẹ diệt nấm Saprolegnia trong phòng thí nghiệm 21

2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm nấm trên cá chép 22

2.4.3.1 Chuẩn bị cá để cảm nhiễm 22

2.4.3.2 Sản xuất bào tử nấm Saprolegnia 22

2.4.4 Phân lập nấm 23

2.4.5 Phương pháp thử nghiệm nước ép lá hẹ (Allium tuberosum) diệt nấm Saprolegnia 24

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.6.1 Thời gian 24

2.6.2 Địa điểm 24

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 25

3.1 Kết quả thử nghiệm tính kháng nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ trong phòng thí nghiệm 25

3.1.1 Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ 25

3.1.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế nấm tối thiểu của nước ép lá hẹ.26 3.1.3 Kết quả xác định nồng độ diệt nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ 27

3.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm 31

3.3 Kết quả phân lập tác nhân gây bệnh 32

3.3.1 Dấu hiệu bệnh lý 32

3.3.2 Kết quả phân lập 33

3.3.2.1 Đặc điểm hình thái 33

3.3.2.1.1 Khuẩn lạc 33

3.3.2.1.2 Sợi nấm 33

3.3.2.1.3 Phương thức sinh sản bào tử 35

3.3.2.1.4 Túi bào tử 36

3.3.2.1.5 Sự hình thành bào tử 36

3.3.2.1.6 Quá trình giải phóng bào tử 36

3.3.2.2 Đặc điểm của nấm 38

3.3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm 38

3.3.2.2.2 Ảnh hưởng của độ muối đến sự sinh trưởng của khuẩn lạc nấm 39

3.4 Kết quả thử nghiệm nước ép lá hẹ diệt nấm Saprolegnia trên cá chép 42

Kết luận và đề xuất 43

Tài liệu tham khảo 44 Phụ lục I

MỞ ĐẦU

Thuỷ sản là một ngành có nhiều thế mạnh ở nước ta hiện nay, với kim ngạch xuất khẩu năm 2007 là 3,75 tỷ USD thì đây là một trong ba ngành có đóng góp lớn nhất cho kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam Cùng với sự phát triển của ngành thuỷ sản Việt Nam thì đóng góp của NTTS ngày càng tăng do sản lượng khai thác thuỷ sản trong những năm gần đây tăng không đáng kể

Năm 2006 sản lượng khai thác đạt 2026,6 nghìn tấn, năm 2007 sản lượng khai

thác tăng không đáng kể chỉ dạt 2063,8 nghìn tấn [48].

Bên cạnh sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi ven biển và nghề nuôi biển thì nghề nuôi cá nước ngọt vẫn khẳng định được vai trò của mình Với lịch sử lâu đời của nghề nuôi cá nước ngọt và những đối tượng nuôi có giá trị cao và nhu cầu lớn trên thị trường như cá Tra, Cá Basa và gần đây là cá hồi nước lạnh thì nghề NTTS nước ngọt vẫn là một trong những nghề mũi nhọn của NTTS Việt Nam [17]

Khi ngành nuôi trồng đã phát triển, nhiều đối tượng có giá trị kinh tế được đưa vào nuôi, các hình thức nuôi công nghiệp như nuôi thâm canh, siêu thâm canh được áp dụng phổ biến, sự đầu tư lớn về giống, thức ăn và năng suất cao luôn là điều kiện tiềm ẩn nguy cơ bùng nổ dịch bệnh Do vậy khi NTTS càng phát triển thì vấn đề dịch bệnh càng trở nên thường xuyên, đe dọa ngành nuôi trồng thủy sản, gây những thiệt hại lớn, và đôi khi bệnh trở thành nhân tố quyết định thắng thua trong một đợt sản xuất

Trong nuôi cá nước ngọt dịch bệnh thường xuyên xảy ra Và bệnh nấm thủy mi là bệnh hay gặp nhất trên các đối tượng nuôi vào mùa có nhiệt độ

thấp, nuôi ở mật độ cao, đặc biệt là trứng cá Chép (Cyprinus carpio) Bệnh

này gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi [6]

Hiện nay việc phòng trị bệnh trên cá nước ngọt ở nước ta vẫn chủ yếu dựa vào việc sử dụng thuốc kháng sinh và hoá chất Tuy nhiên một số hoá chất bị cấm sử dụng và một số ảnh hưởng không tốt cho môi trường nuôi Trước đây

người ta thường sử dụng thuốc Xanh Malachite tắm cho cá bị nấm thuỷ mi ở nồng độ 1- 4ppm, thời gian tắm 15-30 phút Tuy nhiên hiện nay Bộ Thủy sản

đã công bố việc cấm sử dụng loại thuốc này (Ban hành kèm theo Quyết định

số 07/2005/QĐ-BTS ngày 24 tháng 02 năm 2005 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản)

vì sự tồn đọng của nó trong cơ thể động vật là không tốt cho sức khỏe con

người Dư lượng xanh Malachite gây rất nhiều tác hại cho con người như đó

là chất gây đột biến gen, chất gây ung thư… [46].

Trước tình hình đó xu hướng nghiên cứu các loại thảo dược để thay thế các hoá chất, kháng sinh đang được sử dụng là hướng mới và rất hiệu quả bởi chi phí thấp, dễ sử dụng, không gây hại đến môi trường nuôi cũng như môi trường xung quanh, tạo ra sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm

Hẹ (Allium tuberosum) là một loài thảo dược Trong Đông Y sử dụng hẹ có

tác dụng trợ thận, bổ dương, ôn trung, hành khí, tán huyết, giải độc, cầm máu, tiêu đờm….Trong Tây Y hẹ có tác dụng tăng tính nhạy cảm với insulin làm giảm đường huyết, giảm mỡ máu, ngừa xơ mỡ động mạch, bảo vệ tuyến tụy [43] Nhiều nghiên cứu đã xác định trong lá cây hẹ và củ hẹ có chất sunfua, saponin, chất đắng và hai hoạt chất tên là odorin, allicin có tác dụng kháng

khuẩn, kháng nấm mạnh [8] Đây là cơ sở để chúng ta nghiên cứu và tìm ra

những tác dụng của hẹ trong việc phòng và trị bệnh động vật thuỷ sản

Do những yêu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “ Thử nghiệm

tính kháng nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ (Allium tuberosum) trên cá Chép (Cyprinus carpio)”.

Mục tiêu nghiên cứu:

- Xác định được khả năng kháng nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ (Allium

tuberosum) trên cá chép (cyprinus carpio)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Cá Chép (Cyprinus carpio)

1.1.1.1 Hệ thống phân loại

Nghành: Gnathosmata

Lớp: Osteichthyes

Bộ: Cypriniformes

1.1.1.2 Phân bố

Cá chép (Cyprinus carpio) được phân bố rất rộng, gặp ở hầu hết các

nước trên thế giới, tính thích nghi cao Cá chép được coi là loài cá nuôi ở ao,

hồ nước ngọt lâu đời nhất trên thế giới [1].

Cá chép nước ta phân bố chủ yếu ở miền Bắc, các tỉnh phía Nam không

có cá chép gốc ở địa phương mà là cá chép di giống từ miền Bắc vào Cá chép sống được ở hầu hết các thủy vực nước ngọt như ao, hồ, đầm, ruộng, sông, suối, cá sống ở tầng giữa và đáy Giới hạn nhiệt độ từ 00C - 400C, nhiệt độ thích hợp 200C - 270C, hàm lượng oxy cực tiểu cho phép là 2mg/lít, pH từ 4 -

9, cá sống ở nước ngọt đôi khi sống được cả vùng nước lợ có nồng độ muối tới 14‰ [2], [1]

1.1.1.3 Đặc điểm hình thái

Cá chép có thân hình nhẵn bóng, vẩy to tròn, thường có màu trắng bạc, hơi pha màu vàng, vây đuôi pha màu đỏ Do chọn giống, hiện nay có rất nhiều loại hình cá chép, ở nước ta đã gặp tới 6 loại hình khác nhau: cá chép trắng,

cá chép đỏ, chép kính, chép cảm, chép Bắc Cạn, chép gù [2].

1.1.1.4 Đặc điểm sinh sản và sinh trưởng

Ở Việt Nam cá chép thành thục sinh dục vào 1+ tuổi, tuổi thành thục và

cỡ cá thành thục của cá chép phụ thuộc vào vĩ độ, chế độ dinh dưỡng Nhiệt

độ thích hợp cho sinh sản của cá chép là 260C - 290C Ở các tỉnh miền Bắc cá chép sinh sản vào hai vụ là vụ xuân và vụ thu, nhưng tập trung vào vụ xuân,

tháng 2-5 dương lịch Đối với các tỉnh phía nam cá chép đẻ hầu như quanh năm, trong đó mùa đẻ tập trung vào mùa mưa [2].

Cá chép là loài đẻ trứng dính, có thể cho đẻ giá thể hoặc cho đẻ vuốt ấp trứng trong bình vây Cá chép thường đẻ vào sáng sớm, có khi kéo dài tới 8h -

9 h sáng hoặc đến trưa Tốc độ sinh trưởng của cá chép phụ thuộc vào chế độ thức ăn của vùng nuôi (Kết quả khảo sát 1965 - 1966, Trạm nghiên cứu cá nước ngọt Đình Bảng) Cá chép nuôi trong ao có thể dạt trọng lượng sau 1 năm từ 0,3 kg- 0,5 kg, 3 năm từ 1,0 kg - 1,5 kg Hiện nay ở phía Bắc có giống

cá V1 là loài cá 3 máu do viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I tiến hành lai tạo giữa 3 loài cá chép là cá chép Hungari, cá chép Indonexia và cá chép Việt,

ưu thế của cá chép V1 là thịt thơm, tốc độ tăng trưởng nhanh, có sức đề kháng

Hình 1.1 Nấm Saprolegnia

1.1.2.2 Đặc điểm của nấm Saprolegnia

1.1.2.2.1 Hình thái cấu tạo

Đây là nấm dạng sợi, thuộc nhóm nấm bậc thấp, cấu tạo sợi nấm đa bào nhưng không có các vách ngăn Sợi nấm có chiều dài 3mm - 5mm, đường kính sợi nấm khoảng 20- 42µm, có phân nhánh và chia làm 2 phần, một phần

gốc bám chắc vào cơ thể cá, phần ngọn tự do ngoài môi trường nước [4].

1.1.2.2.2 Hình thức sinh sản

* Sinh sản sinh dưỡng

Bằng cách phát triển ở đầu mút của khuẩn ty hình thành các bào tử màng dày, các hạch nấm các tế bào này đứt ra khỏi cơ thể mẹ và phát triển thành sợi nấm mới [4]

* Sinh sản vô tính

Trong quá trình sinh sản vô tính bắt đầu từ túi bào tử hình thành các bào tử động riêng biệt được giải phóng ra ngoài bơi, vận động tự do trong môi trường có hình ovan quả lê sau đó trải qua giai đoạn đứng yên để chuyển sang dạng bào tử hình quả thận vận động sau một thời gian bào tử nẩy mầm phát triển thành sợi nấm, khi chất dinh dưỡng đầy đủ đỉnh đầu sợi nấm phồng lớn, các nguyên sinh chất bắt đầu tập trung lại ở phần đỉnh bắt đầu xuất vách ngăn, ngăn cách giữa nơi tập trung nguyên sinh chất và phần ngoài sợi nấm để hình

thành túi bào tử và hoàn thành quá trinh sinh sản [4].

phình to ở đầu một nhánh sợi nấm gọi là thể sinh túi Thể sinh túi có thể là hình cầu hoặc hình trụ đầu kéo dài một ống gọi là sợi thụ tinh [4].

Khi đầu giao tử đực tiếp giáp với đầu thụ tinh, khối nguyên sinh chất chứa nhiều nhân của nó sẽ chui qua sợi thụ tinh để đi vào giao tử cái Các nhân xếp thành từng đôi, gồm nhân đực và nhân cái, các nhân kép được chuyển vào các sợi sinh túi do thể sinh túi mọc ra và sau đó phân chia giao tử cái ra nhiều tế bào lưỡng bội chứa nhân kép Tế bào ở cuối sợi uốn cong lại, hai nhân chứa trong tế bào này phân chia một lần thành 4 nhân Tiếp đó tế bào này tách ra thành 3 tế bào, tế bào ở chỗ uốn cong chứa hai nhân (một nhân đực, một nhân cái), tế bào ngọn và tế bào gốc chứa một nhân Từ túi bào tử mẹ tăng sinh ban đầu tập trung nhiều nguyên sinh chất sau đó từ một túi bào tử mẹ có thể sinh sản ra từ 1- 8 bào tử con bên trong khi các tế bào con thành thục được giải phóng từ bào tử mẹ sẽ tiếp tục nẩy mầm và phát triển thành sợi nấm Tế bào ở

chỗ uốn cong chính là tế bào mẹ của túi và phát triển túi bào tử [4]

Hình 1.3 Lá hẹ Allium tuberosum

1.1.3.2 Đặc điểm sinh học

Mùi vị của nó là trung gian giữa tỏi và hành tăm Hẹ là loại rau được dùng nhiều trong các món ăn Ngoài ra người ta còn dùng hẹ như hành hay tỏi để chữa nhiều bệnh từ thông thường đến phức tạp [44].

Hẹ có đặc điểm cao khoảng 20cm - 50cm, có thân mọc đứng, hình trụ hoặc có góc ở đầu Lá ở gốc thân, hình dài phẳng hẹp, có rãnh, dài 15cm - 30cm, rộng 1,5mm - 7mm [44]

Cây của vùng Đông Á ôn đới, được trồng rộng rãi làm rau ăn ở miền núi, trung du và đồng bằng Thường trồng bằng củ tách ở cây đã tàn lụi Có thể trồng vào mùa xuân, hoặc thu đông là tốt nhất Thường thu hái hẹ quanh

năm, dùng khi đang tươi [44].

1.1.3.3.Thành phần hoá học

Trong lá cây hẹ và củ hẹ có chất sunfua, saponin, chất đắng và hai hoạt chất tên là odorin, allicin có tác dụng kháng khuẩn, nấm mạnh Khả năng diệt trùng của allicin do oxy nguyên tử, allicin rất dễ kết hợp với một axit amin có gốc SH là Cystein của tế bào vi khuẩn để tạo thành hợp chất làm vi khuẩn hết khả năng sinh sản, dẫn đến ức chế Chất allicin tinh khiết là một chất dầu không màu tan trong cồn, trong bezen, trong ete, allicin cho vào dung dịch

nước dễ bị thuỷ phân làm mất tính ổn định của chất Allicin có phổ diệt khuẩn rộng với nhiều loại vi khuẩn như: thương hàn, phó thương hàn, lỵ tả, trực khuẩn bạch hầu, vi khuẩn gây thối rữa Odorin có tác dụng kháng mạnh đối

với tụ cầu và nhiều loại vi khuẩn thuộc vi khuẩn gram âm [8].

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH NẤM Ở ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nấm gây bệnh ở động vật thuỷ sản đã được nghiên cứu từ rất sớm Tuy nhiên đó chỉ là những nghiên cứu về tác nhân gây bệnh, tác hại của nó

Theo Willoughby (1969) một số bệnh gây chết cá hồi thường thấy ở

Scotlen, Italia, nguyên nhân là do một số loài Saprolegnia sp, bệnh thối mang

ở cá hồi cũng do Saprolegnia sp gây ra Ở cá loài cá khác bệnh này thường

do nấm thuộc giống Branchiomyces gây nên [26]

Theo Chen chin Leu (1973) một số loài cá nước ngọt ở tỉnh Hồ Bắc- Trung Quốc luôn nhiễm nấm Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces Còn Pichyang và Bodhala Mik (1983) thì cho rằng nấm Saprolegnia và Achlya là các giống gây ra hội chứng lở loét ở Thái Lan Subasinghe và ctv (1990) đã khẳng định Achlya là nấm gây bệnh duy nhất có liên quan tới dịch bệnh ở Srilanca từ trước tới nay [39]

Theo sổ tay phòng trị bệnh của Sở nghiên cứu tỉnh Hồ Bắc (1975) đã nghiên cứu ra các tác nhân gây bệnh nấm cá chủ yếu là nấm thủy mi Saprolegnia, Achlya, nấm mang Branchiomyces gây bệnh ở cá bột, cá hương,

cá giống và cả cá thịt ở các loài cá như trắm cỏ, cá mè hoa, mè trắng, trôi, rôphi chúng phát triển nhanh làm chết cá hàng loạt [6]

Theo Mekenzic và Hall (1976) lần đầu tiên phân lập được các sợi nấm không màu không chia đốt từ các vết loét ngoài da của cá đối với bệnh đốm

đỏ Theo Callian và ctv (1990) đã tìm ra một loài nấm Aphanomyces từ vết

loét xuất hiện sớm của một số loài cá bệnh và kết luận rằng: Bệnh này đã gây

ra đốm đỏ bằng cách xâm nhập lên da và nằm dưới cơ xương của những cá không chịu được sự thay đổi khắc nghiệt của môi trường nước Đây là những loài nấm gây bệnh cho tôm sông và hủy diệt đàn tôm sông ở Châu Âu [10]

Theo Roberts và ctv (1989) đã tìm thấy một loài nấm Aphanomyces

tương tự đã ký sinh trên tất cả các mẫu bệnh cá ở Bangladesh Họ đã xác định được rằng nấm dễ dàng phát triển trên các vết thương của cá nước ngọt Mặc

dù một số nấm đóng vai trò là tác nhân gây bệnh đầu tiên, nhưng nấm

Aphanomyces vẫn chỉ là những sinh vật xâm nhập thứ hai mặc dù vậy bệnh

do nấm này sẽ gây nguy hiểm cho cá và phải tìm ra những biện pháp hữu hiệu

để phòng trị nấm [34]

Hatai và Hasbiai (1993) cho rằng bệnh nấm Saprolegnia đã gây chết cá với tỷ lệ cao, được ghi lại lần đầu tiên ở cá hồi trong thuỷ vực nước ngọt ở

một trại nuôi ở quận Myaginia, Nhật Bản 1983 [25].

Theo tài liệu về “Hội chứng dịch bệnh lở loét ở cá” trong chương trình

dự án phát triển của FAO khẳng định rằng: Nấm luôn được coi là có vai trò quan trọng trong nguyên nhân tổng hợp của hội chứng dịch bệnh lở loét (EUS) Những giống nấm có liên quan với các biểu hiện của EUS như

Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces, tuy nhiên Saprolegnia là phổ biến nhất

có liên quan đến lở loét da Nhưng cá mới có dấu hiệu sớm của bệnh hoặc ở

giai đoạn vết thương đang lành thì khó có thể phân lập được nấm [3].

Plehn (1912) đã tìm thấy nấm Branchiomyces sanguitis trên cá chép

Cũng trên cá chép thì Tills (1977) đã phân lập được giống nấm Basidiobolus

ở giai đoạn cá giống Tuy nhiên bệnh nấm không chỉ xuất hiện trên cơ thể cá

mà chúng còn xâm nhập cả vào trứng của chúng như giống Achlya,

Aphanomyces, Saprolegnia đã phân lập được từ trứng của động vật thuỷ sản

nước ngọt (Neish & Hughes, 1980) [31].

Kishio Hatai, Gen- Ichihoshiai (1993) đã phân lập được một số loài

nấm từ những thương tổn của cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) trong đó có Saprolegniosis Một loài nấm thường xuyên được tìm thấy là Saprolegnia

parasitica, loài ít thấy nhất là Saprolegnia diclin[23].

Kazuyo Nakammura (1995) đã nghiên cứu kỹ lưỡng hệ thống coenzyme Q có trong 32 loài của Saprolegniales và Lagenidiales Những loài nấm này được phân lập từ các động vật bị nhiễm nấm, môi trường nước ngọt

và môi trường nước mặn Kết luận cho biết thành phần quan trọng nhất có trong nấm là coenzyme Q-9 [20] Cũng trong năm này ông cũng đã nghiên

cứu vá tìm thấy Legenidium nhiễm trên trứng và ấu trùng cua (Scyllya

serrata) trong quá trình sản xuất ở Bali, Indonisia Kết quả cho thấy trứng và

giai đoạn Zoea của cua đều bị chết khoảng 10% tổng số và có sự thay đổi màu sắc của trứng [21]

Kishio Hatai và ctv (1997) đã chứng minh được tính hiệu quả của H202

diệt nấm gây trên trứng cá hồi (Rain bow trout) Ở 500µg/ml H202 trong 60s ở

200C ức chế sự phát triển của động bào tử và 1000µg/ml H202 cũng ở thời gian

và nhiệt độ trên thì ức chế quá trình sinh dưỡng của nấm Trị bệnh với 100µg/ml H202 trong 60s ở 130C có hiệu quả nhất Nó hạn chế nấm bị nhiễm

và làm tăng tỷ lệ nở của trứng cá hồi [33].

Niulubol Kitancharoen, Kissshio Hatai và ctv (1997) đã nghiên cứu hiệu quả của NaCl kháng nấm Saprolegniasis ở trứng cá hồi Đã chứng minh trong 1h ở t0 = 130C, nồng độ tối đa NaCl = 25ppt là không gây độc đối với trứng cá hồi Nghiên cứu này cho thấy rằng nếu trị bệnh với nồng độ NaCl = 25ppt trong 1h, 2 lần trong 1 tuần thì trứng bị nhiễm nấm giảm và làm tăng tỷ

lệ nở trứng cá hồi Tiếp tục trị bệnh với NaCl ở nồng độ lần lượt là 3ppt, 5ppt, 7ppt thì tỷ lệ nở của trứng đều giống nhau Hơn nữa nhóm trị bệnh ở NaCl =

7ppt thì những trứng nhiễm nấm bị chết [32].

Hussein và Kishio Hatai (1999) đã phân lập được một loài mới trong hệ

thống Saprolegia có tên là Saprolegnia salmonis Được tìm thấy ở cá hồi đỏ

nuôi (Sockeye salmon) bị chết nổi ở Hokkaido, Nhật Bản [29].

Mortada M.A.Hussein, Kishio Hatai và Tetsuichi Nomura (2001) đã

tìm thấy bệnh nấm Saprolegniosis ở trứng và cá hồi nuôi (Salmoinds) tại một

trại sản xuất giống ở Hokkaido, Nhật Bản Hầu hết các trường hợp ban đầu đều có biểu hiện lâm sàng ở đặc điểm sinh học đó là sự phát triển của sợi nấm trên bề mặt cơ thể cá đặc biệt là ở đầu, vây, đuôi Có 33 loài được phân lập từ những thương tổn trên đều thuộc họ Saprolegnia Căn cứ vào hình thái học và

đặc điểm sinh học đã kết luận được 15 loài là Saprolegnia parasitica, 16 loài

là Saprolegnia salmonis và 2 loài là Saprolegnia australis [30]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Hiện nay bệnh ở động vật thủy sản đã được nghiên cứu rất nhiều Cùng với các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng thì bệnh do nấm cũng đã được nghiên cứu, tuy nhiên nó chỉ mới dừng lại ở những bài báo cáo về tác nhân gây bệnh và tác hại của nó, sự mô tả về nấm còn rất sơ sài và chưa được quan tâm như các tác nhân gây bệnh khác

Hà Ký (1967) đã kiểm tra thấy nấm thủy mi trên trứng cá chép tại trạm nuôi cá nước ngọt Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh và trại cá Thanh Liệt - Hà Nội Cũng vào năm này, Hà Ký và ctv đã nghiên cứu cách phòng trị nấm thủy

mi ở trứng cá chép và cá rôphi Kết quả đã xác định được nồng độ, liều lượng thuốc khi sử dụng và diệt nấm khi ấp trứng cá chép dưới ao dùng Xanh machite với nồng độ 0,1ppm bằng cách phun trực tiếp xuống ao (Tuy nhiên hiện nay Xanh machite đã bị cấm sử dụng) [7]

Theo điều tra của trung tâm thủy sản III - Nha Trang bệnh nấm và bệnh màng nhày xuất hiện từ cuối năm 1989, gây nhiều thiệt hại cho người sản xuất tôm giống [18]

Theo điều tra của Bộ môn bệnh cá - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, thì từ 1995 - 1996 những hộ nuôi baba ở Hà Nam và Hà Nội đã thiệt hại

do nấm gây ra làm chết từ 30% - 40% tổng số baba nuôi Năm 2000 bộ môn bệnh động vật thủy sản đã nghiên cứu bệnh trên cá trắm cỏ tại các tỉnh Tuyên Quang, Phú Thọ, Thái Nguyên, Hưng Yên đã xác định được khoảng 50% cá

bị nhiễm nấm Cũng trong năm này Viện Thủy sản I đã điều tra về bệnh cá Tuyên Quang, kết quả đã phân lập 35 mẫu có 12 mẫu nhiễm nấm chiếm 34,3% [13]

Bùi Quang Tề (1977) đã tiến hành nghiên cứu, thí nghiệm phòng trị bệnh nấm thuỷ mi cho trứng cá chép kính nội lai với cá chép trắng Việt Nam bằng xanh Malachite với các nồng độ 0,1ppm, 0,15ppm, 0,2ppm Kết quả ở các nồng độ đều hạn chế được nấm thuỷ mi phát triển trên trứng cá chép nhưng ở nồng độ 0,1ppm thì tỷ lệ sống và tỷ lệ nở ổn định hơn, tỷ lệ nở hơn 90% [12]

Năm 1996, tại viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, bộ môn bệnh động vật thủy sản đã đi sâu nghiên cứu tác nhân gây bệnh nấm cho động vật thủy sản, đã phân lập được nấm gây bệnh cho cá nước ngọt chủ yếu là

Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces, Branchiomyces [7].

Trong báo cáo kết quả nghiên cứu năm 2000 của bộ môn bệnh tôm cá - Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản I đã tiến hành nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh trên một số loài thuỷ sản ở một số tỉnh phía Bắc, đã phân lập được một số giống thường gặp là Aspergillus, Saprolegnia, Fuarium, Penicilium, Phoma [11]

Theo điều tra của bộ môn bệnh cá - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I từ 1999- 2002 ở các tỉnh miền Bắc và ven biển miền Trung Kết quả ở các loài cá nước ngọt như trắm cỏ, cá chình, cá trê, cá chép, mrigal, cá basa, tôm càng xanh phân lập được các giống chủ yếu là Aspergillus, Saprolegnia,

còn ở các loài nước mặn từ Thanh Hoá đến Nghệ An tác nhân gây bệnh chủ

yếu là các giống Fusarium, Hapliphthoros, Lagenidium [13].

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THẢO DƯỢC PHÒNG TRỊ BỆNH THUỶ SẢN

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Việc nghiên cứu và cho ra đời các sản phẩm thuốc từ thảo dược có tác dụng phòng và trị bệnh cho thuỷ sản thì còn rất nhiều khiêm tốn Nghiên cứu

và sử dụng kháng sinh thảo dược đã thực sự có những lợi ích thiết thực ví như chi phí thấp dễ sử dụng không gây hại đến môi trường nuôi cũng như môi trường xung quanh, tạo ra sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm Lợi ích cuối cùng của việc sử dụng thảo mộc đó là dễ tìm kiếm ngoài tự nhiên hoặc là nông dân có thể trồng được Chính vì vậy hiện đã có rất nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng thảo mộc vào trong lĩnh vực thuỷ sản

Mei – Chin Yin, Shih – Ming Tsao (1999), đã nghiên cứu hiệu ứng kìm hãm của 7 loài họ hành đối với 3 loài nấm mốc Hoạt tính kháng nấm và nồng

độ kháng nấm tối thiểu của dịch chiết từ tỏi, tỏi bakeri, cây tỏi tây Trung Quốc, cây hẹ, hành tây, hành tăm, củ hành chống lại các loài nấm Aspergillus,

A flavus và A fumigatus đã được nghiên cứu Những loài thuộc họ hành này đều có hoạt tính kháng nấm với tỏi thì có nồng độ thấp nhất, rồi tới hẹ Ngoại trừ hành, hiệu ứng kìm hãm các loài nấm của các loài họ hành là giảm khi nhiệt độ tăng và không có sự khác nhau khi pH = 2, 4, 6 [28]

Theo Masoomeh Shams - Ghahfarokhi, Mohammad - Reza Shokoohamiri (2005), thì dịch chiết từ hành, tỏi, hẹ được sử dụng để thử tính kháng nấm Malassezia furfur (25 loài) , candid albicans (18 loài) là rất tốt Tất

cả các loài hành này đều có khả năng ngăn chặn sự phát triển của tất cả các

loài nấm được sử dụng làm nghiên cứu Kết quả là tỏi và hẹ là 2 loài có hiệu quả cao nhất trong khả năng kháng nấm [27].

Ở Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu trong qui mô phòng thí nghiệm với 3 loại thảo mộc Ocimum sanctum (os), withania somniera (ws) và Myristik fragrans (mf) có ảnh hưởng kháng lại loài vi khuẩn vibrio Harvey gây bệnh trên cá song Epinephelus tauvina Vậy bước đầu đã có kết quả tốt trong việc

sử dụng Os, Ws, Mf có tính kháng vi khuẩn vibrio harvey Cũng tại Ấn Độ đã

có nghiên cứu kết luận chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống lại các

loài vi khuẩn Stapilococcus, Shigella, Salmonella, Pacilus, E.Coli,

Cloestridium [37].

Hasnabana (2004), ông đã nghiên cứu sử dụng Azadirachta indik,

Allium sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo mộc dùng để kháng

khuẩn Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng chúng là các thảo dược có tác dụng phòng bệnh nhưng không gây ô nhiễm môi trường Một nghiên cứu khác đề cập đến hiệu quả của thảo mộc đối với tính miễn dịch của cá chép Ấn Độ Thí nghiệm tiến hành trên cá có trọng lượng (200±17g) cho ăn thức ăn có chứa

0,5% rễ cây Achyranthes astera (Amaranthaceae) sau 4 tuần cho ăn nhận thấy

cá có khả năng sinh ra kháng thể [40].

Kobori và Tanabe (1993); Parasatporn và ctv (2005) đã khẳng định, những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị bệnh thuỷ sản ngày càng phổ biến do biên độ an toàn cao Các chiết xuất từ thảo dược như Hinokiticol, Citral và allylisocyanate được sử dụng rộng rãi trong bảo quản và

điều trị bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra [24].

Các chất như alixin trong tỏi, odorin trong hẹ, brazilin và sappanin trong Tô mộc mãi về sau này mới biết, song từ thế kỷ XIV, Đại y thiên sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều loại thảo mộc như tỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, trầu không… trị một số bệnh nhiễm khuẩn [14]

Binz (1867) đã chứng minh được quinin rất độc với Paramecium Ở nồng độ 1/20.000 ppm quinin làm suy yếu hoạt lực của Paramecium sau 2h

Từ đó Binz đưa ra vấn đề về khả năng dùng quinin để điều trị các bệnh do

paramecium [14].

Gries (1943) và Largralge (1956) chiết xuất được chất Juglon từ cây Hồ Đào, chất này là một dẫn xuất Natoquinon, Juglon có tác dụng với nhiều loại nấm và vi khuẩn có nhu bào [14]

Một số thử nghiệm ban đầu ở Ấn Độ cho thấy dịch chiết cây C.roseus (L.)

kích thích hoạt động thực bào ở cá Chép (Cyprinus carrpio) [17].

Noble (1990), Somporn (1994), Renault (1999) cho biết C.roseus (L.) là loại cây thuốc quan trọng vì nó có tới 150 loại alcalvid, trong đó có 2 loại quan trọng là vinblastin và vincristin được dùng trong điều trị bệnh máu trắng

và chống ung thư [17].

Chuntao Yuan, Dongmei Li, Wei Chen, Fangfang Sun, Guanghong

Wu, Yi Gong, Fianqing Tang, Meifang và Xiaodong Han (2007) đã nghiên cứu về tính miễn dịch của cá chép, trộn lẫn một số loại thảo mộc với nhau như

Astragalus mempranaceus (phần rễ và thân), Poligonum multiflorum (phần rễ), Isatis tinctoria (phần rễ), Glycyrrhida grabra (phần thân) cho cá chép ăn 0,5%

và 1% trong thời gian 30 ngày , kết quả cho thấy thảo dược giúp tính miễn

dịch của cá tăng lên đáng kể [19].

Hiện ở Trung Quốc sản phẩm có nguồn gốc từ tỏi (Allium sativum) dạng

bột mịn trắng đã được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trong việc phòng

và trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá trắm cỏ

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo kinh nghiệm dân gian, có khá nhiều loại cây thuốc nam, thảo mộc

đã và đang được sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản như lá xoan, tỏi, cây chó

đẻ răng cưa, hạt cau, hạt bí ngô, lá xoan đâu… mỗi một loại có tác dụng

khác nhau trong việc phòng và trị bệnh, một số cây có ưu thế trong việc phòng trị bệnh do tác nhân gây bệnh là ký sinh trùng và một số cây có ưu thế phòng trị bệnh nhiễm khuẩn.

Hợp chất có trong thảo dược rất phong phú, chúng được chia thành các nhóm bao gồm kháng sinh thực vật (phytocide) có tác dụng diệt khuẩn cũng như hạn chế sự sinh trưởng của các loại vi khuẩn như alinin có trong tỏi có tác dụng diệt khuẩn rất tốt Một số alkanoid và tannins, có trong cây xoan rừng có tác dụng diệt ký sinh trùng Ngoài ra một số hợp chất của quinols có trong rong biển có tác dụng ức chế sự sinh trưởng của một số loại nấm bậc

cao trong đó có cả Fusarium sp [8]

Nhiều gia đình nuôi cá ở huyện Anh Sơn (nghệ An) dùng một số thảo mộc phòng chữa một số bệnh thường gặp ở cá đã có kết quả rất tốt Như dùng

lá xoan để diệt trùng mỏ neo và trùng bánh xe; dùng lá thầu dầu chữa bệnh loét mang, bệnh đốm đỏ; dùng cây rau sam chữa bệnh viêm ruột do vi khuẩn

ở cá trắm cỏ; dùng cây tía đỏ chữa bệnh đường ruột cho cá trắm cỏ [42].

Kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học thuộc Bộ Môn Ngư Y- Khoa Thuỷ sản, Đại học Nông - Lâm - Huế và Bộ môn bệnh cá - Trường Đại học Nippon, Tokyo - Nhật Bản cho thấy, 2500ppm là nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết lá trầu với dung môi là nước cất và ethanol lên tất cả các nấm thuộc

họ Saprolegniaceae và Achlya Trong khi đó với nồng độ 1250ppm có khả

năng ức chế nấm Aphanomycespiscida Tuy nhiên nghiên cứu mới chỉ triển

khai trong phòng thí nghiệm [41] Nguyễn Ngọc Phước và ctv (2006) cũng đã

ghi nhận dịch chiết từ lá Trầu có khả năng tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Saprolegniaceae [10]

Nguyễn Thị Vân Thái, Bùi Quang Tề và ctv (2006) đã nghiên cứu xây dựng công thức chế phẩm VTH1- QT gồm tinh dầu kết hợp với nhóm Flavoinoids nhằm góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng chế phẩm với tác

dụng kháng khuẩn antioxidant và tăng cường khả năng thích nghi Kết quả bước đầu cho thấy tính kháng khuẩn của Flavonoid được tách chiết từ

Sambucus Chinensis L Caprifoliaceae là rất tốt [16]

Hiện tại ở Anh Sơn – Nghệ An đã sản xuất được sản phẩm thảo dược được chiết xuất từ cây Dầu Trăm Bầu với tên thị trường là FIBA ngoài việc trị được sán lá đơn chủ 16 và 18 móc, các ký sinh trùng sống trên mang, vòm miệng,vây và da cá như trùng bánh xe, trùng mỏ neo, trùng quả dưa thì loại thuốc này còn có khả năng tiêu diệt các loại nấm mang, nấm thủy mi…[42]

Ở Đồng bằng sông Cửu Long người dân thường dùng các loại cây như

lá trầu, cỏ mực, cỏ ri để trị bệnh ký sinh trùng cho cá có kết quả rất tốt Người dân thường sử dụng 10g cỏ mực + 10 lá trầu + 3cc dầu bạc hà trộn đều 1kg thức ăn, cho cá ăn từ 1-3 lần/ ngày [45]

Nhìn chung việc sử dụng các loại thảo mộc ở nước ta để phòng trị bệnh thủy sản còn rất khiêm tốn Đây là một hướng nghiên cứu rất tốt và sẽ phát triển trong tương lai Nhằm tạo ra những loại thuốc thay thế cho các hóa chất, kháng sinh đang dùng không tốt cho động vật nuôi cũng như môi trường

1.5 MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN CHỦ YẾU GÂY BỆNH NẤM CHO ĐỘNG VẬT THUỶ SẢN

Môi trường nước là yếu tố quan trọng quyết định tới năng suất và sức khoẻ của vật nuôi, là nơi để vật nuôi kiếm mồi, lấy oxy và thực hiện các chức năng của nó, tuy nhiên môi trường nước cũng lá nơi dễ lây lan mầm bệnh như bệnh nấm, đặc biệt ở những vực nước tù, nước có mùi tanh hôi động vật thuỷ sản rất dễ mắc bệnh Theo nghiên cứu của Suruki (1960) trong các dòng sông thường gặp các đại diện của giống Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces Như vậy trong nước luôn có sẵn các bào tử nấm gây bệnh, nếu môi trường càng ô

nhiễm thì nấm càng phát triển mạnh [38].

Theo Zobell (1946) thì 2 giống Achlya, Saprolegnia có thể phát triển trong môi trường pH = 3,2 – 9,6 như vậy trong quá trình nuôi, môi trường phải đầy đủ các thông số phù hợp cho nuôi động vật thuỷ sản [36].

Ngoài pH thì hàm lượng oxy hoà tan cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng của nấm Khi hàm lượng oxy hoà tan trong nước đầy đủ (>2mg/l ) sợi nấm nhỏ dài và phát triển nhanh, thời gian hình thành túi bào tử dài hơn, khi hàm lượng oxy hoà tan thấp khuẩn lạc chụm lại một chỗ, sợi nấm ngắn nhỏ, không

dễ hình thành túi bào tử [35] Bên cạnh môi trường nước thì nhiệt độ cũng ảnh

hưởng đến sự phát triển của nấm Nhiệt độ thích hợp cho nấm Saprolegnia gây bệnh và phát triển là 150C – 200C Đặc biệt là những ngày trời nồm ở

miền Bắc [6].

Hàm lượng muối trong nước cũng ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng sinh sản của nấm, hàm lượng nước trong muối cao có thể khống chế sự phát triển mầm của nấm nước ngọt vì thế dùng để ngâm tắm cá bị bệnh có tác dụng khống chế sinh trưởng của nấm Theo Lê Văn Khoa (2006) NaCl ở nồng độ

1,5% – 5% hạn chế sự nảy mầm của bào tử nấm [6] Tuy nhiên nguy cơ lây

nhiễm nấm có thể xâm nhập vào cơ thể động vật thuỷ sản ngay trong quá trình đánh bắt, vận chuyển, vì một lý do nào đó gây xây xát cơ thể là tạo điều kiện cho nấm xâm nhập và phát triển, ngoài ra mật độ dày cũng là nguyên nhân gây nên bệnh nấm do sự va chạm nhau nhiều trong môi trường nuôi nên

tỷ lệ lây nhiễm càng nhanh Vì vậy để hạn chế bớt những nguy cơ lây bệnh, người nuôi phải chú ý đến môi trường nước, nhiệt độ nước và nhiệt độ không khí cũng như những thao tác trong quá trình đánh bắt, vận chuyển tôm cá [4]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM, NỘI

DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

* Cá chép (Cyprinus carpio) không mang mầm bệnh có trọng lượng,

chiều dài trung bình 3cm -5cm để làm thí nghiệm

* Nấm Saprolegnia gây bệnh nấm thuỷ mi thuần chủng được phân lập

từ trứng cá chép bị bệnh

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Lá hẹ (Allium tuberosum) tươi, sạch, đã phơi khô tự nhiên.

- Dụng cụ chiết xuất nước ép lá hẹ: máy xay sinh tố, tủ lạnh, lưới lọc,

cốc đong, găng tay, kéo

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

* Môi trường GY agar (Glucose, Yeast extract, agar, nước cất)

* Môi trường GY brothh (Glucose, Yeast extract, nước cất)

* Nước cất khử trùng (tapwater) : Sử dụng nước máy lọc qua giấy thấm (18Ø), đổ vào bình thuỷ tinh, sau đó cho vào nồi hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 20 phút

Tất cả các môi trường nuôi cấy đều được hấp ở 1210C trong 20 phút.

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Khả năng ức chế nấm Saprolegnia của nước ép lá hẹ (Allium tuberosum).

- Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt tối thiểu (MFC)

- Hiệu quả của nước ép lá hẹ (Allium tuberosum) để diệt Nấm Saprolegnia

Có thể tóm tắt nội dung nghiên cứu như sau:

Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp tách chiết hẹ ( Allium tuberosum)

Tên đề tài

Mục tiêu của đề tài

Xác định nồng độ ức chế

tối thiểu và nồng độ diệt tối

thiểu của nước ép lá hẹ đối

Kết luận và kiến nghị

khoảng 1cm và cho vào máy xay sinh tố xay thật nhuyễn Dùng lưới lọc có kích thước nhỏ lọc lấy nước nguyên chất của hẹ, loại bỏ phần bã Nước hẹ đã lọc được lấy làm thí nghiệm và có thể được bảo quản ở tủ lạnh.

2.4.2 Phương pháp thử nghiệm nước ép lá hẹ diệt nấm Saprolegnia trong phòng thí nghiệm

Quá trình thí nghiệm xác định nồng độ của nước ép lá hẹ diệt nấm Saprolegnia được thể hiện ở sơ đồ sau:

Thí nghiệm 1: Thí nghiệm sàng lọc các nồng độ chế phẩm

Thí nghiệm được bố trí ở các đĩa peptri đã được khử trùng

Bước 1: Dung dịch nước ép lá hẹ được pha loãng bằng nước cất khử trùng ở

các nồng độ khác nhau, nồng độ sau giảm dần (với nồng độ cao nhất là 100%)

và mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nước ép

lá hẹ vào

Bước 2: Nấm thuần Saprolegnia được nuôi cấy ở môi trường tăng sinh GY

broth Sau 24h dùng kéo, panh cắt nhỏ những sợi nấm, rửa sạch trong nước cất

đã khử trùng 3 lần Những sợi nấm này cho vào dung dịch nước hẹ ở những

TN1

Xác định được nồng độ thấp nhất của nước ép lá hẹ có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Saprolegnia

Kết quả ở TN1 được pha loãng và xác định được nồng độ

ức chế tối thiểu của nước ép lá hẹ lên sự phát triển của nấm Saprolegnia

TN2

TN3

Xác định nồng độ diệt tối thiểu: Những nồng độ nước ép

lá hẹ ở TN2 được để trong tủ ấm Sau 7 ngày nồng độ thấp nhất mà nấm không thể phát triển được

nồng độ khác nhau đã được pha ở trên tương ứng với thời gian thử nghiệm (10phút, 30 phút, 1h, 2h, 24h, 48h).

Bước 3: Sợi nấm đã ngâm trong dung dịch nước hẹ được lấy ra và nuôi cấy trên môi trường GY agar Để trong 48h trong tủ ấm ở nhiệt độ 200C

Thí nghiệm 3: Xác định nồng độ diệt nấm Saprolegnia tối thiểu

Những nồng độ ức chế được sự phát triển của nấm ở TN2 sẽ được để trong tủ ấm Sau 7 ngày nồng độ thấp nhất mà nấm không thể phát triển được

đó là nồng độ diệt tối thiểu

2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm nấm trên cá chép

2.4.3.1 Chuẩn bị cá để cảm nhiễm

Cá dùng cảm nhiễm được nuôi 1 tuần trong điều kiện bể dùng làm thí nghiệm Trước khi cảm nhiễm cá phải được kiểm tra Nếu không bị bệnh được dùng để cảm nhiễm

2.4.3.2 Sản xuất bào tử nấm

- Từ đĩa GY agar có khuẩn lạc nấm phát triển, dùng dao giải phẫu cắt khối nấm nhỏ (kích thước khoảng 0,5 cm2) thả vào đĩa peptri có chứa 25ml môi trường GY broth nuôi cấy ở 250C trong 2-3 ngày

- Dùng panh nhặt những khuẩn lạc riêng rẽ trong GY broth rửa qua nước cất khử trùng (2-3 lần), sau đó thả vào các đĩa peptri có chứa 40ml nước cất khử trùng ở nhiệt độ 250C.

- Sau 24h nuôi cấy sử dụng buồng đếm xác định nồng độ bào tử động, pha nồng độ bào tử động ở các nồng độ khác nhau để dùng cảm nhiễm

2.4.4 Phân lập nấm

Theo phương pháp phân lập của Haita (1992) và Willoughby (1994) [22]

Có thể tiến hành phân lập nấm theo sơ đồ sau:

Nấm thuần

Kết luận giống nấm

Cá sau khi cảm nhiễm có dấu hiệu bệnh lý, phân lập được tác nhân gây bệnh thì chúng tôi tiến hành thử nghiệm nước ép lá hẹ để diệt nấm.

Thí nghiệm tiến hành trong 4 bể, mỗi bể 10 con

Bể 1, bể 2, bể 3 sau khi đã cảm nhiễm nấm Saprolegnia thì cho nước ép

lá hẹ (Alliumtuberosum) vào ngâm (Nồng độ và thời gian được xác định sau

phần kết quả)

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm thường xuyên quan sát, thu mẫu

và kiểm tra hàng ngày

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Xử lý số liệu trên phần mềm Ecxel

2.6 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Thời gian : Từ 5/05/2008 đến 5/10/2008

2.1.2 Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu quan trắc cảnh báo môi trường và

phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực phía Bắc - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I - Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

bể 4 (đc)

bể 3

bể 2

bể 1

3.1 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM NƯỚC ÉP LÁ HẸ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

3.1.1.Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc nồng độ của nước ép lá hẹ

Nước ép

lá hẹ(%)

Sự phát triển nấm / Thời gian nuôi cấy

10 phút 30 phút 1 giờ 2 giờ 24 giờ 48 giờ

Ghi chú : (+) : Dương tính ; (-) Âm tính

Từ kết quả sàng lọc ban đầu chúng tôi xác định được ở 5% nước ép lá

hẹ ở 1h có tác dụng ức chế khả năng phát triển của nấm Ở lô đối chứng nấm

không ngâm qua nước ép lá hẹ nấm vẫn phát triển bình thường

3.1.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu của nước ép lá hẹ