Thành phần loài nấm đối kháng trichoderma trên đồng lạc ở nghệ an và sự phát triển của t harzianum tri 011(1) NL trên moi trường rắn luận văn tốt nghiệp đại học

Trong đó, tận dụng khả năng đàn ápđối kháng của một số vi sinh vật cần được đánh giá cao để đối kháng lại các tácnhân gây bệnh truyền qua đất đến cây trồng mục tiêu.. Nhiều vi sinh vật n

LỜI CAM ĐOAN

Thực tập tốt nghiệp là thời gian để người sinh viên có điều kiện rèn luyệntính tự lực, độc lập trong suy nghĩ, bổ sung những kiến thức mới mẻ từ thực tiễn,nâng cao trình độ lý luận chuyên môn Tiếp tục rèn luyện đạo đức tác phong,quan điểm phục vụ của người cán bộ khoa học kỹ thuật

Để hoàn thành luận văn này tôi xin cam đoan:

1 Trong quá trình nghiên cứu, bản thân luôn nhiệt tình với công việc

2 Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực

3 Kết quả nghiên cứu của bản thân có được là nhờ sự giúp đỡ tận tìnhcủa thầy hướng dẫn PGS.TS Trần Ngọc Lân

4 Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn vàcác thông tin trich dẫn trong khóa luận đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh, ngày tháng năm

Tác giả luận văn

Võ Thị Trang

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình tiến hành làm khóa luận tốt nghiệp ngành kỹ sư Nônghọc, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía các thầy cô giáo, bạn bè,người thân…

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lờicảm ơn tới PGS TS Trần Ngọc Lân, người đã dìu dắt và hướng dẫn cho tôi từnhững bước đầu tiên làm quen với nghiên cứu khoa học, là người thầy đã rất tậntâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài khóa luận tốt nghiệp.Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo trong tổ bộmôn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kỹ thuật viên phòng thí nghiệmđặc biệt là NCS Nguyễn Thị Thu, KS Trần Văn Cảnh đã tạo mọi điều kiện về

cơ sở vật chất cũng như những sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho tôi trongsuốt quá trình làm đề tài

Xin được gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, họ hàng vàtất cả bạn bè, những người đã có sự hỗ trợ thiết thực cho tôi cả về mặt tinh thần,vật chất và công sức để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận của mình

Xin chân thành cảm ơn

Vinh, ngày tháng năm

Tác giả

Lê Thị Thanh Vinh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài 4

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Phân loại và lịch sử nghiên cứu nấm Trichoderma 5

1.1.1 Hệ thống phân loại của nấm Trichoderma 5

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Trichoderma 5

1.2 Đặc điểm hình thái và sinh thái của nấm Trichoderma 6

1.2.1 Đặc điểm hình thái 6

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma 7

1.2.3 Đặc điểm sinh thái của Trichoderma 9

1.2.3.1 Sinh cảnh 9

1.2.3.2 Thông số môi trường 10

1.2.3 3 Đa dạng thể nền 12

1.3 Vai trò của vi nấm Trichoderma 12

1.3.1 Vai trò của nấm Trichoderma trong việc xử lý hạt giống 13

1.3.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng và làm phân bón 14

1.3.3 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen 14

1.3.4 Lương thực và ngành dệt 14

1.4 Tính năng của Trichoderma trong phòng trừ sinh học 15

1.4.1 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma 15

1.4.2 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma 15

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động đối kháng 16

1.5 Nhân nuôi sinh khối vi nấm Trichoderma 17

1.5.1 Dinh dưỡng của vi sinh vật 17

1.5.2 Ứng dụng công nghệ len men bề mặt trong sản xuất sinh khối 19

1.6 Tổng quan tài liệu nghiên cứu 21

1.6.1.Những nghiên cứu trên thế giới 21

1.6.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 25

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Quy trình nghiên cứu 28

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.3 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 29

2.3.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 29

2.3.2 Dụng cụ phục vụ nghiên cứu 29

2.4 Phương pháp tiếp cận trong nghiên cứu vi nấm 29

2.4.1 Tiếp cận công nghệ sinh học hiện đại phù hợp 29

2.4.2 T iếp cận ứng dụng thực tiễn 30

2.5 Phương pháp thu thập và phân lập nấm Trichoderma 31

2.5.1 Phương pháp thu thập 31

2.5.2 Phương pháp phân lập 31

2.6 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm mốc A Flavus 32

2.7 Phương pháp nhân sinh khối nấm Trichoderma 34

2.7.1 Bố trí thí nghiệm 34

2.7.2 Môi trường PDA và phương pháp cấy nấm từ PDA sang PDA 36

2.7.3 Môi trường lên men lỏng và phương pháp cấy nấm 37

2.7.4 Chuẩn bị môi trường và phương pháp cấy nấm trên môi trường rắn 38

2.7.5 Phương pháp xác định số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu 39

2.7.6 Phương pháp pha loãng nồng độ bào tử 40

2.7.7 Phương pháp thu hồi sinh khối bào tử 40

2.8 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 40

2.8.1.Phương pháp thu thập số liệu môi trường rắn: 40

2.8.2 Phương pháp xử lý số liệu 41

Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Thành phần loài và mức độ phổ biến của các loài Trichoderma .42

3.2 Mô tả chủng Trichoderma harzianum Tri.011(1).NL 44

3.3 Khả năng đối kháng của chủng Trichoderma harzianum Tri.0011.NL với A.flavus 46

3.4 Khả năng sinh trưởng của T harzianum Tri.0011.NL trên các loại môi trường rắn 50

3.4.1 Ảnh hưởng của phương pháp cấy giống đến khả năng phát sinh bào tử của nấm T.harzianum Tri.011(1).NL 50

3.4.2 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến khả năng sinh trưởng của T harzianum Tri.011(1).NL 52

3.4.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh trưởng của T harzianum Tri.011(1).NL 54

3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng của T harzianum Tri.011(1).NL 60

3.5 Xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm T harzianum Tri.011(1).NL 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

1 KẾT LUẬN 64

2 KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PDA Potato Dextrose Agar/ môi trường thạch agar

PIMG Percent Inhibition of Mycelial Growth/ Tỷ lệ kìm hãm sự sinh

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 2.1 Thành phần và tỉ lệ các công thức môi trường rắn 35

Bảng 2.2 Thành phần và tỉ lệ công thức môi trường rắn 36

Bảng 2.3 Thành phần và tỷ lệ môi trường PDA 36

Bảng 2.4 Thành phần và tỷ lệ môi trường lỏng 37

Bảng 3.1 Tần suất xuất hiện Trichoderma trên đất ruộng lạc ở Nghệ An 42

Bảng 3.2: Thành phần loài nấm đối kháng Trichoderma trong đất lạc ở Nghệ An

43 Bảng 3.3 Khả năng đối kháng của các loài Trichoderma đối với chủng A flavus 46

Bảng 3.4 Khả năng đối kháng của các chủng T hazianum đối với chủng A

flavus 47

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của phương pháp cấy giống đến khả năng phát sinh bào tử của T harzianum trên môi trường rắn 51

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến độ bao phủ bề mặt môi trường của T harzianum Tri.011(1).NL 52

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thành phần cơ chất đến khả năng phát sinh bào tử của T harzianum Tri.011(1).NL 53

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến độ bao phủ bề mặt môi trường của T harzianum Tri.011(1).NL 54

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến khả năng phát sinh bào tử của T harzianum Tri.011(1).NL 56

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phát sinh bào tử của T.harzianum 61

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1 Bào tử của nấm Trichoderma harzianum Tri.011(1).NL 44

Hình 3.2 Cuống bào tử đính của Trichoderma harzianum Tri.011(1)NL 44

Hình 3.3 Mặt trước và mặt sau nấm Trichoderma harzianum Tri.011(1)NL trên đĩa petri 45

Hình 3.4 Chỉ số đối kháng của các loài Trichoderma 46

Hình 3.5 Chỉ số đối kháng của các chủng T harzianum 48

Hình 3.6 Sự đối kháng của chủng T harzianum Tri.011(1).NL với A flavus

Hình 3.10 Nồng độ bào tử của T harzianum Tri.011(1).NL trên các môi trường có các thành phần khác nhau 54

Hình 3.11 Khả năng phát triển sợi nấm của T harzianum Tri.011(1).NL trên các loại môi trường có tỷ lệ cơ chất khác nhau 55

Hình 3.12 Khả năng phát sinh bào tử của T harzianum Tri.011(1).NL trên các loại môi trường tỷ lệ cơ chất khác nhau 56

Hình 3.13.Sự phát triển của sợi nấm T.harzianum Tri.011(1).NL sau 3 ngày cấy 59

Hình 3.14 Sự phát triển của sợi nấm T.harzianum Tri.011(1).NL sau 5 ngày cấy

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, có khoảng 30% các loài thực vật đã bị phá hủy bởi tác nhân gâybệnh cây trồng (Merih KIVANÇ, 2002) [48] và chúng tiếp tục đe dọa cây trồngtrong sản xuất nông nghiệp Không những thế chúng còn đóng vai trò trực tiếptrong việc phá hủy tài nguyên thiên nhiên trong nông nghiệp Trong đất, sinh vậtgây bệnh đặc biệt là nấm gây thiệt hại nghiêm trọng Một số cây trồng quan trọngcủa đất chịu tác nhân gây bệnh như: Aspergillus, Pythium, Phytopthora, Botrytis,Rhizoctonia, Fusarium và Meloidogyne đã lây lan rất nhanh và tác động có hạitrên các cây trồng có tầm quan trọng kinh tế Với sự ra đời của các hợp chất hóahọc mà người ta nghĩ rằng đó là một giải pháp lâu dài và đáng tin cậy cho việcphòng trừ các tác nhân gây bệnh trong qua đất truyền qua cây trồng nhưng họ đãnhận ra rằng sử dụng thuốc trừ sâu không an toàn cho môi trường như chất độcgây ra ô nhiễm môi trường và có hại đối với con người (FA Mohiddin, 2010)[28] Để kiểm soát một mầm bệnh mục tiêu trong đất bằng thuốc trừ sâu đã làmảnh hưởng hơn 100 loài sinh vật không phải là mục tiêu (Alabouvette vàCouteadier, 1992)[7] Mặt khác, một số thuốc trừ sâu có hiệu quả đã bị cấm sửdụng trong nông nghiệp Do đó, để giảm bớt việc sử dụng hóa chất biện phápsinh học cần được áp dụng và tăng cường Trong đó, tận dụng khả năng đàn áp(đối kháng) của một số vi sinh vật cần được đánh giá cao để đối kháng lại các tácnhân gây bệnh truyền qua đất đến cây trồng mục tiêu Như vây được gọi là cáctác nhân kiểm soát sinh học (biocontrol) và công thức thương mại của chúng như

là thuốc trừ bệnh sinh học (biopesticides)

Nghiên cứu gần đây về kiểm soát sinh học đã được thực hiện với phươngpháp tiếp cận hệ thống lớn hơn và thiết thực hơn Nhiều vi sinh vật như nấm, vikhuẩn,… đã được thử nghiệm khả năng đối kháng của chúng để kiểm soát bệnh

gây hại cây trồng Trichoderma nằm trong số loài nấm phân lập từ đất và thường

xuyên trong hệ sinh thái gốc của thực vật (Harman và cs., 2004) [33] Hơn nữa,

Trichoderma spp chia sẻ gần 50% thị trường BCAs nấm Cho đến nay Trichoderma sp nằm trong số các tác nhân kiểm soát sinh học được nghiên cứu

nhiều nhất trong hơn 80 năm và thương mại trên thị trường như là thuốc trừbệnh sinh học, phân sinh học và cũng được sử dụng trong cải tạo đất (Harman,

2000; Harman và cs., 2004) [32], [33] Tùy thuộc vào các chủng, việc sử dụng

Trichoderma trong nông nghiệp có thể cung cấp rất nhiều lợi thế: (1) Thiết lập

quần thể vùng rễ (ưu thế vùng rễ) cho phép thành lập nhanh chóng trong quần xã

ổn định trong vùng rễ, (2) kiểm soát gây bệnh và cạnh tranh của hệ vi khuẩnbằng cách sử dụng nhiều cơ chế, (3) cải thiện sức khỏe cây trồng và (4) kíchthích tăng trưởng gốc (Harman và cs., 2004)

Cây lạc sản xuất củ (quả) lạc, là loại thực phẩm cho dầu quan trọng trong

số những cây công nghiệp thực phẩm ngắn ngày không chỉ ở Nghệ An mà cả trên

thế giới Nhưng một bất cập rất đáng quan tâm là việc nhiễm nấm Aspergillus (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus) sinh độc tố aflatoxin (trước khi thu

hoạch và sau khi thu hoạch lạc), một loại độc tố ảnh hưởng nghiêm trọng đến sứckhỏe con người Nhiều biện pháp được đưa ra để làm giảm thiểu độc tố mà cácloại nấm mốc này sinh ra, tuy nhiên bệnh phát sinh từ đất, lan truyền mạnh quađất, không khí và cả trong nguồn nước Cho nên đã hạn chế các phương pháp đưa

ra như phương pháp hóa học, sử dụng hóa chất bảo quản,… Vì vậy, để kiểm soátloài nấm này, trên thế giới các nhà khoa học đã thành công trong việc sử dụng

chủng nấm đối kháng Trichoderma dựa vào các cơ chế ức chế bệnh có thể là

competition (cạnh tranh), antibiosis (sự đối kháng) hoặc mycoparasitism (ký sinh

nấm) đối với Aspergillus.

Mỗi vùng có thể sẽ có những chủng nấm Trichoderma spp khác nhau với

những hiệu quả đối kháng khác nhau được gọi là các chủng bản địa Các chủngbản địa sẽ thích ứng tốt với điều kiện ở vùng đó và tạo điều kiện cho khả năng

đối kháng cao Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Thành phần loài

nấm đối kháng Trichoderma trên đồng lạc ở Nghệ An và sự phát triển của

Trichoderma hazianum Tri.011(1).NL trên môi trường rắn”

Kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp một phần quan trọng trong việc phòng trừnấm mốc sinh độc tố aflatoxin và là nguồn dẫn liệu ban đầu cho những nghiêncứu sau này

2 Mục đích nghiên cứu

2.1 Mục đích tổng quát

Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích xác định thành phần loài Trichoderma

sp ở Nghi Lộc, Nghệ An và đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm

T hazianum trên các loại môi trường khác nhau, từ đó tìm ra loại môi trường và phương pháp nhân sinh khối thích hợp nhất để nhân nhanh sinh khối nấm T hazianum phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Thu thập phân lập xác định thành phần loài Trichoderma sp.

- Lựa chọn chủng nấm đối kháng với Aspergillus flavus

- Nhân sinh khối trên các loại môi trường

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm Trichoderma spp nói chung và nấm đối kháng Trichoderma hazianum thu được ở Nghi Lộc, Nghệ An vào tháng 4/2011.

- Nguyên liệu sử dụng là các loại bột sẵn có: cám gạo, cám ngô, cám vỏ lạc,trấu,…

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập và phân lập để xác định thành phần loài Trichoderma sp có

trên đất ruộng trồng lạc ở Nghi Lộc, Nghệ An

- Nuôi cấy và bảo quản mẫu nấm Trichoderma sp.

- Đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma hazianum với Aspergillus flavus

- Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm T hazianum trên

môi trường rắn nhằm lựa chọn ra môi trường cho nồng độ bào tử lớn nhất trongthời gian ngắn nhất

4 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài

Kết quả của đề tài góp phần cho các nghiên cứu về nấm đối kháng

Trichoderma thêm đa dạng, phong phú hơn Ngoài ra đề tài này cung cấp những dẫn liệu về nhân sinh khối nấm Trichoderma hazianum để phòng trừ sinh học nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin.

Chương I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phân loại và lịch sử nghiên cứu nấm Trichoderma

1.1.1 Hệ thống phân loại của nấm Trichoderma

Trichoderma được phân loại như dưới:

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Trichoderma

Các chi Trichoderma đã được mô tả năm 1791 tại Đức và bốn loài đã

được mô tả ban đầu Năm 1927, Gilman và Abbott được công nhận bốn loài Cácloài này được phân biệt dựa trên cơ sở của màu sắc và hình dạng của bào tử nấmcủa chúng và về sự xuất hiện Colony Phần lớn các loài được xác định

là T lignorum (= T viride) bởi vì các bào tử của nó có dạng hình cầu hoặc

là T koningii vì bào tử của nó có dạng hình chữ nhật Tiềm năng sử dụng Trichoderma sp như là tác nhân kiểm soát sinh học đã được đề xuất hơn 80

năm trước đây bởi Weindling (1932) [64] là người đầu tiên cho thấy hoạt động

ký sinh của các thành viên của chi này với tác nhân gây bệnh như R solani Trichoderma có lẽ nổi tiếng nhất là “ký sinh nấm” được đề xuất như là một tác

nhân kiểm soát sinh học chống lại tác nhân gây bệnh truyền qua đất trên nhiềucây trồng

1.2 Đặc điểm hình thái và sinh thái của nấm Trichoderma

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Nấm đối kháng Trichoderma là nhóm nấm đất, phát triển tốt trên các loại

đất giàu dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật Đặc điểm hình thái của nấm này làcành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phânnhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn Bào tử thường có màu xanh, đơn bào,hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy theo từng loài Bào tử đính ở đỉnh củacành

Rifai (1969) [56] và Bissett (1991a) [12] đã nghiên về hình thái vi sinh vật

mà họ sử dụng để mô tả và phân biệt loài Trichoderma sp Cả hai tác giả nhấn mạnh những khó khăn vốn có trong việc định loại hình thái của Trichoderma.

Samuels (1996) [57] cũng cung cấp những quan sát chi tiết và ý kiến về các tiện

ích của hình thái học để xác định loài Trichoderma sp Đặc điểm hữu ích cho sự

mô tả và nhận dạng trong các chi Hyphomycete rất khác thường không có ích

trong việc phân biệt các loài Trichoderma sp., thường là vì phạm vi hẹp của các biến thể của các hình thái đơn giản hóa trong Trichoderma sp., hoặc bởi vì thuật

ngữ để mô tả sự biến đổi về màu sắc hoặc khuôn mẫu không đủ chính xác để xácđịnh sự khác biệt giữa các loài Tuy nhiên, quan sát hình thái cẩn thận thường là

đủ để nhận dạng các loài và chủng Trichoderma spp., ít nhất là đến mức đơn vị

phân loại đã được phân biệt hình thái học và được mô tả đầy đủ trong các tài liệuhiện có Nhận dạng dựa trên đặc trưng hình thái vẫn là phương pháp chính để xác

định và xác minh của loài Trichoderma sp.

Có thể đặc điểm của colony là nét đặc trưng của một loài và để phân biệtvới các loài khác Tuy nhiên, vẻ bề ngoài của colony rất khó để mô tả với độchính xác đủ cho việc nhận dạng Tốc độ tăng trưởng trong môi trường có thểhữu ích để phân biệt các loài tương tự Việc sản xuất bào tử nấm từconidiophores tỏa ra, hoặc từ conidiophores kết hợp thành cụm hay nhỏ lẻthường là nét đặc trưng của một loài

Sự phân tán (diffusable) của sắc tố cũng có thể là điểm đặc trưng, mặc dù

màu sắc của các sắc tố như không thay đổi nhiều trong Trichoderma

Chủng T longibrachiatum có thể là điểm chung (referable) để phân

biệt, nó thường có màu vàng tươi lẫn màu xanh lục, ít nhất là khi lần đầu tiênphân lập

Sắc tố mờ màu vàng rất phổ biến ở nhiều loài, nhưng không phải là điểmđặc biệt Đặc điểm tinh thể được sản xuất tại các môi trường nhân nuôi đã được

báo cáo chỉ cho loài Trichoderma aureoviride Mốc hoặc mùi mốc không rõ ràng thường được sản xuất bởi các chủng Trichoderma spp khác nhau Mùi thơm đặc trưng giống như dừa thường được sản xuất bởi các chủng của Trichoderma viride, và đôi khi cũng do từ Trichoderma atroviride.

Các kiểu hình nhánh của conidiophore và sự tập hợp của conidiophoresvào một cụm và những mụn mủ là rất hữu ích để xác định các

chủng Trichoderma spp để phân chi và kết hợp với các loài nấm Conidial có

hình dạng thay đổi từ hình cầu, elip, ô van, hoặc hình trụ ngắn, với sự kết thúc cơbản nhiều hoặc ít thon hơn và cắt ngắn Sắc tố của conidial cũng được đặc trưng,thay đổi từ không màu (màu trắng trong), với nhiều màu xanh, hoặc ít hơnthường có màu xám hoặc nâu Ở một số loài trưởng thành bào tử nấm màu xanh

lá cây xuất hiện màu đen trong các kính hiển vi gắn kết, trong những loài khácchỉ có màu nhạt [1]

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma

Trichoderma là loại nấm hoại sinh sống trong đất nên Trichoderma có khả

năng sử dụng nguồn hỗn hợp carbon và nitrogen Nguồn carbon và năng lượng

Trichoderma sử dụng được là Monosaccharides và Disaccharides, cùng với hỗn

hợp Polysaccharides, puriness, pyrinidines, acide amin, tanmins và caechins côđọng; Aldehydes và acide hữu cơ Đặc biệt là acide béo (E.B Nelson, G.E.Harman, dữ liệu chưa được công bố), methanol methylamine, formate và NH3 lànguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi trồng Trichoderma Nhữngnguồn nitrogen nào cũng cần hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng Muối,

các nguồn sulfur và các hỗn hợp như vitamin cũng có ảnh hưởng lớn đến khả

năng sinh trưởng của Trichoderma Nhưng muối sodium chloride sẽ làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Trichoderma sp Do đó trong môi

trường nuôi cấy không được có mặt của muối này Nồng độ CO2 trong môitrường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm đối kháng trong đất.Tuy nhiên ảnh hưởng của CO2 đến khả năng sinh trưởng và sản xuất của

Trichoderma phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường đất CO2 nồng độ 10%

không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Tốc độ mọc nhanh của Trichoderma ở nồng độ CO2 cao trong môi trường kiềm, có thể giải thích tại sao Trichoderma thường sống trong môi trường đất phèn, ẩm ướt, ít hiện diện trên đất kiềm Vì thế CO2 có ảnh hưởng đến sinh trưởng của Trichoderma tại độ

pH có giá trị cao

Sự hình thành bào tử trên môi trường: Phần lớn các loài Trichoderma sp.

có cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều kiện môi trường tự nhiên và nhân tạodưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất hiện trong điều kiện sáng.Môi trường agar trong khoảng 20-30 giây ánh sáng 85 Lux làm tăng hiệu quả nảymầm Thể bào tử phialoconidio cảm ứng với ánh sáng nhất sẽ xuất hiện nhiềudưới ánh sáng ban ngày chỉ trong khoảng 3 phút hoặc gần tia cực tím (bước sóng

366nm) trong khoảng 10 – 30 giây Trichoderma không hình thành bào tử ở bước

sóng dưới 254nm hoặc trên 1.100nm và hình thành bào tử nhiều nhất ở bướcsóng 380nm đến 440nm Các bào tử cảm quang hạn chế phát triển dưới ảnhhưởng của các hóa chất Các hỗn hợp như azaguanine, 5-fluorouracil, actiomycin

D, cycloheximide, phenethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hìnhthành các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc đặc biệt của cơ thể rất quan trọng

trong hình thái, làm tăng tiềm năng trong phòng trừ sinh học Các loài T hamatum, T hazianum, T viride, T virens ở trong cả môi trường lỏng và rắn có

acide thích hợp cho bào tử nảy mầm hơn là môi trường trung tính [1]

1.2.3 Đặc điểm sinh thái của Trichoderma

Trichoderma Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và

liên quan đến hiện tượng giảm khả năng kháng nấm trong đất Độ nhạy của đấtkháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và đất acide Các bào

tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nấm hơn bào

tử phân sinh

Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây: Trichoderma đã được phân lập từ rễ

cây và có khả năng dùng vào việc phòng trừ sinh học tại vùng rễ cây bị bệnh

Hiệu quả của Trichoderma không chỉ xử lý hạt mà còn tiếp tục thiết lập quần thể dưới vùng rễ cây sau khi xử lý hạt Trichoderma xử lý hạt phát triển nhanh xung

quanh hệ rễ tạo các bào tử ngăn cản bệnh xâm nhiễm cây trồng NếuTrichoderma được cấy vào đất với tác dụng chống bệnh cho cây bắt buộc phải

cấy dọc theo bề mặt rễ nhưng cách xa lá mầm Trichoderma có khả năng diệt trừ bệnh thối rễ, hạt và bệnh chết cây con Những nghiên cứu gần đây cho thấy T hazianum không thiết lập quần thể xung quanh hệ rễ cây họ đậu và cây đậu Hòa

Lan con Quan sát bào tử trên vùng rễ cây gồm rễ, vỏ, hạt bị thối và lá mầm, sốlượng bào tử trên mỗi gram đất xung quanh hệ rễ luôn luôn ít W.L.Chao, G.E.Harma và E.B.Nelson (1986) [17] trên số liệu không công bố, cho rằng bào tử

của Trichoderma ít thiết lập quần thể hay ít di chuyển vào vùng rễ cây Với T hazianum vài bào tử được tìm thấy cách xung quanh hệ rễ cây 10cm, trên cây

được xử lý hạt Ngược lại, số lượng bào tử tìm thấy nhiều trên là mầm đậu HòaLan bị thối và vỏ hạt giống kể cả mẫu bệnh xung quanh rễ Có nhiều giải thích về

việc số lượng bào tử Trichoderma tăng hoặc giảm trong đất và Trichoderma

không có khả năng thiết lập quần thể ở vùng rễ cây, do có nhiều lý do, bao gồm

thiếu dinh dưỡng, sự có mặt của các chất độc trong rễ cây hay sự có mặt của chất

kháng hoặc sự có mặt của vi sinh vật đối lập với Trichoderma (W.L Chao, G.E.

Hazman, E.B Nelson, 1986) [17] tại vùng rễ hay mức độ rễ của cây Ví dụPseudomonas đối lập với tác nhân phòng trừ sinh học nhưng khi có mặt của chấtsắt trong vùng rễ của cây hay Pseudomonas sản xuất chất độc chuyển đổi gây ảnh

hưởng đến bào tử của Trichoderma

Trichoderma sp - loài nấm đất quốc tế (Waksman, 1952) [62] Chúng

xâm chiếm hàng loạt trong các hốc đất từ ôn đới mát mẻ tới vùng khí hậu nhiệtđới, bao gồm đất nông nghiệp, vườn cây, rừng, đồng cỏ và sa mạc Bản chất hoại

sinh của Trichoderma tạo cho chúng có khả năng hiện diện trong tầng đầu của

đất (F và H), nơi sợi nấm có mật độ cao và có thể được phục hồi Tính linh hoạt

cao của chi này là một số loài Trichoderma cũng được thu thập trong các môi

trường khắc nghiệt như vùng đầm lầy ngập mặn, đầm muối, cửa sông trầm tích(Borut & Johnson, 1962 [13]; Domsch và cs., 1980 [25]; Lee & Baker, 1972)[44] nơi điều kiện bất lợi tiềm năng thẩm thấu đặt ra một thách thức thực sự chonấm sự sống còn Tuy nhiên, môi trường đó trở thành thuộc địa phổ biến của T

viride Pers ex Gray, các loài khác như T harzianum được thấy nhiều ở các vùng

rễ của cây trồng (Parkinson và cộng sự, 1963) [50] như khoai tây, lúa mì vàthuốc lá và cũng có thể được phân lập từ rễ của cây lâu năm như cây liễu

(Gochenaur & Backus, 1967) [30] Do đó có thể nói rằng chi Trichoderma không

bị giới hạn bởi phạm vi môi trường sống Những hạn chế khả năng nhất cho chinày là các thông số (giới hạn) môi trường yêu cầu cho sự phân tán và phổ biếncủa các loài cụ thể

1.2.3.2 Thông số môi trường

Thành phần, sinh khối và hoạt động sinh học của cộng đồng vi khuẩntrong đất phụ thuộc vào các yếu tố vật lý và hóa học Các thông số môi trườngnhư nhiệt độ của đất, độ ẩm, không khí, độ pH, chất hữu cơ (OM), điều kiện dinhdưỡng và loại cây trồng là chìa khóa các yếu tố ảnh hưởng đến đất thuộc địa của

loài Trichoderma sp (Carreiro & Koske, 1992; Danielson & Davey, 1973d;

Domsch và cs, 1980; Eastburn & Butler, 1988b; Klein & Eveleigh, 1998;Widden & Abitbol, 1980) [27] Các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng loài

Trichoderma sp có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ đất đến sự phân bố của chúng Các loài như T harzianum thường phân lập được từ đất ấm nhiệt đới trong khi T polysporum và T viride chủ yếu là tại khu vực ôn đới mát mẻ Các

khoảng nhiệt độ mà tại đó loài Trichoderma có thể phát triển khá rộng, nó có thể

nhỏ nhất là 0°C cho T polysporum và cao đến 40°C cho T koningii Nhiệt độ

không chỉ ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của các loài Trichoderma, nó cũng ảnhhưởng đến hoạt động trao đổi chất của chúng đặc biệt sản xuất thuốc kháng sinh

dễ bay hơi (Tronsmo & Dennis, 1978) [61] và enzyme

Độ ẩm hoặc nước tiềm tàng cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng

đến sự thành lập các quần thể Trichoderma cũng như vi sinh vật khác trong

đất (Lavelle & Spain, 2001) [43] Nước tiềm tàm là phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt

độ đất và trở nên tiêu cực hơn khi nhiệt độ tăng Hầu hết các loài

Trichoderma sp đòi hỏi một mức nước tiềm năng thấp để đạt được mức tăng

trưởng tối ưu và quẩn thể nói chung là phong phú hơn trong đất ẩm, đặc biệt là ở

lứa ẩm (Danielson & Davey, 1973a) [19] Mặc dù vậy, một số loài như T viride

đã được biết để đạt được tốc độ tăng trưởng nước tiềm năng của đất là -240

MPa Nấm từ chi Trichoderma dường như ảnh hưởng tích cực của chất axit n,

hầu hết các loài có một phạm vi tối ưu pH của 3,5-5,6 cho cả nảy mầm, tăngtrưởng của bào tử và thậm chí có thể tăng trưởng ở pH 2.1

Nói chung, chúng thường được chấp nhận nhiệt độ, độ ẩm và độ pH củađất là yếu tố môi trường quan trọng nhất trong việc xác định việc tập hợp cũng

như phân bố của các loài Trichoderma sp Chúng cũng liên quan đến một lưu ý

rằng đất là một môi trường rất phức tạp và các yếu tố môi trường khácnhư: lượng dinh dưỡng (nitơ sẵn có), oxy hóa khử (Eh), cấu trúc và kết cấu đất,thành phần không khí trong đất và bức xạ mặt trời có thể đóng vai trò quan trọng

trong hoạt động của vi sinh vật và loài Trichoderma sp.

1.2.3 3 Đa dạng thể nền

Nấm hoại sinh như loài Trichoderma sp có khả năng chuyển hóa một loạt

các nguồn carbon Phần lớn các loài phát triển tốt về chất cacbon đơn giản giốngnhư sucrose, D- mannose, D-xylose, D-galactose, D-fructose và raffinose(Danielson & Davey, 1973b [20]; Domsch và cs., 1980 [25]; Klein & Eveleigh,

1998 [40]; Papavizas, 1985) [52] nhưng hiện tại hầu hết carbon trong OM đất bịliết kết trong các phân tử phức tạp với trọng lượng cao phân tử được gọi làpolysaccharides Với ngoại lệ của lignin, polysaccharides như cellulose, chitin,xylan, tinh bột và pectin có thể dễ dàng bị xuống cấp bởi hầu hết các loàiTrichoderma thông qua việc tiết các enzym polysaccharase cụ thể (Dix &

Webster, 1995 [24]; Klein & Eveleigh, 1998 [40]) Một số chủng Trichoderma

spp cũng có thể làm suy giảm hợp chất xenobiotic như hydrocarbon, thuốc trừsâu clo hữu cơ và thậm chí các hợp chất như methanol

Hầu hết các loại nấm hoại sinh có yêu cầu nitơ đơn giản và có thể táichế axit amin nhất được tìm thấy trong đất (Kubicek-Pranz, 1998) [42] Loài

Trichoderma sp có khả năng chuyển hóa các nguồn nitơ phức tạp và đơn

giản Khi carbohydrate được sử dụng như là nguồn cacbon, amoni thường được

sử dụng dễ dàng hơn chứ không phải là nguồn nitơ nitrat và axit amin nhưaspartic acid, alanine,casamino acid và acid glutamic, cung cấp các nguồn nitơ

hữu cơ tốt nhất cho Trichoderma Cũng cần lưu ý rằng khả năng chuyển hóa các nguồn nitơ như nitrat của các loài Trichoderma sp khác nhau rất nhiều giữa các

loài khác nhau

1.3 Vai trò của vi nấm Trichoderma

Loài Trichoderma sp có mặt gần như trong tất cả các loại đất và trong

một số môi trường sống khác Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triểnmạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Nhữnggiống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phươngpháp Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễphụ thuộc vào từng giống Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những

giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và còn hiệu lực cho đến 18 thángsau khi sử dụng Tuy nhiên không nhiều giống có khả năng này

Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế

cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sựsinh trưởng và phát triển của cây Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinhhọc và nâng cao sự sinh trưởng của cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng.Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từ gen khác nhau Sauđây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranh chất dinhdưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng sựphát triển của cây và rễ; làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ, cảm ứng

sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh

Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là

cơ chế sinh sản vô tính Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã đượcghi nhận nhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phươngpháp kiểm soát sinh học Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khácnhau về hình thái chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiềuphương pháp phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng Hiện nay, nấm

Trichoderma ít nhất có 33 loài [1].

1.3.1 Vai trò của nấm Trichoderma trong việc xử lý hạt giống

Sử dụng Trichoderma vào việc xử lý hạt giống có liên quan đến khả năng xâm nhập của Trichoderma vào trong đất, phương pháp này đòi hỏi một số lượng

bào tử lớn để áp dụng Tuy nhiên, đây là một phương pháp rất có ý nghĩa trongviệc phòng trừ nấm gây bệnh ở giai đoạn hạt đến giai đoạn cây con Khả năng

PTSH của nấm T hamatum với bệnh chết rạp cây con do nấm R solani

và Pythium spp có hiệu quả trên hạt giống đậu Hòa Lan và củ cải đường

(Harman và cộng tác viên, 1980) Dòng nấm T harzianum xử lý qua tia tử ngoại

và T viride có hiệu quả trong PTSH

1.3.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng và làm phân bón

Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiềunăm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật doviệc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so vớithông thường Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu

rõ ràng hơn trong thời gian gần đây Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã

được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 mdưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khảnăng chịu được hạn hán Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có

sự hiện diện của nấm Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn

đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

Ngoài ra, Trichoderma có khả năng phân hủy Celulose,… nên chúng được

ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm để ủ phân làm phân sinh học

1.3.3 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mãhoá các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học Nhiều

gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng

rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh Chưa

có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiêncứu và phát triển

1.3.4 Lương thực và ngành dệt

Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào rất có

hiệu quả Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và cácenzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thườngđược sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự [1]

1.4 Tính năng của Trichoderma trong phòng trừ sinh học

1 4.1 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma

Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Vào năm

1932 Weiding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và

đặt tên cho hiện tượng đó là ”Giao thoa sợi nấm” (Cnyder, 1976) Hiện tượng

giao thoa gồm ba giai đoạn như sau: (1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh; (2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh cây; (3) Cuối cùng là sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng

lớp tế bào của nấm gây bệnh, dẫn đến sự gây bệnh làm cho chất nguyên sinhtrong nấm gây bệnh bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh chết Sau này quan sát

dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây

bệnh teo lại và chết (Dubey, 1995; Rousscu và cs., 1996) Ngược lại ở những

điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh

ra gây độc cho nấm gây bệnh (Agrowcal và cs., 1979; Michrina và cs., 1996) [1]

1.4.2 Các sản phẩm trao đổi của nấm Trichoderma

Weidling (1932-1941) là tác giả đầu tiên công bố sản phẩm được trao đổi

của Trichoderma Weidling và Emerson (1936) [65] đã phân lập được chất kết

tinh từ chất trao đổi hữu cơ rất độc khi pha loãng nhiều lần khi dùng

Trichoderma chống R.solani Chất này tên thông thường là Gliotoxin, chất độc thứ 2 do Brian và Mc Growan (1945) [14]ư công bố là viridin sản xuất từ T viride Webster và Lomas (1964) [63] ghi nhận là hai chất kháng sinh này đều hiện diện trên môi trường được lọc từ T viride Dennis và Webstre (1971) [23] ghi nhận Trichoderma spp có sản phẩm kháng, khác với gliotoxin và viridin, sản

phẩm đó là chất kháng sinh, có thể hòa tan được trichlorofore tên thông thường là

T viride và T polysporum và 1 chất kháng peptied từ T hazianum Ngoài chất độc là chất trao đổi và kháng sinh ra, Trichoderma còn có thể tiết ra nhiều enzym

khác như exo và endoglucanases, cellobiase và chitinase có khả năng phân hủy

thành tế bào của nấm gây bệnh Nấm Trichoderma cũng như một số nấm mốc khác như Gliocladium, Calvatia cho lượng enzym chitinase cao, chitinase có

nhiều chức năng, một trong những chức năng chính là khả năng phân hủychitinase là thành phần chất dính cấu tạo vách tế bào nấm, yếu tố rất quan trọngtrong hoạt động ký sinh nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật, cácthành phần cấu tạo của thành tế bào ở nấm Chitine có thể bị phân hủy bởi acide

vô cơ mạnh (HCL đậm đặc, H2SO4 đậm đặc) hoặc bằng enzym sinh vật Trong

quá trình ký sinh trên nấm bệnh, Trichoderma có thể tiết ra các loại enzym để

phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh

Ngoài ra, 3 loại enzym ngoại bào khác sinh sản ra từ nấm Trichoderma đã

được tách chiết, tinh sạch cũng có hoạt tính phân hủy Chitine Các enzym đó làN-acetylglucosamidase, Chitosesidase và Endochitinase

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động đối kháng

- Yếu tố ảnh hưởng chất biocontrol: Ưu thế vùng rễ: ưu thế vùng rễ là khả

năng định cư và phát triển gắn với rễ cây Điều này có thể là yếu tố quan trọngnhất trong việc xem xét tiềm năng của bất kỳ loài được phân lập để kiểm soátsinh học bởi vì nó là thước đo khả năng phân lập của một loài tồn tại trong đất

- Nhiệt độ: Điều quan trọng là hiểu được chu kỳ của mầm bệnh để xác

định thời gian tốt nhất cho các ứng dụng của một tác nhân kiểm soát sinh học.Chủng biocontrol tiềm năng cần phải bao gồm quang phổ nhiệt của các sinh vật

mục tiêu, ví dụ Botrytis có một phổ rất rộng Crinipellis dường như phát triển ở nhiệt độ tối ưu cao hơn so với T stromaticum do đó hạn chế khả năng của Trichoderma để kiểm soát ký sinh trùng thực vật.

- Độ ẩm: Độ ẩm có thể giới hạn khả năng của một tác nhân biocontrol đểxâm chiếm môi trường sống Thiếu độ ẩm có thể giới hạn khả năng biocontrolcủa các bào tử để nảy mầm Độ ẩm điều khiển sẵn có của các chất dinh dưỡngcần thiết cho sự tăng trưởng của các tác nhân biocontrol Ứng dụng có thể đượchẹn giờ để thời gian khi sẽ có đủ độ ẩm để kích thích nảy mầm bào tử

- Các chất dinh dưỡng: bào tử nấm Trichoderma là rất nhỏ Chúng phải

mất nước và sưng trước khi nảy mầm Quá trình đó đòi hỏi sự hiện diện của cácchất dinh dưỡng (cacbon, nitơ) Sợi nấm và chlamydospores ít nhạy cảm vớifungistasis đất

- Cơ chế ức chế bệnh: Các hoạt động của tác nhân biocontrol (kiểm soát

sinh học) chủ yếu phụ thuộc vào môi trường, điều kiện lý hóa khác nhau màchúng đang phải chịu Tìm hiểu về cả tính đa dạng di truyền của các chủng trong

loài Trichoderma sp và cơ chế của chúng về biocontrol sẽ dẫn đến ứng dụng cải

tiến của các chủng khác nhau như tác nhân biocontrol Những cơ chế này rấtphức tạp và những gì đã được định nghĩa là biocontrol là kết quả cuối cùng của

cơ chế khác nhau để đạt được khả năng kiểm soát dịch bệnh (Howell, 2003)[34] Biocontrol là kết quả hoặc từ các đối thủ cạnh tranh cho các chất dinhdưỡng và không gian hoặc như là kết quả của các khả năng của các tác nhân

biocontrol Trichoderma để sản xuất, chống lại các chất chuyển hóa mà cản trở

hoặc nảy mầm bào tử (fungistatis), tiêu diệt các tế bào (antibiosis) hoặc sửa đổicác vùng rễ, ví dụ, bằng axit hóa đất, do đó, tác nhân gây bệnh không thể pháttriển Biocontrol cũng có thể là kết quả của sự tương tác trực tiếp giữa các tácnhân gây bệnh chính nó và tác nhân biocontrol, như trong mycoparasitism, trong

đó có việc liên hệ với vật lý và tổng hợp của các enzym thủy phân, các hợp chấtđộc hại và/hoặc thuốc kháng sinh mà hành động synergistically với các enzym

Trichoderma sp thậm chí có thể phát huy tác dụng tích cực đến các với sự tăng

trưởng của thực vật (khoáng) và kích thích các cơ chế bảo vệ thực vật

1.5 Nhân nuôi sinh khối vi nấm Trichoderma

1.5.1 Dinh dưỡng của vi sinh vật

Vi sinh vật sản xuất rất nhiều enzym, hầu hết là thực hiện trong chỉ một

lượng nhỏ và được tham gia vào quá trình di động Enzym ngoại bào thường cókhả năng tiêu hóa vật liệu không hòa tan chất dinh dưỡng như cellulose, protein,tinh bột và các sản phẩm tiêu hóa được vận chuyển vào trong tế bào, nơi chúngđược sử dụng như là chất dinh dưỡng cho sự tăng trưởng

Theo PGS.TS Lê Văn Hoàng, dinh dưỡng của vi sinh vật được khái quát bởi

ba yếu tố chính là nguồn dinh dưỡng Cacbon, nguồn dinh dưỡng Nitơ và nguồn dinhdưỡng khoáng Bởi thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầudinh dưỡng của chúng mà thành phần hóa học của các chất dinh dưỡng được cấu tạo

từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa và vi lượng

Do lượng các nguyên tố chứa ở các vi sinh vật khác nhau là không giốngnhau và trong các điểu kiện nuôi cấy khác nhau, tương ứng với các giai đoạnphát triển khác nhau, lượng các nguyên tố chứa trong cùng một loài vi sinh vậtũng không giống nhau Nên hàm lượng và tỉ lệ dinh dưỡng cho nhân nuôi cácloài khác nhau là khác nhau

 Nguồn thức ăn Cacbon của vi sinh vật

Trong các môi trường chứa tinh bột trước hết phải tiến hành hồ hóa tinhbột ở nhiệt độ 60 – 70oC, sau đó đun sôi rồi mới đưa đi khử trùng

Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô,nước chiết nấm men ) có thể sử dụng làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với visinh vật

 Nguồn thức ăn Nitơ của vi sinh vật

Nguồn Nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Muốinitrat là nguồn thức ăn thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩnnhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn Thường sử dụngmuối NH4NO3 để làm nguồn Nitơ cho nhiều loài vi sinh vật

Nguồn Nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên chính là nguồn khí nitơ tự do(N2) trong khí quyển Vi sinh vật còn có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứatrong các thức ăn hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy visinh vật là pepton loại chế phẩm thủy phân không triệt để của một nguồn proteinnào đấy Nhu cầu về axit amin của các loại vi sinh vật khác nhau là rất khácnhau

 Nguồn thức ăn khoáng của vi sinh vật

Khi tạo các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hóa chất) bắt buộcphải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết Nồng độ cần thiết của từngnguyên tố vi lượng trong môi trường thương chỉ vào khoảng 10-6 – 10-8 M Nhucầu khoáng của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giaiđoạn phát triển

1.5.2 Ứng dụng công nghệ len men bề mặt trong sản xuất sinh khối

Nhân nuôi sinh khối trên môi trường rắn hay lên men trạng thái rắn(Solid state fermentation – SSF) đã được định nghĩa là quá trình lên men xẩy rakhi không có mặt hoặc vắng mặt của nước lượng nước tự do [46] SSF là quátrình sử dụng chung một nguồn nguyên vật liệu tự nhiên như nguồn dinh dưỡngcacbon, nitơ và nguồn năng lượng Tuy nhiên, thể nền rắn đó phải có đủ độ ẩm.Tùy thuộc vào bản chất của bề mặt, lượng nước có thể hấp thụ được ít hay nhiềuhơn trọng lượng khô của nó, hoạt động sinh hóa xẩy ra cao hơn khi lượng nướctrong khối rắn đầy đủ và đều đặn Độ xốp của thể nền rắn cũng tương đương với

độ ẩm của thể nền rắn và lượng không khí lưu thông trong đó Cho nên, việc duytrì độ ẩm bằng lượng nước thích hợp là cần thiết cho quá trình lên men trạng tháirắn

Chất rắn nói chung cung cấp một môi trường tốt cho các loài vi sinh vậtsinh trưởng mà đặc biệt là nấm Bởi trên môi trường này không những có đầy đủdinh dưỡng, diện tích bề mặt lớn mà còn có độ thông thoáng bên trong khá tốtcho sợi nấm phát triển bề mặt và ăn sâu vào trong khối cơ chất rắn Một số sảnphẩm nông nghiệp như lúa mì, gạo, ngô, đậu và các phụ phế phẩm như cámngô, cám gạo, là nguồn dinh dưỡng tốt nhất và thường xuyên nhất cho quá trìnhlên men trạng thái rắn

Một số phương pháp SSF truyền thống tiêu biểu ở một số nước như:Phương pháp “Koji” của nhật bản sử dụng gạo làm chất nền rắn nuôi

Asperghillus.

Phương pháp “tempeh” của Indonesia, phương pháp “ragi”của Ấn Độ sửdụng đâu làm môi trường lên men cho vi khuẩn, ngoài các phương pháp truyềnthống có một số phương pháp cải tiến cho sản xuất công nghiệp.

Không chỉ riêng cho nhóm nấm côn trùng mà phương pháp SSF có thể

sử dụng cho các loại nấm với mục đích như thực phẩm, y dược Để có một quytrình lên men rắn đảm bảo chất lượng người ta thường thực hiện qua các bước(gia đoạn) như sau [37]

- Giai đoạn 1: Nhân sinh giống nấm trên môi trường thạch (có các loại như

Potato dextrose agar (PDA), Yeast extract agar (Yea), Malt extract agar (MEA),Yeast malt agar (YMA) và Peptone yeast glucose agar (PYG)), giai đoạn này cóthể chỉ 10 – 15 ngày hay lâu hơn tuỳ loại nấm

- Giai đoạn 2: Nhân giống trên môi trường lỏng (như Potato dextrose broth

(PDB), Yeast extract broth (YEB), Malt extract broth (MEB), Yeast malt broth(YMB), Peptone yeast glucose broth (PYGB) và có thể là các dịch trích tự chếvới tỷ lệ thích hợp cho từng loài) thời gian của giai đoạn này diễn ra trong vòng 4– 7 ngày cũng tuỳ thuộc vào loài nấm

- Giai đoạn 3: Là giai đoạn nhân sinh khối trên môi trường lên men rắn

(SSF), các thành phần thích hợp cho môi trường lên men bao gồm một nguồnCacbon, một nguồn Nitơ, Vitamin, và chất khoáng Ngoài ra, các nguyên tố vàcác chất hữu cơ có thể được thêm vào Nguồn Cacbon nguồn từ ít nhất một trongnhững thành phần sau đây: starch, glucose, monosaccharide, polysaccharide,dextrin, maltose, saccharose, methyl cellulose, fructose, turanose, và bột ngô Các nguồn nitơ bắt nguồn từ ít nhất một trong những thành phần sau đây: bột đậunành, peptone, men bột, men nước mật đường, bột đậu phộng, bột men, cám lúa

mì, casein, Các loại Vitamin như vitamin B 1, vitamin B 6,… và axít nicotinic.Các chất vô cơ bao gồm CaSo4, CaCO3, MgSO4,

Trong quá trình SSF, pH, lượng nước trong SSF, nhiệt độ, độ ẩm tươngđối, và chu kỳ ánh sáng được kiểm soát pH là thích hợp được kiểm soát ở pH 4,5

- 7 Nhiệt độ được thích hợp được kiểm soát trong vòng 18 đến 300C Lượng

nước trong SSF, thích hợp được giữ giữa 40 - 70% Độ ẩm tương đối thích hợptrong khoảng 60 - 80% [35]

1.6 Tổng quan tài liệu nghiên cứu

1.6.1.Những nghiên cứu trên thế giới

Cùng với việc nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm không độc

Aspergillus spp để phòng trừ sự nhiễm aflatoxin sinh ra bởi Aspergillus flavus và Aspergillus parasinicus Hiện nay, có nhiều công trình nghiên cứu đề cập đến việc sử dụng các chủng nấm thuộc nhóm Trichoderma spp Đây là một loại nấm

đối kháng có phổ ký sinh rộng kiểm soát một số loài bệnh hại nguy hiểm trên cây

trồng (Papavizas, 1985) [52] Trichoderma harzianum đã được thử nghiệm kiểm

soát một số bệnh hại trên lạc và kết quả nghiên cứu đã cho thấy khả năng kiểmsoát của chúng

Khả năng đối kháng của các loài Trichoderma spp đã được phát hiện từ

70 năm trước (Weindling, 1937) [66] Hiện nay các tác nhân kiểm soát sinh học

từ nấm đã được nghiên cứu và triển khai rộng rãi trên toàn thế giới Cơ chế chínhcủa sự đối kháng trong Trichoderma là do mycoparasitism Nấm đối kháng

Trichoderma spp cũng là đối thủ cạnh tranh tốt trong đất, sản xuất thuốc kháng

sinh để ngăn chặn tác nhân gây bệnh Do hiệu quả và dễ sản xuất cho các ứngdụng thương mại, ít nhất là 9 loại sản phẩm sinh học thương mại dựa trên các

loài nấm Trichoderma sp được sản xuất và tiếp thị tại Bỉ, Thụy Điển, Israel, Mỹ,

Đan Mạch, Ấn Độ và New Zealand để sử dụng trên một số cây trồng Tại Châu Phi,nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tiềm năng kiểm soát sinh học của

nấm Trichoderma spp chống lại một số tác nhân gây bệnh nấm tấn công hạt giống,

cây giống, rễ, thân và lá của nhiều loại cây trồng

Cho đến nay, việc ứng dụng các chủng nấm đối kháng để kiểm soát cáctác nhân vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng và nông sản được xem là một giảipháp hiệu quả và nhiều triển vọng để thay thế dần thuốc hóa học (Baker andPaulitz, 1996) [10]

Theo nghiên cứu của Papavizas, G.V and Lumsden, R.D (1980) [51] thì

nấm Trichoderma spp đã được điều tra, nghiên cứu trong hơn hai mươi năm để

làm tác nhân đối kháng với nấm gây bệnh thực vật và đã được chứng minh là mộttrong những nấm hiệu quả nhất Cơ chế kiểm soát sinh học cho một số nấm bệnhhại cây trồng của nó liên quan đến một hành động bổ sung của antibiosis, cạnhtranh dinh dưỡng và thành tế bào antibiosis xuống cấp, các enzym như -1,3-glucanases, protease và chitinase (El-Katatny, M Gudelj K.-H Robra, 2001)[26] Từ chitin là thành phần chủ yếu của thành tế bào nấm, một vai trò chính đã

được quy cho chitinases trong hoạt động kiểm soát sinh học của Trichoderma Gần đây một số chủng Trichoderma spp đã được lựa chon và làm tinh khiết Một

số gen mã hóa chúng được nhân bản và trình tự, và biến nạp được lấy đó xácnhận vào sản xuất protease đơn hoặc chitinase để phòng trừ tốt hơn Việc nghiên

cứu kiểm soát sinh học thực nghiệm, ứng dụng nấm Trichoderma spp đang được

tiến hành ngày một sâu rộng hơn

Theo Calistru và McLean (1997a) [15], hai chủng T harzianum và hai chủng T viride có khả năng ức chế sự phát triển của A flavus Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy sự xâm nhập, kiểm soát Trichoderma spp đối với

A flavus Kết quả nghiên cứu của AK Choudhary (1992) [8] cho thấy, chủng T viride làm giảm thiểu sự sản sinh độc tố aflatoxin B1 (73,5%) và aflatoxin G (100%) khi nuôi cấy chung với chủng A flavus

Trong một số nghiên cứu cho thấy, sử dụng các tác nhân vi nấm như T harzianum, A niger và sự kết hợp của cả hai sinh vật này đã làm ức chế sản xuất

aflatoxin B1 gần 100% Phát hiện này cũng tương tự như một số nghiên cứutrước đó cho rằng một số vi sinh vật bao gồm nấm men, vi khuẩn và nấm mốc,ảnh hưởng đến sản xuất của aflatoxin trong một môi trường cạnh tranh Các

chủng Trichoderma spp đã được nghiên cứu như một tác nhân kiểm soát sinh

học cho nấm sản xuất độc tố mycotoxin Calistru và cs (1997b) [16], hai chủng

T harzianum và T viride có khả năng ức chế tăng trưởng của A flavus Nghiên

cứu của Aziz và Shahin (1997) [9] cho thấy có thể hỗn hợp chủng nấm A niger

và T viride để ức chế sản xuất aflatoxin do A flavus.

Kết quả nghiên cứu của Kishore và cs (2001) [39] đã cho thấy tiềm năngkiểm soát sinh học của 16 chủng phân lập thuộc nhóm nấm đối kháng

Trichoderma spp với A niger và hiệu lực phòng trừ của các chủng phân lập kiểm soát A niger trong điều kiện nhà lưới được so sánh với thuốc trừ nấm.

Trong 16 chủng phân lập này thu được từ các cánh đồng trồng lạc tại ICRISAT

(Ấn Độ) và chúng được phân thành 4 loài là T hamatum, T harzianum, T longibrachiatum và T viride Aspergillus niger được phân lập từ ruộng thí nghiệm của ICRISAT Hoạt động của nấm đối kháng Trichoderma với A niger

được đánh giá thông qua kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường PDA và tiềm năngđối kháng của những chủng này được sắp xếp theo thang điểm từ 1 đến 5 (Bell và

cs., 1982) [11] Trong số 16 chủng phân lập của Trichoderma, có 2 chủng phân lập của loài T harzianum là A3 và A11, và 1 chủng của loài T viride là A14 có tính đối kháng cao với A niger và được xếp ở thang điểm 1 Trong 13 chủng còn lại, có 9

chủng ở mức điểm 2 và 4 chủng ở mức điểm 3

Theo nghiên cứu của Srilakshmi, P.; Thakur, R.P.; Prasad, K.S.; Rao, V.P

(2001) [58], đã đánh giá tiềm năng đối kháng của 212 chủng Trichoderma spp.

được phân lập, thu được từ các mẫu đất từ 4 huyện ở bang Andhra Pradesh vàbang Karnataka, Ấn Độ, Trong đó có 145 chủng phân lập đối kháng với Af 11-4

và có 39 chủng có khả năng ức chế mạnh đối với chủng nấm Af 11-4 Nhữngchủng này được nghiên cứu xác định và đánh giá khả năng đối kháng, liên quanđến sản xuất thuốc kháng sinh phòng trừ chủng nấm với Af 11-4 Trong 39

chủng được phân lập thuộc 6 nhóm: T harzianum (11), T hamatum (1), T viride (9), T longibrachiatum (5), T koningii (9), T pseudokoningii (3) Trong số các chủng phân lập, thì chủng T 102 (T longibrachiatum) cho thấy có khả năng sự

ức chế mạnh nhất Có 15 chủng ức chế chủng nấm mốc11-4 Af bằng cách sản

xuất kháng sinh diffusible để kiểm soát Các chủng nấm T 29 (T pseudokoningii), T 42 (T harzianum), và T 83 (T koningii) ức chế sự tăng

trưởng đáng kể của Af 11-4 Kiểm tra dưới kính hiển vi cho thấy, chủng nấm T

16 (T viride), T 109 (T harzianum), và T 188 (T viride) tạo các hệ nấm cuộn lại

với sợi nấm Af 11-4

Theo Thakur RP và cs (2003) [53], sự nhiễm độc tố aflatoxin ở lạc gây ra

bởi Aspergillus flavus (Af), là một vấn đề lớn trong sản xuất nông nghiệp ở các

nước thuộc vùng nhiệt đới Kiểm soát sinh học là một trong những thành phầncủa quản lý tổng hợp để giảm nhiễm độc tố trước trong và sau khi thu hoạch lạc

6 chủng Trichoderma spp và 3 chủng Pseudomonas spp đã được xác định là có tính đối kháng cao với A flavus được đánh giá trong ống nghiệm với ba thí nghiệm để xác định tiềm năng kiểm soát sinh học của chúng 2 chủng T viride (Tv

17 và Tv 23), một chủng T harzianum (Th 23), và một chủng Pseudomonas spp.

(Pf 2) cho thấy khả năng đối kháng cao hơn hai chủng còn lại Các chủng này đã

làm giảm đáng kể mật độ quần thể A flavus trên hạt lạc và trong vùng rễ của lạc

Kết quả hợp tác nghiên cứu giữa ICRISAT và Trường Đại học Vrije của

Bỉ do Anjaiah chủ trì (2005) về việc đánh giá các vi khuẩn và nấm Trichoderma

để kiểm soát sinh học trước sự xâm nhập qua hạt của nấm Aspergillus flavus ở

lạc cho thấy: trong thí nghiệm chậu vại cũng như thí nghiệm trên đồng ruộng, các

chủng nấm đối kháng có tác dụng làm giảm ở mức ý nghĩa sự xâm nhiễm của A flavus vào hạt và giảm 50% quần thể A flavus trên ruộng lạc

Kết quả nghiên cứu của Kishore G K và cs (2001) [38] về kiểm soát sinhhọc sự nhiễm aflatoxin ở lạc cho thấy: trong tổng số 212 chủng phẩn lập thuộc

nhóm Trichoderma spp hiện có ở ICRISAT 48 trong 212 chủng hiện nay có khả năng kiểm soát sự nhiễm aflatoxin gây ra bởi A flavus Kết quả nghiên cứu ứng

dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu mỗi quan hệ phát sinh loài đã được địnhđược 48 chủng này thuộc 10 loài trong giống Trichoderma Ngoài ra, dựa vào những

nghiên cứu chuyên sâu về công nghệ enzyme được sinh ra bởi Trichoderma, các

nhà khoa học ICRISAT đã xác định được 7 chủng thuộc 6 loài khác nhau của giốngTrichoderma có khả năng kiểm soát aflatoxin trên đồng ruộng và cho thấy hiệu quảhơn so với việc dùng thuốc hóa học trừ nấm

Tại trung tâm ICRISAT (Ấn Độ) đã nghiên cứu, tuyển chọn được 26

chủng Trichoderma spp với 5 loài khác nhau là T harzianum, T viride, T auroviride, T longibrachiatum và T hamatum, có tiềm năng lớn để ứng dụng

trong phòng trừ sinh học Tốc độ tăng trưởng, sản xuất các enzym thủy phân, các

hợp chất kháng nấm và mycoparasitism của nấm sinh độc tố A flavus Trong số

26 chủng phân lập, có 8 chủng được ghi nhận có sự tăng trưởng nhanh hơn, bao

phủ được A flavus, và có 3 chủng có khả năng ức chế sự phát triển của A flavus khi

nuôi cấy trên đĩa petri Phân tích di truyền DNA từ 17 chủng được phân lập của loài

Trichoderma sp Sự tương đồng của các gen chitinase trong số các loài Trichoderma sp đã làm cho nó có thể xác định những gen này bằng cách sử dụng

phương pháp PCR Mồi sử dụng trong PCR này được thiết kế theo các chủ đề bảotồn của trình tự gen chitinase của Trichoderma Gen chitinase được khuếch đại tại

11 trong số 17 loài Trichoderma sp Kết quả này cho thấy tiềm năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp trong phòng trừ sinh học và hiệu quả của chúng đang

được kiểm chứng trong các thí nghiệm nhà trong kính trên nhiều cây trồng như lạc,ngô, đậu tương

1.6.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam, hướng nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong phòng trừ nấm mốc

Aspergillus spp sinh độc tố aflatoxin bằng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh

độc tố đã có một số kết quả bước đầu Nguyễn Thùy Châu (2010) [5], nghiên cứu

phòng chống Aspergillus sp sản sinh aflatoxin và ochratoxin A trên cà phê ở giai

đoạn ngoài đồng và trong quá trình bảo quản bằng chủng không sản sinhaflatoxin; Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2010) [4], nghiên cứu tác dụng

của chủng Aspergillus flavus DA2 không sinh và phòng chống aflatoxin trên ngô

ở giai đoạn ngoài đồng và trong quá trình bảo quản; Lê Thiên Minh, NguyễnTiến Minh, Nguyễn Thùy Châu (2010), nghiên cứu đánh giá hiệu quả của chế

phẩm Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin để phòng chống aflatoxin trên

lạc (ở Vĩnh Phúc)

Đánh giá về khả năng kiểm soát bệnh thì rất nhiều giống Trichoderma có

khả năng cạnh tranh, loại trừ nhiều loài nấm gây bệnh khác Tuy nhiên một sốgiống thường có hiệu quả hơn những giống khác trên một số bệnh nhất định.Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma đối kháng nhiều loại nấm

gây thối rễ Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Quá trình đó được gọi là: kí sinh nấm (mycoparasitism) Trichoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của

các loài nấm khác Sau đó nó có thể tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó

và tiêu thụ chúng Chủng sử dụng trong T-22 tiết ra nhiều enzym chính yếu,endochitinase, hơn các chủng hoang dại, do đó, T-22 sinh trưởng tốt hơn và tiết

ra nhiều enzym hơn các chủng hoang dại Sự kết hợp này cho phép nó bảo vệvùng rễ của cây trồng chống lại các loại nấm gây thối rễ trên đồng ruộng

Xử lý bệnh trên vườn sầu riêng tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền Giang donấm Phytophthora palmivora gây cháy lá, chảy mủ gốc bằng chủng nấmTrichoderma spp giúp rễ và lá bệnh phục hồi nhanh chóng sau 53 ngày xử lý vàkéo dài đến 150 ngày do Dương Minh và cộng sự (2006) [3]

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số giống có khả năng hoạt hóa

cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những giống này cũng có khả năng kiểm soát

những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm Các chế phẩm nấm Trichoderma được

sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức

sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bóncho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của

cây (Dương Hoa Xô- TT CNSH Tp Hồ Chí Minh, 2008).[2]

Ở tỉnh Nghệ An, kết quả điều tra thu thập nấm đối kháng Trichoderma trênđồng ruộng trồng lạc ở huyện Nghi Lộc tỉnh Nghệ An (năm 2010) cho thấy, có 5

loài nấm đối kháng Trichoderma, chúng sinh trưởng nhanh trên môi trường PDA

và môi trường cám gạo, mùn cưa, trấu Bước đầu đánh giá tính kháng trên đĩa

petri cho thấy, Trichoderma sp3 có tính kháng mạnh với Aspergillus flavus

Một số kết quả nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam về phòng trừ Aspergillus

spp sinh độc tố aflatoxin chưa thể đáp ứng được yêu cầu cấp thiết để có thể kiểm

soát độc tố aflatoxin trong cây trồng, nông sản và thực phẩm Vì vậy cần có mộtchiến lược, giải pháp thực sự có hiệu quả trong việc giảm thiệu độc tố aflatoxin.

Có nhiều cách tiếp cận nhưng cho đến nay ứng dụng công nghệ sinh học và côngnghệ vi sinh với kiểm soát sinh học hiện nay là hướng triển vọng, đặc biệt là sử

dụng các chủng nấm Trichoderma spp đối kháng phòng trừ sinh học các chủng Aspergillus spp sinh độc tố aflatoxin trong nông sản như lạc được đánh giá là

giải pháp tối ưu

Chương II.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Quy trình nghiên cứu

Sơ đồ quy trình nghiên cứu

Bảo quản mẫu nuôi cấy:

- Lưu giữ mẫu nấm thu thập trong slope bảo quản ở nhiệt độ

250C

Thu thập nấm

Trichoderma

trên mẫu đất

Phân lập, nuôi cấy

- Phân lập mẫu nấm trên môi trường PDA

- Nuôi cấy mẫu nấm trên môi trường PDA

Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát

triển của nấm Trichoderma hazianum

trên môi trường rắn

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian: Từ tháng 1 năm 2011 đến tháng 7 năm 2011

 Địa điểm:

- Thu thập nấm đối kháng Trichoderma ở các mẫu đất các ruộng ngô và

lạc ở các huyện thuộc Nghệ An

- Định loại nấm Trichoderma và đánh giá khả năng kiểm soát nấm Aspergillus flavus của các loài nấm Trichoderma tại phòng thí nghiệm Vi sinh -

Công nghệ sinh học, khoa Nông Lâm Ngư, Đại học Vinh

- Nhân sinh khối nấm Trichoderma hazianum trong phòng thí nghiệm Vi

sinh – Công nghệ sinh học, khoa Nông Lâm Ngư

2.3 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu

 Đối tượng:

- Nấm đối kháng Trichoderma hazianum

 Vật liệu nghiên cứu

- Dụng cụ vệ sinh: Bình xịt cồn, đèn cồn, giấy lau

- Dụng cụ, thiết bị chuẩn bị môi trường: Xoong nhôm, bếp từ, chai thủytinh có nắp nhựa loại 1000 ml, nồi hấp tiệt trùng, tủ sấy tiệt trùng, đĩa petri (3loại), ống nghiệm thủy tinh (slope), bình tam giác miệng rộng và miệng hẹp loại

200 ml, 500 ml, nút bông, giấy bọc đĩa…

- Dụng cụ để nhân nuôi, lưu mẫu: Hộp đựng mẫu, tủ Colifom

2.4 Phương pháp tiếp cận trong nghiên cứu vi nấm

2.4.1 Tiếp cận công nghệ sinh học hiện đại phù hợp

Cho đến nay ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu ứng

dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số loại bệnh do nấm gây ra ở

rễ cây trồng và sản xuất phân hữu cơ sinh học Việc nghiên cứu ứng dụng nấm

đối kháng Trichoderma spp để làm giảm thiểu độc tố aflatoxin trên lạc cũng như

các cây trồng khác chưa được chú ý

Trên thế giới, nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để kiểm soát Aspergillus spp bằng cách “loại trừ bằng cạnh tranh sinh học” hiện nay là

hướng nghiên cứu ứng dụng đang được quan tâm và nhiều triển vọng

Bên cạnh đó, ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp trong nông nghiệp đangđánh dấu với nhiều kết quả đã đạt được, điển hình là sử dụng các loại vi khuẩn

mang peptid như E coli, Bacillus, Agrobecterium để tạo sản phẩm

Gần đây, với những thành công của các nhà khoa học Mỹ, Ấn Độ trongviệc tạo ra các sản phẩm thuốc sinh học thương mại có chất hoạt động được phát

triển dựa trên chủng nấm không độc thuộc loài A flavus AF36, NRRL21882,

CT3, K49, Những sản phẩm này đã được Chính phủ Mỹ cấp bằng sáng chế.Mặt khác, các nhà khoa học thuộc ICRISAT đã và đang tiến hành các nghiên cứuphòng trừ sự nhiễm aflatoxin, trong đó tập trung vào nguồn gen kháng, nhânnuôi, kiểm soát sinh học, và công nghệ sinh học Gần đây, ICRISAT đã đưa rađược bộ kit chi phí thấp (1 đô la) có thể phát hiện các độc tố aflatoxin dựa trêncông nghệ enzyme - linked immunoabsorbent (chất hấp thụ miễn dịch liên kếtenzyme - ELISA)

Ngoài ra, các nhà khoa học ICRISAT đã xác định được hàng loạt các

chủng nấm thuộc giống Trichoderma và Aspergillus có tiềm năng trong phòng

trừ sinh học làm giảm thiểu hàm lượng aflatoxin trong nông sản đồng thời giảm

thiểu đáng kể Aspergillus flavus trong đất Có thể nói, việc sử dụng nấm

Trichoderma spp để kiểm soát sinh học Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin

là giải pháp hiệu quả và đã được kiểm chứng ở nhiều nước trên thế giới(ICRISAT, Ấn Độ, Châu Phi)

2.5 Phương pháp thu thập và phân lập nấm Trichoderma

2.5.1 Phương pháp thu thập

Các

1 Chuẩn bị dụng cụ, tư trang cần thiết: Hộp chứa mẫu, dao, túi nilon,vòng giun, …

2 Thảo luận về địa điểm, cách thức lấy mẫu với cán bộ và chuyên gia

3 Chọn điểm lấy mẫu trên ruộng ( )

Dùng dao nhọn đào mẫu đất xung quanh các gốc cây ở độ sâu khoảng5- 10 cm

Mỗi mẫu đất lấy khoảng 200- 300g, lấy đất trên nhiều ruộng thành 1mẫu (khoảng 3 ruộng/1 mẫu)

Chụp ảnh

4 Xử lý và bảo quản mẫu

Vệ sinh: Phơi khô trong râm, đập nhỏ, loại bỏ các cọng rơm, cỏ, rác

Bảo quản: Cho mẫu đất vào túi bóng, có ghi nhãn cho mẫu Để mẫunơi mát mẻ, tránh ánh sáng mặt trời

2.5.2 Phương pháp phân lập

Lưu ý: Lý do cho việc sử dụng phương pháp pha loãng đất là để phân lập

các bào tử (hoặc các sợi nấm) của vi nấm không hoạt động xảy ra trong đất, trongkhi đó lý do cho việc sử dụng kỹ thuật rửa đất là để phân lập sợi nấm của vi nấmhoạt động

Cho nên để sử dụng triệt để lượng mẫu thu được, đồng thời làm tăng xác

suất các chủng và loài nấm Trichoderma sp hiện diện trong đất thì chúng ta sử

dụng cả hai phương pháp phân lập sau đây:

Phương pháp pha loãng đất (Waksman, 1922; Johnson và cs., 1959) [27] Các

1 Trộn đều các mẫu đất thu được trên ruộng rồi cân lấy 10g

2 Cho 10g đất vào bình 250 ml có chứa 90ml WA 0,01% đã hấp tiệttrùng rồi đặt lên máy lắc, cho lắc 200v/p trong 10 phút để tạo dungdịch A có độ pha loãng là 10-1

Tiếp tục lấy 10ml dung dịch A cho vào bình tam giác khác có chứa90ml WA 0,01% rồi đem lắc đều để tạo thành dung dịch B có độ phaloãng là 10-2

Tiếp tuc lấy 10ml dung dịch B cho vào bình tam giác khác có chứa90ml WA 0,01% rồi đem lắc đều để tạo thành dung dịch C có độ phaloãng là 10-3

3 Dùng pipet hút 1ml dung dịch C trải đều lên đĩa petri loại 9cm cóchứa PDA được bổ sung 50 mg/l streptomycin và 10 mg/lcyclosporine rồi nuôi ở 250C trong 5-7 ngày Cấy ra 10 – 15 đĩa Petri

4 Sau thời gian nuôi (5-7 ngày), dựa vào hình thái để chúng ta tách

riêng các loài Trichoderma ra các đĩa petri khác

5 Chuyển sang các đĩa petri có chứa PDA (Potato dextrose agar) vànuôi ở 15, 25, 30 và 35 0C để xác định xa hơn nữa tới cấp độ loài

 Phương pháp xác định tần suất xuất hiện của loài:

Tần suất bắt gặp của mỗi giống loài được tính bằng công thức sau:

Tần suất bắt gặp của giống/loài A = Số lần xuất hiện của giống/loài ATổng số mẫu thu thập x100

2.6 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm mốc A Flavus

Đánh giá tính đối kháng của nấm Trichoderma sp và nấm Aspegillus flavus bằng nuôi kép theo phương pháp của Ahmed Imtiaj, Tae-sô Lê (2008) [6]