Nghiên cứu sự hình thành synnema của isaria tenuipes (PECK ) samson bằng phương pháp lên men bề mặt luận văn tốt nghiệp đại học

Theo Evans 1988, nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: 1 Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn trùng ký chủ; 2 Ký sinh ngoài tức là nấm phát

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

- -TRỊNH THỊ MINH THÀNH

NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH SYNNEMA

CỦA Isaria tenuipes (PECK.) SAMSON BẰNG

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC

Vinh – 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

- -NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH SYNNEMA

CỦA Isaria tenuipes (PECK.) SAMSON BẰNG

PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này làhoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thântiến hành và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đãđược chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh họcNông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh với sự đồng ý vàhướng dẫn của PGS TS Trần Ngọc Lân, giáo viên hướng dẫn và các kĩ thuậtviên phụ trách phòng thí nghiệm

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Vinh, ngày 20 tháng 7 năm 2011

Tác giả

Trịnh Thị Minh Thành

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệpngành kĩ sư Nông học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy

cô, bạn bè, người thân

Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lờicảm ơn đặc biệt tới PGS TS Trần Ngọc Lân, Th.S Nguyễn Thị Thúy, KS TrầnVăn Cảnh, những người hướng dẫn tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoahọc, đã rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài luận văntốt nghiệp

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong tổ bộmôn Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm

đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ýkiến cho tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Và tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn

bè đã động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoànthành luận văn này

Vinh, ngày 20 tháng 7 năm 2011

Tác giả

Trịnh Thị Minh Thành

DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 1.1 Thành phần loài Isaria tại VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống 23Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của Isaria tenuipes trong tự nhiên và nhân tạo 33Bảng 3.2 Khả năng phát triển của sợi nấm trên bề mặt môi trường 35Bảng 3.3 Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến thời gian hình thành synnema 36Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sản lượng synnema 38Bảng 3.5 Khả năng phát triển của sợi nấm trên bề mặt theo thời gian 39Bảng 3.6 Ảnh hưởng của khối lượng cơ chất đến thời gian hình thành

synnema

40

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của khối lượng cơ chất đến sự sản lượng Synnema 43Bảng 3.8 Khả năng phát triển của sợi nầm trên bề mặt cơ chất theo thời gian 44Bảng 3.9 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến thời gian hình thành synnma 45Bảng 3.10 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến sản lượng synnema 47Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn vi lượng đến khả năng phát triển của sợi

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu sự hình thành synnema trên môi trường

rắn nhân tạo

25

Hình 3.1 Mẫu vật, cấu trúc sinh bào tử và PDA của I tenuipes 34Hình 3.2 Khả năng phát triển sợi nấm trên bề mặt môi trường lỏng 35Hình 3.3 Khả năng bao phủ của sợi nấm trên bề mặt môi trường 35Hình 3.4 Thời gian sinh trưởng của synnema trên các môi trường lỏng 36

Hình 3.8 Khả năng phát triển của sợi nấm trên bề mặt cơ chất 39Hình 3.9 Ảnh hưởng của khối lượng cơ chất đế khả năng hình thành synnema 41

Hình 3.11 Ảnh hưởng của khối cơ chất đến sảnlượng synnnema 43Hình 3.12 Synnema thu được trên các mức cơ chất khác nhau 43Hình 3.13 Khả năng phát triển của sợi nấm trên bề mặt cơ chất theo thời gian 44Hình 3.14 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến thời gian hình thành synnma 45

Hình 3.16 Synnema thu được khi nuôi trong vật liệu nuôi khác nhau 48Hình 3.17 Khả năng phát triển của sợi nấm trên bề mặt cơ chất 49

Sản lượng synnemaHình 3.20 Synnema thu được khi bổ sung nguồn vi lượng khác nhau 52

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nội dung

Danh mục chữ cái viết tắt v

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 4

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 6

1.1 Nấm ký sinh côn trùng 6

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 7

1.2 Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng 11

1.2.1 Nghiên cứu về đa dạng sinh học và nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng 11

1.2.2 Nghiên cứu nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng dược phẩm và làm

thực phẩm chức năng

16

1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nấm Isaria Tenuipes 17

1.4. Tiềm năng và tình hình nghiên cứu Isaria tenuipes ở Việt Nam 22

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Quy trình nghiên cứu 25

2.2.2 Chủng nấm và phương pháp thu thập, phân lập 26

Phương pháp phân lập và nuôi cấy 26

2.3 Phương pháp nhân nuôi synnema 28

.

So sánh các nguồn dinh dưỡng bổ sung khác nhau 29

2.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1. So sánh đặc điểm hình thái của I tenuipes trong tự nhiên và nhân

3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến khả năng phát triển của sợi nấm

trên bề mặt môi trường

34

3.2.2 Ảnh hưởng của môi trường lỏng đến thời gian hình thành synnema

36

3.2.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lỏng đến sản lượng synnema 38

3.3 Ảnh hưởng của khối lượng cơ chất đến khả năng hình thành

3.3.2 Ảnh hưởng của lượng cơ chất đến thời gian hình thành synnema 40

3.3.3 Ảnh hưởng của khối lượng cơ chất đến sản lượng synnema 42

3.4 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến hình thành synnema 44

3.4.1 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến khả năng phát triển sợi nấm trên bề

mặt cơ chất

44

3.4.2 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đên thời gian hình thành synnema 45

3.4.3 Ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến sản lượng synnema 46

3.5 Ảnh hưởng của nguồn vi lượng đến sự hình thành synnema 49

3.5.1 Ảnh hưởng của nguồn vi lượng bổ sung vào cơ chất đến khả năng

phát triển của sợi nấm trên bề mặt cơ chất

49

3.5.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng bổ sung đến thời gian hình thành

synnema

50

3.5.3 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng bổ sung đến sản lượng synnema 52

3.6 Quy trình kỹ thuật sản xuất synnema của Isaria tenuipes VN1342 (Peck.)

Samson

53

Một số hình ảnh sản phẩm thu được 57

Phục lục

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong tự nhiên, mối quan hệ giữa nấm với côn trùng và các loài chânkhớp khác có thể là cộng sinh đến ký sinh gây hại Nấm côn trùng là thiên địchphổ biến của các loài chân khớp trên khắp thế giới và được xem như là các đốitượng kiểm soát sinh học (Hajek và St Leger, 1994; Shah và Pell, 2003) [23-45].Nhóm nấm này có sự phân bố rộng, sự phân bố và tính đa dạng các loài nấm côntrùng tùy thuộc vào điều kiện môi trường, tính đa dạng của các loài côn trùng vàtình trạng của ký chủ (Hajek and St Leger, 1994) [23] Khu vực có khí hậu nhiệtđới hay ôn đới, đặc biệt ở các nước nhiệt đới có ẩm độ không khí cao, có sự đadạng và phong phú của các loài côn trùng là điều kiện lý tưởng cho nấm côntrùng phát triển Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới có nguồn đadạng sinh học rất phong phú, do đó có tiềm năng về nguồn lợi nấm ký sinh côntrùng trong tự nhiên

Nhiều loài nấm côn trùng đã được ứng dụng rộng rãi trong đấu tranh sinh

học kiểm soát dịch hại, trong đó phổ biến là các loài Beauveria bassiana,

Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi Theo Taborsky (1992) [50], ứng

dụng đầu tiên sử dụng Metarhizium anisopliae cho đấu tranh sinh học được thực

hiện vào năm 1888 bởi Krassilstchik Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã thànhcông trong việc sử dụng nấm côn trùng phòng trị các loại côn trùng và sâu hại

cây trồng, điển hình như nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana đã

được ứng dụng trong phòng trừ mối nhà (Nguyễn Dương Khuê, 2005) [2], sâukhoang hại cải xanh (Võ Thị Thu Oanh và cs., 2005) [11], sâu hại đậu tương vàđậu xanh (Phạm Thị Thùy và cs., 2005) [5], rầy mềm và các loài sâu hại lúa(Trần Văn Hai và cs., 2006; Nguyễn Thị Lộc và cs., 2002) [4-10]

Trong y học cổ truyền, Ophiocordyceps sinensis (tên cũ Cordyceps

sinensis, tiếng Việt gọi là “Đông Trùng, Hạ Thảo”) được sử dụng như thuốc trị

bệnh và bồi bổ cơ thể từ hơn 1.000 năm qua tại các nước châu Á, đặc biệt là

Trung Quốc và Nhật Bản Đây là loài nấm sống ký sinh trên sâu bướm thuộc loài

Thitarodes armoricanus, và được tìm thấy trên vùng núi có độ cao từ

3.000-5.000 m tại Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal và Bhutan Trong y học cổ truyền TrungQuốc, “Đông Trùng, Hạ Thảo” dùng để chữa các bệnh về phổi và hô hấp, thận,gan, tim mạch; trị bệnh yếu sinh lý và cao huyết áp; trị rối loạn miễn dịch vàchống ung thư (Zhu và cs., 1998a,b) [56- 57]

Nấm Isaria tenuipes (Peck.) Samson còn được gọi là Paecilomyces

japonica Yasuda hoặc Paecilomyces tenuipes, cũng là một loài nấm được dùng

trong y học cổ truyền của Trung Quốc cùng với nấm Đông trùng hạ thảo

(Cordyceps sinensis) và Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) Cả hai chi

Paecilomyces và Cordyceps đều thuộc họ Clavicipitaceae Các kết quả nghiên

cứu sinh học phân tử gần đây đã xác định Paecilomyces tenuipes là giai đoạn vô tính của Cordyceps takaomontana Yakushiji et Kumazawa (Spatafora J W and

M Blackwell, 1993; Shimizu, 1994, Eiji Yokoyama và cs., 2003)

Theo y học cổ truyền Trung Hoa, thể quả của nấm I tenuipes có giá trị

cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh học của chúng Nhữnghợp chất có hoạt tính bao gồm cả hoạt tính chống khối u hoặc tác động đến hệthống miễn dịch tách chiết từ các loài nấm Paecilomyces đã được công bố(Borchers và cs., 1999; Liu và cs., 1996; Lee và cs., 1996) như Leucinostatins A,

D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin, Sphingofungins E và F,UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F, Ergosterol peroxide,Acetoxyscirpenediol…

Theo kết quả nghiên cứu của Haruhisa Kikuchi và cs (2004) cho thấy,

trong sinh khối nấm P tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt chất

có hoạt tính sinh học cao [21]

Tuy nhiên, vì những tính chất độc đáo về dược liệu đã tạo nên giá trị hànghóa khá cao và ngày càng được sử dụng rộng rãi, tăng liều lượng dẫn đến thuhoạch quá mức làm giảm nguồn tài nguyên hoang dã, mặt khác để phục vụ chonhững nghiên cứu sâu hơn về nấm ký sinh côn trùng và nấm dược liệu do đó cần

một số lượng lớn Để bù đắp cho sự thiếu hụt đó các nhà khoa học đã tiến hành

mở rộng nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo trên các chất nền như các loại hạt ngũcốc, sâu non, tằm, nhộng tằm và một số nguyên liệu khác bằng việc mô tả các

đặc điểm tự nhiên của chúng Đặc biệt là sự thành công về nhân nuôi Cordyceps

trên môi trường rắn nhân tạo, tạo ra các hoạt chất sinh học, các thực phẩm chứcnăng có giá trị dinh dưỡng cao

Qua nghiên cứu điều tra sự đa dạng nấm ký sinh côn trùng ở vườn quốc gia

Phù Mát và khu bảo tồn thiên nhiên Phù Huống cho thấy loài nấm I tenuipes có sự

đa dạng cao, có tiềm năng sản xuất nhân tạo làm nguốn thực phẩm có giá trị

Đối với Việt Nam, công nghệ nấm ký sinh côn trùng là một lĩnh vực rấtmới, đặc biệt đối với các loài nấm ký sinh côn trùng có các hoạt chất sinh học vàdùng làm dược liệu, hầu như chưa có tài liệu nghiên cứu về sản xuất loài này Dovậy, cần có những nghiên cứu sâu hơn và phân tích thận trọng để chứng minhchính xác Nhưng điều quan trọng hơn là số lượng và thời gian để nghiên cứu vàphân tích mà việc thu thập từ tự nhiên rất khó khăn và cực kỳ hiếm hoi Mặt

khác, mỗi loài vi sinh vật nói chung và nấm ký sinh côn trùng nói riêng đều có

yêu cầu khác nhau để chúng sinh trưởng phát triển tốt Do vậy, tiến hành nhữngnghiên cứu về phương pháp nhân nuôi nhân tạo nhằm tìm ra quy trình nhân nuôinhân tạo phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn là hết sức cần thiết

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sự

hình thành synnema của Isaria tenuipes (Peck.) Samson bằng phương pháp lên men bề mặt” Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần quan trọng trong

tiến trình nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo nấm ký sinh côn trùng nói chung vànấm dược liệu nói riêng

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Đề tài nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá khả năng hình thành

synnema bằng phương pháp lên men bề mặt của chủng Isaria tenuipes (VN1342)

làm cơ sở khoa học cho sản xuất sinh khối ở quy mô nhỏ

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định và đánh giá sự hình thành synnema của I tenuipes (VN1342)

trên môi trường lỏng

- Xác định công thức và tỷ lệ cơ chất cho sự hình thành synnema của I.

tenuipes (VN1342) trong vật liệu nuôi thích hợp

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (VN1342)

thu được tại vườn quốc gia Phù Mát, tỉnh Nghệ An

- Vật liệu nghiên cứu: Gạo lứt, nhộng tằm và một số hóa chất

3.2 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và phòngthí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Khoa Nông Lâm Ngư, trường Đạihọc Vinh trong thời gian từ tháng 1 năm 2011 đến tháng 7 năm 2011

3.3 Nội dung nghiên cứu

Đề tài được tiến hành nghiên cứu với những nội dung sau:

- Đánh giá khả năng sinh trưởng và hình thành synnema của Isaria

tenuipes (VN1342) trên môi trường lỏng.

- Đánh giá ảnh hưởng của lượng cơ chất (gạo lứt) lên sự hình thành synnema

của I tenuipes (VN1342) nhằm tìm ra lượng cơ chất (gạo lứt) thích hợp.

- Đánh giá ảnh hưởng của vật liệu nuôi đến sự hình thành synnema của I.

tenuipes (VN1342) nhằm tìm ra vật liệu nuôi thích hợp

- Đánh giá sự hình thành synnema của I tenuipes (VN1342) trên các loại

môi trường có nguồn dinh dưỡng bổ sung khác nhau

Đề tài được tiến hành nghiên cứu dựa trên tính kế thừa các nghiên cứutrên thế giới

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đề tài mang lại một sô ý nghĩa khoa học và thực tiễn cho những nghiêncứu sâu hơn trong nghiên cứu nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng Kết quả của đề

tài sẽ bổ sung cho những nghiên cứu trước đó về nấm Isaria tenuipes không

những theo hướng phòng trừ sinh học mà nó còn bổ sung cho nguồn nguyên liệunhằm đáp ứng cho ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng trong tương

lai, đồng thời làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về nấm Isaria tenuipes.

Kết quả nghiên cứu còn là nguồn tham khảo tốt cho những nghiên cứu

nhân nuôi nhân tạo nấm ký sinh côn trùng không chỉ đối với loài Isaria tenuipes

mà còn cho nhiều loài nấm ký sinh côn trùng khác

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nấm ký sinh côn trùng

1.1.1 Khái niệm

“Nấm ký sinh công trùng - Entomology phathogenic fungi (EPF) hay

nấm côn trùng – Insect fungi” là khái niệm được các nhà khoa học sử dụng như

là một thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật ký sinh gây bệnh cho côntrùng

Nấm ký sinh côn trùng vừa là một nhóm nấm có tính đa dạng sinh học cao(trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó ở Thái Lan có khoảng70.000 - 150.000 loài nấm và 2000 loài nấm ký sinh côn trùng) vừa có vai tròquan trọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng và trong y dược

Theo Evans (1988), nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: (1)

Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, khoang cơ thể của côn trùng

ký chủ; (2) Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp cuticun vỏ cơ thể của côntrùng và gây nên bệnh hại cho ký chủ; (3) Nấm mọc trên côn trùng tức là nhữngnấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng ký sinh trên côn trùng(samson và cs., 1988); (4) Cộng sinh có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng manglại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống

Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinhthứ cấp (secondery pathogen) (Pu và Li, 1996) Nấm ký sinh sơ cấp thườngnhiễm vào ký chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng.Trong khi đó, nấm ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng yếuhoặc bị thương.Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côntrùng bị bệnh được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại kýsinh này có thể nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơthể côn trùng (dẫn theo Trần Ngọc Lân và cs., 2008) [8]

Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượngnấm ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng.Theo Tzean và cs (1997), kháiniệm này cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là

2 nhóm(lớp) trong một nghành Động vật chân khớp và chúng có cùng kiểu sinhthái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây (Dẫn theo Trần NgọcLân, 2008) [8]

1.1.2 Chu trình sống và lây nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua conđường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏcuticun của chúng Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thểvật chủ Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào

tủ mọc mần và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cuticun.Khi nấm xâm nhiễm vào bên trong, nấm mọc khắp cơ thể của côn trùng, nhiềuloại nấm cũng sản xuất các độc tốc trong đó để tăng tốc độ giết chế côn trùnghoặc ngăn chặn sự cạnh tranh của các loài vi sinh vật khác

Hình 1.1 Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trongxoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải

phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticuncủa côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase,carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme nàyđược tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài vàthậm chí ngay trong một loài.

Enzyme protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham giaphân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein).Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai trò không kémphần quan trọng Nhưng quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) vàenzyme phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng Hai enzyme này có liên quan trựctiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Tạ Kim Chỉnh và cs.,2005) [7]

(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chếtĐây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùngnấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi nấmđược hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, pháhủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phậnnội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hôhấp Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với cáctác nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soáthoạt động sống và dẫn đến chết (Phạm Văn Lầm, 2000) [6]

(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Đây là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Xác côn trùng chết là nguồndinh dưỡng có giá trị cho các vi sinh vật Thông thường, các bộ phận bên trong cơ thểcôn trùng sẽ bị phân hủy bởi vi khuẩn hoại sinh Trên bề mặt ngoài của cơ thể côn

trùng, các nấm hoại sinh như Aspergillus spp., Penicillium spp và Fusarium spp định

cư ở lớp biểu bì và cạnh tranh với vi khuẩn ở bên trong cơ thể côn trùng Do nấm côntrùng có khả năng sản xuất ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt

động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vậtnày để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy.

Sau khi nấm côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thểcôn trùng, nó chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử

Ở giai đoạn xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng, nấm sử dụng cácenzyme ngoại bào để phân hủy lớp vỏ cuticun Khác với giai đoạn này, ở giai đoạnnấm đâm xuyên, mọc thành sợi ra bên ngoài nó sử dụng toàn bộ tác động cơ học.Sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ Nhiềucôn trùng bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và các bào tử, vì vậy mà rấtkhó hoặc không thể xác định các vật chủ (Janet Jennifer và cs., 2006) [28]

Những cá thể sâu hại bị nhiễm nấm thường có các vệt chấm đen xuất hiệntrên bề mặt, có thể tại nơi bào tử nấm bám vào và mọc mầm xâm nhiễm vào bên

trong cơ thể vật chủ Nơi xâm nhập của nấm Beaueria bassiana thường có vệt

chấm đen hình dạng bất định

Khi bị bệnh do nấm, sâu hại ngừng hoạt động khoảng 2 - 3 ngày trướcthời điểm phát triển hoàn toàn của nấm ở trong cơ thể vật chủ Nếu bị bệnh do

nấm Beauveria thì sâu hại sẽ ngừng hoạt động khoảng 7 ngày trước khi chết.

Những cá thể sâu hại bị nhiễm bệnh nấm côn trùng thường có màu hồngnhạt Một số loài nấm có thể làm cho sâu bệnh trở nên có màu vàng nhạt, xanh lácây hoặc nâu Cơ thể sâu bị bệnh trở nên hóa cứng

Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bao giờ bị thối, lũn màthường vẫn giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể sâu chếtchứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn

bộ bề mặt ngoài của cơ thể sâu Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết donấm côn trùng với sâu chết do virus, vi khuẩn gây bệnh ( Phạm Văn Lầm, 2000) [8]

Thomas M B., Read A F (2007) đã đưa ra sơ đồ xâm nhiễm của nấm kýsinh côn trùng vào cơ thể vật chủ (hình 1.1) [51]

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng

(Nguồn: Thomas M B & Read A F., 2007)Theo Thomas M B., Read A F., chu kỳ phát triển của nấm ký sinh côn

trùng, như nấm Beaueria bassiana và Metarhizium anisopliae gồm các giai

đoạn: Bào tử đính tiếp xúc với tầng cuticun của lớp vỏ vật chủ Bào tử nảy mầm

và sinh sản hình thành vòi và giác bám (cấu trúc cơ quan xâm nhập)

Sự xâm nhập của bào tử đính là sự tổ hợp của sức ép cơ học và sự tác độngcủa enzyme phân giải tầng cuticun Quá trình sinh trưởng bên trong xoang máu cơ thểvật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ chết Tầng cuticun của vỏ cơ thểvật chủ là tầng chống chịu đầu tiên trong việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễmcủa nấm và nó có vai trò quyết định tính chuyên hóa đặc hiệu của nấm Nếunấm phá vỡ được tầng cuticun thì sự xâm nhiễm thành công, sau đó phụthuộc vào khả năng chiến thắng được phản ứng miễn dịch bẩm sinh ở côntrùng của nấm

Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng

cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Sự hình thành hoạt động miễn dịchcàng sớm ở điểm phân giải bào tử đính trong suốt quá trình xâm nhập Các

loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tự vệcủa vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụytrang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễndịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận ức chế hệ thống bảo vệ.

Nếu một loại nấm Cordyceps tấn công vật chủ thì thể sợi nấm xâm chiếm và

dần dần thay thế các mô trong cơ thể vật chủ, vào lúc hình thành dạng quả thể thondài (chất đệm) có thể có hình trụ, phân nhánh hay tập hợp nhiều hình thù khác nhau[59]

Một số loài Cordyceps có thể ảnh hưởng đến hành vi của vật chủ sâu bọ.

Cordyceps unilateralis gây bệnh trên kiến và khiến chúng leo lên cây rồi bám ở

đó trước khi chết, đảm bảo phân phối tối đa bào tử từ quả thể mọc ra ngoài cơ thểcôn trùng đã chết [59]

1.2 Lược sử nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng

1.2.1 Nghiên cứu về đa dạng sinh học và nguồn lợi nấm ký sinh côn trùng

Trên thế giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm tính đến năm 2005 theo đánhgiá của Hywel-Jones (BIOTEC, Thái Lan) Trong 1,5 triệu loài nấm có khoảng2.000 loài nấm ký sinh côn trùng (Hywel-Jones, 2005) Mặt khác, theo kết quảcông bố mới nhất về nấm ký sinh côn trùng của trang web Index Fungorum

(www.indexfungorum org), trên thế giới có khoảng 2500 loài nấm ký sinh côn trùng, trong đó thứ tự về sự đa dạng của nấm được xếp như sau: Cordyceps với

525 loài, Verticillium với 261 loài, Entomophthora với 152 loài,tiếp đến là

Hypocrella với 112 loài, Aschersonia với 79 loài và Turrubiella với 83 loài,…

Hiện nay trên thế giới nghiên cứu mới chỉ tập trung vào một số ít loài như

Metarhizium anisopliae, Hisutela lecaniicola, Beauveria basiana, B amorpha, Akathomyces aranearum, Cordycep sinclairii,…

Nấm ký sinh côn trùng không chỉ là nhóm có tính đa dạng sinh học cao và lànguồn lợi có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng màcòn là một nguồn tài nguyên rất quí cung cấp thực phẩm chức năng, dược liệu

Nấm ký sinh côn trùng được đánh giá là một trong những nguồn cung cấpcác hợp chất có hoạt tính sinh học cao sử dụng trong y - dược trong tương lai đểchữa trị các chứng bệnh nan y hiện nay Trong đó, Bộ Clavicipitales được đánhgiá có nhiều đặc tính ưu việt nhất với các giống như Cordyceps, Mertacordyceps,Elaphocordyceps, Ophiocordyceps, vì phần lớn các loài cho các chất có hoạt tínhsinh học cao

Cordyceps là nhóm nấm ký sinh côn trùng thuộc lớp nấm túi Ascomycetes, hầu

hết các loài này ký sinh chủ yếu trên côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh

trên các loài nấm khác Cho đến nay, mới chỉ nghiên cứu nhiều về 2 loài là Cordyceps

sinensis S (Đông trùng hạ thảo) và C militaris L (Nhộng trùng thảo) Ở các nước

Châu Âu sử dụng nấm này làm thực phẩm chức năng bổ sung dinh dưỡng., còn ở nước

ta hiện đang sử dụng nấm Cordyceps sinensis làm dược liệu trong Đông y

Trên thế giới một số nước đã thành công trong nghiên cứu ứng dụng nấm

ký sinh côn trùng trong thực phẩm chức năng, dược liệu, enzyme, như Hoa Kỳ,

Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Trung Quốc (“Đông trùng Hạ thảo“ Cordyceps

sinensis) Cordyceps sinensis, khi ký sinh trên các ấu trùng của các loài sâu thuộc

chi Thiarodes được gọi là đông trùng hạ thảo, một loại dược liệu quý hiếm sửdụng trong y học cổ truyền một số quốc gia Đông Á, chẳng hạn như trong y học

cổ truyền Trung Hoahay trong y học cổ truyền Tây Tạng

Phần lớn các loài của giống Cordyceps cho các chất có hoạt tính sinh họccao Trong loài thuộc giống Cordyceps có chất Cordycepin có thể chữa các bệnhưng thư thông qua việc tăng khả năng miễn dịch của con người, có thể ngăn chặnđược di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Thomadaki H và cs., 2008).Nghiên cứu của Nan J X (2001) đã chứng minh nấm Đông trùng - Hạ thảo chữabệnh rối loạn chức năng gan hiệu quả

Các nghiên cứu của Thomadaki H và cs (2008) [52] cho thấy trong loài

thuộc giống Cordyceps có chất Cordycepin có thể chữa các bệnh ưng thư thông

qua việc tăng khả năng miễn dịch của con người Cordycepin chính là3`deoxyadenosine và khi được chèn vào ADN có khả năng kìm hãm sự sao chép

của phân tử ADN này Ngoài ra, chất này có khả năng kìm hãm sự phát triển của

vi khuẩn, virut và tế bào ưng thư Điều này được thể hiện rõ ràng qua khả năng

kìm hãm sự phát triển của Clostidium sp (Ahn Y.J và cs., 2000) [12].

Các nghiên cứu của Pegler D N và cs (1994), Mizuno T (1999) và Tang

W., Eisenbrand G (1992) cho thấy các loài Cordyceps sp thường được sử dụng

như là một loài thuốc kéo dài tuổi thọ và nó được xem như là thuốc cầm máu,thuốc chữa bệnh hen và chứng giảm glucoza trong máu Sở dĩ nó có được nhữngchức năng như thế là vì chúng có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao, nhưcordycepin, ophiocordin và một số hợp chất polisaccharides

Loài C unilateralis có 6 chất dẫn xuất của napthoquinone có hoạt tính

sinh học cao như eythrostominone, deoxyerythrostominone, 4-O-methylerythrostominone, epierythrostominol, deoxyerythrostominol và đặc biệt là 3,5 -β-trihydrooxy-6-methoxy-2-(5-oxyohexa-1,3-dienyl)-1,4-naphthoquinone đượcxem như là chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét - malaria (PatcharapornWongsa và cs., 2005 và Kittakoop P và cs., 1999)

Các nghiên cứu của Sengonca C., Thungrabeab M., Blaeser P (2007) cho

thấy Cordyceps sp có khả năng trong kiểm soát sinh học phòng trừ sâu non của

Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae).

Ở Thái Lan, nấm ký sinh côn trùng mới được nghiên cứu trong nhữngnăm gần đây Trong khoảng 15 năm qua, BIOTEC đã phát hiện được ở Thái Lan

có hơn 380 loài nấm ký sinh côn trùng BIOTEC đã có nhiều thành công trongnghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong sản xuất thuốc sinh học trừ sâuhại cây trồng và sản xuất các chế phẩm dược liệu (Janet Jennifer Luangsa-ard vàcs., 2006) [28] Các nhà khoa học BIOTEC đã phân loại nấm ký sinh côn trùng

về hình thái, sinh học (Janet Jennifer Luangsa-ard và cs., 2006, 2007) [28] Phân

loại các loài Cordyceps bằng sinh học phân tử ADN (Gi-Ho Sung, Nigel L.

Hywel-Jones và cs., 2007) [22] Nghiên cứu phát hiện các loài nấm ký sinh côn

trùng mới Cordyceps khaoyaiensis, Cordyceps pseudomilitaris (Hywel-Jones N.,

L., 1994) [24]; Nghiên cứu ứng dụng các loài nấm ký sinh côn trùng có giá trị

dược liệu, như Cordyceps unilateralis (K Kocharin, P Wongsa, 2006; Panida

Unagul, P Wongsa và cs., 2005; Patcharaporn Wongsa và cs., 2005) [31], [41],

[42]; Cordyceps nipponica (Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2001) [27],

Cordyceps pseudomilitaris (Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2000) [26].

Dịch chiết C sinensis có hoạt tính chống oxi hoá (antioxidation), miễn dịch

(immunomodulatory), hypoglycemic, hạ huyết áp (hypotensive) và vasorelaxant, vàcác hoạt tính chống khối u ung thư (antitumor activities) (Chen Y.J và cs., 1997;Bok J.W và cs., 1999; Chiou W.F và cs., 2000; Yamaguchi Y và cs., 2000; KuoY.C và cs., 2001; ) [18], [14], [17], [33] Nghiên cứu thành phần hoá học của loài

C sinensis chứa các polysaccharit và các sterols (Kiho T và cs., 1986; Bok J.W và

cs., 1999) [34], [14] Ngoài ra còn có 17 acid amin khác nhau, có lipid, có nhiềunguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na,…) và các loại vitamin Nhiều hợp chất có hoạttính sinh học cao đang được phát hiện nhờ sự tiến bộ của ngành hoá học các hợp

chất thiên nhiên Loài C sinensis đã được sử dụng trong y học cổ truyền của Trung

Quốc cách đây 2000 năm (Zhu J.-S và cs., 1998a,b) [56], [57] Sự quan tâmnghiên cứu được phát triển mạnh trong 15 năm gần đây Ngày nay ở Trung Quốc đã

có nhiều chế phẩm từ C sinensis được bán rộng rãi trên thị trường

Loài Cordyceps unilateralis, được thu mẫu ở Vườn Quốc gia Khao Luang

(Thái Lan) đã phân lập được các dẫn xuất naphthoquinone mới Điều đáng quantâm là các naphthoquinone này có hoạt tính antimalarial với liều IC50 2.5 - 10.1

g/ml (Kittakoop và cs., 1999) [35]

Loài Cordyceps nipponica có nguồn gốc ở Nhật Bản và cũng được tìm thấy

ở Thái Lan Hai hydroxy-2-pyridones, cordypyridon A và B và hai tricyclic

N-methoxy-2-pyridon, cordypyridon C và D đã được phân lập từ loài Cordyceps

nipponica BCC (mẫu thu ở vườn Quốc gia Khao Yai, Thái Lan) Cordypyridon

A và B có hoạt tính chống sốt rét với liều IC50, 0,066 và 0,037 g/mL tương ứng(Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2001) [27]

Loài Cordyceps pseudomilitaris chỉ phát hiện được ở Thái Lan và cho đến

nay chỉ tìm thấy tại vườn Quốc gia Sam Lan, khi nó ký sinh trên ấu trùng

Lepidoptera từ tháng 8 đến tháng 10 (Hywel-Jones N.L., 1994) [24].

Cordyanhydride A và B, hai anhydride đơn, được phân lập từ loài Cordyceps

pseudomilitaris BCC 1620 Quan trọng nhất là cordyanhydride B là lần đầu tiên

tìm thấy trong tự nhiên nonadride chứa 3 đơn vị C-9 Tuy nhiên các anhydridenày cho thấy kết quả âm tính về antimalarial, antituberculous và cytotoxicityassays (Isaka M., Tanticharoen M và cs., 2000) [26]

Một phần từ Cordyceps, dịch chiết của sợi nấm và thân quả của nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Paecilomyces đã phân lập được các hợp chất có hoạt

tính sinh học Các hợp chất trichothecane mới, paecilomycine A, B và C được

tách ra từ loài Paecilomyces tenuipes (trạng thái vô tính của Cordyceps

takaomontana), là một loại nấm được sử dụng rộng rãi như là một thực phẩm

thuốc ở các nước Bắc Á (Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản) Từ thân quả nuôicấy của loài nấm này, đã phân lập được các trichothecane, tenuipesine A vàspirotenuipesine A và B Các công trình nghiên cứu hoạt chất sinh học về nấm kýsinh côn trùng đã được tổng kết (Kikuchi H và cs., 2004a,b; Masahiko I và cs.,2005) [31], [41]

Bên cạnh cho các chất có hoạt tính sinh học cao, nấm ký sinh côn trùngcòn có ứng dụng quan trọng về kiểm soát sinh học các dịch hại côn trùng trong

hệ sinh thái nông nghiệp

Các nghiên cứu của Samson và Rombach (1985) chỉ ra rằng các loài thuộc

giống Aschersonia trong đó có loài A aleyrodis có thể sử dụng để kiểm soát loài

Trialeurodes vaporariorum thuộc họ Coccoidea, bộ Homoptera Mặt khác, tác

giả này còn nghiên cứu về khả năng sử dụng chế phẩm từ A aleyrodis ở nồng độ cao

(1013 bào tử/ha) có thể tiêu diệt được loài T vaporariorum trên cây bầu bí Nghiên

cứu của Evans (1988), Evans và Hywel - Jones (1997) đưa ra triển vọng sử dụng

các loài thuộc giống Aschersonia như là thiên địch tự nhiên của các loài côn

trùng thuộc họ Aleyrodiidae và Coccoidea Các nghiên cứu của Wagenaar,Melissa M.,Gibson, Donna M., Clardy, Jon (2002) cho thấy, giống

Ankanthomyces có loài A gracilis được xem như là tác nhân phòng trừ sâu hại

loài Staphylococcus aureus.

Các nghiên cứu của Sengonca C., Thungrabeab M., Blaeser P (2007) cho

thấy Cordyceps sp có khả năng trong kiểm soát sinh học phòng trừ sâu non của

Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae).

1.2.2 Nghiên cứu nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng dược phẩm và làm thực phẩm chức năng

Nhiều công trình đã nghiên cứu nuôi nhân sinh khối loài Cordyceps

sinensis để chiết suất lấy các hoạt chất làm dược liệu (Sun S và cs., 2003; Chen

Y.Q và cs., 2004; Jonh Holliday và cs., 2004; Weiyun Zhang và cs., 2005;Richard Alan Miller, 2005; Cleaver Phillip D., John C., 2006; ) [47], [19], [29],

[52], [44], [20] Nghiên cứu nuôi nhân sinh khối loài Cordyceps militaris để chiết

suất lấy các hoạt chất làm dược liệu (Hiroki Sato và cs., 2002; Kim S.W và cs., 2003;Mina Masuda và cs., 2005; Sung-Hom Yeon và cs., 2006) [25], [35], [39], [48]

Nấm ký sinh côn trùng thu hái từ thiên nhiên chỉ có hạn, môi trường tự

nhiên thích hợp cho sự phát triển của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps lại là ở các vùng núi cao hiểm trở, xa xôi, rất khó bắt gặp (như các loài Cordyceps sp1.,

Cordyceps sp2 ở VQG Pù Mát) Cho nên việc nghiên cứu ứng dụng để có được

các công nghệ nuôi nhân, công nghệ chiết suất các chất có hoạt tính sinh học cao

của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp rất cần thiết và rất có giá trị cho các

ngành công nghiệp dược liệu, thực phẩm chức năng

Một số nước như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốccũng đã nghiên cứu thành công và triển khai nhân nuôi sản xuất nấm ký sinh côntrùng ở quy mô nông hộ, quy mô thủ công nghiệp và quy mô công nghiệp Cho đến

nay, ở Trung Quốc có ít nhất 25 sản phẩm của Cordyceps sinensis.

Nghiên cứu về nhân sinh khối Cordyceps militaris trong điều kiện lên men

chìm của Trung Quốc cho thấy nguồn cacbon và tỷ lệ C/N có ảnh hưởng tới nồng

độ Cordycepin thu được Nguồn cacbon thích hợp nhất cho tế bào sợi nấm pháttriển là glactose, tuy nhiên nguồn cacbon thích hợp nhất cho sản xuất Cordycepin

trong môi trường lên men lỏng là glucose Nồng độ Cordycepin trong môi trườngnuôi cấy đạt cao nhất là 345.4 ± 8.5 mg/l, khả năng sản xuất Cordycepin cao nhấtđạt 19.2 ± 0.5 mg/l khi trong môi trường có tỷ lệ C/N là 42.0g glucose/l và 15.8gpeptone/l [55].

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nấm Isaria Tenuipes

 Nghiên cứu nhân nuôi nấm Isaria tenuipes

Theo đánh giá của Hywel-Jones (BIOTEC, Thái lan), trên thế giới cókhoảng 1.5 triệu loài nấm, trong đó có khoảng 2.000 loài nấm ký sinh côn trùng.Mặt khác, theo kết quả công bố mới theo trang web Index Fungorum(www.indexfungorum), trên thế giới có khoảng 2.500 loài nấm ký sinh côn trùng,trong đó giống có thành phần loài da dạng nhất là Cordyceps với 525 loài, tiếptheo là Verticillium với 261 loài, Entomophthora với 152 loài

Sau 15 năm nghiên cứu các nhà khoa học BIOTEC đã phát hiện hơn 400loài nấm ký cinh côn trùng thuộc 15 giống được phát hiện ở Thái lan trong đó có

hơn 120 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc giống Cordyceps.

Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng của Aung và cs (2008) tạiChiang mai, Thái Lan trong thời gian từ tháng 6 năm 2005 đến tháng 10 năm

2006 cho thấy, có 34 loài thuộc 15 giống ký sinh côn trùng trong tổng số 301mẵu thu thập ký sinh trên 10 bộ côn trùng chân khớp

Nghiên cứu của Katsuji Yamana và cs (1998) [29] về đặc điểm nuôi

trồng Isaria tenuipestrên môi trường lỏng và rắn để sản xuất thể quả (synnema)

trên một quy mô lớn Kết quả nghiên cứu cho thấy: Sợi nấm phát triển tốt nhất ở18-28oC trên môi trường PDA với PH ban đầu là 7.0 Sự hình thành fruit-body

của Isaria tenuipesđược gây ra bằng cách hạ thấp nhiệt độ xuống dưới 200C ởmôi trường lỏng PD Trong mùn cưa, cám gạo trộn với bột nhộng tằm cho thấytrọng lượng tươi của thể quả ngày càng tăng với nội dung ngày càng tăng của bộtnhộng tằm Sản lượng cao nhất của bộ phận thể quả đã thu được trong môitrường giàu cacbon như hạt lúa mạch có bổ sung lượng bột nhộng tằm

Nghiên cứu của Yi Sang Mong và cs (1998) về sự thay đổi tỷ lệ lây

nhiễm Isaria tenuipes trên nhộng đã được phân tích trong các giai đoạn phát triển

tương ứng trong tằm Boombyx mori Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tiêmnhiễm vào nhộng 5 ngày tuổi đạt tỷ lệ cao nhất (khoảng 90%) so với các phươngpháp khác

Nghiên cứu của Sae yun Cho và cs (1999) về việc nuôi trồng Isaria

tenuipesbằng cách sử dụng nhộng tằm Nguồn giống được lấy từ PDA môi

trường gạo lứt (Uncleaned rice) được nuôi ở 20-250C trong thời gian 30-40 ngày.Nghiên cứu sử dụng nhộng tằm tuổi 4 hoặc tuổi 5 để lây nhiễm với nồng độ bào

tử là 104- 106 sporse/ml được nuôi ở nhiệt độ từ 15-300C, PR ≥ 90%

Nghiên cứu của He-Duck Lss và cs (1999) được tiến hành nhằm tìm ra

phương pháp sản xuất fruit-body của Isaria tenuipes đại trà bằng môi trường

nhân tạo Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng nhộng tằm ở ngày đầu tiêncủa tuổi 5 đạt tỷ lệ nhiễm cao nhất là 72.0% Và công thức môi trường rắn tối ưucho sản xuất sinh khối là 80g Brownrice + 20g bột nhộng tằm, cường độ chiếusáng tối ưu cho sự hình thành thể quả là 200 lux, lượng giống (kích thước) truyềnđộc tối ưu là 5% (w/v)

Nghiên cứu của Yanging (1999) về tỷ lệ lây nhiễm trên thời gian ủ bệnh làkhác nhau Sau khi lây nhiễm trên ấu trùng tằm tuổi 5 đã cho thấy thời gian ủbệnh 16h sau khi lây nhiễm với nồng độ là 106 cfu/ml đạt tỷ lệ nhiễm cao nhất sovới thời gian ủ bệnh khác (8h và 24h)

Nghiên cứu của H S Kang (2003) về phương pháp nuôi trồng Isaria

tenuipes bằng cách sử dụng trứng Kết quả nghiên cứu cho thấy sợi nấm phát

triển tốt nhất ở 22-260C và bộ phận thể quả được thu hoặc từ một trong nhữngquả trứng sau 60 ngày tiêm nhiễm

Nghiên cứu của Pil-Don Kang và Gyoo- Byung Sung (2010) [43] đượctiến hành nhằm tìm ra một loại tằm thích hợp nhất cho sản xuất synnema của

Isaria tenuipes Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể đã

được quan sát trong sự hình thành synnema trong số các giống tằm Các synnema

của Isaria tenuipes sản xuất trên nhộng tằm tương tự như trong hình dạng và màu sắc synnema của Isaria tenuipes thu được trong tự nhiên

 Các hợp chất sinh học và thành phần hóa học có trong Isaria teuipes

Nấm ký sinh côn trùng không chỉ được ứng dụng trong kiểm soát sinh học, màchúng còn mang lại những nguốn lợi khác, trong đó có khả năng cho hợp chất có hoạttính sinh học cao( bioactive compound) là nguồn nguyên liệu cho y- dược

Rachada Haritakun và cs (2007) [49] nghiên cứu về các hợp chất trong

loài Isaria tenuipes BCC 7.831, kết qua phân tích cho thấy Isariotins A-D (1-4),

có một ancaloit sở hữu một đơn chất được cố định với vòng kép [3.3.1] Các cấutrúc của các hợp chất này đã được làm sáng tỏ chủ yếu bởi NMR và phân tíchkhối lượng bằng kính quan phổ

Theo y học truyền thống của Trung Hoa, thể quả của nấm P tenuipes có

giá trị cao về mặt dược liệu do các tác dụng về dược lý và sinh học của chúng.Những hợp chất có hoạt tính bao gồm cả hoạt tính chống khối u hoặc tác độngđến hệ thống miễn dịch tách chiết từ các loài nấm Paecilomyces đã được công bố(Borchers và cs., 1999; Liu và cs., 1996; Lee và cs., 1996) như Leucinostatins A,

D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin, Sphingofungins E và F,UCE1022, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F, Ergosterol peroxide,Acetoxyscirpenediol…

Polysaccharides phân lập từ P tenuipes đã được báo cáo có hoạt động

chống ưng thư trong cơ thể (Ban và cs., 1998) Báo cáo này cho rằng tác dụngchống ưng thư của Polysaccharides có thể do sự kích thích của hệ thống miễn dịch

Các hoạt chất Ergosterol peroxide và Acetoxyscirpenediol tách chiết từnấm P tenuipes nuôi cấy nhân tạo có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư ởngười như tế bào khối u dạ dày, tế bào ung thư gan, tế bào ung thư ruột kết-ruộtthẳng Hoạt tính của Acetoxyscirpenediol mạnh hơn Cisplatin là hoạt chất đangđược dùng điều trị cho các bệnh nhân ung thư hiện nay là 4 đến 6.6 lần (Nam vàcs., 2000)

Phân tích hóa sinh cho thấy, hợp chất Y dược Adenosine và

N6-(2-hydroxyethyl) adenosine trong thể quả của Isaria tenuipes, hai hợp chất này là

hợp chất quan trọng trong điều chỉnh sự vận chuyển nơron và chúng được chứngminh có liên quan nhiều đến chức năng sinh lý như điều hòa giấc ngủ, điều hòa

sự lo lắng, nhận thức

Các chiết xuất của methanol từ P tenuipes cho thấy, khả năng gây độc

đáng kể so với dòng tế bào ung thư HeLa, HeLa S3 và A-431 ( Shin và cs., 2000)

Park và cs (2000) nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào ung thư của P.

tenuipes trên môt số tế bào khối u ở con người.

Nghiên cứu của Nilanonta và cs (2000) cho thấy loài P tenuipes có chứa

các chất kháng khuẩn chống ưng thư và trùng rốt rét( plasmodial) do trong loàinày có chứa hoạt chất thuộc nhóm cycoldepsipeptides

Theo kết quả nghiên cứu của Haruhisa Kikuchi và cs (2004) cho thấy,

trong sinh khối nấm I tenuipes chứa Paecilomycine A, B và C là các hoạt chất có

hoạt tính sinh học cao[20]

Năm 2009, Akira Sakakura, Kazufumi Shioya và cs [13] đã phát hiện hợpchất mới chống oxy hóa pseudo-di-peptide và tiền chất của nó được chiết xuất từ

Isaria tenuipes.Chất này đã được sử dụng như một loại thuốc dân gian có nguồn

gốc từ thiên nhiên tại Nhật Bản và có tên là ‘Hanasanagitake’ Cấu trúc di-peptide được xác định là (R)-3,4-diguanidinobutanoyl-(S)-DOPA và (R)-3,4-

pseudo-diguanidinobutanoyl-(S)-tyrosine bằng phân tích quang phổ, tổng hợp hóa học vàchuyển đổi enzym.

T Bunyapaiboonsri và cs (2009) [53] Một Hêmiacêtan mới có vòng kép

và đơn, isariotins E (1) và F (2), cùng với TK-57-164A (3) đã được phân lập từ

nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes BCC 12.625 Cấu hình tuyệt đối của (3)

được ghi địa chỉ bằng cách áp dụng các phương pháp sửa đổi của Mosher.Isariotin F (2) trưng bày các hoạt động chống lại bệnh sốt rét ký sinh trùngPlasmodium falciparum K1 với IC50 là 5.1 μm và các hoạt động độc tế bàom và các hoạt động độc tế bàochống lại dòng tế bào ung thư (KB, BC, và NCI-H187) và nonmalignant (Vero)

tế bào, tương ứng với giá trị IC50 của 15.8 , 2.4, 1.6, và 2.9 μm và các hoạt động độc tế bàom

Hiện nay Hàn Quốc là nước có quy mô sản xuất P tenuipes lớn nhất thế giới Sản phẩm của P tenuipes đa dạng từ dạng thực phẩm chức năng đến các

dạng thuốc viên nang

 Khả năng ứng dụng trong phòng trừ sinh học

Trên thế giới chi Isaria cũng được xem như là một tác nhân quan trọngtrong phòng trừ sâu hại cậy trồng vì chúng dể dàng phân lập và hình thành bào tửtrong môi trường nuôi cấy (Nigel L., Hywel- Jones, 2005) Trong đó có các loài

như Isaria javanica, Isaria fariosa, Isaria fumosorosea

Nấm Isaria javanica đã được sử dụng để phòng trừ nhiều loại cây trồng.

Năm 2008 ở Argentina đã phòng trừ sâu hại cây trồng đạt hiệu quả phòng trừ từ26.6-76.6% với nồng độ 107 sau 7 ngày sau xử lý cùng các lại nấm ký sinh côntrùng khác

Theo kết quả nghiên cứu của Takeshi Maruyama và cs (2009) sử dụng P.

tenuipes để tạo ra sản phẩm làm thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ rệp trắng hại rau

trong nhà kính với hiệu quả cao

Nghiên cứu của Vega-Aquino và cs (2010) cho thấy, nấm Nomuraea

rileyi và Isaria tenuipes (= Paecilomyces tenuipes ) là các tác nhân gây bệnh phổ

biến của lepidopterans Các thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt động

của dầu làm chất bám dính cho bào tử của N rileyi và I tenuipes chống lại ấu

trùng của Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Helicoverpa Zea, vàHeliothis virescens Cả hai loại nấm được đánh giá cao tương thích với các loạidầu và tỉ lệ chết gây ra gần 100% trong tất cả các phương pháp kết hợp với dầu,

giá trị LT(50) thấp nhất 4,7 ngày đối với N rileyi và 6,0 ngày đối với I tenuipes trong dầu đậu nành Tỉ lệ chết với I tenuipes chống lại S exigua dao động từ

90% đến 100% (giống ARSEF 2488 và 4096), N rileyi gây ra tử vong 95% S.frugiperda Kết quả cho thấy một đánh giá toàn diện các nấm ký sinh côn trùngtrong nông nghiệp bằng cách sử dụng các công nghệ ứng dụng dầu là khuyếnkhích, đặc biệt, trong các nền nông nghiệp hữu cơ bền vững

1.4 Tiềm năng và tình hình nghiên cứu Isaria tenuipes ở Việt Nam

Nấm ký sinh côn trùng và công nghệ nấm – côn trùng là một lĩnh vực mớiđối với Việt Nam Cho đến nay, ở Việt Nam chỉ mới nghiên cứu về một vài loainấm ký sinh côn trùng theo hướng nghiên cứu phòng trừ sâu hại cây trồng và chỉ

tập trung nghiên cứu ứng dụng hai loài nấm Beaueria, Metarhizium, những hạn

chế về đa dạng sinh học các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, khả năng nhânnuôi để thu synnema còn rất hạn chế

Kết quả nghiên cứu của Võ Thị Thu Oanh (2003) [11] về thành phần nấm

ký sinh trên côn trùng gây hại tại một số quận ngoại thành của thành phố Hồ ChíMinh cho thấy, có 8 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc các giống Beaueria,Metarhizium, Normuraea, Entomophthora, Verticillium, Aschersonia, Fusarium

và Hirsutella Trong các mẫu thu thập thì 2 loại nấm Beaueria, Metarhizium ký

sinh trên nhiều loài côn trùng khác nhau

Kết quả nghiên cứu giữa Viên sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh

và Trung tâm Quốc gia về Kỹ nghệ gen và Công nghệ sinh học (BIOTEC, TháiLan) về đa dạng nấm ký sinh côn trùng ở Vườn Quốc gia Cát Tiên cho thấy có 35loài nấm ký sinh côn trùng thuộc 13 giống Giống có thành phần loài đa dạng nhất làgiống Aschersonia với 8 loài, tiếp theo là giống Cordyceps và Torrubiella với 5 loài.Các giống khác biến động từ 1-3 loài (Lê Tấn Hưng, 2008)

Kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2010) [9] về đa dạng nấm

ký sinh côn trùng giống Isaria ở vườn Quốc gia Phù Mát và khu bảo tồn thiênnhiên Phù Huống cho thấy có 13 loài Isaria đã được thu thập và định loại, trong

đó Isaria tenuipes là loài phổ biến nhất, tiếp theo là Isaria javanica Các loài còn

lại rất hiếm gặp, số mẫu thu được dao động từ 1 - 5 mẫu

Bảng 1 Thành phần loài Isaria tại VQG Pù Mát và Khu BTTN Pù Huống

Vật chủ của I tenuipes chỉ có trên các loài nhộng hoặc sâu non bộ cánh

vảy nhưng chủ yếu là nhộng Kích thước vật chủ biến động rất lớn, với chiều dài

2.21 - 27.36 mm, chiều rộng 1.13 - 7.78mm Điều này, chứng tỏ I tenuipes ký

sinh trên nhiều loài sâu cánh vảy khác nhau Mức độ chuyên hóa tương đối caochỉ ký sinh ở pha nhộng của sâu bộ cánh vảy Các loại sâu cánh vảy khi hóa

nhộng thường nằm trong lá, cành cây hay trong đất, nếu bị nấm ký sinh thì saumột thời gian các synnemata mọc lên có màu trắng đặc trưng

Theo nghiên cứu của Trần Ngọc Lân, Thái Thị Ngọc Lam, Nguyễn ThịThành[9] về sự sinh trưởng phát triển của Isaria tenuipes trên môi trường PDA

cho thấy Khuẩn lạc trên môi trường PDA mọc nhanh, hình toả tròn, hướng lêntrên Màu sắc khuẩn lạc thay đổi, đầu tiên màu trắng sau đó chuyển sang màu vàng

và vàng nhạt khi thành thục Bào tử xuất hiện sau nuôi cấy từ 4 - 7 ngày Sau 10ngày khuẩn lạc bao phủ PDA Kết quả bảng 5 cho thấy, đường kính của khuẩn lạctăng dần theo thời gian nuôi cấy và đạt giá trị lớn nhất là 23.66 mm sau 10 ngày(khuẩn lạc phủ kín bề mặt PDA)

Sau ngày thứ 4, bề mặt khuẩn lạc bắt đầu xuất hiện những đường trònđồng tâm Ngày thứ 5 ở giữa tâm của khuẩn lạc có xu hướng lõm xuống, mặt saumàu vàng nhạt, ở giữa màu trắng và bắt đầu xuất hiện bào tử màu trắng bao phủtrên bề mặt nấm, dạng bột Sự xuất hiện bào tử ở ngày thứ 5 đã ảnh hưởng đến

độ dày khuẩn lạc Độ dày tăng dần từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 5 và đạt đỉnh ởngày thứ 6 sau đó giảm dần

Sau 6 ngày, nấm lõm xuống rõ ràng và phân biệt thành 3 đường tròn đồngtâm trên bề mặt PDA Sợi nấm dạng lông nhu màu vàng nhạt, mềm, có lớp bào tửtrắng, dạng bột, mỏng bao phủ khắp bề mặt nấm Sau 7 ngày, giữa tâm củakhuẩn lạc bào tử nhô dần lên, dày đặc

Đái Huy Ban, Trần Đình Toại, Lưu Tham Mưu (2007) đã công bố nghiêncứu về một loại Đông trùng Hạ Thảo Isaria sp Tiêu bản của Đông trùng HạThảo đã được phát hiện ở Tuyên Quang

Kết quả nghiên cứu về thành phần sinh hóa trong nấm “Đông trùng hạ

thảo tằm dâu” (Isaria tenuipes) của Nguyễn Mậu Tuấn (2010) cho thấy, hàm

lượng protein dao động từ 59.61 đến 70.45%, hàm lượng mannitol dao động từ1.21 đến 1.78%, tổng acid amin dao động từ 27.75 đến 48.02% với các thànhphần vi lượng và vitamin cao Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu không cho thấy sự

hiện diện của hợp chất adenosien và N6-(2-hydroxyethyl) adenosine trong cácthành phần hóa sinh phân tích từ loài này mà [3] đã báo cáo

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 1/2011 đến tháng 7/2011

- Địa điểm: Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thựcvật và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư,trường Đại học Vinh

Nhân giống lỏng trên môi trường PDB

Đánh giá sự hình thành synnema trên môi trường lỏng

Ảnh hưởng của lượng cơ chất

CT3

Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

Ảnh hưởng của

dụng cụ nuôi

Xây dựng quy trình nhân nuôi synnema

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu sự hình thành synnema trên môi trường rắn nhân tạo

2.2 Nguyên vật liệu

2.2.1 Trang thiết bị, vật tư, hoá chất

- Nguyên liệu, hóa chất: Khoai tây, Agar, Dextrose, Glucose, Peptone,paraffin, cồn, Vitamin (B1, B2, B6, B12), nguồn cacbon (glucozo, mantozo,glactozo, sucrozo, fructozo), nguồn nitơ (peptone, yeast extract, malat extrac, ure,amoniclorua, glyxin)

- Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác,kính hiển vi, tủ lạnh khô, tủ hấp tiệt trùng, buồng nuôi cấy, hộp và dụng cụ thumẫu thực địa, dụng cụ nuôi cấy,…

2 2.2 Chủng nấm và phương pháp thu thập, phân lập

2.2.2.1 Chủng nấm

Mẫu nấm Isaria tenuipes thu thập ở VQG Pù Mát

2.2.2.2 Phương pháp phân lập và nuôi cấy

Các mẫu vật thu thập được phân loại và đánh giá dưới kính hiển vi điện tửtheo phương pháp Lacey and Brooks (1997) [38] Phân lập sử dụng theo phươngpháp của Goettel và Inglis (1997) [22] Phân lập các bào tử đơn dựa theophương pháp của Choi và cs (1997) [17]

Cấy chuyển sang môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) theo phươngpháp của Brown and Smith (1957) [16] và Samson (1974) Đặc điểm hình tháicủa bào tử, sợi, cấu trúc quả thể và một số đặc điểm sinh học khác được đánh giá,nhận dạng các loài ký sinh côn trùng theo phương pháp của Samson và cs.(1988) [46]; Kobayasi và Shimizu (1983) [37]; Luangsa - ard và cs (2007) [39]

và Sung và cs (2007) [49 ]

 Phân loại sơ bộ mẫu nấm ngay sau khi thu thập

Mẫu EPF sau khi thu thập phải tiến hành phận loại ngay trên thực địa vàphải chú ý quan sát hình thái bên ngoài, màu sắc, hình dạng, dạng sinh sản hữutính hay vô tính để xác định cách phân loại (có thể dựa vào vật chủ để phân loạinếu chưa xác định mẫu rõ ràng)

Đánh ký hiệu số thứ tự cho các mẫu EPF và định loại chúng theo giống

(genus); vẽ và ghi thông tin về mẫu vào sổ (chiều dài và chiều rộng quả thể, số

quả thể, màu sắc quả thể, chiều dài và chiều rộng synnema, số synnema và màu sắc); ký chủ (chiều dài và chiều rộng vật chủ…), cây cỏ, nơi thu thập, người thu

thập, địa điểm thu thập, tọa độ địa lý (GIS)

Đối với những mẫu bẩn, dùng cồn 75% vệ sinh sơ bộ để tránh nhiễmkhuẩn trong quá trình phân lập Đặc biệt là những mẫu sinh sản hữu tính như

Hypocrella, Moelleriella, Samuelsia, Torrubiella, Cordyceps và Ophiocordyceps.

 Chuẩn bị môi trường PDA

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) bao gồm các thành phần sau:Khoai tây (Potato) 200 gam

Bước 1 Khoai tây được rửa sạch và gọt vỏ, để ráo nước

Bước 2 Cân 200g và cắt nhỏ theo kích thước 1,0 x 1,0 cm rồi cho vào nồi

cùng 1000ml nước cất, nấu mềm trong khoảng 45 phút đến 1 giờ.Bước 3 Lọc lấy dịch chiết và thêm vào 20g glucose + 15g agar + lượng nước

sao cho đủ 1000ml, cho lên bếp từ, vừa đun nóng vừa cho con khuấy

từ đánh tan đều

Bước 4 Cho vào một cái chai loại 1000ml có nắp kín, đem hấp tiệt trùng ở 1210,

20p, 15psi

Lấy ra làm nguội và đổ vào đĩa petri ở điều kiện vô trùng trong buồng cấy

 Phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường PDA

Bước 1 Chuẩn bị môi trường (PDA có thêm chất kháng sinh), các dụng cụ để

phân lập và nuôi cấy

Bước 2 Mẫu đã hình thành bào tử phải phân lập ngay, mẫu non có thể để sau

vài ngày và quan sát sự hình thành bào tử

Bước 3 Dùng dụng cụ phân lập đã vô trùng để lấy bào tử rồi rải đều trên đĩa