Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn streptococcus spp gây bệnh lở loét trên cá rô phi vằn (oreochromis niloticus) của dịch ép cây cỏ lào (chromolanea odorata) luận văn tốt nghiệp đại học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINHĐOÀN THỊ THU HOÀI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Streptococcus spp GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ RÔ PHI VẰN Oreochromis niloticus CỦA DỊCH ÉP CÂY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

ĐOÀN THỊ THU HOÀI

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN

Streptococcus spp GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ

RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) CỦA DỊCH ÉP

CÂY CỎ LÀO (Chromolanea odorata)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

VINH - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN

Streptococcus spp GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ

RÔ PHI VẰN (Oreochromis niloticus) CỦA DỊCH ÉP

CÂY CỎ LÀO (Chromolanea odorata)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Người thực hiện : Đoàn thị Thu Hoài Người hướng dẫn : TS Trần Ngọc Hùng

VINH - 2011

Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn ThS Trương Thị Thành Vinh, cô giáo Nguyễn Thị Kim Chung và các giáo viên phòng thí nghiệm khoa Nông Lâm Ngư đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các thầy

cô giáo khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh đã dạy dỗ, trang bị cho tôi nền tảng kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt những năm học qua.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, tập thể lớp 48K1 – NTTS những người đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng với tất cả lòng biết ơn và kính trọng tôi xin gửi tới bố mẹ, các

em và toàn thể đại gia đình đã chăm sóc, nuôi dạy và giành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất!

Vinh, tháng 07 năm 2011 Sinh viên

Đoàn Thị Thu Hoài

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

CÁC SƠ ĐỒ v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Cây cỏ Lào 3

1.1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp 5

1.1.3 Cá Rô phi vằn ( Oreochromis niloticus) 7

1.2 Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho ĐVTS 8

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới và ở Việt Nam 9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược ở Việt Nam 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu 16

2.2.1 Dụng cụ thí nghiệm 16

2.2.2 Môi trường và hóa chất 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Sơ đồ tổng thể các nội dung nghiên cứu 17

2.4.2 Phương pháp tách chiết dịch ép 17

2.4.3 Xác định mật độ vi khuẩn 18

2.4.4 Phương pháp thử kháng sinh đồ 19

2.4.5 Thiết kế thí nghiệm 20

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.5.1 Thời gian nghiên cứu 24

2.5.2 Địa điểm nghiên cứu 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 So sánh khả năng kháng vi khuẩn streptococcus spp của dịch ép các bộ phận cây cỏ Lào 25

3.2 So sánh khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của các nồng độ dịch ép cỏ Lào 27

3.3 So sánh khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của dịch ép cỏ Lào ở các nhiệt độ khác nhau 29

3.4 So sánh khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của dịch ép cỏ Lào ở các nhiệt độ bảo quản khác nhau 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

TrangBảng 3.1 So sánh đường kính vòng kháng khuẩn của các bộ phận

cây cỏ Lào đối với Streptococcus spp 25

Bảng 3.2 So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus

spp của các nồng độ dịch ép cỏ Lào 27Bảng 3.3 So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus

spp của dịch ép ở các nhiệt độ khác nhau 30Bảng 3.4 So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus

spp của dịch ép ở các nhiệt độ bảo quản 33

CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.4.1 Sơ đồ khối nội dung thí nghiệm 17

Sơ đồ 2.4.2 Thí nghiệm tính kháng khuẩn của dịch ép 20

Sơ đồ 2.4.3 Thí nghiệm nồng độ kháng khuẩn của dịch ép cây

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1.1 Cây cỏ Lào Chromolaena odorata 3

Hình 1.1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp 5

Hình 1.1.3 Cá Rô phi vằn Oreochromis niloticus 7

Hình 2.4 Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn 18

Hình 3.1.1 So sánh đường kính vòng kháng khuẩn của các bộ phận cây cỏ Lào đối với Streptococcus spp 26

Hình 3.1.2 Đường kính vòng kháng kháng khuẩn phần ngọn 26

Hình 3.1.3 Đường kính vòng khuẩn phần lá 26

Hình 3.2.1 So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của các nồng dịch ép cỏ Lào 28

Hình 3.2.2 Đường kính vòng kháng khuẩn của cỏ Lào 28

Hình 3.3.1 So sánh đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của dịch ép ở các nhiệt độ khác nhau 31

Hình 3.3.2 Đường kính vòng kháng khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau .31

Hình 3.4.1 Đồ thị đường kính vòng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của dịch ép ở các nhiệt độ bảo quản 33

Hình 3.4.2 Đường kính vòng kháng khuẩn ở các mức nhiệt độ bảo quản 34

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cá Rô phi vằn (Oreochromis niloticus) hiện nay đang là đối tượng xuất

khẩu chủ lực của nhiều nước trên thế giới Khi nhu cầu về cá rô phi tiếp tụctăng trên toàn thế giới với sản lượng ước đạt 3 triệu tấn trên toàn cầu trongnăm 2010 so với 2,6 triệu trong năm 2007 Với doanh thu ước tính lên tới 5 tỉUSD vào năm 2010, ngành nuôi cá rô phi tăng trưởng liên tục với sự đa dạnghóa về sản phẩm như rô phi đông lạnh, rô phi philê Tuy nhiên, loài cá này rấtmẫn cảm với nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau trong ao nuôi như virus, vi

khuẩn, nấm, kí sinh trùng Trong đó, bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp là

tác nhân gây thiệt hại lớn trên các đối tượng cá nước ngọt đặc biệt là trên cá

rô phi vằn, ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thuỷ sản thế

giới Ước tính tổng thiệt hại bệnh do vi khuẩn gây ra hàng năm là khoảng 150

triệu USD

Hiện nay, có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến việc điều trị không hiệu quảđối với các bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản như: các loại kháng sinhtrước đây sử dụng đặc trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá nước ngọt không còn hiệuquả do các dòng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng tăng, danh mục kháng sinh

bị cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản theo quy định ngày càng nhiều….Trước tình hình đó, việc tìm ra các giải pháp mới trong phòng – trị bệnhnhiễm khuẩn trên động vật thủy sản nói chung, cá Rô phi vằn nói riêng nhằmthay thế các loại hóa chất, kháng sinh đang được sử dụng Xu hướng nghiêncứu các chất chiết xuất từ thảo dược không độc hại, không gây ô nhiễm môitrường đang được nhiều người quan tâm Trong số các loại thảo dược nghiêncứu thì cỏ Lào là một loài thảo dược có nhiều ưu điểm nhưng vẫn chưa đượcnghiên cứu nhiều

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Thử nghiệm khả năng kháng

vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh lở loét trên cá rô phi vằn

(Oreochromis niloticus) của dịch ép cây cỏ Lào”.

2 Mục tiêu đề tài:

- Xác định bộ phận sử dụng có tính kháng khuẩn mạnh nhất của cây

cỏ Lào

- Xác định nồng độ dịch ép cỏ Lào phù hợp tiêu diệt vi khuẩn

- Xác định khả năng kháng vi khuẩn của cỏ Lào ở các mức nhiệt độ

- Xác định nhiệt độ bảo quản của cây cỏ Lào

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu

Loài: Chromolaena odorata King & H.E Robins

Hình 1.1.1: Cây cỏ Lào Chromolaena odorata

Cỏ Lào còn có tên là Yến Bạch, Cỏ hôi, Cỏ Việt Minh, Cây Cộng sản, Cây

Lốp bốp, Cây Phân xanh, Cỏ Nhật Tên khoa học: Chromolaena odorata (L) King & H.E Robins hoặc Eupatorium odoratum L Họ Cúc (Asteraceae) [21].

Cỏ Lào là một loài cây nhỏ mọc thành bụi, thân hình trụ thẳng cao tớihơn 2 mét, có nhiều cành Lá mọc đối, lúc non hình tam giác, dài 5 – 10cm,rộng 3 – 6cm; khi cây trưởng thành, lá biến dạng thành hình quả trám lệch

Đầu lá nhọn, mép có răng cưa thưa, có lông thưa và ngăn ở cả hai mặt lá vàngọn cành Vò lá và cành non có mùi hắc thơm Cụm hoa đầu, hình trụ dài 9 –11mm, đường kính 5 – 6mm Lúc mới nở, hoa màu xanh tím, sau trắng [45].Quả bé nhỏ dài, đầu có túm lông nên có thể phát tán đi rất xa nhờ gió.Mùa hoa tháng 11 – 12 dương lịch Ở Việt Nam, cỏ Lào phân bố nhiều nhất ởtrung du, miền núi thấp ngay ở ngoại thành Hà Nội cũng thấy những bụi lớn

cỏ Lào mọc ven đường Cây có thể sinh sản vô tính rất mạnh Ngọn non, cànhgià bẻ trụi lá cắm xuống đất chỉ một tuần là mọc rễ trắng Chặt cây sát gốccàng đâm chồi mạnh Mãi năm 1935 các nhà thực vật học mới ghi nhận cây

cỏ Lào ở Việt Nam[45]

Về công dụng trong y học, từ lâu dân gian đã biết dùng cỏ Lào để cầmmáu, chữa lành các vết thương, vết bỏng và trị một số bệnh do nhiễm khuẩn

về đường ruột, ung nhọt, ghẻ lở, viêm đại tràng, đau nhức xương, cảm cúm [21]

Năm 1976, Viện Nghiên cứu y học quân sự công bố kết quả nghiên cứu:Tác dụng chống viêm, tác dụng kháng khuẩn của cỏ Lào Tác dụng chốngviêm bộ phận sử dụng là lá, thân, ngọn, rễ nhưng là lá mạnh hơn cả Tác dụngkháng khuẩn: nước sắc cỏ Lào có tác dụng ức chế vi khuẩn gây mủ trên vếtthương và ức chế trực khuẩn lỵ Shigella [24]

Năm 1983 đã nghiên cứu xác định hiệu lực kháng khuẩn của cỏ Lào theotháng và theo tuổi Ngọn non và lá bánh tẻ thu hái trong các tháng đều có hiệulực như nhau Ngọn có nụ hiệu lực kháng khuẩn kém [44]

Thành phần hóa học của cỏ Lào đã được nhiều tác giả trong và ngoàinước nghiên cứu Học viện Quân Y 17 đã nghiên cứu dịch chiết toàn phần từcây Cỏ Lào để bào chế dạng thuốc trị vết thương, vết bỏng Những nghiêncứu cho thấy Cỏ Lào giàu đạm, lân, kali Lá và ngọn non cỏ Lào chứa: Đạm2,65%, kali(K2O) 2,48%, Lân(P2O5) 0,5%, tinh dầu, tanin, flavonoid,coumarin và ankaloit Trong số đó flavonoid là nhóm hợp chất có hoạt tính

sinh học trong phòng chống các bệnh tật, tạo nên những công dụng chính củacây cỏ Lào [21].

So sánh giữa dược liệu khô và tươi và các dung môi chiết suất khác nhauthấy: Dược liệu tươi chiết bằng nước nóng 80oC ít tạp chất và có hiệu lựckháng khuẩn cao nhất, so với dược liệu khô và dung môi cồn Cao đặc và caokhô cỏ Lào chiết từ dược liệu tươi bằng nước nóng 800C bảo quản được lâusau 1 năm không mốc và giữ nguyên hiệu lực kháng khuẩn Cao khô cỏ Làohút nước mạnh hơn cao khô các loại khác Sử dụng cỏ Lào làm nguyên liệusản xuất thuốc kháng viêm, kháng khuẩn thực vật, bổ sung cho các loại thuốckháng khuẩn chế từ vi sinh vật đang bị kháng thuốc là một hướng đi mới cầnđược chú ý [44]

Hình 1.1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp

Streptococcus spp là vi khuẩn thường gây bệnh lở loét trên cá hay còn

gọi là bệnh đốm đỏ Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm,ngoài ra chúng ta còn tìm thấy trong muối tươi, biển và nơi cửa sông, đượcphân lập từ người và động vật Vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá,người và động vật lưỡng cư như ếch, thằn lằn, cá sấu…[9]

Theo Bergey (1984)[7], Streptocuccus spp có hình dạng cầu hoặc hình

ovan, có thể đứng riêng lẻ, thành cặp hay tạo thành chuỗi dài nên gọi là cầukhuẩn Vi khuẩn bắt màu tím của Gram dương không di động, hầu hết yếmkhí tùy tiện, lên men trong môi trường Glucoze, nhu cầu phát triển phức tạp

Vi khuẩn có kích thước 0,5 x 1- 1,5 μm

Streptocuccus spp phát triển tốt trên các môi trường thạch Tryptic Soy,

Brain Heart Infusion, Muller-Hinton, Nutrien agar và thạch máu cừu Nhiệt

độ nuôi cấy thích hợp 25 – 28oC Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo khuẩn lạcnhỏ (0,5 - 0,7mm) màu trắng đục, hình tròn, hơi lồi Một số chủng vi khuẩntạo khuẩn lạc trong suốt có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy Vi khuẩn khôngphát triển ở điều kiện pH 9.6, NaCl 6.5%, nhiệt độ 10oC và 45oC

Streptococcus spp là tác nhân chính của nhiều bệnh nguy hiểm gây nên

thiệt hại lớn cho cá nước ngọt nói chúng và cá Rô phi nói riêng, làm ảnhhưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành NTTS thế giới

1.1.3 Cá Rô phi vằn ( Oreochromis niloticus)

Loài: Oreochromis niloticus

Hình 1.1.3 Cá Rô phi vằn Oreochromis niloticus

Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) có thân ngắn mình cao, vảy lớn

dày và cứng Miệng cá có nhiều răng nhỏ và sắc, dạ dày bé Đặc biệt cá rô phi

có ruột dài gấp 6 – 7 lần chiều dài cơ thể chúng Cá có tốc độ tăng trưởngnhanh và kích thước lớn, lớn nhanh vào tháng đầu tới tháng 5 – 6 Cá đực lớnnhanh hơn cá cái, trong điều kiện có phân bón và cung cấp thức ăn bổ sungthì sau 4 tháng nuôi cá đạt kích cỡ là 300 – 400 g/con Cá rô phi vằn có thểsống trong khoảng nhiệt độ 8 – 420C, nhiệt độ thích hợp để cá tăng trưởng tốt

là 28 – 300C, pH thích hợp là 6,5 – 8,5, độ mặn thích hợp là 10 – 12% [38]

1.2 Những hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong phòng, trị bệnh cho ĐVTS

Kháng sinh là chất hữu cơ do sinh vật tiết ra hoặc do con người tổng hợpnên, có khả năng ức chế, kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn ở một nồng độ nhấtđịnh Trong y học, thú y và nuôi trồng thủy sản, người ta dùng kháng sinh đểtrị các bệnh nhiễm khuẩn và đem lại hiệu quả rất cao, nếu dùng đúng thuốc,đúng liều và đúng thời gian Tuy vậy, kháng sinh cũng là con dao hai lưỡi, cóthể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe động vật sử dụng nó và cũng có tác độngkhông nhỏ tới môi trường sinh thái, nếu dùng kháng sinh tùy tiện và thiếuhiểu biết có khả năng làm giảm sức đề kháng của vật nuôi với các loại mầmbệnh [9]

Việc sử dụng kháng sinh trong phòng trị bệnh vi khuẩn đã mang lạinhững thành công nhất định, nhưng nó cũng làm gia tăng những dòng vikhuẩn kháng thuốc (Weston, 1996) Sự kháng thuốc này còn được truyềnsang dòng vi khuẩn khác thông qua các thể plasmid trong đó có các vi khuẩngây bệnh trên người và động vật nuôi khác, làm hạn chế việc sử dụng khángsinh trong phòng trị bệnh cho người và trong thú y (Towner, 1995)

Dư lượng kháng sinh tồn tại trong cơ thể động vật thủy sản nuôi làmgiảm giá trị thương phẩm và tăng rủi ro cho người tiêu thụ Sự kháng thuốccũng được tìm trên những vi khuẩn gây bệnh cho người (Towner, 1995) ỞAnh và Ai Len, ADN của những vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh đã chuyển

sang các loại vi khuẩn E coli và Aeromonas phân lập từ các bệnh viện

(Rhodes và ctv, 2000)

Một trong những lý do quan trọng nhất để kiểm soát việc sử dụng khángsinh trong NTTS là sự nguy hiểm của việc các vi khuẩn kháng thuốc phát triển.Khi vi khuẩn có sức đề kháng, chúng ta sẽ rất khó khăn trong việc loại trừ chúngbằng thuốc kháng sinh Hơn nữa, nhiều loại thuốc kháng sinh được sử dụng có

tính bền khá cao trong môi trường và có thể lan ra các vùng xung quanh, làmthay đổi hệ sinh thái bằng cách biến đổi cấu trúc thông thường của vi khuẩn vàcũng có những ảnh hưởng rất lớn đối với động thực vật thủy sinh [14].

Với những hạn chế như trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Namđang có xu hướng nghiên cứu các loại thuốc điều trị bệnh cho ĐVTS cónguồn gốc từ thiên nhiên để thay thế dần các thuốc kháng sinh

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược trên thế giới

Hiện nay, việc dùng hóa chất và kháng sinh trong NTTS đã gây nên một

số tác hại như: dư lượng hóa chất, kháng sinh trong thịt tôm cá nuôi, độc hạiđối với sức khỏe con người và tác động xấu tới môi trường Do đó, xu hướngnghiên cứu những loại thuốc có nguồn gốc thảo dược phòng và trị bệnh chođộng vật thủy sản đang được thế giới quan tâm Mặt khác, ưu thế của các loạithuốc này là: an toàn đối với vật nuôi, con người và môi trường Cho nên đâyđược coi là một hướng đi phát triển bền vững cho ngành thủy sản [9]

Tác dụng diệt khuẩn của chúng được nghiên cứu trên khá nhiều loài vi

khuẩn như Aeromonas hydrophyla, Streptococus sp, Vibrio sp Các nghiên

cứu đã đề xuất được một số phương thức sử dụng thảo dược bằng cách sửdụng các bộ phận khác nhau trong cây như lá, ngọn, thân và rễ; sử dụng dịch

ép, dịch chiết hay hoạt chất của thảo dược Qua các kết quả nghiên cứu chothấy một số thảo dược bước đầu có tác dụng trong việc phòng trị bệnh cho vậtnuôi hoặc giúp sinh ra kháng thể Bên cạnh đó, có nghiên cứu còn chứngminh được tính vô hại của thảo dược đối với môi trường Mặc dù còn hạn chếnhiều so với nghiên cứu trên người và gia súc nhưng cũng có một số nghiêncứu điển hình như:

- Ở Thái Lan, Sataporn Direbusarakom, Ungkana Hiransali và SompronRunngkammerdwong (1997) đã thử nghiệm tác dụng của một số loại cây

Ocimum sanctum, Eclipta alba, Cassia alata, đối với YHV trên Penaeus monodon Kết quả cho thấy O.sanctum, E alba, C alata, P acidus có tác

dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn này và nồng độ ức chế tối thiểu là 1mg/ml,liều gây chết 50% đối với poslava 15 sau 24h là 1,987 – 3,548 ppm [39]

- Ở Trung Quốc, Khuê Lập Trung (1985) trong “Kỹ thuật phòng trị bệnh

tôm, cá và nhuyễn thể” đã đưa ra 22 loại thảo dược chủ yếu phòng trị bệnh

nhiễm khuẩn, ngoại ký sinh trùng và bệnh đường ruột Các loài thảo dược cóthể kể như: Xuyên Tâm liên, Địa Niên thảo, Lưu Xô thử, Tiền thảo, Quảntrọng…[22].

Một nghiên cứu trên cá chép ở Trung Quốc là người ta trộn lẫn một số

thảo dược với nhau (Astragalus mempranaceus phần rễ và thân, Poligonum

multiflorum phần rễ, Isatis tinctoria phần rễ, Glycyrhida grabra phần thân)

cho cá ăn 0,5 và 1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy tính miễn dịchcủa cá tăng lên đáng kể [30]

Hiện nay ở Trung Quốc sản phẩm được sử dụng phổ biến và nhiều người

biết đến có nguồn gốc từ tỏi (Allium sativum), đóng gói dạng bột mịn trắng với

trọng lượng 1kg/gói (trong gói 1kg có 10 gói nhỏ mỗi gói có trọng lượng100gram) đã được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao trong việc phòng và trịbệnh nhiễm khuẩn trên cá trắm cỏ nói riêng và cá nuôi nước ngọt nói chung[10]

Một hợp tác nghiên cứu giữa các nhà nghiên cứu người Trung Quốc và

Ấn Độ về hiệu quả của 1 số thảo mộc đối với khả năng kháng lại virus đốm

trắng trên tôm Sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm được tiến hành như sau: Năm loại thảo dược lần lượt có tên Cyanodon dactylon, Aegle marmelos,

Tinospora cordifolia, Picrorhiza kurooa và Eclipta alba được tách chiết bằng

phương pháp methanol, tiến hành dùng thảo dược đã được tách chiết trộn vàothức ăn lần lượt với các nồng độ sau 100mg/kg thức ăn; 200mg/kg thức ăn;400mg/kg thức ăn; 800mg/kg thức ăn Sau 7 ngày thí nghiệm lô đối chứng (lôkhông có tác động của thảo dược), tôm đã chết Sau 25 ngày lô thí nghiệm có

ăn thảo dược ở nồng đô 800mg/kg thức ăn có tỷ lệ sống đạt trên 74%(P<0,0001) [41]

Người ta đã nghiên cứu hiệu quả của 2 loại thảo dược (Astralagus radix

và Scutellavia radiis) lên tính miễn dịch đặc hiệu của cá rô phi Kết quả cho thấy Astralagus radix cho ăn với nồng độ 0,1 và 0,5% trong thời gian 3 tuần

là có hiệu quả tối ưu nhất; với Scutellavia radiis cần có thêm thí nghiệm để

tìm ra nồng độ và thời gian cho ăn thích hợp [31]

- Ở Ấn Độ, người ta đã tiến hành nghiên cứu trong phòng thí nghiệm với

3 loài thảo dược: Ocimum sanctum (os), withania somniera (ws) và myristik

fragrans (mf) có ảnh hưởng kháng lại vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh trên

cá song [40]

Năm 2004, Hasnabana đã nghiên cứu sử dụng Azadirachta indik,

Allium sativum và Poligonum hidropiper là 3 loại thảo dược dùng để kháng

khuẩn Kết quả cho thấy chúng có tác dụng phòng bệnh nhưng không gây ônhiễm môi trường [32]

Một nghiên cứu khác đề cập đến hiệu quả của thảo dược đối với tínhmiễn dịch của cá chép Ấn Độ khi cho ăn thức ăn chứa 0,5% rễ cây

Achyranthes astera sau 4 tuần thấy cá có khả năng sinh kháng thể [42].

Cũng ở Ấn Độ, người ta cũng đã tiến hành nghiên cứu trong quy mô

phòng thí nghiệm với 3 loại thảo mộc Ocimum sanctum (OS), Withania

somnifera (WS) và Myristica fragrans (MF) có ảnh hưởng kháng lại vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh trên cá song (Epinephelus tauvina) bước đầu đã có

kết quả tốt trong việc trị bệnh do vi khuẩn Vibrio harveyi Một nghiên cứu

khác tại Ấn Độ cho thấy chất chiết từ lá ổi và quả ổi có tác dụng chống lại các

loài vi khuẩn Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Bacillus, E coli,

Clostridium và Pseudomonas [40].

Nhìn chung, trên thế giới đã quan tâm tới vấn đề hiệu quả sử dụng thảodược về khía cạnh kháng khuẩn trên các đối tượng thủy sản nhằm phòng vàtrị bệnh Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu còn hạn chế ở quy mô phòng thínghiệm, các sản phẩm ra đời trên thị trường từ các kết quả nghiên cứu hiệnnay còn hạn hữu

1.3.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng thảo dược ở Việt Nam

Cũng như nhiều nước trên thế giới có nghề NTTS, Việt Nam cũng đangđối mặt với những ảnh hưởng lớn của dư lượng hóa chất, kháng sinh sử dụngtồn đọng trong sản phẩm thủy sản gây độc cho sức khỏe con người, vật nuôiđồng thời tác động xấu đến môi trường sinh thái

Để khắc phục tình trạng lệ thuộc vào hóa chất, kháng sinh trong phòngtrị bệnh cho động vật thủy sản nuôi, đảm bảo nguồn thực phẩm an toàn chongười tiêu dùng, thời gian qua đã có không ít những nghiên cứu sử dụng thảodược trong phòng trị bệnh thủy sản Một số loài thảo dược đã được đưa vàonghiên cứu: tỏi, lá xoan, lá ổi, lá hẹ,… Đối tượng nuôi được nghiên cứu baogồm cả các loài nước mặn và nước ngọt như cá chép, cá trắm cỏ, cá rô phi, cásong [23]

Từ lâu, nhân dân ta đã biết sử dụng cây cỏ xung quanh mình để trị nhiềubệnh như viêm nhiễm đường ruột, đường hô hấp, tiết niệu, trị mụn nhọt, rửavết thương Từ thế kỉ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng các loại thảomộc như tỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, lá trầu, để trị một số bệnh cho con người[19], nhưng các chất như Alixin trong tỏi, Odorin trong hẹ, Brazilin vàsappanin trong tô mộc,… chỉ mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây.Theo y học cổ truyền thì phần lớn các thuốc có tác dụng chữa bệnh nhiễm

khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc gọi là “ thanh nhiệt, giải độc, thuốc khửhàn,…”[19].

Ở Việt Nam, các thực nghiệm nghiên cứu xác định tính kháng khuẩnthực vật mới chỉ được chú ý từ giữa thế kỉ XX trở lại đây [19]

Phạm Văn Ngữ (1956), qua nghiên cứu trên 500 cây thuốc đã khẳng địnhrằng nhiều cây có tính kháng khuẩn mạnh Nguyễn Văn Hưởng và ctv (1959),

đã đưa ra chế phẩm Tô mộc trị kiết lỵ sau khi nghiên cứu trên 1000 cây thuốc

Đây là loài thảo dược có tác dụng kháng nhiều loài vi khuẩn Gram (+) và vi

khuẩn Gram (-) Tác dụng kháng khuẩn của cây Tô mộc rất bền, giữ được hoạttính trên invitro, liều điều trị và liều gây độc có khoảng cách an toàn rộng [19].Việc nghiên cứu sử dụng thảo dược phòng trị bệnh cho vật nuôi thủy sản

ở nước ta đã có bước tiến đáng kể Ban đầu là phương pháp trộn cả phần thôthảo dược vào thức ăn cho cá như phương pháp của Bùi Quang Tề (1985)hoặc của Đỗ Thị Hòa (1996) [9,10] Ngày nay hầu hết các nghiên cứu đều sửdụng dịch chiết, có nghiên cứu còn thu được hoạt chất

Ở miền Bắc, thuốc KN 04 - 12 là sản phẩm phối chế của đề tài cấp nhànước mã số KN 04 -12 năm 1990 - 1995 do Hà Ký làm chủ nhiệm Thànhphần thuốc bao gồm các cây thuốc có kháng sinh thực vật, gồm: rau nghể

(Polygonum hydropiper L.); rau sam (Portulaca cleracae L.); cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta L.); cỏ sữa lá nhỏ (Euphobia thymifolis); sài đất (Wedelia

calendulacae); nhọ nồi (Eclipta alba Hassk); bồ công anh (Lactuca indica

L.); cây vòi voi (Heliotrpium indicum L.); chó đẻ răng cưa (Phyllantus

urinaria L.) và vitamin cùng một số vi lượng khác Thuốc có tác dụng phòng

và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôi lồnghay nuôi ao [10]

Ở miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôithủy sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian: Khu vực nuôi cá bè ở Tân Châu -

Châu Đốc An Giang; Hồng Ngự Đồng Tháp; Vĩnh Hưng, Tân Hưng

-Đồng Tháp Mười - Long An,…người dân đã biết dùng cây cỏ mực (Prostista

alba), dây trầu không (Piper better L.) để phòng trị bệnh ký sinh trùng cho cá;

lá ổi (Psidium guajava) chữa bệnh nhiễm khuẩn cho cá [15].

Năm 2002, Phan Xuân Thanh và ctv đã nghiên cứu chọn ra được một sốcây có hoạt chất chính là 2 - hydro - 6 -pentodecatrienylbenzoate có tác dụngchống khuẩn và chống nấm phổ rộng Hoạt chất này là thành phần chính củachế phẩm Sông Lam TS3 hiện đang được sử dụng để phòng trị bệnh cho độngvật thủy sản [10]

Nguyễn Thị Vân Thái (2004), đã nghiên cứu thấy nhiều vị thuốc có tínhkháng khuẩn được kết hợp với nhau để trở thành một đơn thuốc, ví dụ như:kết hợp củ cải, hạt tía tô, hạt cải bẹ để trị bệnh nhiễm khuẩn ở phổi hoặc kếthợp với các vị hoàng liên, hoàng lá, đại hoàng, gọi là “tam hoàng” để sắc rửavết thương nhiễm khuẩn Ngày nay, với y học tiến bộ người ta đã tách chiếtthành công các hoạt chất làm tăng tác dụng điều trị và ổn định chế phẩm [19].Theo tổng kết của Đỗ Tất Lợi (2006), hợp chất có trong thảo dược rấtphong phú, chúng được chia thành các nhóm trong đó bao gồm kháng sinhthực vật (Phitoncid) có tác dụng diệt khuẩn cũng như hạn chế sự sinh trưởngcủa các loại vi khuẩn [23]

Viện bỏng quốc gia ngày 28/6/2006 đã hoàn thành quy trình sản xuấtthuốc mỡ Eupolin để điều trị bỏng cho bệnh nhân từ cỏ Lào Nghiên cứu trênnhiều bệnh nhân bỏng cho thấy, thuốc mỡ Eupolin sản xuất từ cây cỏ Lào cóhiệu quả ức chế vi khuẩn mạnh, kích thích biểu mô phát triển, liền vết thương

và giảm sưng viêm, sản phẩm có giá thành thấp nhưng chất lượng vượt trội sovới các loại thuốc sử dụng trước đây [5] Ngoài ra, dịch chiết từ cây cỏ Lào ởnhững nồng độ nhất định có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của tế bào gốcdây cuống rốn Đây sẽ là cơ sở để tiến hành nghiên cứu các chế phẩm điều trịbệnh nan y[21]

Lý Thị Thanh Loan và ctv (2006) trong đề tài: “ Thử nghiệm sử dụng

một số cây thuốc và các hợp chất chiết xuất từ thảo mộc trong phòng và trị các bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng ở tôm, cá” đã nghiên cứu sử

dụng một số cây thuốc và các hợp chất chiết xuất từ thảo mộc để phòng và trịbệnh do vi khuẩn, virus và ký sinh trùng trên tôm sú và cá tra, ba sa Nghiêncứu đã tách chiết được các hoạt chất có trong 4 loài cây: lá diệp hạ châu

(Phyllanthus amarus), cây ổi (Psidium guajava L), cây bồ kết (Gleditsia

sinEnzofroxaccinsia Lamk) và cây xoan (Azadirachta indica A Juss) có hiệu

quả phòng, trị bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng ở tôm sú và cá tra, cábasa [15]

Một sản phẩm có tên VTS1 - C và VTS1 - T là sản phẩm thảo dược

phối chế từ các hoạt chất tách chiết từ tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia

calendulacea), nhọ nồi (Elista alba Hassk) để phòng trị bệnh cho tôm Sú và

cá tra nuôi ao và nuôi lồng để phòng trị một số bệnh do vi khuẩn Aeromonas

hydrophyla, Edwardsiella tarda, Hafnia alvei, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus [17].

Như vậy, ngoài các vấn đề đã giải quyết được thì các nghiên cứu trên vẫncòn bộc lộ một số hạn chế như: các nghiên cứu trên thực địa còn ít, sản phẩmthuốc có nguồn gốc từ thảo dược còn khiêm tốn, các thí nghiệm nghiên cứu

về nồng độ thảo dược, ảnh hưởng của nhiệt độ, nhiệt độ bảo quản, các chấthóa học đến tính kháng khuẩn của thảo dược còn ít Mặt khác, phần lớnđang sử dụng dịch chiết dạng thô, chưa tách được kháng sinh nguyên chất cótrong thảo dược nghiên cứu

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cây cỏ Lào (Chromolaena odorata) thuộc họ Cúc (Asteraceae).

- Vi khuẩn Streptocuccus spp được thu và lưu giữ ở phòng thí nghiệm vi

sinh bệnh học khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học Vinh

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ thí nghiệm

- Đĩa petri, kính hiển vi

- Que cấy, đèn cồn, lam kính, khay inox, panh, kẹp gắp

- Dao, kéo, cối, chày, lưới lọc, giấy lọc, cốc thủy tinh, đĩa lồng

- Tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp

- Nước cất, dầu soi kính

Và một số dụng cụ cần thiết khác.

2.2.2 Môi trường và hóa chất

- Môi trường: Nutrient Agar,

- Hóa chất: Dung dịch chỉ thị màu dùng để nhuộm Gram: Dung dịchCrysta Violet, dung dịch Lugol, dung dịch cồn 96%, dung dịch Safranin

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của dịch ép

các bộ phân là lá bánh tẻ, ngọn non và phần thân cây cỏ Lào

- Thử nghiệm khả năng tiêu diệt vi khuẩn Streptococcus spp của các nồng độ pha loãng dịch ép cây cỏ Lào

- Thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp ở các mức nhiệt độ khác nhau của dịch ép cây cỏ Lào.

- Thử nghiệm khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp ở các mức

nhiệt độ bảo quản dịch ép cây cỏ Lào

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Sơ đồ tổng thể các nội dung nghiên cứu

Sơ đồ 2.4.1 Sơ đồ khối nội dung thí nghiệm

2.4.2 Phương pháp tách chiết dịch ép

Cỏ Lào thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độphòng, cân khối lượng rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, vắt lấy dịch ép qualưới lọc Dịch ép được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảmdưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt

độ

Xác định khả năng kháng khuẩn của các bộ phận cây cỏ Lào

Kết luận

Streptococcus spp

Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, …,10-n.

Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấytrên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt Mỗi độ pha loãng nuôicấy từ 2 – 3 đĩa lồng

Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trênđĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng

Hình 2.4 Các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X = V A.K

NA(-) NA(-) NA(-)

Nước muối sinh lý

Vi khuẩn gốc

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Trong đó:

X: mật độ vi khuẩn

A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng

V: Thể nước đưa vào nuôi cấy

K: Hệ số pha loãng

2.4.4 Phương pháp thử kháng sinh đồ

Thử kháng sinh đồ theo phương pháp của Bauer - Kirby (1997): Khángsinh đồ được thực hiện trên môi trường Nutrient agar, các đĩa giấy có kíchthước 0,6 cm được tẩm dịch ép của các loại thảo dược đến no (mỗi nồng độthảo dược thử nghiệm được lặp lại 4 lần)

Cách tiến hành: - Dùng pipet lấy 0,1ml dung dịch vi khuẩn, dàn đều lênmặt thạch, để ráo trong 1 phút

- Đặt các đĩa giấy kháng sinh tẩm thảo dược đặt ở các vị trí khác nhautrên mặt thạch, đưa vào tủ ấm giữ ở nhiệt độ 280C – 300C

Đọc kết quả, đo đường kính vòng kháng khuẩn sau 24h

+ Đường kính vòng kháng khuẩn ˃20 mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm cao.+ Đường kính vòng kháng khuẩn từ 11 – 20 mm là vi khuẩn có tính mẫncảm trung bình

+ Đường kính vòng kháng khuẩn <11 mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm kém.+ Đường kính vòng kháng khuẩn = 0 là vi khuẩn không có tính mẫn cảm

2.4.5 Thiết kế thí nghiệm

a) TN1: Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Streptococcus spp của dịch

ép các bộ phận là lá bánh tẻ, ngọn non và phần thân cây cỏ Lào

Sơ đồ 2.4.2 Thí nghiệm tính kháng khuẩn của dịch ép

Cỏ Lào tươi được rửa sạch, để ráo nước ở nhiệt độ phòng (khoảng

300C) Dùng cối dã nhuyễn các bộ phận khác nhau rồi vắt lấy nước, chúng tôithu được Dịch ép và cho vào các ống nghiệm khác nhau Cho các khoanh giấyvào các ống nghiệm đó tới khi ngậm no nước thì gắp ra để ráo

Vi khuẩn được lưu giữ lấy ra nuôi cấy tăng sinh Sau đó chúng tôi xácđịnh mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (Bauer - Kirby(1997)) Tiếp theo tiến hành trang vi khuẩn trên đĩa MHA (theo Kock, 1987)nhằm xác định số vi khuẩn sống để tiến hành thử kháng sinh đồ

Tiến hành thử kháng sinh đồ đối với mật độ vi khuẩn 106CFU/ml Mỗiđĩa thạch trang 0,1ml dung dịch vi khuẩn

Dung dịch vi khuẩn

- Dịch ép có tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn hay không.

- Các bộ phận thì bộ phận nào có tính kháng khuẩn mạnh nhất.