Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Màng sinh học biofilm là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh vật, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn của một hoặc một số loài phát triển tr

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Đức Hạnh

LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú Y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn khoa học PGS

TS Nguyễn Bá Hiên đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị trong bộ môn Vi Sinh Vật - Truyền Nhiễm đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Đức Hạnh

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái niệm về màng sinh học (BIOFILM) 3

2.2 Các dạng màng sinh học trong tự nhiên 5

2.3 Qúa trình hình thành màng sinh học 6

2.4 Cấu trúc của màng sinh học 10

2.5 Vai trò của màng sinh học đối với vi sinh vật trong tự nhiên 13

2.6 Các phương pháp nghiên cứu sự hình thành màng sinh học 16

2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành màng sinh học 20

2.8 Tác hại của màng sinh học 22

2.9 Biện pháp kiểm soát sự hình thành màng sinh học 23

2.10 Ứng dụng có lợi của màng sinh học 23

PHẦN 3 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Đối tượng nghiên cứu 27

3.2 Nội dung nghiên cứu 27

3.3 Địa điểm nghiên cứu 27

3.4 Thời gian nghiên cứu 27

3.5 Nguyên liệu 27

3.6 Phương pháp nghiên cứu 28

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

4.1 Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn 32

4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 35

4.3 Kết quả định lượng khả năng sản sinh màng sinh học 37

4.4 Biến động của quá trình sản xuất màng sinh học 39

4.5 Kết quả nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học 42

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Kiến nghị 46

Tài liệu tham khảo 48

Phụ lục 55

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn 35 Bảng 4.2 Kết quả xác định khả năng đề kháng kháng sinh 44

DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn 4 Hình 2.2 Một số ví dụ về màng sinh học 6 Hình 2.3 Mô hình phát triển của màng sinh học 7 Hình 2.4 Mô hình cấu trúc của màng sinh học hoàn chỉnh 11 Hình 2.5 Cấu trúc phân lớp của màng sinh học 12 Hình 2.6 Cấu trúc phân lớp của màng sinh học 13 Hình 2.7 Vai trò của vi khuẩn không hoạt động trong lớp biofilm 14 Hình 2.8 Khả năng đề kháng với hiện tượng thực bào của biofilm 15 Hình 2.9 Phương pháp ống nghiệm nghiên cứu sự hình thành biofilm 17 Hình 2.10 Phương pháp bổ sung đỏ Congo nghiên cứu sự hình thành biofilm 18 Hình 2.11 Mức độ sản sinh biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo 18 Hình 2.12 Dụng cụ cải tiến dùng trong nghiên cứu biofilm 19 Hình 2.13 Phương pháp slide- band xác định sự hình thành biofilm 19 Hình 3.1 Các bước nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian 30 Hình 3.2 Tóm tắt các bước nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh 31 Hình 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu swab 32 Hình 4.2 Kết quả thuần khiết tụ cầu khuẩn từ mẫu swab 33 Hình 4.3 Hình thái của chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết 34 Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng của tụ cầu khuẩn ở môi trường TSB-Y 36 Hình 4.5 Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học 37 Hình 4.6 Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (200X) 38 Hình 4.7 Mức tạo màng sinh học của tụ cầu khuẩn 39 Hình 4.8 Biến động về lượng biofilm sản sinh theo thời gian 40 Hình 4.9 Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại bởi lớp biofilm 41 Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh 43

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Đức Hạnh

Tên Luận văn: Nghiên cứu sự hình thành màng sinh học (biofilm) và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm

Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm

Phương pháp nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập được ở đường hô hấp của gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội và một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương

* Nội dung nghiên cứu

 Phân lập và thuần khiết vi khuẩn

 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

 Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn

 Nghiên cứu biến động của quá trình sản sinh màng sinh học theo thời gian

 Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học

* Nguyên liệu

+ Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water (Merck)

+ Yeast extract (Oxoid)

+ Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột

+ Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences)

+ Hóa chất dùng trong định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate

+ Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808)

* Phương pháp nghiên cứu

+ Phương pháp phân lập, thuần khiết vi khuẩn

+ Phương pháp xác định khả năng sản sinh màng biofilm

+ Phương pháp nghiên cứu biến động lượng biofilm sản sinh theo thời gian + Phương pháp xác định khả năng đề kháng kháng sinh

THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Duc Hanh

Thesis title: Research of the formation of biofilm and antibiotic tolerance of producing bacteria

biofilm-Major: Veterinary Medicine Code: 60.64.01.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

To determine the ability to formation the biofilm of isolated gram-positive bacteria

To research the antibiotic tolerance of biofilm-producing bacteria

Research Methods

* Research subjects

The gram-positive bacteria is isolated in the respiratory tract of chickens which are raised in Gia Lam district, Ha Noi capital and some neighboring provinces such as Bac Giang, Vinh Phuc and Hai Duong

* Research content

+ Isolattion and purification bacteria

+ Quantify the biofilm production ability of bacteria

+ Research the characteristics of biofilm production by time

+ Research antibiotic resistance ability of biofilm-producing bacteria

* Research materials

+ Liquid environment: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water (Merck) + Yeast extract (Oxoid)

+ Antibiotic impregnated paper, antibiotic powder

+ 96 wells aseptic plastic disk

+ Chemicals used in quantifying biofilm membrane: methanol, 1x PBS buffer, 1% crystal violet solution, 80% alcohol solution with additional 5% sodium dodecyl sulfate

+ ELISA reader (Biotek, ELx808)

Research method

+ Method of isolating and purifying aerobic bacteria

+ Method of determining the biofilm production ability of bacteria

+ Method of research the variation of biofilm amount produced by time

+ Method of determining the antibiotic resistance ability

Main findings and conclusions

- There were 51.61% of Staphylococcus spp isolated from the respiratory tract of chickens produced biofilm at strong, medium and weak level

- Biofilm formation process has characteristics: biofilm production increased from

4 to 20 hours, then reduced from 24 hours to 40 hours

- Antibiotic concentration of 100 times higher and 10 times minimum inhibitory concentration only reduced the attenuation of bacteria respectively 7.4 times and 6.2 times compared with the bacterial attenuation concentration in the absence of antibiotics

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Màng sinh học (biofilm) là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh vật, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn của một hoặc một số loài phát triển trên một bề mặt vật chất và được cấu tạo từ sự liên kết của các tế bào với các polysaccharide, protein và nucleic acid của chính các tế bào đó Do được lớp polysaccharide bao bọc nên những vi khuẩn này có khả năng bám dính, tồn tại lâu dài trên bề mặt, đề kháng tốt với hiện tượng thực bào và sự tác động của kháng sinh (Costerton, 1999) Dưới sự bảo vệ của lớp màng sinh học này, các vi khuẩn có thể chịu được một liều lượng kháng sinh cao đáng kinh ngạc mà chỉ với liều kháng sinh bằng 1/1000 liều lượng này các vi khuẩn không có màng sinh học

Trong lĩnh vực thú y đã có một số đề tài tập trung nghiên cứu mức độ kháng thuốc (Nguyễn Đức Hiền, 2012) và hiện tượng kháng kháng sinh trong mối tương quan với các gen kháng thuốc (Võ Thành Thìn, 2011) Tuy vậy, theo hiểu biết của chúng tôi, việc nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học và đánh giá ảnh hưởng của màng sinh học tới sức đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh chưa được thực hiện Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu:

+ Xác định khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn + Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn sản sinh biofilm

1.2 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho hướng nghiên cứu về (i) khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) và (ii) khả năng đề kháng kháng sinh của các vi sinh vật gây bệnh trong lĩnh vực thú y

- Kết quả nghiên cứu của đề tài này sẽ giúp chúng ta nhận thấy được tính chất nguy hiểm của vi khuẩn có khả năng sản sinh biofilm, từ đó nâng cao được ý thức của người chăn nuôi trong công tác vệ sinh phòng bệnh và cách sử dụng kháng sinh hợp lý

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ MÀNG SINH HỌC (BIOFILM)

Vi sinh vật là tên gọi chung để chỉ tất cả các sinh vật có hình thể bé nhỏ, muốn thấy rõ được người ta phải sử dụng tới kính hiển vi Vi sinh vật không phải

là một nhóm riêng biệt trong sinh giới Chúng thậm chí thuộc về nhiều giới sinh vật khác nhau và giữa các nhóm có thể không có quan hệ mật thiết với nhau (Nguyễn Lân Dũng, 2002)

Lịch sử nghiên cứu và phát triển của vi sinh vật học đã ghi nhận người có công phát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên mô tả hình thái nhiều loại vi sinh vật đó là Antonie van Leeuwenhoek (1632 - 1723) Với việc tự chế tạo ra trên 400 chiếc kính hiển vi, ông đã lần lượt quan sát mọi thứ có xung quanh mình, trong đó có cả các vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà ông đã gọi là những “động vật vô cùng nhỏ bé” Ông là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng bám dính và phát triển phổ biến của vi khuẩn trên bề mặt răng tạo thành các mảng bám răng, một dạng của màng sinh học sau này (Nguyễn Lân Dũng, 2002)

Zobell (1936) đã nghiên cứu cho thấy số lượng vi khuẩn bám dính tại vị trí tiếp xúc giữa nước biển và bề mặt vật rắn lớn hơn nhiều so với các vị trí xung quanh Lợi ích của bề mặt chất rắn mang lại được đánh giá như một nơi cư trú của các vi khuẩn giúp tập trung hấp thụ chất dinh dưỡng, tăng cường hoạt động của các enzyme và hấp thụ các chất chuyển hóa,bề mặt chất rắn còn làm chậm sự khuếch tán của các enzyme ngoại bào, thúc đẩy sự đồng hóa các chất dinh dưỡng thông qua quá trình thủy phân trước khi chúng được hấp thụ (Zobell, 1943)

Năm 1969, (Jones, 1969), đã sử dụng kính hiển vi điện tử quét để chỉ ra sự xuất hiện của màng sinh học trong bộ lọc nhỏ giọt của một nhà máy xử lý nước thải và cho thấy rằng chúng bao gồm nhiều loại, nhóm các vi sinh vật khác nhau (dựa trên đặc điểm hình thái tế bào) Bằng cách sử dụng chất nhuộm màu polysaccharide đặc biệt là đỏ Ruthenimum và cố định bởi Osmium tetroxide (OsO4), các nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng vật liệu chất nền bao xung quanh và kết dính các tế bào trong cấu trúc màng sinh học chính là polysaccharide

Dựa trên những quan sát ở mảng bám răng và một số thí nghiệm khác, (Costerton, 1978), đã đưa ra giả thuyết về màng sinh học: “Trong tự nhiên, các tế bào vi khuẩn gắn kết với nhau và bám dính trên một bề mặt nhất định nhờ hệ thống sợi glycocalyx” Giả thuyết này đã góp phần giải thích cơ chế bám dính của vi sinh vật trên các vật liệu vô sinh và hữu sinh và những lợi ích thu được nhờ phương thức sinh thái thích hợp này Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng sinh học được đưa ra ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn Hiện nay, khái niệm màng sinh học được hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh vật bám dính và phát triển trên bề mặt các môi trường khác nhau thông qua mạng lưới chất ngoại bào do chính chúng tạo ra (Donlan, 2002; Morikawa, 2006a)

Các tế bào vi sinh vật trong một màng sinh học khác biệt với các tế bào sống trôi nổi tự do bởi việc tổng hợp các chất ngoại bào giúp các tế bào bám dính với nhau trên bề mặt, sự giảm tỷ lệ tăng trưởng, và sự điều hòa tăng hoặc giảm của các gen đặc biệt nào đó Khả năng bám dính của vi sinh vật là một quá trình phức tạp được điều hòa bởi sự khác nhau về môi trường nuôi cấy, chất nền ngoại bào và bề mặt tế bào (Morikawa, 2006b)

Ở một khía cạnh khác, màng sinh học được xem như một dạng sống của vi sinh vật (Flemming, 2016), giúp chúng đề kháng với hiện tượng thực bào (Costerton, 1999) và đề kháng với các hóa chất diệt khuẩn (Chambless, 2006) Minh họa về màng sinh học được trình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn

Nguồn: Ikuma (2013)

2.2 CÁC DẠNG MÀNG SINH HỌC TRONG TỰ NHIÊN

2.2.1 Trong môi trường tự nhiên

Môi trường nước trong các hồ, ao, sông, suối là điều kiện thuận lợi nhất cho việc hình thành và phát triển một mạng lưới màng sinh học Màng sinh học có thể được tạo thành ngay trên bề mặt nước (khoảng tiếp xúc với không khí) để hình thành nên dạng cấu trúc màng nổi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạng những cặn hay váng của vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước

Một dạng khác của màng sinh học trong tự nhiên được tìm thấy là khi các vi sinh vật bám dính trên bề mặt vật liệu rắn như các viên sỏi, đá trong nước tạo thành dạng màng sinh học bề mặt (hình 2.2a)

2.2.2 Trong các hệ thống thiết bị nhân tạo

Màng sinh học cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủ yếu từ vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép …) như trên vỏ của tàu thuyền, trong lòng các ống dẫn nước, ống dẫn dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thực phẩm

Trong các thiết bị, đồ dùng gia đình cũng có sự xuất hiện của màng sinh học khi các vi sinh vật bám dính trong hệ thống vòi hoa sen, bồn rửa mặt

2.2.3 Trong cơ thể sinh vật sống

Màng sinh học có thể hình thành trên bề mặt lớp tế bào biểu mô như biểu

mô ống dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên răng tạo thành cấu trúc màng sinh học gọi là mảng bám răng (hình 2.2c) Thậm chí bề mặt của những dụng cụ y

tế đặt trong cơ thể như van tim, niệu quản nhân tạo cũng có thể là vị trí tồn tại của màng sinh học

a b c

Hình 2.2 Một số ví dụ về màng sinh học

(a): Màng sinh học trên tảng đá (b): Màng sinh học trên bề mặt bàn chải đánh răng (c): Màng sinh học của vi khuẩn sâu răng hình thành nên mảng bám răng

2.3 QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh học, các nhà khoa học đã đưa ra một mô hình cấu trúc màng sinh học cơ bản (Costerton, 1995) Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các khuẩn lạc và được bao quanh bởi một mạng lưới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các

tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh học Nhờ đó, dịch tế bào có thể đi qua màng sinh học tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải (Steyn, 2005)

Sự tạo thành màng sinh học cũng giống như một quá trình phát triển của

vi sinh vật và cần phải trải qua một số bước Cơ chế phân tử giữa các vi sinh vật có thể khác nhau nhưng các giai đoạn trong sự phát triển của màng sinh học thì luôn được bảo tồn Quá trình này lần lượt bao gồm: sự gắn kết của các

tế bào vi sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trưởng và liên kết các

tế bào thành khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh học trưởng thành (hoàn chỉnh)

và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (hình 2.3)

Gắn kết

thuận nghịch

Gắn kết không thuận nghịch

Hình thành các khuẩn lạc

Hình thành màng sinh học trưởng thành

Tách rời

Hình 2.3 Mô hình phát triển của màng sinh học

Nguồn: Steyn (2005)

2.3.1 Giai đoạn 1: Giai đoạn gắn kết thuận nghịch

Trước khi vi sinh vật bám dính lên bề mặt, các phân tử hữu cơ, protein, glycoprotein đã tiếp xúc và hình thành nên một màng điều kiện, đó là một khu vực giàu dinh dưỡng giúp thuận lợi cho sự trao đổi chất của các tế bào vi sinh vật (Beveridge, 1997)

Khi bề mặt điều kiện được hình thành, các thuộc tính của nó thay đổi để thu hút các vi sinh vật Sự gắn kết của các vi sinh vật lên bề mặt nhờ lực liên kết Vander Waals, lực hút tĩnh điện, tương tác ưa nước và các tương tác đặc biệt khác, hoặc bởi một sự kết hợp các liên kết này, tùy theo mức độ gần gũi của các vi sinh vật với bề mặt bám dính Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút

tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ được bao bọc trong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh học (O'toole, 2000) Tuy nhiên, các tế bào này chưa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh học và có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống phù du

2.3.2 Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch

Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trưởng để hình thành

một màng sinh học hoàn chỉnh Vì vậy, giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa tế bào và giá thể (Notermans, 1991)

Các nghiên cứu trên gen chỉ thị cho thấy biểu hiện của gen sinh tổng hợp alginate ở Pseudomonas aeruginosa algC và algD được điều hòa tăng lên trong

15 phút ngay sau khi có sự bám dính đầu tiên của vi khuẩn lên một bề mặt Mặc

dù sự sản xuất alginate cũng được xem như là phương thức để hình thành nên bộ khung cấu trúc và hóa học của màng sinh học (Stoodley, 2002), nhưng những nghiên cứu gần đây lại chứng minh rằng chính sự hiện diện của mạng lưới chất ngoại bào chứ không phải alginate là thực sự cần thiết cho sự hình thành màng sinh học của P aeruginosa (Matsukawa, 2004)

Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dính không thuận nghịch được thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi được đánh giá là quan trọng trong bước đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rút được chỉ ra là cần thiết cho sự trưởng thành của màng sinh học trong điều kiện tĩnh Cụ thể, nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng sinh học bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tương tác giữa các vi khuẩn với bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào, qua đó giúp tăng cường mức độ bám dính với bề mặt (O'toole, 2000)

2.3.3 Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới khuẩn lạc

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các khuẩn lạc Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh học cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên Một mạng lưới màng sinh học dần được hình thành (Steyn, 2005)

2.3.4 Giai đoạn 4: Hình thành màng sinh học hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình sinh trưởng của màng sinh học bắt đầu Trong suốt quá trình này, sự phân chia trực phân của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân

giúp các tế bào phân chia để lan rộng và phát triển đầy lên từ các điểm gắn kết để hình thành các khuẩn lạc hay các cụm tế bào (Heydorn, 2000)

Bản chất của bề mặt là nơi bám dính của các khuẩn lạc và chính các điều kiện vật lý và hóa học của môi trường sẽ quyết định cơ chế hình thành màng sinh học nào là chiếm ưu thế Sự sinh trưởng của màng sinh học dẫn đến sự kế tiếp của các cấu trúc dạng nấm hay dạng cột xen kẽ với các kênh chứa đầy dịch, và một khi phát triển đến mức đầy đủ thì màng sinh học sẽ cho thấy những mô hình biến đổi trong sự tăng trưởng của vi khuẩn cũng như sự tương tác sinh lý và hiệu quả trao đổi chất (Korber, 1989)

2.3.5 Giai đoạn 5: Tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh học giới hạn trong điều kiện dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào Các phân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng, sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu

tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy (O'toole, 2000) Trong một số trường hợp, khi màng sinh học đạt đến khối lượng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các khuẩn lạc (Korber, 1989)

Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng quá trình tách rời là hết sức phức tạp Sự khác biệt về mặt tế bào và hoạt tính của nó tại các trung tâm của một cấu trúc màng sinh học trưởng thành dẫn đến sự phân tách tế bào từ bên trong cấu trúc màng, chuyển sang lấp đầy các khoảng trống của một màng sinh học khác chưa hoàn thiện Cơ chế tách rời của màng sinh học liên quan đến sự phân hủy các tế bào bên trong cấu trúc của nó Enzyme lyase phân hủy polysaccharide đóng vai trò quan trọng trong sự phân rã màng sinh học ở nhiều loài vi sinh vật bằng cách phân hủy mạng lưới chất nền ngoại bào được tạo ra từ các tế bào (Kaplan, 2003)

(Boyd, 1994), đã chứng minh sự cảm ứng biểu hiện của enzyme lyase phân giải alginate ở P aeruginosa làm giảm đáng kể tổng lượng sản xuất alginate, tương ứng với sự tăng số lượng tế bào bị phân tách Điều này giúp các nhà nghiên cứu khẳng định vai trò của enzyme phân giải alginate ở dạng P

aeruginosa hoang dại có thể là nguyên nhân giải phóng các tế bào khỏi các bề mặt rắn hay các màng sinh học của chúng, làm phát tán những vi sinh vật vào trong môi trường nuôi cấy

Quá trình tách rời cũng có nguyên nhân bởi các lực tương tác vật lý, (Brading, 1995), đã nhấn mạnh tầm quan trọng của các tương tác vật lý trong

sự tách rời, bao gồm 3 quá trình chính đó là: sự xói mòn hay phân cắt (liên tục loại bỏ những phần nhỏ của màng sinh học), sự bóc tách (loại bỏ nhanh chóng

và với lượng lớn) và sự bào mòn (sự tách rời do va chạm của lượng lớn các hạt phân tử chất lỏng với màng sinh học) (Characklis, 1990b), nhận thấy rằng tỷ lệ xói mòn tăng lên cùng với độ dày màng sinh học và dòng chất lỏng tại bề mặt giao diện với màng sinh học mà ở đó màng dày lên Với sự gia tăng của tốc độ dòng chảy, thủy động lực học của lớp ranh giới giảm, dẫn đến sự pha trộn và nhiễu loạn ở gần bề mặt màng sinh học Sự bóc tách xảy ra ngẫu nhiên hơn sự xói mòn và được cho là kết quả của sự suy giảm chất dinh dưỡng và oxy trong cấu trúc màng sinh học

2.4 CẤU TRÚC CỦA MÀNG SINH HỌC

Về khả năng hình thành màng sinh học, cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm đều có khả năng tạo màng sinh học Tuy nhiên, mức tạo màng sinh học mạnh - yếu là khác nhau, hoặc có chủng vi khuẩn không có khả năng tạo biofilm Rất nhiều vi khuẩn được xác định có khả năng sản sinh màng sinh học trong quá trình phát triển gồm: Haemophilus influenza, Escherichia coli, Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Actinomyces israeli, Acinetobacter baumanii, Actinobacillus equuli, Aeromonas hydrophila, Listeria monocytogenes, Salmonella enteric, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, v.v… (Auger, 2009, Clutterbuck, 2007, Costerton, 1999, Djordjevic, 2002, Lee, 2007, Scher, 2005) Một số vi khuẩn thường gặp khác cũng hình thành màng sinh học như: Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridians, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis và Pseudomonas aeruginosa (Hassan, 2011)

Màng sinh học hoàn chỉnh (mature biofilm) là một cấu trúc có dạng hình nấm Trong cấu trúc này có các kênh để lưu thông các dòng chất lỏng, tín hiệu hóa học, sản phẩm trao đổi chất (Costerton, 2001; Nadell, 2009)

Hình 2.4 Mô hình cấu trúc của màng sinh học hoàn chỉnh

Dòng vật chất chảy qua các kênh của biofilm là cầu nối giữa các vi sinh vật nằm trong lớp biofilm, và đóng vai trò dẫn truyền các tín hiệu hóa học (quorum sensing molecule) Vi khuẩn nằm trong biofilm luôn có sự tương tác thông qua tín hiệu hóa học hoặc sự trao đổi plasmid, do vậy biofilm luôn ở trạng thái động (luôn có sự giải phóng vi khuẩn khỏi biofilm và sự tiếp nhận vi khuẩn cùng/ khác loài vào lớp biofilm) Về thành phần vi sinh vật, màng sinh học có thể bao gồm một hoặc nhiều loài vi khuẩn khác nhau (Thornton, 2011; Yang, 2011) Mối quan hệ giữa các loài vi sinh vật khác nhau có thể là quan hệ cạnh tranh hoặc tương hỗ (Yang, 2011)

Các nghiên cứu sâu về cấu trúc còn cho thấy màng sinh học hoàn chỉnh (mature biofilm) là một cấu trúc phân lớp và không đồng nhất (Stewart, 2008) được minh họa ở hình 2.8

Hình 2.5 Cấu trúc phân lớp của màng sinh học

Có thể thấy ở cấu trúc biofilm mới hình thành (chỉ bao gồm 1 lớp vi khuẩn), quá trình thẩm thấu diễn ra nhanh chóng nên oxy hòa tan và các cơ chất (substrate) được cung cấp một cách đồng đều cho tất cả vi sinh vật nằm trong màng biofilm Ngược lại, ở cấu trúc màng biofilm hoàn chỉnh có sự phân lớp rõ ràng, bao gồm:

- Lớp tiếp xúc trực tiếp với môi trường (lớp b) được cung cấp đầy đủ oxy và

cơ chất Vi sinh vật trong lớp này sẽ có kiểu trao đổi chất hiếu khí (aerobic metabolism)

- Lớp giữa (lớp c) có lượng oxy hòa tan hạn chế Vi sinh vật nằm trong lớp này trao đổi chất theo phương thức lên men (fermentation)

- Lớp trong cùng của biofilm (lớp d) là khu vực trong đó rất nghèo oxy và cơ chất Vi sinh vật nằm trong lớp này tồn tại ở trạng thái không hoạt động (inactive) Điểm đáng chú ý khác trong cấu trúc của biofilm là: dưới tác động bất lợi của ngoại cảnh (ví dụ như kháng sinh), biofilm có thể bao gồm các vi khuẩn ở các trạng thái khác nhau (hình 2.6)

Hình 2.6 Cấu trúc phân lớp của màng sinh học Hình 2.6 mô tả sự phân hóa các vùng trong cấu trúc biofilm dưới tác động của kháng sinh (Chambless, 2006) Vùng màu vàng là vùng vi khuẩn tiếp xúc với kháng sinh ở nồng độ cao nhất Do được bao phủ bởi các thành phần là polysaccharide ngoại bào, quá trình thẩm thấu kháng sinh vào các vùng phía dưới

bị hạn chế, tạo điều kiện cho vi khuẩn có thời gian để thích nghi, hình thành những kiểu hình đề kháng Vùng lõi của biofilm là vùng có sự thay đổi tiểu môi trường mạnh mẽ nhất (thiếu oxy, cơ chất), các tế bào vi khuẩn chuyển sang trạng thái tĩnh, không hoạt động (persister) Nhóm này chiếm khoảng 1% trong tổng số

vi khuẩn cấu thành nên biofilm

2.5 VAI TRÒ CỦA MÀNG SINH HỌC ĐỐI VỚI VI SINH VẬT TRONG

TỰ NHIÊN

Sự tạo thành màng sinh học là một hiện tượng phổ biến trong đời sống của các vi sinh vật và trở thành phương thức giúp chúng tồn tại và phát triển trong

tự nhiên

2.5.1 Bảo vệ tế bào trước những bất lợi của môi trường

Mạng lưới ngoại bào của màng sinh học cung cấp nơi khu trú và một hằng

số nội môi thích hợp cho các vi khuẩn tồn tại Nó đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của các màng sinh học Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng

nhờ hoạt tính trao đổi anion Điều này cũng có nghĩa là nó sẽ làm hạn chế sự khuếch tán của một số hợp chất từ môi trường xung quanh vào trong màng sinh học (Kokare, 2009)

Màng sinh học của các chủng vi sinh vật tạo màng giúp chúng kháng lại các tác nhân là các vi khuẩn, các chất kháng sinh hay chất sát trùng Cơ chế bảo vệ của màng sinh học có thể là: ngăn chặn sự xâm nhập của các chất này vào trong màng sinh học; thay đổi tốc độ tăng trưởng của các vi sinh vật trong màng hay các biến đổi chức năng sinh lý khác thông qua các phương thức tăng trưởng Đặc tính này phần lớn phụ thuộc vào tính chất của cả mạng lưới biofim và tác nhân kháng khuẩn và thường thể hiện rõ với các chất kháng sinh thuộc nhóm ưa nước

và tích điện dương như các aminoglycoside (Gilbert, 1997)

Trong nhiều bệnh nhiễm trùng mạn tính, sự hình thành biofilm làm cho vi khuẩn rất khó bị tiêu diệt bởi kháng sinh Khi ngừng dùng thuốc, vi khuẩn nằm trong lớp biofilm phát triển và gây nhiễm trùng trở lại Hiện tượng này được giải thích bởi sự tồn tại của vi khuẩn ở trạng thái không hoạt động (persister cells) nằm trong lớp biofilm (hình 2.7)

Hình 2.7 Vai trò của vi khuẩn không hoạt động trong lớp biofilm Vai trò của biofilm trong cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn còn được nhìn nhận

ở một góc độ khác: đề kháng lại hiện tượng thực bào (Costerton, 1999)

Hình 2.8 Khả năng đề kháng với hiện tượng thực bào của biofilm Hình 2.8 giải thích một phần vai trò của màng sinh học trong cơ chế sinh bệnh Đối với vi khuẩn tự do (planktonic bacteria), chúng có thể bị tiêu diệt bởi kháng thể và quá trình đại thực bào, đồng thời cũng mẫn cảm với kháng sinh Vi khuẩn nằm trong lớp màng sinh học (sessile communities) được bao bọc bởi lớp polysaccharide ngoại bào, có kích thước không gian lớn nên không thể bị thực bào Lớp màng này cũng làm hạn chế khả năng thẩm thấu của kháng sinh vào các lớp tế bào vi khuẩn bên trong cấu trúc biofilm Do tính chất lạ, màng sinh học cũng thu hút sự tập trung của đại thực bào, giải phóng enzyme và gây ra tổn thương cho mô bào xung quanh vị trí vi khuẩn hình thành màng sinh học Do quá trình hình thành màng sinh học là một quá trình động, vi khuẩn nằm trong lớp màng này có thể được giải phóng dưới dạng vi khuẩn tự do, phát tán tới các vị trí khác trong cơ thể

Mạng lưới chất ngoại bào cũng được ghi nhận là có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trường như sự thay đổi độ pH, bức xạ tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn (Kokare, 2009) Thành phần chính của màng sinh học chiếm tới 97% là nước Khả năng giữ nước cao của mạng lưới ngoại bào thông qua các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo

vệ màng chống lại sự khô hạn trong môi trường tự nhiên Quá trình hấp thụ các nguyên tố kim loại nặng được biết đến do tác dụng của nhóm mang điện tích âm trong mạng lưới chất ngoại bào như nhóm phosphate, lưu huỳnh, hay nhóm chức axit (Morikawa, 2006a)

2.5.2 Thu nhận nguồn chất dinh dưỡng từ môi trường

Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh học cung cấp phương tiện trao đổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn, tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất có nguy cơ độc hại (Decho, 1990) Màng sinh học cung cấp một môi trường lý tưởng cho sự thiết lập mối quan hệ hợp dưỡng giữa các loài vi sinh vật Hợp dưỡng là một trường hợp đặc biệt của mối quan hệ cộng sinh, trong đó hai loài (hoặc hai chủng) vi sinh vật khác nhau phụ thuộc lẫn nhau về mặt trao đổi chất để sử dụng một số cơ chất nhất định, đặc biệt là cho các yêu cầu về năng lượng (Flemming, 1993)

2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SỰ HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC

Có nhiều phương pháp được dùng để định tính hoặc định lượng sự hình thành màng sinh học của vi sinh vật, ví dụ như: định lượng trên đĩa nuôi tế bào (Tissue Culture Plate, TCP), ống nghiệm (Tube method, TM), thử khả năng tạo chất nhày (slime) trên thạch bổ sung đỏ Congo (Congo Red Agar, CRA), bioluminescent assay, piezoelectric sensors và phương pháp huỳnh quang (Hassan, 2011) Cũng theo tác giả trên, phương pháp định lượng màng sinh học TCP có ưu điểm nổi trội so với các phương pháp đơn giản khác như TM và CRA (Hassan, 2011) Bên cạnh các phương pháp trên, có thể phát hiện sự có mặt của gen quyết định khả năng sản sinh màng sinh học, như gen eno, icaA, icaD và bap của vi khuẩn Staphylococcus aureus và coagulase negative Staphylococci (Darwish, 2013)

2.6.1 Phương pháp xác định biofilm trong ống nghiệm (tube method)

Đây là phương pháp đầu tiên dùng để xác định biofilm của vi sinh vật, và được mô tả lần đầu tiên bởi (Christensen, 1982), trong nghiên cứu khả năng sản sinh chất có khả năng bám dính của chủng Staphylococcus epidemidis Trong

phương pháp này, ống ly tâm nhựa 15 ml được dùng để nuôi vi khuẩn và tạo bề mặt cho sự bám dính của vi khuẩn Vi khuẩn được nuôi cấy tĩnh trong môi trường TSB ở 37oC sau 18 đến 24 giờ Sau thời gian nuôi cấy, môi trường được loại bỏ và lớp vi khuẩn bám dính bên trong lòng ống được nhuộm bằng trypan blue Kết quả của phương pháp xác định biofilm trong ống nghiệm được trình bày ở hình 2.9

Hình 2.9 Phương pháp ống nghiệm nghiên cứu sự hình thành biofilm

Vi khuẩn S epidemidis chủng RP-12 có khả năng sản sinh chất bám dính trong quá trình sinh trưởng (hình 2.9A) và vi khuẩn S epidemidis chủng SP-2 không có khả năng sản sinh chất bám dính (hình 2.9B) Phương pháp ống nghiệm

là phương pháp định tính, do vậy rất khó phát hiện được những chủng vi khuẩn chỉ sản sinh biofilm ở mức độ yếu Trong phương pháp ống nghiệm, một số tác giả cho rằng việc kéo dài thời gian nuôi cấy tĩnh vi khuẩn lên 48 giờ có thể làm rõ kết quả hình thành biofilm (Freeman, 1989)

2.6.2 Phương pháp xác định biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo

Phương pháp này lần đầu tiên được mô tả bởi (Freeman, 1989) nhằm cải tiến những nhược điểm của phương pháp ống nghiệm của (Christensen, 1982) Theo phương pháp này, vi khuẩn được ria cấy trên thạch brain heart infusion agar

có bổ sung thuốc nhuộm đỏ Congo ở nồng độ 0,08% Theo tác giả (Freeman, 1989), cơ chế cụ thể của thuốc nhuộm Congo trong xác định sự hình thành biofilm còn chưa sáng tỏ, nhưng thuốc nhuộm có thể tương tác với những chất bám dính tiết ra bởi vi khuẩn (exopolysaccharide) để tạo ra khuẩn lạc có màu khác nhau, tương ứng với mức hình thành biofilm Vi khuẩn sau khi ria cấy được nuôi hiếu khí ở 37oC/24 giờ Vi khuẩn sản sinh biofilm sẽ hình thành khuẩn lạc màu đen ánh kim; vi khuẩn không hình thành biofilm có màu hồng của thuốc

nhuộm Kết quả xác định biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo được trình bày ở hình 2.10 (Darwish, 2013)

Hình 2.10.Phương pháp bổ sung đỏ Congo nghiên cứu sự hình thành biofilm Trong hình 2.10, hình A biểu thị chủng vi khuẩn hình thành biofilm, trong khi đó hình D biểu thị chủng vi khuẩn không hình thành biofilm Tác giả (Arciola, 2002), còn chia cấp độ hình thành biofilm của vi khuẩn trên thạch bổ sung đỏ Congo theo màu của khuẩn lạc, được minh họa ở hình 2.11

Hình 2.11 Mức độ sản sinh biofilm trên thạch bổ sung đỏ Congo Trên hình 2.11 vi khuẩn không hình thành biofilm (phía trái) được chia thành các cấp độ màu khác nhau từ đỏ sẫm - đỏ - đỏ bordeaux Trong khi đó, vi khuẩn hình thành biofilm (phía phải) được chia thành màu nâu - đen - đen sẫm, tương ứng với mức độ tăng dần của lượng biofilm sản sinh

2.6.3 Các phương pháp nghiên cứu biofilm khác

Hiện nay, có rất nhiều cải tiến được đề xuất trong nghiên cứu sự hình thành biofilm của vi khuẩn Tác giả (Almshawit, 2014), đề xuất tận dụng ống nhựa polypropylene và hộp đựng đầu típ để tạo thành dụng cụ nghiên cứu biofilm kinh

tế và tiết kiệm (hình 2.12)

Hình 2.12 Dụng cụ cải tiến dùng trong nghiên cứu biofilm

Tác giả (Paytubi, 2014), đã công bố một cách cải tiến khác (được thực hiện trên phiến kính) để nghiên cứu biofilm Trong phương pháp slide- band này, các phiến kính hoặc phiến silicon được nhúng vào bể nuôi vi khuẩn Các phiến kính sau đó sẽ được lấy ra tại các thời điểm khác nhau như 24, 48 và 72 giờ Phương pháp này đặc biệt phù hợp khi xác định biofilm hình thành ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường và không khí Hình 2.13 trình bày kết quả xác định biofilm bằng phương pháp này

Hình 2.13 Phương pháp slide- band xác định sự hình thành biofilm

2.7 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC

Để chuyển từ dạng sống tự do sang dạng cấu trúc màng sinh học đòi hỏi một loạt những điều kiện nhất định, trong đó có ba yếu tố chính quy định nên sự hình thành màng sinh học :

 Tính chất bề mặt giá thể;

 Điều kiện môi trường;

 Đặc tính tế bào của các chủng vi sinh vật (Kokare, 2009)

2.7.1 Tính chất bề mặt giá thể

Sự phát triển của các tế bào bên trong màng sinh học đã được chứng minh

là có tăng lên khi tăng mức độ thô ráp của bề mặt Năm 1990, (Characklis, 1990a), đã ghi nhận mức độ bám dính của khuẩn lạc vi sinh vật gia tăng khi các

bề mặt càng ghồ ghề Điều này được giải thích là do ở bề mặt thô nhám, lực tương tác giữa các tế bào với bề mặt giảm đi và diện tích tiếp xúc được tăng lên đáng kể so với các bề mặt trơn nhẵn

Tính chất hóa lý của bề mặt vật liệu cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đến tốc độ

và mức độ bám dính của tế bào lên bề mặt Hầu hết các nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật gắn kết với một bề mặt kị nước, không phân cực như Teflon và nhựa nhanh hơn và tốt hơn so với bề mặt một vật liệu ưa nước như thủy tinh hay kim loại (Bendinger, 1993)

Bên cạnh đó, diện tích bề mặt là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của màng sinh học Theo nguyên tắc, diện tích bề mặt càng lớn càng làm tăng khả năng tiếp xúc với tế bào, qua đó tạo điều kiện cho việc bám dính lên bề mặt giá thể Các hệ thống ống dẫn khác với hầu hết các môi trường tự nhiên (ao hồ, sông …) thường có một diện tích bề mặt khá lớn tạo điều kiện cho việc tiếp xúc giữa tế bào vi khuẩn và bề mặt

2.7.2 Điều kiện môi trường

Các đặc trưng hóa lý của môi trường như nhiệt độ, pH, mức độ dinh dưỡng, nồng độ các ion, đóng một vai trò quan trọng ảnh hưởng đến tốc độ gắn kết của

vi sinh vật lên bề mặt

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng khả năng bám dính của vi sinh vật và sự hình thành màng sinh học cũng chịu ảnh hưởng của nhịp điệu mùa ở các lưu vực nước khác nhau (Donlan, 1994) Hiệu ứng này có được là do ảnh hưởng của nhiệt độ nước theo mùa lên các thông số tăng trưởng của vi sinh vật Năm 1988, (Fletcher, 1988), cũng đã chứng minh sự gia tăng nồng độ của một số cation (Na+, Ca2+, Fe3+, La+) ảnh hưởng đến khả năng bám dính của chủng Pseudomonas fluorescens lên bề mặt thủy tinh, bằng cách làm giảm lực tương tác giữa các tế bào vi khuẩn với bề mặt kính Nghiên cứu của (Cowan, 1991), cho thấy sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng tỷ lệ thuận với số lượng gắn kết của các tế bào vi khuẩn lên bề mặt

Việc tạo màng sinh học có thể coi như là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của môi trường Khi lượng chất dinh dưỡng bao gồm nguồn cacbon, nitơ bị giảm sút thì các vi sinh vật sống trôi nổi trong môi trường nước sẽ có xu hướng tập trung đến nơi có nguồn dinh dưỡng tích tụ Khi các hợp chất hữu cơ tích tụ lại trên bề mặt, chúng sẽ thu hút các vi khuẩn, tảo và động vật nguyên sinh đến, theo thời gian sẽ phát triển thành một màng sinh học

2.7.3 Đặc tính tế bào của các chủng vi sinh vật

Mặc dù màng sinh học là hình thức tồn tại phổ biến của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên nhưng không phải vi sinh vật nào cũng có khả năng hình thành màng sinh học Các đặc tính của tế bào bao gồm các cấu trúc phụ trợ như lông roi, tiêm mao, khả năng di động, bám dính, khả năng tạo các chất ngoại bào (protein, polysaccharide), cảm biến mật độ (quorum sensing) ảnh hưởng lớn đến việc hình thành màng sinh học Thí nghiệm so sánh giữa hai chủng Pseudomonas fluorescens của (Davey, 2000), đã cho thấy chủng di động có khả năng hình thành màng sinh học nhanh hơn so với chủng không di động

Tuy nhiên, một số loài không có phần phụ trợ tế bào nhưng vẫn có khả năng hình thành màng sinh học mạnh dựa vào khả năng tự tổng hợp các chất ngoại bào như lipopolysaccharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc màng giáp (capsule), màng nhày (slime) bao quanh tế bào Đặc tính này tạo tính tự kết dính cho tế bào và chủ yếu có trong những loài vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus mutants, Streptococcus salivarius, Xanthomonas, Bacillus anthracis (Costerton, 1974)