Tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ trứng gà tại một số trang trại trên địa bàn hà nội và vùng phụ cận

LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu trong luận văn là một phần của đề tài “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng và sự phát tán của chủng vi khuẩn kháng thuốc giữa các

Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

- Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại các trang trại trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận

- Phân lập và giám định vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng thu thập tại trang trại trên địa bàn hà nội và vùng phụ cận

- Kiểm tra tính kháng kháng sinh và xác định đặc điểm gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E.coli phân lập được.

Đối tượng nghiên cứu

⚠️The Pollinations legacy text API is being deprecated for **authenticated users**.Please migrate to our new service at https://enter.pollinations.ai for better performance and access to all the latest models.Note: Anonymous requests to text.pollinations.ai are NOT affected and will continue to work normally.

Nguyên liệu nghiên cứu

- Mẫu trứng gà thu thập tại các trang trại chăn nuôi

3.3.2 Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn

- Các môi trường dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn E.coli gồm: Môi trường thạch MacConkey, thạch Mueller Hinton, Tryptone Bile Glucuronic Agar (TBX), nước thịt pepton

3.3.3 Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài

Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin và Amoxicillin-clavulanic acid

- Khoanh giấy tẩm kháng sinh được bảo quản theo tiêu chuẩn Kết quả được đánh giá theo qui định của nhà sản xuất

- Hoá chất: Dung dịch NaOH 10%, muối tinh, pepton, cồn sát trùng 70%, nước muối sinh lý 0,85%, ống so màu độ đục chuẩn (Mc Farland 0,5)…

Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà đẻ

3.4.2 Phương pháp thu thập trứng

- Mỗi mẫu trứng lấy với số lượng là 3 quả

- Lấy 4 mẫu/ hộ chăn nuôi gia cầm để xét nghiệm vi khuẩn E coli

3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu vận chuyển về phòng thí nghiệm được xử lý ngay, trường hợp chưa xử lý được thì mẫu được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4 o C không quá 36 giờ

3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu

Vi khuẩn E coli thuần khiết được bảo quản trong dung dịch Glycerol với tỷ lệ 1:1 và được cất giữ trong tủ lạnh âm sâu -80 o C

3.4.5 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E coli

Hình 3.1 Tóm tắt các bước phân lập và bảo quản giống

3.4.6 Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được

* Phương pháp được tiến hành như sau:

+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Mueller Hinton

+ Bước 3: Dùng kẹp đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt thạch

Bảng 3.1 Bảng đánh giá khả năng mẫn cảm / kháng kháng sinh của E coli theo (CLSI 2014)

Hàm lượng kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí các khoanh giấy kháng sinh

Xác định gen kháng kháng sinh của chủng E.coli phân lập được

Chủng vi khuẩn E coli đa kháng kháng sinh được gửi tới công ty BGI

(Hồng Kông) để tiến hành giải trình tự genome bằng hệ thống Illumnia HiSeq

Bảng 3.2 Trình tự gen tham chiếu mcr-1

GenBank Mã số Protein Loài vi khuẩn Biến thể gen MCR

KX276657 anh55937 Escherichia coli MCR1

NG_051170 wp065274078 Klebsiella pneumoniae MCR1.2(Q3L)

LC191581 bav82474 Escherichia coli MCR1

KY075656 aqz20430 Escherichia coli MCR1

NG_054678 wp085562392 Escherichia coli MCR1.7(A215T)

KY271416 apm84489 Escherichia coli MCR1.5(H452Y)

NG_052664 wp076611062 Escherichia coli MCR1.4(D440N)

KX859085 aqs99092 Escherichia coli MCR1.13(M2V)

NG_054697 wp085562407 Escherichia coli MCR1.8(Q3R)

NG_052893 wp077248208 Salmonella enterica MCR1.6(R536H) KX443408 ara74236 Klebsiella pneumoniae MCR1.9(V413A)

NG_052861 wp077064885 Escherichia coli MCR1.3(I38V)

NG_051171 wp065419574 Escherichia coli MCR2

NG_055496 wp078254299 Moraxella pluranimalium MCR2.1

CP014234 ame01623 Moraxella osloensis MCR-M

Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học và sử dụng phần mềm Excel.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh

Hình 4.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh

Ghi chú: 12 nhóm kháng sinh được điều tra, bao gồm: Aminoglycoside (1), Amphenicols (2), Beta-lactam

(3), Cephalosporin (4), Fluoroquinolone (5), Glycopeptides (6), Lincosamides (7), Macrolide (8), Nitrofurans (9), Pleuromutilins (10), Polypeptide (11), Spectinomycin (12), Tetracycline (13) và

Có 9 trong tổng số 14 loại kháng sinh được điều tra đã được sử dụng trong quá trình chăn nuôi gà Các loại kháng sinh được dùng thuộc về 12 nhóm kháng sinh (hình 4.1) Trong 14 loại kháng sinh được điều tra, một số loại được thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%) Nhận xét về cách dùng thuốc, chúng tôi thấy người chăn nuôi dùng kháng sinh quá lạm dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có một phần nhỏ các hộ chăn nuôi thì cập nhật kỹ thuật của một số các công ty lớn nhưng không nhiều Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinh được dùng để phòng và trị bệnh Thời gian ngừng sử dụng thuốc kháng sinh cho gia cầm trước khi xuất chuồng tại các hộ chăn nuôi thường theo kinh nghiệm ( Phụ Lục 1)

Kết quả phân lập và giám định vi khuẩn E coli

4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E Coli

Hình 4.2 Hình ảnh đặc trưng của vi khuẩn E coli trên môi trường (1)

Hình 4.3 Kết quả phân lập E coli trên thạch TBX

Bảng 4.1 Kết quả phân lập E coli từ trứng và swab ổ nhớp

Loại mẫu Số mẫu kiểm tra*

Số mẫu phân lập được E coli

Ghi chú: * có 62 mẫu lòng trứng trong số 204 quả trứng được dùng phân lập E coli Phân lập E coli từ

50 mẫu swab ổ nhớp lấy ở gà của trang trại thu mẫu trứng

E coli ở vỏ trứng thấp hơn rõ rệt so với mẫu swab ổ nhớp Sự khác biệt này là do cơ chế chống nhiễm khuẩn của trứng (Jonchère et al., 2010; Wellman-Labadie et al., 2008), với sự hiện diện của nhiều loại protein có hoạt tính diệt khuẩn trên vỏ trứng, ví dụ như: ovocleidin-17, ovocleidin-116, ovocalyxin-21, ovocalyxin- 25, ovocalyxin-32 và ovocalyxin-36 (Hamid, 2016) Về tỷ lệ dương tính, một số nghiên cứu trong nước và quốc tế cho biết tỷ lệ nhiễm E coli ở vỏ trứng rất biến động, từ 10,5% (Eid et al., 2015) cho đến 29,1% (Trương Hà Thái và cs., 2017)

E coli ở vỏ trứng và dùng cho nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh Các phần dưới đây tổng hợp kết quả phân lập E coli ở vỏ trứng theo địa phương và theo tình trạng sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi

Bảng 4.2 Kết quả phân lập E coli ở vỏ trứng theo địa phương lấy mẫu

TT Địa điểm* Số mẫu kiểm tra

Số mẫu phân lập được E coli

Lương Sơn của tỉnh Hòa Bình

Có 29/72 (40,3%) mẫu vỏ trứng phân lập được E coli ở nhóm không sử dụng kháng sinh Ở nhóm sử dụng kháng sinh, E coli phân lập được ở 39/139

Hình 4.4 Tỷ lệ phân lập E coli ở vỏ trứng theo tình trạng dùng kháng sinh

4.2.2 Kết quả giám định vi khuẩn E.coli

Với 68 chủng E.coli phân lập được đã tiến hành giám định một số đặc tính sinh hóa chủ yếu Kết quả thể hiện ở bảng 4.3

Bảng 4.3 Chỉ tiêu sinh hóa của Vi khuẩn E.coli STT Chỉ tiêu sinh hóa Số chủng kiểm tra Số chủng (+) Tỷ lệ (+)

Ghi chú:VP: Voges-proskauer, MR: Red Methyl, LCD: Lysine decaboxy holate Dương tính (+)

Kết quả kiểm tra sinh hóa được minh họa bởi hình 4.5

Kiểm tra tính kháng kháng sinh và xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn

4.3.1 Đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được

Nghiên cứu về đặc điểm kháng kháng sinh của E coli, có khoảng 16 loại kháng sinh thường được dùng: Neomycin, Doxycycline, Rifampicin, Amoxicillin, Vancomycin, Nitrofurantoin, Penicillin-G, Ciprofloxacin,

Erythromycin, Gentamicin, Streptomycin, Tetracycline, Oxacillin, Amoxicillin- clavulanic acid, Sufamethoxazole/Trimethoprim, và Colistin (Okorie-Kanu et al.,

Hình 4.6 Tính mẫn cảm kháng sinh của E coli phân lập từ vỏ trứng

4.3.1.1 Đặc điểm mẫn cảm với từng loại kháng sinh của vi khuẩn E.coli Đặc điểm mẫn cảm với kháng sinh được phân tích theo 3 nhóm tùy thuộc vào mức độ quan trọng của kháng sinh dùng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở người Kết quả được trình bày ở các hình (hình 4.7 và 4.8)

Hình 4.7 Tính mẫn cảm với Ciprofloxacin, Amoxicillin và Colistin

Ghi chú: kết quả được tổng hợp đối với 68 chủng E coli, và được chia thành nhóm không sử dụng kháng sinh và nhóm có sử dụng kháng sinh

Hình 4.8 Kết quả thử tính mẫn cảm với Gentamycin,

Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline và Nitrofurantoin

4.3.1.2 Đặc điểm mẫn cảm theo tình hình sử dụng kháng sinh

Hình 4.9 So sánh tính mẫn cảm của E coli phân lập từ vỏ trứng ở nhóm không sử dụng và có sử dụng kháng sinh

4.3.1.3 Tính đa kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được Ở Việt Nam, nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của E coli đã được quan tâm từ rất sớm (Bùi Thị Tho, 1996), vi khuẩn E coli kháng thuốc được phát hiện phổ biến ở động vật nuôi như gà, vịt và lợn (Cao Thuấn and Lý Thị Liên Khai, 2018; Dang và cs.,2018; Dang and Nguyen, 2016; Lê Văn Lê Anh and Lý Thị Liên Khai, 2017; Trương Hà Thái và cs.,2017) Để tìm hiểu về đặc điểm đa kháng kháng sinh của các chủng E coli phân lập từ trứng trong nghiên cứu này, kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh đã được tổng hợp theo số loại kháng sinh bị kháng (bảng 4.4)

Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra tính đa kháng kháng sinh

TT Số loại kháng sinh bị kháng

Kiểu hình đa kháng Số lượng chủng Tỷ lệ (%)

1 7 CIP, AMC, CT, CN, SXT, TE, F 3 4,4

CIP, AMC, CT, SXT, TE, F 1

3 CIP, AMC, CT, CN, SXT, TE 1

4 CIP, CT, CN, SXT, TE, F 5

AMC, CT, CN, SXT, TE 1

7 CIP, AMC, CT, SXT, TE 2

8 CIP, CT, CN, SXT, TE 10

Ghi chú: Ciprofloxacin (CIP), Amoxicillin-clavulanic acid (AMC), Colistin (CT), Gentamicin (CN),

Trimethoprim/ Sufamethoxazole (SXT), Tetracyclin (TE), Nitrofurantoin (F)

4.3.2 Xác định gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	5,44 MB

Tài liệu tham khảo	Loại	Chi tiết
12. Võ Thành Thìn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng (2010). Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con mắc bệnh tiêu chảy. Tạp chí KHKT thú y.XVII. (6). Tr. 5	Khác
13. Bùi Thị Tho (2010). Dược lý học thú y. Chuyên đề giảng dạy sau đại học, chuyên ngành Thú y. Học viện Nông nghiệp Việt Nam	Khác
14. Bùi Thị Tho, 1996. Nghiên cứu tác dụng của một số thuốc hóa học trị liệu và phytoncid với E. coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng. Luận án phó tiến sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội	Khác
15. Trí, N.M., 2000. Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh thường dùng trên 5 loại vi khuẩn gây nhiễm trùng cộng đồng tại bệnh viện Chợ Rẫy từ 1/2000 đến 5/2000.II. Tài liệu tiếng Anh	Khác
16. Abellanosa I and Nichter M (1996). Antibiotic prophylaxis amongcommercial sex workers in Cebu City, Philippines. Patterns of use and perceptions of efficacy.Sex Transm Dis. 23. pp. 407 – 412	Khác
17. Alonso, J.L., Soriano, A., Carbajo, O., Amoros, I., Garelick, H. (1999): Comparison and Recovery of Escherichia coli and Thermotolerant Coliforms in Water with a Chromogenic Medium Incubated at 41 and 44.5°C. Appl. Environ.Microbiol. 65. pp. 3746-3749	Khác
18. Dang, S.T.T., Bortolaia, V., Tran, N.T., Le, H.Q. and Dalsgaard, A., 2018. Cephalosporin-resistant Escherichia coli isolated from farm workers and pigs in northern Vietnam. Tropical medicine & international health : TM & IH 23, 415-424	Khác
20. Smith, J.L and Fratamico, P.M., (2006): Escherichia coli infections. In: Riemann, H.P., Cliver, D.O. (3 rd ): Food-borne infections and intoxications. Florida:Elsevier Inc. Academic Press. pp. 205-208	Khác
21. Nguyen, N.T., Nguyen, H.M., Nguyen, C.V., Nguyen, T.V., Nguyen, M.T., Thai, H.Q., Ho, M.H., Thwaites, G., Ngo, H.T., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2016a. Use of Colistin and Other Critical Antimicrobials on Pig and Chicken Farms in Southern Vietnam and Its Association with Resistance in Commensal Escherichia coli Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82. pp. 3727	Khác
22. Nguyen, V.T., Carrique-Mas, J.J., Ngo, T.H., Ho, H.M., Ha, T.T., Campbell, J.I., Nguyen, T.N., Hoang, N.N., Pham, V.M., Wagenaar, J.A., Hardon, A., Thai, Q.H., Schultsz, C., 2015. Prevalence and risk factors for carriage of antimicrobial-resistant	Khác
23. Usui, M., Ozawa, S., Onozato, H., Kuge, R., Obata, Y., Uemae, T., Ngoc, P.T., Heriyanto, A., Chalemchaikit, T., Makita, K., Muramatsu, Y., Tamura, Y., 2014.Antimicrobial susceptibility of indicator bacteria isolated from chickens in Southeast Asian countries (Vietnam, Indonesia and Thailand). J Vet Med Sci 76. pp. 685-692	Khác
24. Nhung, N.T., Cuong, N.V., Campbell, J., Hoa, N.T., Bryant, J.E., Truc, V.N., Kiet, B.T., Jombart, T., Trung, N.V., Hien, V.B., Thwaites, G., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2015. High levels of antimicrobial resistance among escherichia coli isolates from livestock farms and synanthropic rats and shrews in the Mekong Delta of Vietnam. Appl Environ Microbiol 81. pp. 812-820	Khác
25. Al-Kobaisi, M.F., 2007. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology 24th Edition. Sultan Qaboos University Medical Journal [SQUMJ] 7, 273-275	Khác
26. Chu, V.T., Tran, T.M.T., Vu, D.M., Pham, T.T., Khuc, T.S., Tran, T.H., Nguyen, T.L., Nguyen, T.K.C., Do, V.T., Nguyen, T.T.H., 2016. Study on residues of antibiotics and beta-agonistin fresh meat (pork, chicken meat) and pig urine at slaughterhouses in some Northern provinces, Viet Nam. Veterinary Sciences and Techniques 23. pp. 76-84	Khác
27. DEid, S., Nasef, S., Erfan, A., 2015. Multidrug resistant bacterial pathogens in eggs collected from backyard chickens. Assiut Vet. Med. J. Vol. 61 No 144. pp. 87-103	Khác
28. Hamid, S., 2016. Insight into Chicken Egg Proteins and Their Role in Chemical Defense Mechanism. International Journal of Poultry Science 15. pp. 76-80	Khác
29. Jonchère, V., Réhault-Godbert, S., Hennequet-Antier, C., Cabau, C., Sibut, V., Cogburn, L.A., Nys, Y., Gautron, J., 2010. Gene expression profiling to identify eggshell proteins involved in physical defense of the chicken egg. BMC Genomics 11. pp. 57	Khác
30. Maciuca, I.E., Cummins, M.L., Cozma, A.P., Rimbu, C.M., Guguianu, E., Panzaru, C., Licker, M., Szekely, E., Flonta, M., Djordjevic, S.P., Timofte, D., 2019. Genetic Features of mcr-1 Mediated Colistin Resistance in CMY-2-Producing Escherichia coli From Romanian Poultry. Frontiers in Microbiology 10	Khác
31. Nguyen, N.T., Nguyen, H.M., Nguyen, C.V., Nguyen, T.V., Nguyen, M.T., Thai, H.Q., Ho, M.H., Thwaites, G., Ngo, H.T., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2016. Use of Colistin and Other Critical Antimicrobials on Pig and Chicken Farms in Southern Vietnam and Its Association with Resistance in Commensal Escherichia coli Bacteria. Applied and Environmental Microbiology 82. pp. 3727	Khác
32. Nguyen, V.T., Carrique-Mas, J.J., Ngo, T.H., Ho, H.M., Ha, T.T., Campbell, J.I., Nguyen, T.N., Hoang, N.N., Pham, V.M., Wagenaar, J.A., Hardon, A., Thai, Q.H., Schultsz, C., 2015. Prevalence and risk factors for carriage of antimicrobial-resistant Escherichia coli on household and small-scale chicken farms in the Mekong Delta of Vietnam. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 70. pp. 2144-2152	Khác