Giám sát sự lưu hành các chủng virus cúm AH5N1, h5n6, h7n9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh nghệ an, thừa thiên huế và ứng dụng kỹ thuật realtime RT PCR trong chẩn đoán bệnh

Giới chuyên gia coi đây là một trường hợp đặc biệt và nguy cơ lây nhiễm từ người sang người rất thấp vì đến nay, trong số những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tử vong chưa có ai xu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐẶNG VĂN HẠNH

GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CÁC CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1, H5N6, H7N9 TẠI MỘT SỐ CHỢ BUÔN BÁN GIA CẦM SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN CÁC TỈNH NGHỆ AN, THỪA THIÊN HUẾ VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Hồng Ngân

NHÀ XUẤT BÁN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Đặng Văn Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc PGS TS Phạm Hồng Ngân đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Thú y cộng đồng, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ công chức, viên chức Cơ quan Thú y vùng III đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận văn

Đặng Văn Hạnh

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích Yếu Luận Văn ix

Thesis Abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Khái niệm về bệnh cúm gia cầm 3

2.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3

2.3.1 Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới 4

2.3.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 6

2.4 VIRUS học bệnh cúm gia cầm 11

2.4.1 cấu trúc của virus cúm gia cầm 11

2.4.2 Đặc điểm cấu trúc hệ gen cúm gia cầm 13

2.4.3 Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch 16

2.4.4 Độc lực của virus 18

2.4.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus 19

2.4.6 Sức đề kháng của virus 21

2.5 Truyền nhiễm học 21

2.5.1 Động vật cảm nhiễm 21

2.5.2 Con đường truyền lây 22

2.6 Triệu chứng và bệnh tích 22

2.6.1 Triệu chứng 22

2.6.2 Bệnh tích 23

2.7 Các phương pháp chẩn đoán 23

2.7.1 Chẩn đoán dịch tễ học 23

2.7.2 Chẩn đoán lâm sàng 23

2.7.3 Chẩn đoán virus học 23

2.7.4 Chẩn đoán huyết thanh học 24

2.8 Phòng bệnh 24

2.8.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh 24

2.8.2 Phòng bệnh bằng vắc xin 24

2.9 Hiểu biết về kỹ thuật REALTIME RT-PCR 25

2.9.1 Thế nào là phản ứng Realtime RT-PCR 25

2.9.2 Cơ chế hoạt động của Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang 26

Phần 3 Nội dung vàphương pháp nghiên cứu 28

3.1 Nội dung, địa điểm nghiên cứu 28

3.1.1 Nội dung 28

3.1.2 Địa điểm 28

3.2 Vật liệu nghiên cứu 28

3.2.1 Đối tượng 28

3.2.2 Các loại dụng cụ, hóa chất 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu 30

3.3.2 Phương pháp tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR 32

3.3.3 Phương pháp thu thập số liệu 34

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 35

4.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại tỉnh nghệ an và thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016 35

4.1.1 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Nghệ An từ năm 2012 - 2016 35

4.1.2 Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016 36

v

4.2 Kết quả tiêm phòng Vaccine cúm gia cầm tại nghệ an và thừa thiên huế

từ năm 2012 - 2016 38

4.3 Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh nghệ an và thừa thiên huế từ năm 2012 - 2016 41

4.3.1 Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016 41

4.3.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016 43

4.3.3 Đăc điểm dịch tễ cúm gia cầm tại tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016 44

4.4 Kết quả giám sát cúm gia cầm tại chợ vinh tỉnh nghệ an và chợ nọ thừa thiên huế năm 2016 48

4.4.1 Kết quả xét nghiệm tại 2 chợ được giám sát năm 2016 48

4.4.2 Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian giám sát tại chợ Vinh và chợ Nọ năm 2016 51

4.4.3 Tỷ lệ nhiễm chủng cúm A/H5N1 và H5N6 theo loại mẫu tại chợ Vinh Nghệ An và chợ Nọ Thừa Thiên Huế năm 2016 53

4.4.4 Diễn biến sự lưu hành các gen M, H5, N1, N6 trong các năm giám sát 54

4.5 Ứng dụng kỹ thuật realtime rt-pcr trong chẩn đoán bệnh 56

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Kiến nghị 59

Tài liệu tham khảo 60

Phụ lục 64

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

BNN và PTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

C t Chu kì ngưỡng (Cycle of threshold)

DNA Axit deoxiribonucleic

FAO Tổ chức Lương thựcvà Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

(Food and Agriculture Organization of the United Nations)

HI Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination – Inhibition) HPAI Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian

Influenza) LPAI Cúm gia cầm thể độc lực thấp (Low Pathogenic Avian Influenza)

RT - PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Cúm gia cầm H5N1 trên người trên thế giới 5

Bảng 3.1 Cặp mồi phát hiện virus Cúm gia cầm 30

Bảng 3.2 Công thức tổ hợp phản ứng Realtime RT-PCR 33

Bảng 4.1 Tổng đàn gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 - 2016 35

Bảng 4.2 Tổng đàn gia cầm tỉnh Thừa thiên Huế từ năm 2012 - 2016 37

Bảng 4.3 Kết quả tiêm phòng vaccine tại 2 tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ 2012 đến vụ xuân 2016 38

Bảng 4.4 Dịch cúm gia cầm tỉnh Nghệ An từ năm 2012 đến tháng 6/2016 41

Bảng 4.5 Dịch cúm gia cầm tại Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 6/2016 43

Bảng 4.6 Dịch cúm gia cầm theo tháng tại Nghệ An từ năm 2012 - 2016 44

Bảng 4.7 Dịch cúm gia cầm theo loài trên địa bàn tỉnh Nghệ An từ 2012 - 2016 47

Bảng 4.8 Kết quả giám sát tại chợ Vinh và chợ Nọ năm 2016 49

Bảng 4.9 Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm theo thời gian tại 2 chợ giám sát năm 2016 52

Bảng 4.10 Tỷ lệ nhiễm H5N1 và H5N6 theo loại mẫu tại 2 chợ được giám sát 53

Bảng 4.11 Tỷ lệ dương tính các gen M, H5, N1, N6 trong các năm giám sát 55

Bảng 4.12 Số lượng mẫu được xét nghiệm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại Trạm chẩn đoán xét nghiệm - Cơ quan Thú y vùng III 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Khu vực có trường hợp nhiễm cúm gia cầm 5

Hình 2.2 Cúm gia cầm năm 2015 tại Việt Nam 11

Hình 2.3 Hình thái và cấu trúc virus cúm gia cầm 12

Hình 2.4 Các hệ gen virus cúm 13

Hình 2.5 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên virus cúm A ở tế bào chủ 20

Hình 2.6 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A 21

Hình 2.7 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe 26

Hình 4.1 Tỷ lệ tiêm phòng vaccine tại Nghệ An và Thừa Thiên Huế 39

Hình 4.2 Diễn biến cúm gia cầm tại Nghệ An từ năm 2012 - 6/2016 42

Hình 4.3 Diễn biến cúm gia cầm theo thời gian tại Nghệ An 45

Hình 4.4 Sự phân bố các ổ dịch trên địa bàn tỉnh Nghệ Antừ năm 2012 - 2016 46

Hình 4.5 Biến động tỷ lệ loài mắc bệnh 48

Hình 4.6 Tỷ lệ nhiễm cúm tại 2 chợ qua đợt giám sát 51

Hình4.7 Tỷ lệ nhiễm H5N1 và H5N6 tại 2 chợ theo thời gian 52

Hình 4.8 Tỷ lệ lưu hành chủng virus H5N1 và H5N6 theo loại mẫu 54

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Đặng Văn Hạnh

Tên Luận văn: Giám sát sự lưu hành các chủng virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế

và ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR trong chẩn đoán bệnh

2 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đối tượng: Virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 trên đàn gia cầm sống tại chợ Vinh,

tỉnh Nghệ An và chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế

Địa điểm: Tại 2 chợ buôn bán gia cầm gồm Chợ Vinh, phường Hồng Sơn, thành

phố Vinh,tỉnh Nghệ An và chợ Nọ, xã Phú Dương, huyện Phú Vang,tỉnh Thừa Thiên Huế Mẫu xét nghiệm tại Cơ quan Thú y vùng III

Thời gian: Bắt đầu từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 11 năm 2016

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu swab hầu họng gà sống, vịt sống, môi trường được lấy từ 2 chợ trên

- Các loại hóa chất và dụng cụ được sử dụng tại phòng thí nghiệm

2.3 Nội dung nghiên cứu

-Tình hình chăn nuôi gia cầm tại Nghệ An, Thừa Thiên Huế từ năm 2012 - 2016

- Kết quả tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại 2 tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế

từ năm 2012 - 2016

-Diễn biến cúm gia cầm tại 2 tỉnh Nghệ An và Thừa Thiên Huế từ 2012 - 2016 -Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N1, H5N6 và H7N9 tại chợ Vinh, tỉnh Nghệ An và chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế

- Ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR trong chẩn đoán bệnh

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

- Phương pháp lấy mẫu: Mẫu được lấy thành 4 đợt tương ứng với các tháng 1, 2,

6, 7 năm 2016 Mỗi đợt lấy 3 loại mẫu chính gồm swab hầu họng gà sống (6 mẫu gộp), swab hầu họng vịt sống (6 mẫu gộp) và mẫu môi trường (6 mẫu gộp)

- Phương pháp tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR

- Phương pháp thu thập số liệu: Thu thập theo phương pháp điều tra hồi cứu

- Phương pháp xử lý số liệu:sử dụng phần mềm ứng dụng Excel 2010

3 Kết luận

- Tổng đàn gia cầm được nuôi trên địa bàn 2 tỉnh được duy trì đều hàng năm, đạt khoảng 18 triệu con ở thời điểm hiện tại đối với tỉnh Nghệ An và 2 triệu con cho tỉnh Thừa thiên Huế

- Tỷ lệ tiêm phòngvaccine tại 2 tỉnh chưa đạt yêu cầu trên 80% theo quy định, tỉnh Nghệ An chỉ đạt từ 7,38% đến 15,39%, tại tỉnh Thừa Thiên Huế từ 13,79% đến 61,11% giai đoạn 2012-2016

- Dịch cúm gia cầm năm 2012 xảy ra ở mức độ “bùng phát mạnh, lây lan rộng” tại Nghệ An, còn lại dịch chỉ xảy ra mang tính chất “địa phương, nhỏ lẻ và rải rác” trên địa bàn 2 tỉnh trong 5 năm điều tra

- Tỷ lệ lưu hành virus cúm A tại chợ Vinh, tỉnh Nghệ An là 23,61%, H5N1 là 6,94%, H5N6 là 2,78% Tỷ lệ lưu hành virus cúm A tại chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế là 20,83%, H5N1 là 1,39% Chưa có sự lưu hành H7N9 tại 2 chợ ở thời điểm giám sát Có

sự lưu hành H5N1 vào các tháng 1, 2 và 7 với cùng tỷ 5,55%, H5N6 vào các tháng 1 và

2 cùng tỷ lệ 2,78% Trên các loại mẫu swab hầu họng gà sống, vịt sống và môi trường

có sự lưu hành H5N1, ở loại mẫu swab hầu họng gà sống, vịt sống có sự lưu hành H5N6 với tỷ lệ 2,08%

- Kỹ thuật Realtime RT-PCR đã được ứng dụng để chẩn đoán nhiều bệnh động vật

trên cạn và thủy sản tại Cơ quan Thú y vùng III

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Dang Van Hanh

Thesis title: Surveillance of influenza virus strain A/H5N1, H5N6 and H7N9

circulation in live bird market in Nghe an and Thua Thien Hue province, and application of Realtime RT-PCR to diagnose the diseases

Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

1 Research Objectives

- Determine the prevalence of influenza virus strain A/H5N1, H5N6 and H7N9 at Vinh market, Nghe An province and No market in Thua Thien Hue province That can help the authorities to overview the changes in this prevalence, and suggest early warnings, policies and solutions in prevention of the diseases

- Enhance local veterinarians΄capacity in sampling, storing and transportation of the samples

2 Materials and Methods

2.1 Object, location and study time

- Object: The object of the study are Influenza A virus strain H5N1, H5N6,

H7N9 in live poultry at the market Vinh, Nghe An province and No market in Thua Thien Hue province

- Location: Surveillance were conducted at two live bird markets including Vinh

Market, Hong Son ward, Vinh City, Nghe An province, and No market in Phu Duong ward, Phu Vang district, Thua Thien Hue province The samples are diagnosed in the laboratory of Regional Animal Health Office No III

- Study period: From October 2015 to November 2016

- Status of avian influenza A outbreaks in two theses provinces from 2012 to 2016

- Prevalence of influenza A/H5N1, H5N6 and H7N9 curculating at Vinh and

- Samples are diagnosed using Realtime RT-PCR

- Data wascollected usingRestospective method

- Data was analysed usingMicrosoft Excel2010

3 Conclusions

- Total poultry population of two provinces does not significantly changed in the last 5 years, with the approximate number of 18 million for Nghe An and around 2 million for Thua Thien Hue

- The proportion of influenza A vaccination of poultry is relatively low, which ranged from 7.38% to 15.39% for Nghe An and 13.79% to 61.11% for Thua Thien Hue

- Avian influenza outbreaks only occurred as epidemic level in 2012 in Nghe An This disease was endemic with several small-scale outbreaks in these two provinces in the rest of study time

- The prevalence of influenza A was 23,61% at Vinh market Of these, the prevalence of H5N1 and H5N6 were 6,94% and 2,78 respectively Whereas, the prevalence of influenza A and H5N1 at No market were 20,83% and 1,39% respectively H7N9 was not detected in the surveillance Moreover, the prevalence of H5N1 was the same in January, February and July (5.55%) In case of H5N6, the prevalence in January and February was the same (2.78%) Analysis the data based on sample types, H5N1 was only tested to be positive in swab of live ducks and chicken, environtment samples While H5N6 was only detected in swab samples of live ducks and chickens with the same proportion of 2.08%

-Realtime RT-PCR technique has been used to diagnose most diseases of terrestrial and aquatic animals at the laboratory of Regional Animal Health Office No III

1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT

Trong nhiều năm qua thế giới đã chứng kiến những ổ dịch cúm gia cầm xảy

ra trên nhiều khu vực với sự khác nhau về điều kiện khí hậu, địa hình, trên các loài gia cầm khác nhau Tùy thuộc vào từng ổ dịch, địa bàn khu vực, từng thời điểm trong năm, từng loài đối tượng gia cầm mà quy mô tính chất từng ổ dịch khác nhau Tuy nhiên, hầu hết các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra nhanh, gây chết hàng loạt, gây thiệt hại lớn đến ngành chăn nuôi gia cầm

Cúm gia cầm có tên khoa học là Avian Influenza, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi virus cúm typ A thuộc họ Orthomyxoviridea Virus cúm typA được chia thành các subtyp khác nhau tùy thuộc vào kháng nguyên bề mặt của chúng là Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) Cho đến nay, người ta xác định được 16 kháng nguyên HA (H1 đến H16) và 9 kháng nguyên N (N1 đến N9).Virus cúm gia cầm thể độc lực cao chủ yếu là các phân typ H5, H7, H9 gây cho gà, vịt, ngan, ngỗng, chim và có thể lây sang người Gia cầm mắc bệnh, đặc biệt là gà, vịt có sự lây lan rất nhanh, tỷ lệ chết rất cao có khi là 100% Bệnh được tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp vào danh mục bảng A các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật Ở Việt Nam dịch cúm gia cầm H5N1lần đầu tiên xuất hiện vào cuối năm 2003, chỉ trong vòng 2 tháng bệnh đã xảy ra trên 57 tỉnh/ thành, tổng số gia cầm chết và tiêu hủy 56,88 triệu con, chiếm 16,71% tổng đàn gia cầm trên cả nước Bệnh không chỉ gây ra trên gia cầm, nguy hiểm hơn là lây lan sang người Riêng ở Việt Nam, từ năm 2003 đến 2013 có 124 ca bệnh nhân mắc bệnh, trong đó 62 người tử vong, chiếm tỷ lệ 50% Bên cạnh sự hộ trợ hàng trăm triệu đô la và kỹ thuật của các chính phủ, tổ chức trên thế giới, chính phủ Việt Nam đã chi hàng trăm tỷ đồng cho công tác phòng, chống dịch bệnh Năm

2014, tại Việt Nam virus cúm A/H5N6 lần đầu tiên được phát hiện tại tỉnh Lạng Sơn, Hà Tĩnh và cho đến nay virus cúm A/H5N6 đang được tiếp tục phát hiện tại nhiều tỉnh trên cả nước nhưQuảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Quảng Trị, Quảng Ngãi Trong khi đó, virus cúm A/H7N9 đã xuất hiện tại nước láng giềng Trung Quốc chúng ta và một số nước khác như Hồng Kông, Malaysia, Đài Loan, Canada làm 683 người bị nhiễm bệnh Tại Việt Nam tuy chưa xuất hiện chủng virus H7N9 nhưng nguy cơ bị xâm nhiễm là rất cao do nước ta có chung đường biên giới với Trung Quốc, việc giao thương đi lại, làm ăn buôn bán giữa hai nước

là rất lớn Cùng với đó, tại Việt Nam các cơ sở chăn nuôi gia cầm thường nhỏ lẻ,

không áp dụng hoặc áp dụng không đầy đủ các biện pháp an toàn sinh học Chăn nuôi gia cầm phần lớn theo hình thức thả rông trên đồng hoặc vườn, tự phát dẫn đến làm nguy cơ bùng phát dịch địa phương là rất cao Bên cạnh việc chăn nuôi, hình thức buôn bán gia cầm tại các chợ ở các địa phương hầu như không được kiểm soát về nguồn gốc xuất xứ gia cầm.Gia cầm sống được xác định là nguồn bệnh lưu trữ, người kinh doanh gia cầm cũng như người nội trợ không thể phát hiện được gia cầm mang trùng, do đó sự lây lanvirus cúm gia cầm tại các chợ kinh doanh gia cầm sống là rất cao Do vậy, cần xác định vùng lưu hành, tỷ lệ nhiễm và sự hiện diện của các chủng virus cúm gia cầm có độc lực cao (H5N1, H5N6, H7N9) để từ đó chủ động đề xuất các biện pháp phòng bệnh có hiệu quả

Nhằm giải quyết vấn đề trên đây, chúng tôi thực hiện đề tài: Giám sát sự lưu

hành các chủng virus cúm A/H5N1, H5N6, H7N9 tại một số chợ buôn bán gia cầm sống trên địa bàn các tỉnh Nghệ An, Thừa Thiên Huế và ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR trong chẩn đoán bệnh

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

-Phát hiện sự lưu hành virus cúm H5N1, H5N6 và H7N9 tại chợ Vinh, tỉnh NghệAn và chợ Nọ, tỉnh Thừa Thiên Huế, để từ đó giúp các ban, ngành của địa phương có cái nhìn tổng quan về sự thay đổi tỷ lệ lưu hành các chủng nhằm cảnh báo sớm dịch cúm gia cầm và đề xuất các biện pháp phòng chống dịch cho phù hợp

- Nâng cao năng lực cho thú y cơ sở các kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Qua kết quả giám sát, đánh giá, kết hợp với tình hình dịch tễ góp phần cung cấp các dữ liệu khoa học cho các nhà chuyên môn, các ngành quản lý về tình hình dịch bệnh cúm gia cầm chủng độc lực cao nhằm cảnh báo nguy cơ đại dịch

có thể xảy ra trong tương lai, đưa ra các biện pháp phòng, chống dịch bệnh có hiệu quả

C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein

(GP) (Murphy, Webster, 1996; Ito et al., 1998)

2.2 LỊCH SỬ BỆNH CÚM GIA CẦM

Lần đầu tiên dịch Cúm được mô tả vào năm 412 trước công nguyên bởi nhà khoa học có tên là Hyppocrates Tuy nhiên, mãi đến năm 1580 mới bắt đầu bùng phát thành dịch Đây được coi là trận dịch cúm đầu tiên mà con người biết tới Dịch bắt nguồn từ châu Á lan sang châu Phi và tấn công vào châu Âu Dịch cúm

đã lây lan mạnh tới mức dẫn đến sự ra đời của từ chỉ dịch cúm “influenza”, bắt nguồn từ cụm từ tiếng Italy “influenza del freddo”, có nghĩa là “ảnh hưởng của cảm lạnh”và làm chết 8.000 người tại thành Rome, Italy Đến năm 1901, Centanni và Savonuzzi đã xác định được căn nguyên gây bệnh là virus siêu nhỏ hơn cả vi khuẩn (vì nó có thể chui qua cả màng lọc vi khuẩn), nhưng mãi tới năm

1955, Schater đã xác định được virus gây bệnh thuộc nhóm virus Cúm typ A với kháng nguyên bề mặt là H và N Tác giả đã nghiên cứu từ hai chủng virus Cúm H7N1 và H7N7 phân lập được từ gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận Đông (Lê Văn Năm, 2014 Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959 Có

thể gọi cúm A/H5N1 phân lập năm 1959 tại Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck-Scotland-(59)(H5N1) (số đăng ký: X07869).Năm 1963, viruscúm typ A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập virus vào đàn gà Cuối thập kỷ 60, phân typ H1N1 thấy ở lợn và có liên quan tới sự tái tổ hợp gen của virusCúm gia cầm

2.3 TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.3.1 Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới

2.3.1.1 Dịch cúm A/H5N1

Sự di trú của các loài chim, dã cầm mang mầm bệnh đã phân tán đi khắp các vùng trên các châu lục, làm cho dịch cúm gia cầm xảy ra trên phạm vi khắp toàn cầu

Vào năm 1971 bệnh được mô tả kỹ qua đợt dịch cúm khá lớn trên gà tây ở

Mỹ Các năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Nam Phi Năm

1977 đã phát hiện dịch trên gà tây do chủng H7N7 gây ra tại Minesota Đặc biệt năm 1983 - 1984 ở Mỹ, dịch cúm gia cầm do chủng H5N2 ở bang Pennsylvania, Virginia, New Jersey làm chết và tiêu hủy hơn 19 triệu con gà Cũng trong thời gian này tại Ireland người ta phải tiêu hủy 270.000 con vịt, tuy không có triệu chứng lâm sàng nhưng đã phân lập được virus H5N8 và bệnh được loại trừ một cách nhanh chóng (Phạm Sỹ Lăng, 2004)

Dịch cúm gia cầm xảy ra giữa năm 2003 tại Đông Nam Á là dịch cúm gia cầm lớn nhất và nghiêm trọng nhất Tác nhân gây bệnh là virus cúm A/H5N1, tiêu hủy khoảng 150 triệu con chim và gia cầm Hiện nay, virus H5N1 được xem

là tác nhân gây dịch tại Indonesia, Việt Nam, Cămpuchia, Trung Quốc, Thái Lan, Lào và một số nước khác

Dịch cúm gia cầm ngày càng lan rộng Tại Thái Lan, đợt dịch thứ nhất kéo dài từ ngày 23/01/2004 đến giữa tháng 03/2004, tiêu hủy 30 triệu con và đợt dịch thứ hai xuất hiện từ ngày 03/07/2004 đến 14/02/2005.Tháng 02/2004 một số nước đã tuyên bố khống chế được dịch,nhưng một số nước dịch lại tái phát dịch lần 2 như Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam Có thể nói đây là lần đầu tiên trong lịch sử bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh trên diện rộng với diễn biến khá phức tạp.Dựa vào số liệu Bảng2.1 các nước có tỷ lệ tử vong/nhiễmcao là: Indonesia với tỷ lệ 167 tử vong/199 mắc (chiếm 83.91%), Ai Cập với tỷ lệ 116 tử vong/346 mắc (chiếm 33,52%), Việt Nam với tỷ lệ 64 tử vong/127 mắc (chiếm 50,39%)

5

Bảng 2.1.Cúm gia cầm H5N1 trên người trên thế giới

Quốc gia Mắc Chết 2003-2009 Mắc Chết 2010 Mắc Chết 2011 Mắc Chết 2012 Mắc Chết 2013 Mắc Chết 2014 Mắc Chết 2015 Mắc Chết Tổng

Azebaijan 8 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5

Bangladesh 1 0 0 0 2 0 30 1 1 0 0 0 0 7 1

Cambodia 9 7 1 1 8 8 3 3 26 14 9 4 0 0 56 37

Canada 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1

China 38 25 2 1 1 1 2 1 2 2 2 0 5 1 53 31

Djibouti 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Egypt 90 27 29 13 30 15 11 5 4 3 37 14 136 39 346 116 Indonesia 162 134 9 7 12 10 9 9 3 3 2 2 2 2 199 167 Iraq 3 2 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 3 2

Lao People’s Democratic Republic 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2

Myanma 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Nigeria 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1

Pakistan 3 1 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 3 1

Thailand 25 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 17

Turkey 12 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 4 Việt Nam 112 57 7 2 0 0 4 2 2 1 2 2 0 0 127 64 Tổng 468 282 48 24 62 34 32 20 39 25 52 22 143 42 845 449

Nguồn: WHO/GIP (2016)

Nguồn: WHO/GIP (2016)

Hình 2.1 Khu vực có trường hợp nhiễm cúm gia cầm

2.3.1.2 Dịch cúm A/H5N6

Bộ Y tế cho biết ca nhiễm cúm A/H5N6 làm một bệnh nhân 49 tuổi ở tỉnh

Tứ Xuyên - Trung Quốc tử vong được phát hiện vào tháng 4-2014 Đây cũng là bệnh nhân đầu tiên trên thế giới nhiễm cúm A/H5N6.Ngày 3/5/2014, phòng thí nghiệm tham khảo Cúm gia cầm quốc gia Trung Quốc đã xác định đây là chủng virus H5N6, 1.338 con gia cầm đã bị tiêu hủy và gà ở các khu vực gần đó đang được giám sát, song lực lượng chức năng chưa phát hiện điều gì bất thường Giới chuyên gia coi đây là một trường hợp đặc biệt và nguy cơ lây nhiễm từ người sang người rất thấp vì đến nay, trong số những người tiếp xúc gần gũi với bệnh nhân tử vong chưa có ai xuất hiện triệu chứng bệnh.Mặc dù toàn bộ gà ở Trung Quốc Đại Lục sẽ được tiêm phòng vắc xin H5N1, nhưng gen H5 trong chủng virus H5N6 này có thế rất khác so với gen H5 của loại vaccine phòng virus H5N1.Vì vậy vẫn có thể bùng phát dịch.Trong năm 2015 dịch cúm A/H5N6 đã xảy ra tại Trung Quốc, Hồng Kông (Trung Quốc), Lào

2.3.1.3 Dịch cúm A/H7N9

Tháng 3/2013 Trung Quốc thông báo ca nhiễm đầu tiên cúm A/H7N9 là một cụ già 87 tuổi, người đã chết vào ngày 4 tháng 3, tiếp đến là tỉnh Hà Nam được ghi nhận sự hiện diện với 2 bệnh nhân Tính đến ngày 14/4/2013 con số người nhiễm A/H7N9 tăng lên 14 ca, trong đó tử vong 5 ca và đến ngày 30/6/2013 Trung Quốc có hơn 133 trường hợp nhiễm cúm 43 trường hợp tử vong.Trong năm 2015 Trung Quốc có thêm 225 ca mắc bệnh cúm A/H7N9 trên người, trong đó có 94 ca tử vong Từ tháng 3/2013 đến nay, bệnh cúm A/H7N9 trên người đã liên tục xảy ra tại Trung Quốc, đã ghi nhận 683 ca bệnh (271 ca tử vong) tại 17 tỉnh, thành phố, Đặc khu hành chính Hồng Kông, Macao, Khu tự trị Ninh Hạ vàTân Cương, vùng lãnh thổ Đài Loan và một trường hợp khách du lịch Trung Quốc đến Malaysia Cho đến nay, virus cúm H7N9 mới chỉ được phát hiện trên người và gia cầm ở Trung Quốc

2.3.2 Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam

2.3.2.1 Dịch cúm A/H5N1

Đến nay dịch cúm A/H5N1 vẫn xảy ra hàng năm ở nước ta gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế Có thể chia ra các đợt dịch cúm gia cầm từ năm 2003 đến nay như sau:

Đợt dịch thứ 1 từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004:Đây là lần đầu tiên bệnh xuất hiện tại Việt Nam, bệnh lây lan một cách nhanh chóng với nhiều ổ dịch xuất

7

hiện trong cùng thời điểm tại nhiều địa điểm từ các tỉnh miền Bắc đến miền Trung, Tây Nguyên và các tỉnh phía Nam Chính vì thế, chỉ trong 2 tháng, đến 27/02/2004 dịch đã làm cho gia cầm của 2.574 xã/phường thuộc 381 huyện/thị trấn của 51 tỉnh/thành phố của Việt Nam bị mắc bệnh Tổng số gia cầm bị chết

do bệnh và bị tiêu hủy hơn 43,9 triệu con và thủy cầm là 13,5 triệu con Ngoài ra còn có 14,76 triệu con chim cút và các loại chim khác bị chết và tiêu hủy (Nguyễn Tuấn Anh, 2006).Đến đầu tháng 2/2004 trung bình 1 ngày có khoảng 13 - 230 xã thuộc 15 - 20 huyện phát sinh ổ dịch mới trong cả nước Số gia cầm phải tiêu hủy lên tới 2 - 3 triệu con/ngày, ngày cao điểm lên tới 4 triệu con Sau ngày 29/2/2004 không có thông báo về các ổ dịch mới, không còn gia cầm bị tiêu hủy Đến ngày 30/3/2004, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (BNN và PTNT) đã công bố hết dịch cúm gia cầm trên toàn quốc Như vậy, trong đợt dịch đầu tiên này có 57/61 tỉnh/thành phố trong cả nước có dịch (trừ 4 tỉnh Tuyên Quang, Phú Yên, Khánh Hòa và Bình Thuận Theo thống kê của Trần Hữu Cổn (2004) và Nguyễn Tiến Dũng (2005) cho đến đợt dịch cuối, đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long là những khu vực tỷ lệ số xã có gia cầm bị mắc bệnh cao nhất

Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: Dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này là 84.078 con Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt và 19.950 con chim cút

Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong Đợt dịch thứ 3 từ tháng 12/2004 đến tháng5/2005: Dịch xảy ra ở 670 xã của

182 huyện thuộc 36 tỉnh/thành phố trong cả nước Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1.846 triệu con (gồm 470.495 gà, 825.689vịt, ngan và 551.029 chim cút, có 61 ca mắc cúm H5N1 ở người, đã có 19 ca tử vong

Đợt dịch thứ 4 từ tháng 10/2005 đến tháng 01/2006: Dịch xảy ra trên 3 miền Bắc, Trung, Nam với 24 tỉnh/thành mắc bệnh với tổng số gia cầm tiêu hủy

là 3.972.081 con (1.338.523 con gà, 2.135.081 thủy cầm và loài khác)

Đợt 5 từ tháng 12/2006 đến hết năm 2007: Từ tháng 12/2006 đến tháng 3/2007 dịch cúm gia cầm tái phát tại Cà Mau, Bạc Liêu, sau đó dịch xuất hiện ở 6 tỉnh khác của vùng đồng bằng sông Cửu Long là Hậu Giang, Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, Kiên Giang, Sóc Trăng và 3 tỉnh Hà Nội, Hà Tây và Hải Dương thuộc đồng bằng sông Hồng Dịch bệnh đã xảy ra tại 83 phường/xã thuộc 33 quận/huyện của 11 tỉnh/thành phố, tổng số gia cầm bị bệnh là 99.040 con trong

đó có 11.950 gà, 87.090 vịt và ngan.Từ tháng 5/2007 đến 8/2007dịch xảy ra ở

167 xã/phường của 10 huyện thuộc 23 tỉnh/thành Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 294.894 con (21.525 con gà, 264.549 con vịt, 8.775 con ngan), sau đó đến tháng 10/2007 dịch lại tái phát ở 15 xã/phường của 9 quận/huyện thuộc 6 tỉnh/thành phố

Dịch cúm gia cầm năm 2008: Dịch xảy ra rải rác tại 57 xã/phường của 40 huyện/thị thuộc 21 tỉnh Tổng số gia cầm tiêu hủy là 60.090 con, trong đó có 23.948 con gà, 36.592 con thủy cầm (Cục Thú y, 2012) Có 6 ca mắc bệnh ở người và 5 ca đã tử vong

Dịch cúm gia cầm năm 2009: Từ đầu năm 2009 đến ngày 22/12/2009 có

129 ổ dịch tại 71 xã/phường của 35 huyện/quận thuộc 18 tỉnh/thành phố Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 112.847 con, trong đó gà 24.686 con (chiếm 21,87%), vịt 85.038 con (chiếm 75,35%) và ngan 3.123 con (chiếm 2,76%) (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

Dịch cúm gia cầm năm 2010: Trong năm 2010, cả nước đã có 62 xã/phường của 36 huyện/quận thuộc 23 tỉnh/thành phố phát dịch cúm gia cầm Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 75.769 con, trong đó có 21.938

gà (chiếm 28,95%), 52.809 vịt (chiếm 69,70%), 1.022 ngan (chiếm 1,34%) Dịch xảy ra mạnh nhất là tỉnh Hà Tĩnh, có số gia cầm tiêu hủy cao nhất 14.199 con chiếm 16,24% Tại Cà Mau, dịch xảy ra trên 12 xã/phường của 5 huyện/thị trấn với số gia cầm phải tiêu hủy là 7.499 con chiếm 8,58% (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

Dịch cúm gia cầm năm 2011: Trong năm 2011, diễn biến dịch bệnh cúm gia cầm ngày càng phức tạp, tăng cả về số xã/phường lẫn số gia cầm tiêu hủy và số gia cầm mắc bệnh Có 22 tỉnh/thành phố có dịch Số xã/phường là 82 của 43 huyện/quận Tổng số gia cầm mắc bệnh lên đến 11.0311 con, trong đó có 39.126

gà, 70.020 vịt và 1.165 ngan Tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 151.356 con, trong đó có 60.787 gà, 89.204 vịt và 1.365 ngan (Nguyễn Ngọc Tiến, 2013) Dịch cúm gia cầm năm 2012: Dịch bệnh cúm gia cầm diễn biến phức tạp hơn với những biến đổi nhiều về cấu trúc gen và độc lực Năm 2012 tăng mạnh

về số tỉnh/thành phố có dịch xảy ra, với 32 tỉnh/thành phố Tổng số 296 xã/phường của 112 huyện/thị trấn có dịch Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 616.109 con trong đó có 117.946 gà (chiếm 19,14%), 479.859 vịt (chiếm 77,89%) và 18.304 ngan (chiếm 2,97%)(Nguyễn Ngọc Tiến, 2013)

tử vong được xác định do nhiễm virus cúm này là một cháu bé 4 tuổi.Tháng 4/2013, cơ quan thú y vùng 6 đã phối hợp với Chi cục Thú y Ninh Thuận lấy mẫu chim yến chết để xét nghiệm,kết quả cho thấy trong một số mẫu chim chết tại Ninh Thuận có dương tính với virus H5N1

Dịch cúm gia cầm năm 2014: Tại Việt Nam, năm 2014 có 02 trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 tại Bình Phước và Đồng Tháp, cả hai trường hợp đều tử vong, cả hai trường hợp này đều có tiền sử tiếp xúc với gia cầm mắc bệnh Dịch cúm gia cầm năm 2015:Các ổ dịch cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện tại

19 xã/phường của 18 huyện/thị xã thuộc 12 tỉnh/thành phố Số gia cầm mắc bệnh

là 56.138 con (gà 51.166 con, chiếm 91,14% tổng số mắc bệnh, vịt 4.922 con, chiếm 8,77% và ngan 50 con, chiếm <1%); trong đó số tiêu hủy là hơn 58.128 con (gà chiếm 90.66% trong tổng số chết vịt chiếm 9.25% và ngan chiếm

<1%).So với năm 2014, diện dịch và mức độ dịch gây ra do cúm A/H5N1 giảm nhiều (số xã có dịch giảm hơn 8 lần, số huyện có dịch giảm hơn 5 lần, số tỉnh giảm gần 3 lần và số gia cầm chết và buộc phải tiêu hủy giảm gần 4 lần)

Dịch cúm gia cầm năm2016:Dịch cúm A/H5N1 đã xảy ra tại xã Quỳnh Hoa, huyện Quỳnh Lưu, tỉnh Nghệ An ngày 01/4/2016 làm 200 con vịt mắc bệnh

2.3.2.2 Dịch cúm H5N6

Tính đến năm 2014, Việt Nam hiện chưa ghi nhận ca nhiễm cúm A/H5N6 trên người Tuy nhiên, theo thông báo của Cục Thú y - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, kết quả giám sát chủ động mới nhất đã phát hiện một số trường hợp dương tính với cúm A/H5N6 trên đàn gà nuôi tại huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn và trên đàn vịt nuôi tại huyện Kỳ Anh, tỉnh Hà Tĩnh Đây là lần đầu tiên virus cúm A/H5N6 được ghi nhận tại Việt Nam.Theo Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), đây là chủng virus có độc lực cao, dù chưa có bằng chứng lây truyền

từ người sang người nhưng việc phát hiện nó trên gia cầm cũng làm tăng nguy cơ lây lan virus cúm gia cầm cho người

Năm 2014 đã ghi nhận các ổ dịch cúm A/H5N6 trên gia cầm tại một số tỉnh Lạng Sơn, Lào Cai, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Quảng Ngãi, Phú Thọ, Bắc Giang, Quảng Nam Kết quả xét nghiệm bằng giải trình tự gen của các mẫu virus cúm A/H5N6 phát hiện ở Việt Nam thấy có sự tương đồng đến 99% với chủng virus

cúm A/H5N6 gây bệnh trên người tại Trung Quốc

Trong năm 2015,các ổ dịch cúm gia cầm H5N6 đã xuất hiện tại 27 xã/phường của 21 huyện/thị xã thuộc 14 tỉnh/thành(Đắk Nông, Hà Nam, Lai Châu, Lào Cai, Nam Định, Nghệ An, Quảng Ngãi, Quảng Ninh, Sơn La, Kon Tum, Lạng Sơn, Quảng Nam, Thái Bình và Tuyên Quang) Số gia cầm mắc bệnh là 36.242 con (gà 13.159 con, chiếm 36,31% tổng số mắc bệnh, vịt 8.019 con, chiếm 22,13%, ngan 1.001 con, chiếm 2,76% và chim cút 14.063 con chiếm 38,80%, trong đó số tiêu hủy là 39.744 con (gà chiếm 44,20% trong tổng số chết, vịt chiếm 17,93%, ngan chiếm 2,49% và chim cút chiếm 35,38%) (Phòng Dịch tễ

- Cục Thú y, 2015)

Đến tháng 5/2016 dịch cúm A/H5N6 xảy ra trên 5 tỉnh bao gồm Tuyên Quang, Lạng Sơn, Nghệ An, Kon Tum, Quảng Ngãi làm cho 7.210 con gia cầm

bị mắc bệnh và chết (6.136 con gà, 1.024 con vịt, 50 con ngan), tổng số gia cầm

bị tiêu hủy là 9.850 con (Phòng Dịch tễ - Cục Thú y, 2016)

Nguồn: Phòng dịch tễ - Cục Thú y (2015)

Hình 2.2 Cúm gia cầm năm 2015 tại Việt Nam 2.4 VIRUS HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM

2.4.1 cấu trúc của virus cúm gia cầm

Hình thái và cấu trúc virus cúm gia cầm đã được Kawaoka and Murphy (1988) mô tả qua kính hiển vi, virus cúm A có hình cầu hoặc hình khối kéo dài, đường kính 80-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi kéo dài đến vài µm Phân

tử lượng của hạt virus có khối lượng khoảng từ 250 triệu Dalton Virus có cấu

tạo đơngiản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn

âm - negative single strand

Nguồn: Davison, 2005 -Đại học Floria Hoa Kỳ

Hình 2.3.Hình thái và cấu trúc virus cúm gia cầm

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ lớp màng tương bào của tế bào vật chủ bị nhiễm và trở thành 1 phần của hạt virus trong quá trình hình thành Trên bề mặt có các gai protein (gai mấu) nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus có bản chất cấu tạo là các glycoprotein gồm: HA có hoạt tính ngưng

kết tố hồng cầu, NA và MA (Matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender et al., 1999; Zhao et al., 2008).Bên cạnh đó, trong thành phần áo ngoài còn có một số ít

lỗ hổng (pore) cấu tạo từ protein M2 Vật chất di truyền (còn gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus, trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2; phân đoạn NS mã hóa cho 2 protein

là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1-F2 (Ito et al., 1998; Conenello et al., 2007)

2.4.2 Đặc điểm cấu trúc hệ gen cúm gia cầm

Hệ genvirus cúm Alà RNA sợi đơn âm (-)ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen

riêng biệt mang tên từ 1 -8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) - bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzyme polymerase (PA, PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus Các phân đoạn của hệ genvirus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10.000 - 15.000 bp (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa đựng khoảng 13,5 kilobase thông tin di truyền và có cấu trúc

xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus Hai đầu 5’- và 3’- sợi RNA hệ genvirus có

gắn thêm chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao giữa các phân typ là: AGUAGAACAAGG… và 3’- UCG(U/C)UUUCGUCC

5’-Nguồn: WHO (2009)

Hình 2.4 Các hệ gen virus cúm

Các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1

Các phân đoạn 1,2 và 3 là những phân đoạn mã hóa tổng hợp các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và

có tính bảo tồn cao, bao gồm:

- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84.103 Da (Murphy and Webster, 1996)

- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2.431 bp, mã hóa tổng hợp enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA (Murphy and Webster, 1996)

- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2.233bp, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83.000 Da, là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài

sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiễm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus (Luong and Palese, 1992)

Các phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein (HA và NA) bề mặt capsid của virus, có tính kháng nguyên đặc trưng theo từng chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm

A Đây là gen chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm, gồm hai tiểu phần HA1 và HA2 Vùng nối giữ HA1 và HA2 gồm một số amino acid mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide,

đó là điểm cắt của enzyme protease, và đây là vùng quyết định độc lực của virus

(Bosch et al., 1981; Gambotto et al., 2008)

- Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 50.000 Da Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác

nhau Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện tượng trượt xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide, làm cho độ dài vốn có trước đây của NA (N1) là 1.410 bp còn lại 1.350 bp

Các phân đoạn gen M, NP và NS mã hóa tổng hợp các protein chức năng khác nhau của virus, có độ dài tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, bao gồm:

- Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1.556 bp, mã hóa tổng hợp nucleotide (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ NP là một protein được glycosyl hóa,

có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 56.000Da (Luong and Palese, 1992; Murphy and Webster, 1996)

- Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1.027 bp, mã hóa cho protein đệm (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được tạ ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và

NA có khoảng 3.000 phân tử MP trên bề mặt capsid củavirus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin Protein M1 là protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và thamgia vào quá trình “nảy chồi” của virus Protein M2 là chuỗi polypeptide bé,

có khối lượng phân tử theo tính toán là 11.000 Da là protein chuyển màng - kênh ion cần thiết cho khả năng lây nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

- Phân đoạn 8 (gen NS) là gen mã hóa protein không cấu trúc, có độ dài ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein), có vai trò bảo vệ hệ gen của virus nếu thiếu chúng virus sinh ra sẽ bị thiểu năng Độc tính của virus có sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gen) được tìm thấy ở biến chủng gen A/H5N1/97 NS1 có khối lượng phân tử theo tính toán

là 27.000 Da chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm, và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30 bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 14.000 Da đóng vai trò vận chuyển các RNA của virus ra khỏi nhân

2.4.3 Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch

Hai protein HA và NA là các protein chính bề mặt capsid (major capsid protein) đặc trưng cho bản chất kháng nguyên của từng chủng virus cúm A

Protein HA (Hemagglutinin)

Protein hemagglutinin là một glycoprotein thuộc protein màng typ I (lectin),

có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro), kháng thể

đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn

trở ngưng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody) Có 16 phân typ

HA đã được phát hiện (H1 - H16) Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus, có vai trò quan trọng trong quá trình nhận diện virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ haidưới đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị

HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên

bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau Vị trí amino acid 226 (aa226) của dưới đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó, ở hầu hết các chủng virus cúm A lưu hành trong tự nhiên vị trí này

là Glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2, 3 sialic acid (chứa sialic acid liên kết

với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên của virus cúm A) Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác: Glutamine 222, Glycine 224, hay cấu trúc SGVSS

và NGQSGR cũng có sự liên quan chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ Đặc biệt, một số chủng virus cường độc A/H5Nx; A/H7Nx lưu hành hiện nay có thể xâm nhiễm trên người, khi chúng có tải lượng cao trong đường hô hấp (do tiếp xúc trực tiếp với chất thải hay gia cầm

nhiễm bệnh)

Trình tự mã hóa chuỗi nối, và thành phần chuỗi nối trên protein HA cũng như các vị trí amino acid liên quan đến khả năng gắn với thụ thể thích ứng, được coi là các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phân tích gen kháng nguyên HA Protein HA còn là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích

cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng typ HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay

Protein NA (neuraminidase)

Protein neuraminidase còn gọi là sialidase (mã số quốc tế là E.C 3.2.1.18),

là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân typ NA Có

9 phân typ (từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai phân typ N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA trên bề mặt capsid hạt virus Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrat của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào Mặt

khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy

nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ.Nguy hiểm nhất là kháng nguyên virus cúm typ A có khả năng tổ hợp biến chủng dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên Chúng có hai khả năng

đột biến (Ito and Kawaoka, 1998)

Đột biến điểm (còn gọi là đột biến ngẫu nhiên hoặc hiện tượng trôi dạt - antigenic drift) Đây là kiểu đột biến xảy ra thường xuyên, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N tạo ra những thay đổi nhỏ về trình tự nucleotide của gen mã hóa cho kháng nguyên H và kháng nguyên N Kết quả là tạo ra các phân typ cúm hoàn toàn mới có tính thích ứng loài vật chủ khác nhau

và mức độ độc lực gây bệnh khác nhau Chu kỳ của bệnh cúm hàng năm phụ thuộc vào sự kết hợp của tốc độ biến đổi, thời gian ủ bệnh và sự biến đổi theo mùa của khí hậu

Đột biến tái tổ hợp di truyền (còn gọi là đột biến có tính chuyển đổi - antigenic shift) Hiện tượng tái tổ hợp gen ít xảy ra hơn so với hiện tượng đột biến điểm Một số chủng virus chỉ gây bệnh cho gia cầm mà không gây bệnh cho người (Ian, 1982; Kawaoka, 1991) Một số chủng khác lại chỉ gây bệnh cho người mà không gây bệnh cho gia cầm Trong một số trường hợp, cả virus cúm người và virus cúm gia cầm có thể cùng nhiễm vào động vật thứ 3 (có thể là lợn) Hiện tượng tái tổ hợp gen chỉ xảy ra khi 2 hoặc nhiều loại virus cúm khác nhau cùng nhiễm vào một tế bào chủ do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus Đột biến này là

sự tổ hợp di truyền xảy ra định kỳ trong đó có sự sắp xếp lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau Điều đó đã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus đời con so với virus bố mẹ Khi nhiều virus khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các thế hệ virus được sinh ra từ sự tái tổ hợp của các gen bố mẹ xuất phát từ nhiều virus khác nhau

Khi xâm nhập nhiễm vào cơ thể động vật, virus cúm A kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể đặc hiệu Trong đó, quan trọng hơn cả là kháng thể kháng

HA, chỉ có kháng thể này mới có vai trò trung hòa virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra

(Klenket al., 1983)

2.4.4 Độc lực của virus

Để đánh giá độc lực của virus cúm gia cầm người ta sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng đã gây nhiễm virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ nhiễm của gà

để cho điểm (chỉ số IVPI: Intravenous Pathogenicity Index) Điểm tối đa là 3 với virus có độ độc lực cao nhất, theo quy định của Ủy ban châu Âu bất cứ virus nào

có chỉ số IVPI từ 1.2 trở lên thuộc nhóm HPAI - độc lực cao (Nguyễn Tiến

Dũng, 2004; OIE, 1992)

Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại: Loại độc lực cao (HPAI - Highly pathogenic avian influenza), và loại độc lực thấp (LPAI - Low pathogenic avian influenza), cả hai loại đều cùng tồn tại trong tự nhiên

- HPAI là loại virus cúm A thường gây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ bị nhiễm với khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội tạng HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và trong tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin (Webster, 1998; Alexander, 2007)

- LPAI là loại virus cúm A khi phát triển trong cơ thể bị nhiễm chỉ gây bệnh cúm nhẹ, không gây triệu chứng lâm sàng điển hình và không gây chết vật chủ(Webster, 1998; Alexander, 2007)

2.4.5 Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus

Virus cúm A phân nhóm H5N1 có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu

mô đường hô hấp, hơn nữa đây là loại virus sống kí sinh nội bào bắt buộc nên quá trình xâm nhiễm và nhân lên chủ yếu xảy ra ở đường hô hấp, đường tiêu hóa

của cơ thể nhiễm (Murphy and Webster, 1996; Nicholson et al., 2003)

Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của

HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, cuối cùng giải phóng

hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm

Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với nhiều virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ) Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, rơi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis)làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ (Webster, 1998;

Uiprasertkulet al., 2007)

Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA - dependent RNA transcription) Phức hợp protein -RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào (Basler, 2007)

Trong nhân tế bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương

từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA - polymerase Các sợi này không được adenine hóa ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương

tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 adenin ở đầu 5’- sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus

Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên

mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy

chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết

hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất

với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi

liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này

và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác

(Murphy and Webster, 1996; Nayak et al., 2004)

Nguồn: Beard (1998)

Hình 2.5 Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên virus cúm A ở tế bào chủ

2.4.6 Sức đề kháng của virus

Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lí hay hóa học Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9 Ở pH quá acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh Lớp vỏ ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng Dưới ánh sáng trực tiếp virus bất hoạt sau 40 giờ, ở ánh sáng bình thường tồn tại được 15 ngày Tia tử ngoại làm bất hoạt virus nhưng không phá hủy kháng nguyên virus.Trong phụ tạng gia cầm (400C) virus tồn tại được 25-30 ngày, trong phân gia cầm tồn tại ít nhất 3 tháng, nếu bảo quản ở nhiệt độ -70oC virus có thể tồn tại hàng năm

2.5 TRUYỀN NHIỄM HỌC

2.5.1 Động vật cảm nhiễm

Tất cả loài gia cầm, thủy cầm, chim hoang dã (đặc biệt là thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus cúm A Bệnh thường phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, gà tây, vịt, chim cút) Ngoài ra virus cúm A có thể lây bệnh cho các loàiđộng vật có vú như lợn, thú hoang dã, ngựa, người Nhờ đặc tính thay đổi tính kháng nguyên trong tự nhiên, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như gà-gà, vịt-vịt hay “ngoại loài” như gà - lợn, lợn–gà-người

Nguồn: Viện sốt rét ký sinh trùng - côn trùng Quy nhơn (2015)

Hình 2.6 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật

chủ của virus cúm A

2.5.2 Con đường truyền lây

Khi gia cầm bị nhiễm virus chúng sẽ nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hóa Những động vật mẫn cảm sẽ bị nhiễm bệnh theo hai phương thức trực tiếp và gián tiếp

Trực tiếp: Con vật cảm nhiễm tiếp xúc với con vật bị bệnh thông qua các hạt khí dung được đào thải qua đường hô hấp hoặc nhiễm từ phân, chất thải, thức

ăn, nước uống

Gián tiếp: Con vật cảm nhiễm tiếp xúc với các hạt khí dung trong không khí hay các dụng cụ, các chất thải có chứa mầm bệnh hoặc từ những loài chim hoang

dã di cư Đây là phương thức truyền lây nguy hiểm vì ít có khả năng phát hiện ra nguồn gốc mầm bệnh, mầm bệnh có khả năng phát tán đi xa làm phát bệnh trên diện rộng

2.5.3 Mùa phát bệnh

Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm nhưng thường tập trung vào tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau Lúc thời tiết có nhiệt độ lạnh, độ ẩm cao cùng với những thay đổi đột ngột khí hậu làm gia cầm có sức đề kháng kém tạo điều kiện thuận lợi cho virus cúm xâm nhập vào cơ thể

2.6 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH

2.6.1 Triệu chứng

Khi gia cầm mắc bệnh thường có những biểu hiện triệu chứng sau:Toàn thân ủ rủ, lông xơ xác Các biểu hiện về đường hô hấp thường xuất hiện đầu tiên như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, chảy nước mắt, nước mũi ở đầu mỏ Đối với những trường hợp gia cầm bị nhiễm virus độc lực cao thì chết đột ngột, chưa có các biểu hiện về triệu chứng, Gia cầm chết rất nhanh, tỷ lệ chết rất cao có khi 100% chỉ trong thời gian ngắn 1 -2 ngày.Gia cầm bệnh sốt cao, phù đầu và mặt, xung huyết ở vùng da không có lông, đặc biệt ở chân, da tím bầm, đứng tụm một chỗ, lông xù, khát nước, bỏ ăn và chết nhanh Mi mắt bị viêm, mào dày lên do thủy thũng, tím tái do có nhiều điểm xuất huyết Tiêu chảy mạnh, phân loãng màu trắng hoặc trắng xanh, ở những con đang đẻ năng suất trứng giảm rõ rệt, thậm chí gà đẻ trứng không có vỏ.Ngoài các tiệu chứng trên, gia cầm bị bệnh còn

có triệu chứng về thần kinh như đi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi,

thường tụ lại thành đống

2.6.2 Bệnh tích

Bệnh tích rất đa dạng, với các đặc trưng chủ yếu sau:Mào, yếm sưng to, tím sẫm, phù mí mắt;Phù keo nhầy và xuất huyết cơ đùi (phần giáp đầu gối);Da chân xung huyết, đỏ sẫm;Dạ dày cơ xuất huyết, đôi khi xuất huyết dạ dày tuyến;Niêm mạc khí quản, đường tiêu hóa viêm cata và viêm tơ huyết;Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy, dịch nhầy có thể đông đặc; Ruột viêm cata và xuất huyết; Hạch ruột sưng; Các cơ quan nội tạng như màng bao tim, màng gan, màng treo ruộtviêm tơ huyết; Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử màu vàng, màu xám;

Mỡ vành tim xuất huyết Gà trống bị xuất huyết bên trong dịch hoàn; Gà mái đẻ viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non; Tuyến tụy xuất huyết và hoại tử, chuyển sang màu vàng có vết sẫm

2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

2.7.1 Chẩn đoán dịch tễ học

Bệnh cúm gia cầm có tính chất lây lan nhanh và mạnh, loài mắc bệnh thường là gia cầm và các loài chim hoang dã Gia cầm ở mọi lứa tuổi đều mắc, nhưng thường từ 4-66 tuần tuổi, đặc biệt là gia cầm trong thời kỳ đẻ.Bệnh thường xảy ra vào lúc thời tiết giao mùa khi điều kiện khí hậu bất lợi (thường từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau).Bệnh xảy ra nhanh chóng, có thể từ vài giờ đến vài ngày, tỷ lệ chết rất cao, có khi 100%

2.7.2 Chẩn đoán lâm sàng

Bệnh cúm gia cầm có triệu chứng lâm sàng rất đa dạng và dễ nhầm lẫn với một số bệnh khác như CRD, Newcastle, Tụ huyết trùng gia cầm Nếu chỉ dựa vào triệu chứng thì khó có thể phát hiện ra bệnh trừ trường hợp dịch bệnh đã xảy ra,

do vậy để chính xác cần phải tiến hành phân lập virus

2.7.3 Chẩn đoán virus học

Bệnh phẩm để phân lập virus bao gồm: Dịch hầu họng, khí quản, ổ nhớp Dùng tăm bông ngoáy nhẹ trên bề mặt niêm mạc hầu họng, lỗ huyệt rồi cho vào ống nghiệm tiệt trùng có 4 ml bảo quản có kháng sinh liều cao, phân hoặc các chất chứa đường ruột, các bộ phận nội tạng như phổi, gan, lách được lấy mẫu đặt trong ống nhựa hoặc túi nhựa đã tiệt trùng Mẫu sau khi lấy xong được bảo quản

ở nhiệt độ 40C và cần tiến hành phân lập trước 48 giờ, trường hợp bảo quản mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -700C

Bệnh phẩm sau khi được xử lý tiêm vào phôi gà 9-11 ngày tuổi đem vào tủ

ấm 370C Sau 72 giờ thu hoạch phôi chết hoặc phôi sống đã gây nhiễm, mổ trứng thu hoạch dịch trong xoang niệu rồi tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

để xác định sự hiện của virus

2.7.4 Chẩn đoán huyết thanh học

Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) hay phản ứng miễn dịch gắn men ELISA phát hiện kháng thể kháng virus trong máu của gia cầm Phương pháp này cho kết quả chính xác cao, phát hiện nhanh và sớm bệnh cúm gia cầm

2.8 PHÒNG BỆNH

2.8.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh

Vệ sinh ăn uống,người dân cần rửa tay thường xuyên bằng xà phòng để hạn chế việc phơi nhiễm với các virus có trên gia cầm trong môi trường.Thực hiện ăn chín uống sôi, không mua gia cầm không rõ nguồn gốc, không ăn trứng, thịt gia cầm khi chưa nấu chín hoàn toàn.Nuôi gia cầm xa nơi ở, khu vực đông dân cư và thường xuyên vệ sinh chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi Phun thuốc sát trùng định

kỳ 1 tuần 1 lần.Quy hoạch hiệu quả việc chăn nuôi gia cầm theo quy mô tập trung và vùng an toàn dịch bệnh, thực hiện việc giết mổ gia cầm tập trung trong các lò giết mổ đủ tiêu chuẩn có sự giám sát chặt chẽ của cơ quan chuyên môn thú

y kể cả trong vận chuyển trước và sau giết mổ

2.8.2 Phòng bệnh bằng vắc xin

Phòng bệnh bằng vaccine là một trong những giải pháp chủ động hiện nay nhằm tạo ra sự miễn dịch chủ động cho gia cầm, sẽ làm giảm tính mẫm cảm của gia cầm và làm giảm sự thải trừ virus ra môi trường bên ngoài, có khả năng thích ứng chống lại virus.Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA

và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào.Hiện nay có 3 loại vắc xin đang được sử dụng tại một số quốc gia

Vaccine vô hoạt đồng chủng(homologous vaccine) là các loại vaccine được sản xuất chứa những chủng virus cúm gia cầm giống như chủng gây bệnh trên thực địa (Kishida, 2005) Nhược điểm của loại vaccine này là không thể phân biệt gia cầm được tiêm chủng với gia cầm tiếp xúc với mầm bệnh trên thực địa, trừ khi có những con chưa được tiêm chủng được nhốt trong chuồng

Vaccine thế hệ mới: là loại vaccine được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật

gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và sử dụng, bao gồm:

Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp với gen H5 và N1 phòng virus typ H5N1 Vaccine dưới đơn vị chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine Vaccine tái tổ hợp có vector dẫn truyền sử dụng adenovirus hoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, được tổ hợp kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus tạo nên virus tái tổ hợp Ví dụ: vaccine sống virus tái tổ hợp TrovacAIV - H5 của Merial lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Iraland/83 (H5N2), sử dụng cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi và đã được sử dụng tại Việt Nam

2.9 HIỂU BIẾT VỀ KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR

2.9.1 Thế nào là phản ứng Realtime RT-PCR

Phản ứng Real Time - PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA Realtime - PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang Hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang

tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA Khi sử dụng máy Bio - Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (cycle of threshold) Đây là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng

Cúm gia cầm typ A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng RT -

PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA→DNA gọi là Reverse Transcription nên phương pháp này được gọi là Real Time RT-PCR

2.9.2 Cơ chế hoạt động của Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang

Trong kỹ thuật này, Realtime RT-PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: (1) Taqman probe, là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả năng thuỷ giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong các chu kỳ nhiệt được trình bày minh hoạ ở Hình 2.7

Hình 2.7 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe