Một số đặc tính sinh học của chủng TGEV (transmissible gastroenteritis virus) và PEDV (porcine epidemic diarhea virus) dùng sản xuất vacxin nhược độc đa giá

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang	77
Dung lượng	4,31 MB

Các công cụ chuyển đổi và chỉnh sửa cho tài liệu này

Cấu trúc

Phần 1. Mở đầu (11)
- 1.1. Đặt vấn đề (11)
- 1.2. Mục tiêu nghiên cứu (11)
- 1.3. Ý nghĩa khoa học (12)
Phần 2. Tổng quan tài liệu (13)
- 2.1. Tình hình nghiên cứu về bệnh tiêu chảy do Virus (13)
  - 2.1.1. Tình hình nghiên cứu về PEDV, TGEV tại Việt Nam (13)
  - 2.1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới (16)
- 2.2. Giới thiệu chung về virus gây tiêu chảy (21)
  - 2.2.1. Phân loại (21)
  - 2.2.2. Virus gây bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (22)
  - 2.2.3. Virus gây bệnh tiêu chảy cấp ở lợn (28)
- 2.3. Miễn dịch và vacxin phòng bệnh (36)
  - 2.3.1. Miễn dịch chống PEDV, TGEV (36)
  - 2.3.2. Vacxin phòng bệnh PEDV, TGEV (37)
Phần 3. Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu (41)
- 3.1. Địa điểm nghiên cứu (41)
- 3.2. Thời gian thực hiện đề tài (41)
- 3.3. Nội dung nghiên cứu (41)
  - 3.3.1. Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá của PEDV và TGEV (41)
  - 3.3.2. Đánh giá tính nhược độc lực của 2 chủng PEDV và TGEV (0)
  - 3.3.3. Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng PEDV và TGEV (41)
- 3.4. Đối tượng - vật liệu nghiên cứu (0)
  - 3.4.1. Đối tượng nghiên cứu (0)
  - 3.4.2. Vật liệu nghiên cứu (41)
- 3.5. Phương pháp nghiên cứu (42)
  - 3.5.1. Phương pháp xác định hiệu giá virus (42)
  - 3.5.2. Phương pháp kiểm tra tính nhược độc hóa của virus (43)
  - 3.5.3. Phương pháp tách ARN (43)
  - 3.5.4. Phương pháp tổng hợp CDNA (44)
  - 3.5.5. Phương pháp realtime RT-PCR định lượng virus (44)
  - 3.5.6. Phương pháp giải trình tự gen mã hóa spike protein (gen S) (46)
  - 3.5.7. Phương pháp phân tích trình tự gen (47)
  - 3.5.8. Phương pháp xử lý số liệu (47)
Phần 4. Kết quả và thảo luận (48)
- 4.1. Đặc tính ổn định hiệu giá của chủng giống PEDV, TGEV (48)
- 4.2. Đặc điểm nhược độc hóa của chủng virus PEDV, TGEV (0)
  - 4.2.1. Triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm (50)
  - 4.2.2. Biến đổi bệnh lý đại thể của lợn gây nhiễm (52)
  - 4.2.3. Biến đổi bệnh lý vi thể ở ruột non của lợn gây nhiễm (54)
  - 4.2.4. Kết quả nghiên cứu sự bài thải và phân bố virus ở đường tiêu hóa (57)
- 4.3. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng giống (59)
  - 4.3.1. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng PEDV (59)
  - 4.3.2. Đặc điểm ổn định di truyền của chủng TGEV (62)
Phần 5. Kết luận và kiến nghị (66)
- 5.1. Kết luận (66)
- 5.2. Kiến nghị (66)
Tài liệu tham khảo (67)

Nội dung

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Minh Tên luận văn:“Một số đặc tính sinh học của chủngTGEV transmissible gastroenteritis virus và PEDV porcine epidemic diarrhea virus dùng sản

Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

- Phòng nghiên cứu và phát triển sản phẩm vacxin, Công ty TNHHMTV AVAC Việt Nam, thôn Ngọc Lịch – xã Trưng Trắc – huyện Văn Lâm – tỉnh Hưng Yên

- Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

Thời gian thực hiện đề tài

Từ ngày 01 tháng 10 năm 2018 đến ngày 30 tháng 09 năm 2019.

Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Đánh giá đặc tính ổn định hiệu giá của PEDV và TGEV

3.3.2 Đánh giá tính nhƣợc độc lực của 2 chủng PEDV và TGEV

- Triệu chứng, bệnh tích ở lợn sơ sinh

- Hàm lượng virus thải qua phân

- Sự phân bố và hàm lượng virus ở đường tiêu hóa

3.3.3 Đánh giá đặc tính ổn định di truyền của hai chủng PEDV và TGEV

- Giải trình tự gen S của chủng PEDV và TGEV ở các lần tiếp đời xung quanh đời chọn làm vacxin: PEDV (P37, P100, P120, P130, P140 và P150); TGEV (P5, P100, P120, P130, P140 và P150)

⚠️The Pollinations legacy text API is being deprecated for **authenticated users**.Please migrate to our new service at https://enter.pollinations.ai for better performance and access to all the latest models.Note: Anonymous requests to text.pollinations.ai are NOT affected and will continue to work normally.

3.4 ĐỐI TƢỢNG - VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Giống virus cường độc TGEV, PEDV (do công ty AVAC cung cấp)

- Môi trường tế bào Vero và ST (công ty AVAC cung cấp)

- Động vật thí nghiệm: lợn sơ sinh chưa bú sữa đầu; âm tính TGEV, PEDV

- Trình tự mồi đặc hiện phát hiện và giải trình tự gen của PEDV, TGEV

- Hóa chất tách ARN (TRIzol) và kít tổng hợp cDNA (MMLV)

- Bộ kít PCR (2X PCR Master mix solution, i-MAXⅡ)

- Trình tự gen mã hóa protein bề mặt (gen S)

3.5.1 Phương pháp xác định hiệu giá virus

- Trước khi gây nhiễm, thảm tế bào được rửa 2 lần bằng PBS 1X

-Nhỏ mẫu đó pha loóng vào giếng của đĩa tế bào (100 àl/giếng) Mỗi nồng độ gây nhiễm vào một dãy 3 giếng

- Ủ đĩa ở 37 o C trong vòng 1 giờ, sau đó loại bỏ huyễn dịch virus

3.5.2 Phương pháp kiểm tra tính nhược độc hóa của virus

Tính độc của PEDV đã được chứng minh với lợn sơ sinh (Thomas et al.,

2015): ở liều thấp (10 ml huyễn dịch virus có hiệu giá trong khoảng 560- 0,056

TCID 50 /ml) cũng gây ra triệu chứng, bệnh tích Do đó, nghiên cứu này đã chọn liều virus của lọ vacxin (105,0 TCID 50 /ml) để thử độc lực của chủng virus vacxin ở lợn sơ sinh Hơn nữa, trong điều kiện Việt Nam, rất khó tìm được trang trại âm tính kháng thể PEDV, do đó, nghiên cứu này chọn lợn sơ sinh (chưa bú sữa đầu) để tiến hành nghiên cứu, thay vì lợn > 5-10 ngày tuổi như một số nghiên cứu (Gerber et al., 2016)

12 giờ để nghiên cứu sự bài thải virus

ARN được tách từ huyễn dịch bệnh phẩm 10%, với các bước như sau: Bước 1: Ly giải mẫu

- Bổ sung 800àl TRIzol vào 200àl huyễn dịch virus, vortex

- Bổ sung tiếp 200àl Chloroform, vortex mạnh trong 15 giõy Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Huyễn dịch được ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C

- Chuyển pha trờn chứa ARN vào một ống Eppendorf mới (500àl) Bước 3: Kết tủa ARN

- Bổ sung 500àl dung dịch Isopropanol, tủa ở -20 o C/ 10 phỳt

- Ly tâm 12000 vòng/ phút/ 10 phút ở 4 o C, bỏ dịch trên, thu tủa ARN Bước 4: Rửa phần tủa

- Thêm 1ml ethanol 75% Lắc nhẹ để trộn đều

- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC

Bước 5: Hoàn nguyên tủa và thu ARN

- Loại bỏ phần dịch phía trên,

- Hũa ARN trong 30àl nước cất 3 lần đó xử lý Rnase và giữ ở -70 o C

3.5.4 Phương pháp tổng hợp cDNA

Bảng 3 1 Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp Cdna

TT Thành phần Thể tích

3.5.5 Phương pháp realtime RT-PCR định lượng virus

Cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được dùng theo nghiên cứu đã công bố: định lượng TGEV (Ma et al., 2014), định lượng PEDV (Miller et al., 2016)

Phản ứng realtime PCR được thực hiện bởi máy ABI StepOne (hình 3.1)

Hình 3.1 Ví dụ về kết quả phản ứng SYBR Green realtime PCR

Hình 3.2 Phân tích melting curve để xác định độ đặc hiệu của phản ứng

3.5.6 Phương pháp giải trình tự gen mã hóa spike protein (gen S)

Bảng 3 2 Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S của PEDV Đoạn gen Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Nhiệt độ ( o C)

Bảng 3 3 Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S của TGEV Đoạn gen Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Nhiệt độ ( o C)

Phản ứng PCR nhân gen được thực hiện với kít thương mại2X PCR Master mix solution (i-MAXⅡ, 25266, iNtRON Biotechnology) Phân tích sản phẩm

PCR bằng điện di trong thạch agarose 2% có bổ sung thuốc nhuộm ADN

3.5.7 Phương pháp phân tích trình tự gen

Sản phẩm PCR nhân gen S của PEDV và TGEV được giải mã bởi công ty

Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự gen S được bắt cặp so sánh với các trình tự tương ứng của PEDV, TGEV được công bố trên Genbank Phần mềm BioEdit

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp xác định hiệu giá virus

- Trước khi gây nhiễm, thảm tế bào được rửa 2 lần bằng PBS 1X

-Nhỏ mẫu đó pha loóng vào giếng của đĩa tế bào (100 àl/giếng) Mỗi nồng độ gây nhiễm vào một dãy 3 giếng

- Ủ đĩa ở 37 o C trong vòng 1 giờ, sau đó loại bỏ huyễn dịch virus

3.5.2 Phương pháp kiểm tra tính nhược độc hóa của virus

Tính độc của PEDV đã được chứng minh với lợn sơ sinh (Thomas et al.,

2015): ở liều thấp (10 ml huyễn dịch virus có hiệu giá trong khoảng 560- 0,056

TCID 50 /ml) cũng gây ra triệu chứng, bệnh tích Do đó, nghiên cứu này đã chọn liều virus của lọ vacxin (105,0 TCID 50 /ml) để thử độc lực của chủng virus vacxin ở lợn sơ sinh Hơn nữa, trong điều kiện Việt Nam, rất khó tìm được trang trại âm tính kháng thể PEDV, do đó, nghiên cứu này chọn lợn sơ sinh (chưa bú sữa đầu) để tiến hành nghiên cứu, thay vì lợn > 5-10 ngày tuổi như một số nghiên cứu (Gerber et al., 2016)

12 giờ để nghiên cứu sự bài thải virus

ARN được tách từ huyễn dịch bệnh phẩm 10%, với các bước như sau: Bước 1: Ly giải mẫu

- Bổ sung 800àl TRIzol vào 200àl huyễn dịch virus, vortex

- Bổ sung tiếp 200àl Chloroform, vortex mạnh trong 15 giõy Ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút

- Huyễn dịch được ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C

- Chuyển pha trờn chứa ARN vào một ống Eppendorf mới (500àl) Bước 3: Kết tủa ARN

- Bổ sung 500àl dung dịch Isopropanol, tủa ở -20 o C/ 10 phỳt

- Ly tâm 12000 vòng/ phút/ 10 phút ở 4 o C, bỏ dịch trên, thu tủa ARN Bước 4: Rửa phần tủa

- Thêm 1ml ethanol 75% Lắc nhẹ để trộn đều

- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4oC

Bước 5: Hoàn nguyên tủa và thu ARN

- Loại bỏ phần dịch phía trên,

- Hũa ARN trong 30àl nước cất 3 lần đó xử lý Rnase và giữ ở -70 o C

3.5.4 Phương pháp tổng hợp cDNA

Bảng 3 1 Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp Cdna

TT Thành phần Thể tích

3.5.5 Phương pháp realtime RT-PCR định lượng virus

Cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt được dùng theo nghiên cứu đã công bố: định lượng TGEV (Ma et al., 2014), định lượng PEDV (Miller et al., 2016)

Phản ứng realtime PCR được thực hiện bởi máy ABI StepOne (hình 3.1)

Hình 3.1 Ví dụ về kết quả phản ứng SYBR Green realtime PCR

Hình 3.2 Phân tích melting curve để xác định độ đặc hiệu của phản ứng

3.5.6 Phương pháp giải trình tự gen mã hóa spike protein (gen S)

Bảng 3 2 Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S của PEDV Đoạn gen Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Nhiệt độ ( o C)

Bảng 3 3 Trình tự primer đặc hiệu giải trình tự gen S của TGEV Đoạn gen Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Nhiệt độ ( o C)

Phản ứng PCR nhân gen được thực hiện với kít thương mại2X PCR Master mix solution (i-MAXⅡ, 25266, iNtRON Biotechnology) Phân tích sản phẩm

PCR bằng điện di trong thạch agarose 2% có bổ sung thuốc nhuộm ADN

3.5.7 Phương pháp phân tích trình tự gen

Sản phẩm PCR nhân gen S của PEDV và TGEV được giải mã bởi công ty

Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự gen S được bắt cặp so sánh với các trình tự tương ứng của PEDV, TGEV được công bố trên Genbank Phần mềm BioEdit

3.5.8 Phương pháp xử lý số liệu

- Số liệu được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel.

Ngày đăng: 14/07/2021, 15:05

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo

Loại

Chi tiết

21. Goede Dane, Michael P Murtaugh, Joel Nerem, Paul Yeske, Kurt Rossow and Robert Morrison, (2015). Previous infection of sows with a “mild” strain of porcine epidemic diarrhea virus confers protection against infection with a“severe” strain. Veterinary microbiology. 176. (1-2). pp. 161-164

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	mild” strain of porcine epidemic diarrhea virus confers protection against infection with a “severe
Tác giả:	Goede Dane, Michael P Murtaugh, Joel Nerem, Paul Yeske, Kurt Rossow and Robert Morrison
Năm:	2015

68. Sueyoshi M., T. Tsuda, K. Yamazaki, K. Yoshida, M. Nakazawa, K. Sato, T. Minami, K. Iwashita, M. Watanabe, Y. Suzuki et al., (1995b). An immunohistochemical investigation of porcine epidemic diarrhoea. J Comp Pathol. 113. (1). pp. 59-67

Sách, tạp chí

Tiêu đề:	et al

1. Huỳnh Minh Trí, Nguyễn Hoàng Việt và Nguyễn Ngọc Hải, (2017). Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus gây bệnh tiêu chảy cấp (porcine epidemic diarhea virus - PEDV) trên heo nái và xác định các yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh PED tại tỉnh Tiền Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 52. tr. 1-7

Khác

2. Lê Văn Phan, Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Bá Hiên, (2015). Một số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch tiêu chảy cấp ở lợn (porcine epidemic diarrhea - PED) tại Quảng Trị, Thái Nguyên và Thái Bình từ năm 2013 - 2014. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 13. (7). tr. 1089-1100

Khác

3. Nguyễn Tất Toàn và Đỗ Tiến Duy (2012). Đặc trưng kiểu gen của virus gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) trên heo ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ. Khoa học Kĩ thuật Thú y. 19. (7). tr. 34-41

Khác

4. Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang Lâm, Trịnh Đình Thâu và Ngô Thị Hạnh, (2018). Nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus PED (porcine epidemic diarrhea virus). Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 16. (3). tr. 257-267

Khác

5. Nguyễn Văn Điệp, Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Thị Hoa và R. Yamaguchi (2014). Một số đặc điểm dịch tễ và bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch trên heo ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Khoa học Kĩ thuật Thú y. 21. (2). tr. 43-55

Khác

6. Vũ Thị Lan Hương, (2007). Nghiên cứu tình hình phơi nhiễm các virus transmissible gastroenteritis virus (TGEV), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) và rotavirus (RV) ở lợn bằng phương pháp Ab-ELISA. Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường đại học Nông nghiệp I.II. Tài liệu tiếng Anh

Khác

1. An Kang, Liurong Fang, Rui Luo, Dang Wang, Lilan Xie, Jing Yang, Huanchun Chen and Shaobo Xiao, (2014). Quantitative proteomic analysis reveals that transmissible gastroenteritis virus activates the JAK-STAT1 signaling pathway.Journal of proteome research. 13. (12) .pp. 5376-5390

Khác

2. Barrera Maritza, Ana Garrido-Haro, Mar Vaca, #xed, a S., Danilo Granda, Alfredo Acosta-Batallas, #xe9 and Lester J. rez, (2017). Tracking the Origin and Deciphering the Phylogenetic Relationship of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Ecuador.BioMed Research International. 2017. 7

Khác

3. Bernard Serge and Hubert Laude, (1995). Site-specific alteration of transmissible gastroenteritis virus spike protein results in markedly reduced pathogenicity.Journal of general virology. 76. (9). pp. 2235-2241

Khác

4. Bernasconi C, F Guscetti, A Utiger, K van Reeth, M Ackermann and A Pospischil, 1995: Experimental infection of gnotobiotic piglets with a cell culture adapted porcine epidemic diarrhoea virus: clinical, histopathological and immunohistochemical findings. Immunobiology of viral infections. Proceedings 3rd Congress of the European Society for Veterinary Virology Interlaken, Switzerland, 4-7 September, 1994. pp. 542-546. Foundation Marcel Merieux

Khác

5. Bohl Edward H and Linda J Saif, (1975). Passive immunity in transmissible gastroenteritis of swine: immunoglobulin characteristics of antibodies in milk after inoculating virus by different routes. Infection and immunity. 11 (1): 23-32

Khác

6. Boonsoongnern Prapassorn, Alongkot Boonsoongnern, Urai Pongchairerk and Tanatpon Paompa, (2018). The comparison of villous damage at different ages of piglets infected with porcine epidemic diarrhea virus. Chiang Mai Veterinary Journal. 16. (1). pp. 37-46

Khác

7. Callebaut P, P Debouck and M Pensaert, (1982). Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of the coronavirus-like agent and its antibodies in pigs with porcine epidemic diarrhea. Veterinary microbiology. 7. (4). pp. 295-306

Khác

8. Carvajal Ana, Ignacio Lanza, Rafael Diego, Pedro Rubio and Pedro Cámenes, (1995). Evaluation of a blocking ELISA using monoclonal antibodies for the detection of porcine epidemic diarrhea virus and its antibodies. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 7. (1). pp. 60-64

Khác

9. Chang Sun-Hwa, Jong-Lye Bae, Tae-Jin Kang, Ju Kim, Gook-Hyun Chung, Chae- Woong Lim, Hubert Laude, Moon-Sik Yang and Yong-Suk Jang, (2002).Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus. Molecules and cells. 14 (2). pp. 295-299

Khác

11. Chen Qi, Ganwu Li, Judith Stasko, Joseph T Thomas, Wendy R Stensland, Angela E Pillatzki, Phillip C Gauger, Kent J Schwartz, Darin Madson and Kyoung-Jin Yoon, (2014). Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States. Journal of clinical microbiology. 52. (1). pp. 234-243

Khác

12. Choe Se-Eun, Kee-Hwan Park, Seong-In Lim, Nguyen Ba Hien, Pham Ngoc Thach, Byung-Hyun An, Song Hee Han, In-Soo Cho and Dong-Jun An, (2016). Complete genome sequence of a porcine epidemic diarrhea virus strain from Vietnam, HUA- 14PED96, with a large genomic deletion. Genome Announc. 4 (1): e00002-00016

Khác

13. Cubero M. J., S. Bernard, L. Leon, P. Berthon and A. Contreras, (1992). Pathogenicity and antigen detection of the Nouzilly strain of transmissible gastroenteritis coronavirus, in 1-week-old piglets. Journal of Comparative Pathology. 106. (1). pp. 61-72

Khác