Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen ph3 và khảo nghiệm các tổ hợp lai cà chua mang gen ph3 vụ xuân hè tại gia lâm hà nội

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu: Xác định chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen Ph3 và tuyển chọn được tổ hợp lai cà chua lai F 1 mang gen Ph3 t

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

BÙI THỊ THÊU

XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT CHẶT VỚI GEN Ph3 VÀ KHẢO NGHỊÊM CÁC TỔ HỢP LAI CÀ CHUA MANG GEN Ph3 VỤ XUÂN HÈ TẠI GIA LÂM- HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Ngọc Hùng

GS.TS Phan Hữu Tôn

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan

và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Bùi Thị Thêu

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi bày tỏ lòng kính trọng

và biết ơn sâu sắc tới GS TS Phan Hữu Tôn và TS Trần Ngọc Hùng đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian, công sức và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản

lý đào tạo, Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Rau quả đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn.

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Bùi Thị Thêu

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục các hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Tổng quan về cây cà chua 4

2.1.1 Danh pháp và phân loại 4

2.1.2 Nguồn gốc, lịch sử và cách sử dụng cà chua 4

2.1.3 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và Việt Nam 5

2.2 Nghiên cứu về bệnh sương mai trên cà chua 9

2.2.1 Triệu chứng và dấu hiệu bệnh sương mai 9

2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 11

2.2.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh 12

2.3. Chỉ thị phân tử và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 13 2.3.1 Chỉ thị phân tử 13

2.3.2 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng 18

2.4. Tình hình nghiên cứu về tính kháng bệnh sương mai và chọn tạo giống cà chua kháng bệnh 19

2.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước 19

2.4.2 Các nghiên cứu trong nước 24

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 26

3.1 Địa điểm nghiên cứu 26

3.2 Thời gian nghiên cứu 26

3.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 26

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.1 Phương pháp xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 26

3.5.2 Phương pháp xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua 32

3.5.3. Đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội 32

3.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

Phần 4 Kết quả và thảo luận 35

4.1 Kết quả khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử.35 4.2. Kết quả xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh 38

4.3. Kết quả ứng dụng chỉ thị phân tử LB3 xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 44

4.4. Kết quả đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua ở vụ Xuân Hè tại Gia Lâm - Hà Nội 48 4.4.1 Kết quả đánh giá đặc điểm sinh trưởng của các tổ hợp lai cà chua 48 4.4.2 Kết quả đánh giá đặc điểm quả của các tổ hợp lai cà chua 49

4.4.3 Kết quả đánh giá năng suất các tổ hợp lai cà chua 51

4.4.4 Tình hình nhiễm sâu bệnh ngoài đồng ruộng của các tổ hợp lai 52

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

Tài liệu tham khảo 56

Phụ lục 62

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt

AVRDC Agriculture Vegetables Reseacher and Development Center

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1. Diện tích và sản lượng cà chua trên toàn thế giới giai đoạn 2012- 2014.6

Bảng 2 2. Diện tích và sản lượng cà chua trên cả nước giai đoạn 2014- 2016 7

Bảng 2 3. Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua một số tỉnh trồng chính trên cả nước giai đoạn 2014- 2016 8

Bảng 3.1 Danh sách các giống cà chua nghiên cứu 27

Bảng 3 2 Thành phần phản ứng PCR với mồi 29

Bảng 3 3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 29

Bảng 3 4 Các tổ hợp lai cà chua tiến hành xác định kiểu gen Ph3 32

Bảng 4 1 Đặc điểm các chỉ thị phân tử thể hiện tính đa hình với gen Ph3 35 Bảng 4 2. Kiểu hình, kiểu gen và trao đổi chéo của quần thể F 2 của tổ hợp lai 08TP03-15-3-1 × 08TP73-10-4 39

Bảng 4 3 Khoảng cách di truyền của các chỉ thị phân tử 44

Bảng 4 4 Kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm 45

Bảng 4 5. Đánh giá tính kháng bệnh sương mai của các tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm 46

Bảng 4 6. Chiều cao cây và dạng hình sinh trưởng của các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội 48

Bảng 4 7. Đặc điểm quả các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm-Hà Nội 50

Bảng 4 8. Năng suất của các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm-Hà Nội 51

Bảng 4 9. Biểu hiện bệnh hại ngoài đồng ruộng các tổ hợp lai cà chua vụ Xuân Hè năm 2017 tại Gia Lâm- Hà Nội 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

2014- 2016

Hình 2 2 Triệu chứng bệnh sương mai trên thân, lá và quả cà chua

Hình 2 3 Chu kỳ vòng đời của nấm Phytophthora infestans

Hình 2 4 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR

Hình 2.5 Vị trí của gen Ph3 trong bản đồ chỉ thị phân tử RFLP tại vai dài của nhiễm sắc thể số 9 (Botstein et al., 2006) .

Hình 2.6 Bản đồ liên kết các gen (QTL) liên quan đến tính kháng bệnh sương mai của cà chua: LB-1 và LB-2- QTL kháng bệnh sương mai (Fray et al., 1998); Ph1, Ph2, Ph3 - gen kháng bệnh sương mai (Chunwongse et al., 2002) .

Hình 2.7 Ảnh điện di của chỉ thị SCAR phát triển từ chỉ thị AFLP (L87) ( Park et al., 2010) (1- kháng bệnh, 2-6 nhiễm bệnh, 7-16 kháng bệnh)

Hình 3 1 Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 trên nhiễm sắc thể số 9

Hình 3.2 Sơ đồ tạo quần thể F Hình 3.3 Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên lá tách rời

Hình 3 4 Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tử động dưới kính hiển vi) .

Hình 4 1 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị TOM 236

Hình 4 2 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SSR383

Hình 4 3 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SSR69

Hình 4 4 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị LB3

Hình 4 5 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SCU602F3R3

Hình 4 6 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị LB3 của quần thể F thể từ 1 đến 35 (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4)

Hình 4 7 Ảnh điện di sản phẩm PCR của chỉ thị SCU602F3R3 quần thể F cá thể từ 1 đến 37 (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4)

Hình 4 8 Ảnh điện di chỉ thị LB3 của tổ hợp lai cà chua khảo nghiệm

Hình 4 9 Đánh giá tính kháng bệnh sương mai của các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Bùi Thị Thêu

Tên luận văn: Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 và khảo nghiệm các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội.

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp

Việt Nam Mục đích nghiên cứu:

Xác định chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen Ph3 và tuyển chọn được tổ hợp lai cà chua lai F 1 mang gen Ph3 triển vọng trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm – Hà Nội.Phương pháp nghiên cứu:

Tiến hành khảo sát đa hình 5 chỉ thị TOM236, SSR383, SSR69, LB3 và SCU602F3R3 với vật liệu giống thí nghiệm (đã biết kiểu gen Ph3) và xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình kháng bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo (phương pháp lá tách rời) với chủng nấm sương mai (Phytophthora infestans) thu thập và phân lập tại Viện Nghiên cứu Rau Quả của quần thể F2 từ tổ hợp lai (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10- 4) Ứng dụng chỉ thị phân tử được xác định liên kết chặt với gen Ph3 thu được

từ thí nghiệm trên để xác định kiểu gen Ph3 và đánh giá kiểu hình của 5 tổ hợp lai cà chua (V1, V2, V3, V4 và V5) mang gen Ph3 Bố trí thí nghiệm theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần nhắc lại với các tổ hợp lai cà chua từ V1 đến V5, trong đó V1 là giống Savior được dùng làm đối chứng để tiến hành khảo nghiệm.

Kết quả chính và kết luận:

Qua kết quả đánh giá, so sánh sự tương đồng giữa kiểu gen Ph3 của 5 chỉ thị nghiên cứu và kiểu hình kháng bằng lây nhiễm trên 96 cá thể ngẫu nhiên của quần thể F2 từ tổ hợp lai (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4), đã lựa chọn được 2 chỉ thị: LB3 với khoảng cách di truyền 2,3 cM và chỉ thị SCU602F3R3 với khoảng cách bằng 3,1

cM, liên kết chặt với gen Ph3 kháng bệnh sương mai ở cà chua Kết quả này là cơ sở giúp chọn tạo giống cà chua chứa gen kháng hữu hiệu Ph3 bằng chỉ thị phân tử đạt

độ chính xác cao Kết quả đánh giá kiểu gen Ph3 sử dụng chỉ thị phân tử LB3 và khảo nghiệm các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội cho thấy tổ hợp lai triển vọng phục vụ sản xuất: V4 (08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3) mang gen Ph3 ở trạng thái dị hợp tử; có nhiều đặc điểm tốt như thuộc nhóm sinh trưởng vô hạn, có khối lượng trung bình quả đạt 100g, độ Brix bằng 3,5%, năng suất thực thu đạt 76,23 tấn/ha, năng suất cà chua thương phẩm đạt 72,63 tấn/ha, chống chịu tốt với chủng nấm bệnh sương mai nghiên cứu.

THESIS ABSTRACT

Master candicate: Bui Thi Theu

Thesis title: Identification of DNA molecular marker closely linked to Ph3 resistant gene and evaluation of tomato hybrid combinations containing Ph3 gene in Spring Summer season at Gia Lam- Hanoi.

Education organization: Vietnam National University of

Agriculture Research Objectives:

To identify DNA molecular markers closely linked to Ph3 gene and find out a promising tomato hybrid combinations containing Ph3 gene in Spring Summer season at Gia Lam- Hanoi.

Materials and Methods:

We have evaluated the polymorphism of 5 markers TOM236, SSR383, SSR69, LB3 và SCU602F3R3 on experimental varieties (Ph3 genotype was denified) and identified marker linkage level by assessing Ph3 genotype and resistant phenotype of F 2 population of cross combination (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4) after infecting (by detached – leavflets method) with the isolates of Phytophthora infestans which were collected and isolated at Fruit and Vegetable Research Institute From above 5 markers, a marker closely linked with Ph3 gene were used for identification Ph3 genotype and evaluate phenotype of 5 tomato cross combinations (V1, V2, V3, V4 and V5) that containing Ph3 gene Experiment were designed by randomized Complete Block with 3 replications of 5 tomato cross combinations above, in which V1 (Savior) was used as the control variety for testing.

Main findings and conclusions:

After assessing Ph3 genotype and resistant phenotype of 96 F 2 randomized individuals of cross combination (08TP03-15-3-1 x 08TP73-10-4), we have identified 2 markers closely linked to Ph3: LB3 marker and SCU602F3R3 marker with genetic distance of 2,3 cM and 3,1 cM , respectively This result is the basis for breeding tomato varieties containing Ph3 resistant gene through molecular marker The result of identification Ph3 genotype by using LB3 marker and testing tomato cross combinations containing Ph3 gene in the Spring Summer season at Gia Lam- Ha Noi shown that: V4 (08TP85-2-3-5-1-1-1-10 x 11FAV-10-3) is a promising variety containing Ph3 heterozygous genotype with many good characteristics such as infinite growth, average fruit weight reach 100 g, Brix ~ 3,5 %, actual yield reach 76.23 tons/ha, commercial yield reach 72.63 tons/ha and strongly resistant to studied isolate of Phytophthora infestans.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây cà chua (Solanum lycopersicum L.) thuộc họ Cà (Solanaceae) có nguồn gốc ở miền Trung, Nam và Bắc Mỹ là một trong những loại rau ăn quả được trồng rộng rãi và tiêu thụ phổ biến nhất hiện nay Diện tích trồng cà chua của Việt Nam trong 5 năm trở lại đây không có sự biến động nhiều, mỗi năm nước ta trồng khoảng 21-24 nghìn ha, với năng suất xấp xỉ 26 tấn/ha, chỉ bằng 60% so với năng suất trung bình của toàn thế giới (FAO 2015) Có nhiều nguyên nhân dẫn đến năng suất còn thấp chủ yếu là do chưa có giống tốt và kháng được nhiều sâu bệnh hại bệnh Trong đó đặc biệt là bệnh sương mai

là đối tượng gây hại phổ biến và tương đối nghiêm trọng cho cà chua trong giai đoạn trồng từ tháng 1 đến tháng 4 ở khu vực đồng bằng sông Hồng.

Bệnh sương mai (late blight) do nấm Phytophthora infestans gây ra là một trong những bệnh gây hại hủy diệt nhất ở hầu hết các vùng trồng cà chua và khoai tây trên toàn thế giới Bệnh có thể gây hại ở mọi thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây Nấm bệnh gây hại nhiều bộ phận của cà chua như: thân, lá, quả và hạt (Rubin et al., 2001; Rubin and Cohen, 2004a) Bệnh có thể tiềm ẩn và truyền qua đất, hạt giống và bào tử có khả năng phát tán được trong không khí Bệnh gây hại nghiêm trọng, ảnh hưởng lớn tới năng suất (có thể làm giảm năng suất tới 60- 70%) và làm giảm phẩm chất cà chua, khoai tây ở một số vùng của

Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai và Đà Lạt (Nguyễn Văn Viên, 1998) Để hạn chế bệnh, biện pháp phổ biến nhất đang được áp dụng hiện nay là phun thuốc trừ nấm Tuy nhiên, hiệu quả phun thuốc hóa học cũng có hạn chế do xuất hiện nhiều chủng nấm sương mai có khả năng kháng metalaxyl, một hoạt chất chính trong các loại thuốc trị bệnh sương mai Việc sử dụng các giống cà chua kháng bệnh sương mai cùng với việc thực hành quản lý cây trồng hiệu quả có thể cung cấp một môi trường an toàn, bền vững và giảm thiểu chi phí sản xuất liên quan đến phun thuốc trừ nấm (Wang et al., 2016).

Trên thế giới, những nghiên cứu ban đầu tính kháng bệnh sương mai trên cà chua đã phát hiện được một số gen kháng như gen Ph1 nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (Collard et al., 2005), gen Ph2 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 (Morgante and Olivieri, 1993), gen Ph3 nằm trên nhiễm sắc thể số 9 (Clayberg et al., 1965).

Gen Ph3 cung cấp tính kháng hàng loạt các isolate của tác nhân gây bệnh, do đó

nó chính là mục tiêu để các nhà chọn tạo giống đưa vào trong các giống thương mại thông qua nhiều chương trình chọn tạo giống cà chua khác nhau Một số chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 đã được công bố như các chỉ thị SCAR và chỉ thị CAPs (Robbins et al., 2010; Park et al., 2013; Trương Thị Hồng Hải và cs., 2013) Khoảng cách di truyền giữa gen với chỉ thị có thể thay đổi tùy theo vật liệu giống mang gen cụ thể Các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai đã được công bố trên nguồn vật liệu nghiên cứu khác nhau, mức độ liên kết cũng rất khác nhau Vì thế dựa trên những chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng Ph3 đã được công bố, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để xác định và lựa chọn lại những chỉ thị liên kết chặt và có độ chính xác cao ứng dụng trong chọn tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai trên nguồn vật liệu của chúng tôi.

Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai bằng chỉ thị phân

tử đã được thực hiện ở Viện nghiên cứu Rau quả trong những năm gần đây Kết quả đã xác định được gen Ph3 là một gen trội không hoàn toàn và kháng hữu hiệu được với nhiều chủng nấm gây bệnh sương mai, phân lập từ các vùng sản xuất cà chua chính của Việt Nam Các nhà khoa học của Viện cũng

đã lai tạo được 4 tổ hợp cà chua lai có chứa gen Ph3 kháng bệnh sương mai (Trịnh Khắc Quang và Trần Ngọc Hùng, 2012; Kết quả đề tài, 2009-2012) Tuy nhiên, trước khi đưa ra sản xuất thì cần phải so sánh với giống lai Savior và đánh giá lại những đặc điểm tốt để tuyển chọn được tổ hợp lai cà chua kháng bệnh sương mai, tiến tới công nhận giống và phát triển mở rộng ra sản xuất Xuất phát từ những lý do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 và khảo nghiệm các tổ hợp lai

cà chua mang gen Ph3 vụ Xuân Hè tại Gia Lâm-Hà Nội”.

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3 kháng bệnh sương mai cà chua, ứng dụng xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua và khảo nghiệm tuyển chọn được tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3

có năng suất cao, chất lượng tốt trong vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

-Đề tài tiến hành thí nghiệm trên các chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3 và các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3.

-Thời gian thực hiện: Vụ Xuân Hè năm 2017

-Địa điểm thực hiện: Viện Nghiên cứu Rau quả, Trâu Quỳ, Gia Lâm,

cà chua chứa gen kháng bệnh sương mai Ph3 chưa được nghiên cứu nhiều.

Hai chỉ thị phân tử LB3 và SCU602F3R3 liên kết chặt với gen Ph3 với lần lượt khoảng cách di truyền là 2,3 cM và 3,1 cM là cơ sở để các nhà chọn tạo giống cà chua sử dụng chọn lọc bằng chỉ thị phân tử đạt độ chính xác cao.

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Tổ hợp lai V4 lai giữa mẫu giống 08TP85-2-3-5-1-1-1-10 với 10-3 chứa gen Ph3 dị hợp tử kháng bệnh sương mai,có năng suất cao, chất lượng tốt góp phần phát triển sản xuất cà chua ở nước ta.

11FAV-PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ CHUA

2.1.1 Danh pháp và phân loại

Cà chua (Solanum lycopersicum L.) thuộc chi Lycopersicon Toum, họ cà Solanaceae Chi Lycopersicon Toum gồm hai chi phụ: Eriopersicon, và Eulycopersicon Chi phụ Eulycopersicon có loài L.esculentum Mill bao gồm các loài phụ sau: L.esculentum ssp Spontaneum (cà chua hoang dại), L.esculentum ssp Cultum (cà chua trồng) (Phạm Hồng Cúc, 2008) Họ Solanaceae bao gồm các cây rau quan trọng khác như ớt và ớt chuông (Capsicum ssp.), khoai tây (Solanum tuberosum), cà tím (Solanum melongena), cà chua xanh (Physalis ixocarpa) và thuốc lá (Nicotiana tabacum) Danh pháp phân loại của cà chua vẫn

là một vấn đề đang được tranh luận Vào năm 1753, nhà thực vật học Linnaeus gọi nó là Solanum lycopersicon; 15 năm sau Philip Miller thay thế bằng Lycopersicon esculentum (Taylor, 1986) Gần đây, các nhà phân loại học đã giới thiệu lại tên thường dùng cà chua là Solanum lycopersicon (Heuvelink, 2005).

2.1.2 Nguồn gốc, lịch sử và cách sử dụng cà chua

Theo các nhà nghiên cứu, tất cả các loài cà chua hoang dại có liên quan đều có nguồn gốc từ vùng Andean Tổ tiên nhiều khả năng nhất là cà chua hoang dại L.esculentum var Cerasiforme- loài bản địa trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nước Mỹ Cà chua ban đầu chỉ được trồng như cây cảnh: quả cà chua được xem như có chất độc bởi có quan hệ gần gũi với cà độc dược (Solanum dulcamara) Từ giữa thế kỷ 16, cà chua được trồng và tiêu thụ ở phía Nam châu Âu; tiếp đó là Trung Quốc, phía Nam và Đông Nam châu Á Một số sản phẩn từ cà chua đã được sản xuất và tiêu thụ vào cuối thế kỷ 19 như nước súp, nước chấm và nước sốt cà (Heuvelink, 2005).

Cà chua có thể được sử dụng để ăn tươi hay chế biến dưới nhiều dạng khác nhau Ba sản phẩm chính được chế biến từ cà chua đó là: (i) cà chua được bảo quản; (ii) cà chua khô dạng bột hay quả; (iii) thực phẩm chế biến từ cà chua Ngoài

ra, cà chua thường được sử dụng như một cây mô hình để nghiên cứu về đa dạng sinh học, tế bào học, hóa sinh học, nghiên cứu phân tử và di truyền bởi là

cây tự thụ phấn, sinh trưởng phát triển dễ dàng, chu trình sống ngắn

và dễ dàng để thao tác; nghiên cứu sinh lý và hóa sinh học về tình trạng ngủ nghỉ, quá trình nảy mầm và phát triển hạt (Heuvelink, 2005).

Ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng cà chua được du nhập từ thời Thực dân Pháp đô hộ (Nguyễn Văn Thắng và Bùi Thị Mỳ, 1996) Cà chua được trồng ngoài đồng ruộng, trong nhà kính, nhà lưới và thậm chí trong điều kiện không thuận lợi Thực tế, các hộ nông dân nước ta đã nhận thức rõ vai trò của cà chua và tăng diện tích trồng lên hàng năm song chủ yếu ở các tỉnh Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hà Nam và Nam Định (Hà Nội, 2001- 2003).

2.1.3 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và Việt Nam

2.1.3.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

Cà chua là cây rau ăn quả được trồng và tiêu thụ ở hầu hết các nước trên thế giới Chọn tạo giống cà chua được bắt đầu thực hiện ở châu Âu (Italia) khoảng 200 năm trước Ở Mỹ, chọn tạo giống cà chua được thực hiện vào những năm 70 của thế kỷ 19 (Stuber, 1994; Umaerus,1994) Năng suất cà chua ở

Mỹ tăng từ 10,1 tấn/ha trong những năm 20 của thế kỷ 20 đến 72,4 tấn trong những năm 90 và đến năm 2004 là 102,0 tấn/ha Đóng góp vào sự nhảy vọt về năng suất trên thì vai trò của công tác giống là 50%, còn lại là do tác động của các biện pháp kỹ thuật và đầu tư khác.Trong quá trình thuần hóa, chọn lọc giống, con người đã làm cho tính đa dạng nguồn gen bị xói mòn, tăng nguy cơ nhiễm nhiều loại sâu bệnh hại trong điều kiện môi trường bất thuận.

Sản lượng cà chua sản xuất ra liên tục tăng mạnh trong những năm gần đây Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) (bảng 2.1), diện tích cà chua sản xuất năm 2014 đạt 5.024 nghìn ha tăng 528 nghìn ha so với năm

2010 (đạt 4.496 ha) Tốc độ gia tăng về diện tích sản xuất chậm Sản lượng cà chua tăng 12,4% từ 151.895 nghìn tấn (2010) lên 170.751 nghìn tấn (2014) Mức gia tăng về sản lượng thấp là do sự tăng năng suất không đáng kể trong những năm vừa qua từ 33,7 tấn/ha (2010) lên 34,0 tấn/ha (2014).

Trong đó, đến năm 2014, châu Á có diện tích cà chua trồng lớn nhất thế giới chiếm trên 55%, tiếp đến là châu Phi chiếm khoảng 24%, châu Âu 10%, khu vực châu Mỹ 9% và các nơi khác là 10% (FAO, 2015).

Bảng 2.1 Diện tích và sản lượng cà chua trên toàn thế giới

giai đoạn 2012- 2014

Châu lục

Châu Phi Châu Mỹ Châu Á Châu Âu Châu Đại Dương Toàn thế giới

Theo số liệu thống kê FAO (2015), 5 nước có sản lượng cà chua lớn nhất lần lượt là Trung Quốc, Ấn Độ, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai Cập Trung Quốc là nước đứng đầu thế giới về diện tích sản xuất cũng như sản lượng cà chua tạo ra trong suốt giai đoạn từ 2012 đến nay Năm 2014, sản lượng cà chua của Trung Quốc đạt 52.723 tấn chiếm 31% tổng sản lượng cà chua thế giới, Ấn Độ đạt 11%, Thổ Nhĩ

Kỳ là 7% Trên thế giới, năng suất cà chua trung bình đạt trên 30 tấn/ha (năm 2013: 33,1 tấn; năm 2014: 34,0 tấn) Mức độ chênh lệch về năng suất thể hiện rõ rệt theo trình độ khoa học công nghệ và vùng lãnh thổ Mỹ là nước có năng suất

cà chua cao nhất, đạt 88,8 tấn/ha gấp 4,18 lần năng suất cà chua của Ấn Độ và 1,69 lần so với Trung Quốc năm 2014 (FAO, 2015).

Cà chua là mặt hàng xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới Mexico là nước đứng đầu trong xuất khẩu cà chua đạt 1.535 nghìn tấn, chiếm hơn 20% khối lượng xuất khẩu trên toàn thế giới (2013) (FAO, 2015).

2.1.3.2 Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cà chua đã và đang trở thành một loại rau ăn quả phổ biến với diện tích trồng hàng năm từ 20- 25 nghìn ha Theo thống kê năm 2016, diện

tích trồng cà chua trên cả nước là 23.868,6 ha tăng 1,09 lần so với năm 2012, với năng suất trung bình đạt 276,5 tạ/ha, tổng sản lượng đạt 655.442,1 tấn Bảng 2.2 Diện tích và sản lượng cà chua trên cả nước giai đoạn 2014- 2016

Bảng 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua một số tỉnh

trồng chính trên cả nước giai đoạn 2014- 2016

Tỉnh/Tp Diện

tích

(ha)

2016 Diện Năng Sản tích suất lượng (ha) (tạ/ha) (tấn)

Sản xuất cà chua ở nước ta có một số tồn tại chủ yếu: Chưa có bộ giống tốt cho từng vụ trồng, sản xuất còn manh mún, chưa có sản phẩm hàng hoá lớn cho chế biến công nghiệp So với các nước trong khu vực, sản xuất cà chua ở Việt Nam có lợi thế rõ rệt về khí hậu, thời tiết và đất đai; đặc biệt các tỉnh phía Bắc phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của cà chua Diện tích phát triển cà chua còn rất lớn vì trồng trong vụ đông, không ảnh hưởng đến 2 vụ lúa nhưng sản phẩm lại là trái vụ so với Trung Quốc Các vùng trồng cà chua đều có nguồn lao động lớn, nông dân có kinh nghiệm canh tác nên giá thành có khả năng cạnh tranh cao (Báo cáo tổng kết đề tài, 2001-2005).

Khu vực Hà Nội cà chua được trồng chủ yếu theo 3 vụ như sau (Báo cáo tổng kết đề tài, 2001-2005):

- Vụ Đông Xuân: Gieo tháng 10 – 11 và thu hoạch vào tháng 1 - 2 dương

8

lịch Cà chua tăng trưởng trong mùa khô, ấm áp nên phát triển tốt năng suất cao.Khó khăn chính là giá bán thấp và bị bệnh sương mai nặng khi thu hoạch.

-Vụ Xuân Hè: Gieo từ tháng 12 - 1 và thu hoạch tháng 3 - 4 dương lịch.

Cà chua tăng trưởng hoàn toàn trong mùa khô nhưng ra hoa kết trái trong những tháng nóng nhất trong năm Mặt khác, ở giai đoạn đầu vụ trời âm u, mưa phùn nhiều, số giờ nắng ít nên bệnh sương mai xuất hiện phá hại nặng.

-Vụ Hè Thu: Gieo từ tháng 6- 7 và thu hoạch tháng 9- 10 dương lịch Giống cà chua vụ này phải chịu nhiệt, chống virus, quả cứng, không nứt và có màu đỏ đẹp khi chín Đây là vụ cà chua khó làm nhưng giá bán được lại rất cao.

Trong giai đoạn từ năm 2011 đến nay, bộ giống cà chua đã có sự chọn lọc đáng kể, các giống cao sản có dạng bán hữu hạn, năng suất cao, phẩm chất quả tốt, như quả cứng, chín đỏ đẹp, đặc biệt là các giống có khả năng chịu nhiệt, kháng virus xoăn vàng lá, bệnh sương mai chiếm ưu thế (70,3%) Trong sản xuất, một số giống có dạng hình vô hạn đã được đưa vào sản xuất ở môt số vùng chuyên canh, có trình độ thâm canh cao (Đặng Văn Niên và cs., 2013).

2.2 NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SƯƠNG MAI TRÊN CÀ CHUA

Bệnh sương mai được phát hiện từ cuối thế kỷ 19 đã góp phần vào việc thiết lập bệnh học thực vật cũng như nghiên cứu mô tả Quần thể nấm Phytophthora infestans trên toàn cầu liên tục thay đổi, với sự xuất hiện của các chủng mới linh hoạt khiến bệnh sương mai đã và đang tiếp tục trở thành mối đe dọa của an ninh lương thực toàn cầu (Whisson et al., 2016).

2.2.1 Triệu chứng và dấu hiệu bệnh sương mai

Trên lá cà chua

Trên lá, vết bệnh xuất hiện đầu tiên ở đầu lá, mép lá hoặc gần cuống lá Các vết bệnh bắt đầu như những điểm không xác định, ngậm nước, khuếch rộng một cách nhanh chóng vào trong, làm màu xanh nhạt đi chuyển thành các vết bệnh màu đen- nâu nhạt và lan rộng ra diện tích lớn của lá Trong điều kiện thời tiết ẩm ướt, các vết bệnh trên bề mặt cuống lá có thể được bao phủ bởi mốc xám đến trắng (dễ nhầm lẫn với bệnh phấn trắng) Ở mặt dưới các vết bệnh lớn hơn, thường xuất hiện một vòng sinh trưởng của mốc của tác nhân gây bệnh trong thời tiết ẩm ướt Cùng với sự phát triển của bệnh, tán lá chuyển từ màu vàng, sang nâu, xoăn lá, teo lại và chết đi (Scot, 2008).

Trên thân cà chua

Vết bệnh ban đầu có hình bầu dục nhỏ hoặc hình dạng không đều đặn; sau đó lan rộng bao quanh, kéo dài dọc thân cành, màu nâu hoặc sẫm, hơi lõm và ủng nước Khi trời ẩm ướt, thân cành bị bệnh giòn, tóp nhỏ và dễ gãy Khi trời khô ráo vết bệnh không phát triển thêm, màu nâu xám, cây có thể tiếp tục sinh trưởng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).

Trên hoa cà chua

Trên hoa vết bệnh màu nâu hoặc màu đen xuất hiện ở đài hoa ngay sau khi nụ được hình thành Bệnh lan sang cánh hoa, nhị hoa

và cuống hoa làm cho cả chùm hoa bị rụng (Black et al., 1996b).

Trên quả cà chua

Trên quả vết bệnh có thể xuất hiện ở núm hoặc giữa quả, lúc đầu màu nâu nhạt, sau thành nâu đậm hoặc nâu đen, vết bệnh lan khắp bề mặt quả (Hà Nội, 2001-2003) Khi thời tiết ẩm ướt có thể xuất hiện một lớp mỏng các hệ sợi nấm trắng Các quả cà chua bị nhiễm bệnh có thể bị teo lại, rụng và không bao giờ chín (Scot, 2008) Hạt trong quả bệnh cũng bị hại, hạt bị bệnh nặng thường nhỏ hơn hạt khỏe, vết bệnh màu nâu chiếm một phần hoặc toàn bề mặt hạt Quả nếu

bị bệnh nặng sẽ thối rửa và hạt bị đen lại (Zhu et al., 2006).

Nguồn: https://usablight.org/node/29Hình 2.2 Triệu chứng bệnh sương mai trên thân, lá và quả cà chua

2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh sương mai (Late blight) do nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây hại trên các bộ phận thân, lá, quả cà chua và khoai tây ở mọi thời kỳ sinh trưởng Hiện tại, để phòng trừ bệnh người ta thường dùng thuốc hóa học Do nấm bệnh thường xuyên thay đổi tính độc nên hiệu quả của việc phòng trừ bằng thuốc hóa học ngày càng ít có tác dụng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).

Nấm Phytophthora infestans (Mont) de Bary thuộc bộ Peronosporales, lớp Phycomycetes, thuộc loại nấm di tản có hai dạng A1 và A2 tùy theo vùng sinh thái, chu kỳ phát triển hoàn toàn gồm giai đoạn sợi nấm, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính tạo ra bào tử trứng Nấm này sinh sản vô tính bằng bào tử phân sinh, dưới 2 hình thức nảy mầm trực tiếp và gián tiếp, muốn tồn tại phải có cây ký chủ Hình thức sinh sản hữu tính xuất hiện khi 2 dạng A1

và A2 cùng tồn tại, bào tử trứng có thể tồn tại trong tự nhiên không cần cây

ký chủ Những nghiên cứu về mối quan hệ giữa các dạng chủng sinh học của nấm với các giống cà chua chứa các gen kháng đã giúp chỉ ra phương hướng mới trong công tác phòng trừ bệnh bằng con đường tạo giống kháng bệnh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).

Nấm Phytophthora infestans có khả năng hình thành nhiều chủng khác nhau Dựa trên lý thuyết “gen đối gen”, Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề cho rằng nấm này ở Việt nam gồm có 16 chủng: chủng đơn và hỗn hợp Số lượng chủng nấm thay đổi tùy thuộc vào vùng sinh thái trồng trọt khác nhau Ý nghĩa chính của việc xác định chủng nấm là để xác định được một giống cà chua nhiễm và kháng với những chủng nấm ở một vùng sinh thái nhất định Từ đó thay đổi cơ cấu giống trong phạm vi tồn tại của chúng hoặc tiến hành lai tạo giống chống chịu bệnh cho vùng sinh thái đó (Kết quả đề tài 2001- 2005).

Về cấu tạo, sợi nấm sương mai có hình ống, đơn bào, nhiều nhân Thời

kỳ tiềm dục ở lá 2 ngày, quả là 3- 10 ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001) Quá trình xâm nhiễm của nấm bệnh bắt đầu khi bào từ nẩy mầm trực tiếp trên

mô của cây ký chủ, trong điều kiện có bề mặt nước và nhiệt độ trên 21 0 C (thích hợp 25 0 C) Sau xâm nhập, nấm phát triển nhanh ở nhiệt độ 22 0 C- 24 0 C Trên

35 0 C, nấm không phát triển được mà bảo tồn trong tàn dư thực vật, bùng phát gây hại khi gặp điều kiện thuận lợi (Fray et al., 1998, 2005).

Hình 2.3 Chu kỳ vòng đời của nấm Phytophthora infestans

Nguồn: https://usablight.org/lateblightNguồn bệnh truyền từ năm này qua năm khác bằng sợi nấm, bào

tử trứng trên tàn dư cây cà chua bị bệnh, sợi nấm còn tồn tại trong hạt

cà chua Trong thời kỳ cây sinh trưởng, bệnh lây lan phát triển nhanh chóng bằng bào tử phân sinh (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001) 2.2.3 Đặc điểm phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh

Các điều kiện thời tiết, đất đai, phân bón và kỹ thuật canh tác

có ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển và gây hại của bệnh trên đồng ruộng (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).

- Ảnh hưởng của thời tiết: Độ ẩm, lượng mưa, nhiệt độ và độ chiếu sáng hàng ngày có ảnh hưởng lớn đến sự phát sinh, phát triển của nấm bệnh sương mai cà chua Bệnh phát sinh, phát triển mạnh ở vụ Đông Xuân

và vụ Xuân Hè khi mưa phùn kéo dài Tiểu khí hậu trong ruộng cà chua tạo điều kiện phát sinh các ổ bệnh, từ đó lan ra ruộng và cánh đồng cà chua.

- Ảnh hưởng của đất đai: Đất đai liên quan đến chế độ nước, dinh dưỡng của cà chua và nguồn nấm bệnh Ở đất thịt, đất thấp trũng bệnh thường nặng hơn nơi đất cát, đất cao thoát nước Ở những vùng đất bạc màu bệnh có xu hướng nhẹ hơn so với những vùng đất màu mỡ.

- Ảnh hưởng của phân bón: Bón kết hợp giữa phân chuồng, phân vô cơ

(N, P, K) cân đối, hợp lý làm tăng sức chống chịu của cây với bệnh sương mai.

- Tính chống bệnh của giống: Các giống cà chua khác nhau có mức độ nhiễm kháng bệnh khác nhau.

- Thời vụ: Vụ cà chua trồng sớm bị bệnh mốc sương nhẹ, bệnh chỉ hại ở giai đoạn cuối khi thu hoạch Cà chua vụ Xuân Hè thường bị hại nặng giai đoạn vườn ươm đến khi cây ra hoa.

2.3 CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG

2.3.1 Chỉ thị phân tử

Chỉ thị phân tử có thể hiểu đơn giản chúng như các cột mốc nằm trên trình tự DNA trong hệ gen Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống hay một loài trong quần thể Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các locus gen hay gen quy định những tính trạng của cây trồng (Chen et al., 1997) Từ những năm 1980, công nghệ chỉ thị DNA được phát hiện và áp dụng nhiều vì các chỉ thị phát hiện gen này không nhạy cảm với môi trường, được tạo ra nhiều có thể dùng để theo dõi chọn lọc hầu hết các gen quy định các tính trạng nông học quan trọng và từ

đó giúp tăng đáng kể hiệu quả của chọn tạo giống cây trồng.

Chỉ thị phân tử dựa trên DNA là công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: phân loại học, chọn tạo giống thực- động vật và kỹ thuật

di truyền (Jonah et al., 2011) Chỉ thị DNA không bị giới hạn về số lượng, ổn định và không chịu tác động của các yếu tố môi trường cũng như các giai đoạn phát triển của thực vật Một chỉ thị DNA lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một chỉ thị phân tử nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và cs., 2001).

Chỉ thị DNA có ứng dụng đặc biệt nếu thể hiện sự khác biệt giữa các cá thể cùng loài hay khác loài dựa trên khả năng phân biệt giữa đồng hợp tử và dị hợp tử bao gồm : chỉ thị đa hình và chỉ thị đơn hình Chỉ thị đồng trội chỉ ra sự khác biệt về kích thước, ngược lại chỉ thị trội chỉ sự có mặt hay vắng mặt (Chunwongse et al., 1998) Chỉ thị DNA phân thành ba nhóm dựa vào phương

pháp phát hiện: Chỉ thị dựa trên cơ sở của phản ứng PCR, chỉ thị dựa trên cơ

sở lai DNA và chỉ thị dựa trên những chuỗi có trình tự lặp lại (Xu et al., 1997).

2.3.1.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA

Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism- Đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn)

Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người Trong chỉ thị RFLP, enzyme cắt giới hạn được sử dụng để cắt DNA genome thành nhiều mảnh DNA có độ dài khác nhau Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt giới hạn trong DNA bộ gen như đảo đoạn, thêm, mất đoạn DNA hoặc đột biến điểm tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc Vì vậy các đoạn DNA được cắt ra bởi những enzyme giới hạn sẽ có kích thước khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem xét các mẫu giống Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật lai với các đoạn DNA với mẫu dò (Botstein et al., 1980).

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, có khả năng biểu hiện ở tất cả các allen của cùng một locus gen Hạn chế của chỉ thị này là tốn nhiều thời gian

và công sức, đòi hỏi phòng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003).

2.3.1.2 Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở tái bản DNA

Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis đưa ra, giúp phát hiện sự đa hình DNA dựa trên

cơ sở nhân bản các đoạn DNA với số lượng lớn trong ống nghiệm.

Phương pháp

PCR Khái niệm

PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA trong ống nghiệm Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).

Nguyên tắc

Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gen quan

tâm bằng mồi đặc hiệu kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase như Taq DNA polymerase trong một chu trình nhiệt hợp lý Tác động của mồi được xem như yếu tố đánh dấu hoạt động của enzyme polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn dùng làm khuôn trong giai đoạn bắt cặp Mồi bên trái tác động trên sợi DNA chiều 3’- 5’ còn được gọi là mồi xuôi, mồi bên phải tác động trên sợi DNA chiều 5’- 3’ Tóm lại, khi các mồi kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong điều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đoạn DNA này

có thể sẽ được khuếch đại lên theo phản ứng chuỗi với enzyme polymerase (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005).

Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu

kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau (Hồ Thị Thùy Dương, 2002).

Bước 1: Biến tính (Denature): Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94- 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân

tử DNA mạch kép tách hoàn toàn thành 2 mạch đơn.

Bước 2: Bắt cặp (Annealing): Nhiệt độ được hạ thấp đến mức cho phép các mồi bắt cặp được với mạch khuôn dao động từ 55- 65 0 C, trong 30 giây- 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy T m của các mồi sử dụng.

Bước 3: Kéo dài (Extension)

Dưới tác động của enzyme DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn ở nhiệt độ 720C trong thời gian từ 30 giây đến vài phút.

Hình 2.4 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR

Nguồn: http://www.universe-review.ca

Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt nào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần Sự khuếch đại này có thể được tính như sau

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2 n (m: là số bản sao của chuỗi mã

hóa; n: là số chu kỳ).

Chỉ thị SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions-

Kỹ thuật nhân bản vùng chuỗi được mô tả (Park et al., 2010).

Chỉ thị SCAR là kỹ thuật nhân DNA bằng PCR tạo ra các đoạn DNA tại những locus nhất định sử dụng các mồi đặc thù SCAR được tiến hành bằng cách tách dòng sản phẩm PCR với các mồi ngẫu nhiên sau đó đọc trình tự hai đầu đoạn tách dòng Dựa vào trình tự hai đầu này để thiết kế cặp mồi với độ dài 15 đến 30bp để nhân băng đơn với kích thước tương

tự như phân đoạn được nhân dòng Sự đa hình được xác định bằng sự

có mặt hay vắng mặt của băng được nhân bản hoặc sự xuất hiện đa hình

về chiều dài đồng thời chuyển chỉ thị trội thành chỉ thị SCAR đồng trội.

Kỹ thuật SCAR được dùng để phân tích thư viện genome, xác định các locus gen đặc thù và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử.

Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs- Đa hình các đoạn DNA khuếch đại dùng mồi đơn ngắn ngẫu nhiên) (Nguyễn Đức Thành, 2014)

Cơ sở của kỹ thuật RAPD là nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR dùng các mồi đơn ngẫu nhiên, ngắn (thường dưới 10 nucleotide) để tạo ra sự đa hình các đoạn DNA Trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên với tỷ lệ GC tối thiểu là 40% (thường 50-80%), không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau Sản phẩm PCR- RAPD thường được phân tách trên gel agarose 1,5- 2,0% Kỹ thuật RAPD đơn giản, dễ thực hiện và không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu, có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung Hạn chế của kỹ thuật RAPD là sản phẩm PCR không ổn định, tạo ra các chỉ thị trội, không phân biệt được các cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử.

RAPD sử dụng nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền, đặc điểm của giống và đánh giá biến đổi di truyền, trong xác định loài và xác định con lai.

Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism- Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc) (Nguyễn Đức Thành, 2014)

Kỹ thuật AFLP được sử dụng để phát hiện đa hình DNA Phân tích AFLP

được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết vào mồi để nhân chọn lọc các đoạn DNA được cắt hạn chế Các cặp mồi thường tạo được từ 50-100 băng trong một phân tích Số lượng băng phụ thuộc vào số nucleotide chọn lọc trong tổ hợp mồi Kỹ thuật AFLP cho phép lấy DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào.

Phân tích AFLP hiệu quả với một số ưu điểm như: độ tin cậy và lặp lại cao; không cần thông tin về trình tự DNA của sinh vật nghiên cứu; khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình với một tổ hợp một trên một gel và có thể cho thấy các locus đặc thù; các số liệu có thể lưu giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh Tuy nhiên, AFLP phải trải qua nhiều bước; DNA cần phải sạch, không có các chất ức chế hoạt động của enzyme cắt hạn chế; đòi hỏi công sức và giá thành cao Kỹ thuật tạo ra chỉ thị trội, không phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử.

AFLP được sử dụng trong nghiên cứu lập bản đồ gen, đa dạng di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng giữa các kiểu gen có quan hệ gần, nghiên cứu cấu trúc di truyền nguồn gen và đánh giá phân hóa di truyền trong quần thể.

2.3.1.3 Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại

Chuỗi lặp lại có trật tự (Tandemly Repeated Sequence) là những trình tự lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng trong hệ gen và tính chất của chuỗi.

Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats- Sự lặp lại các trình tự đơn giản) Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989, là những đoạn DNA lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2-6 nucleotide, theo kiểu lặp lại ngắn và vài chục lần Các trình tự này tồn tại trong cơ thể sinh vật Eukaryote khá phổ biến, tùy từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn (Lê Thị Ánh Hồng, 2002).

Ưu điểm của chỉ thị SSR là dễ thực hiện, không tốn kém SSR là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém

mà mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài Tuy nhiên, SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài động hay thực vật Người ta sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen, xây dựng bản đồ liên kết gen, trong chọn lọc tính kháng bệnh, nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây

trồng, bệnh hại và sử dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ allen thuộc một locus.

Chỉ thị dựa trên các trình tự microsatellite cụ thể ở từng locus từ nhiều loài như xà lách (Lactuca sativa L.), đại mạch (Hordeum vulgare L.), và lúa gạo (Oryza Sativa L.) đã được công bố (Park et al., 2010).

Tiểu vệ tinh (Minisatellite)

Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6 nucleotide trở lên (thường vào khoảng 15 bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3

kb Không giống như DNA vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và thường thay đổi rất nhiều về kích thước (Armour and Jeffreys, 1992) Có 2 loại DNA tiểu vệ tinh Đó là DNA đầu mút nhiễm sắc thể và DNA tiểu vệ tinh siêu biến DNA đầu mút nhiễm sắc thể nằm ở vai nhiễm sắc thể, gồm một vài kilobase DNA tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng phụ đầu mút nhiễm sắc thể (Napvi et al., 1995).

2.3.2 Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cây trồng

Trong nông nghiệp, mục tiêu chính của các nhà chọn tạo giống cây trồng truyền thống là cải thiện các giống cây trồng hiện có, đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào một giống khác bằng phương pháp lai trở lại liên tục, chọn lọc các cá thể ưu tú trong quần thể phân ly từ thế hệ F 2 đến các thế hệ tiếp theo Phương pháp này rất tốn kém, mất nhiều thời gian và chịu tác động của yếu tố môi trường Sự ra đời của công nghệ chỉ thị DNA, chiến lược chọn giống nhờ chỉ thị phân tử đã giúp các nhà chọn giống thực vật và nhà di truyền học vượt qua nhiều vấn đề phải đối mặt trong chọn tạo giống truyền thống, chọn lọc một cách chính xác và hiệu quả hơn (Winter amd Kahl, 1995).

Chỉ thị phân tử hiện nay đã được sử dụng rộng rãi để theo dõi các locus

và các vùng genome trong một vài chương trình chọn tạo giống cây trồng, như chỉ thị phân tử liên kết chặt với một số lượng lớn các tính trạng nông học và tính kháng bệnh có sẵn ở các loài cây trồng chính Trong đó, chỉ thị DNA được tạo ra với số lượng lớn và rất hữu ích trong việc cải thiện giống cây trồng Chẳng hạn, những chỉ thị này đã được sử dụng rộng rãi để xây dựng bản đồ phân tử Sự liên kết của chúng với các gen/QTL kiểm soát các tính trạng kinh tế quan trọng cũng có thể được sử dụng trong một vài trường hợp gián tiếp chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) (Winter and Kahl, 1995).

Chỉ thị DNA cho phép nghiên cứu những biến đổi trong vật liệu di truyền của cơ thể sống ở cấp độ DNA Ngoài việc ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng

di truyền, trên cơ sở phân loại định danh và xác định kiểu gen của cá thể; chỉ thị DNA còn giúp nhà chọn giống xác định nhanh, sớm và chính xác bản chất di truyền của đối tượng cần chọn giống (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).

Cùng với sự tiến bộ của Công nghệ sinh học hiện đại đã phát hiện ra các chỉ thị về DNA đã trở thành công cụ đắc lực giúp các nhà di truyền chọn giống nghiên cứu một cách có hiệu quả về biến đổi di truyền trong quần thể

tự nhiên, xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và quan hệ tiến hóa giữa loài và những nghiên cứu chi tiết hơn phát hiện những thay đổi trong genome (Trần Thị Hòa và Luduwig Triest, 2000) Một vài ứng dụng khác của chỉ thị phân tử bao gồm sự du nhập gen thông qua quá trình lai lại, sự di truyền đặc tính, chẩn đoán di truyền, nghiên cứu tổ chức genome và phân tích sự phát sinh loài Ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật, chỉ thị SSR

đã được chứng minh và đề xuất như là sự lựa chọn của các chỉ thị trong số các chỉ thị phân tử hiện nay (Winter and Kahl, 1995).

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI

VÀ CHỌN TẠO GIỐNG CÀ CHUA KHÁNG BỆNH

2.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Tính kháng bệnh sương mai ở cà chua đã được phát hiện do 3 gen kháng chính quy định, hiện đang có ở các loài cà chua hoang dại quả đỏ S pimpinellifolium, bao gồm Ph1, Ph2 và Ph3, lần lượt nằm trên các nhiễm sắc thể cà chua số 7, số 10 và số 9 Gen kháng Ph1 là gen trội có khả năng kháng chuyên tính với chủng T-0, nhưng nhanh chóng bị vượt qua bởi sự xuất hiện chủng mới của mầm bệnh Gần đây, nấm Phytophthora infestans đang xuất hiện tồn tại chủng T-1 chiếm ưu thế, làm cho khả năng kháng của gen Ph1 không còn hiệu quả Gen trội không hoàn toàn Ph2 cung cấp tính kháng từng phần với một số isolate của chủng T-1 Gen kháng Ph2 làm chậm nhưng không ngừng được sự phát triển của nấm bệnh Hơn nữa, gen Ph2 thường mất tính kháng khi có sự xuất hiện của một số chủng mới linh hoạt hơn Gen Ph2 đã được định vị nằm giữa hai chỉ thị RFLP là CP105 và TG233 ở khoảng 8.4 cM Một gen kháng mạnh hơn là Ph3, đã được phát hiện ở loài cà chua S pimpinellifolium trong dòng L3707 và L3708 đang bảo tồn tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Rau Châu Á Hiện

nay, gen này kháng hữu ích hơn nhiều so với các gen Ph1 và Ph2, mang lại tính kháng trội không hoàn toàn trên diện rộng đối với các chủng Phytophthhora infestans của cà chua Gen Ph3 đã được định vị nằm gần chỉ thị RFLP TG591a (Dilip et al., 2015) Gen Ph3 trội không hoàn toàn, kháng tốt với chủng Pi-16, trong khi đó các gen kháng Ph1 và Ph2 không thể hiện tính kháng với chủng này Giống cà chua mang gen kháng Ph1 hay Ph2 không thể hiện khả năng kháng tốt đối với các chủng nấm sương mai tại Israel (Davis et al., 1996) Điều này chứng

tỏ các gen trên chỉ mang tính kháng chuyên tính với một hoặc một số chủng Phytophthora infestans nhất định Trái lại, do nấm bệnh này có khả năng sinh sản hữu tính tạo ra các dạng tái tổ hợp mới rất nhanh chóng nên giống cà chua mang gen kháng trên rất dễ bị nhiễm bệnh bởi các chủng mới Ngay sau đó, nghiên cứu của Chen et al (2008) chỉ ra rằng “Ph2 và Ph3 bổ sung cho nhau sẽ giúp tăng tính kháng với nhiều chủng nấm Phytophthora infestans gây bệnh hơn

so với khi chỉ có một trong hai gen đơn” Các nghiên cứu từ Trường Đại học Cornell cho thấy khi có mặt của gen kháng bệnh sương mai thứ hai ở L3708 đã tương tác lấn át đối với Ph3 Một vài chỉ thị liên kết với Ph3 được công bố gồm hai vùng trình tự đặc trưng được khuếch đại SCAR và chuỗi đa hình khuếch đại được cắt hạn chế CAPs (Zhu et al., 2006).

Phương pháp sử dụng nhiều gen, mỗi gen có vai trò nhất định liên quan đến tính kháng, nhằm tạo ra các giống cà chua kháng bệnh ổn định đã được nghiên cứu Một số QTL kháng bệnh sương mai đã được xác định trên loài cà chua dại Lycopersicon pimpinellifolium (Fray et al., 2005) Giống L3707 thể hiện tính kháng không chuyên tính với nấm Phytophthora infestans, được quy định bởi hai gen độc lập, trội không hoàn toàn, và thể hiện tương tác trội (Jones et al., 1997) Hầu hết nguồn gen kháng bệnh của cà chua được tìm thấy ở loài hoang dại đều có thể lai với

cà chua trồng Tuy nhiên, cũng gặp một số khó khăn do sử dụng loài xa nhau về di truyền như Lycopersicon chilense hay Lycopersicon peruvianum (Wang et al., 2016) Với phương pháp lai tạo giống truyền thống sẽ gặp nhiều khó khăn để sử dụng các gen trong loài hoang dại Các dạng dại thường thiếu các tính trạng cần thiết cho nhu cầu con người, năng suất thấp, chất lượng quả kém Để hạn chế hàng loạt các gen không cần thiết đi kèm với gen cần trong quá trình lai tạo, phương pháp lai lại với dạng trồng được sử dụng.

Chọn tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai ở Trung tâm Nghiên cứu

và Phát triển Rau Châu Á đã được bắt đầu từ năm 1993 Giống cà chua L3708

(Lycopersicon pimpinellifolium) được chọn lọc như là giống cho tính kháng bệnh sương mai, thể hiện tính kháng cao trên đồng ruộng và trong nhà kính

ở Tanzania và Đài Loan Bên cạnh đó, CL2037 cũng đã được sàng lọc từ quá trình lai lại giữa F 1 của tổ hợp lai Moneymaker × L3708 với Moneymarker Dòng cà chua được mã hóa CL2037B mang gen Ph3 đồng hợp tử đã được chọn lọc để nhân giống và thương mại hóa (AVRDC, 1999) Những nghiên cứu này đã tạo ra một bước ngoặt lớn về nguồn vật liệu cà chua kháng bệnh sương mai cho các nghiên cứu sau này.

Với sự trợ giúp của sinh học phân tử, bản đồ liên kết gen xác định được chính xác từng gen hay QTL và vị trí của nó trên nhiễm sắc thể Các QTL cần thiết sẽ được đưa vào cây trồng, các tính trạng không cần thiết

sẽ loại bỏ nhanh chóng trong quá trình chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (Tigchelaar, 1986) Trong những năm qua, bản đồ chỉ thị phân tử

đã được phát triển cho nhiều loại cây (trong đó có cà chua), thành công trong di truyền và chọn giống ứng dụng Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống cà chua nhằm cải thiện một số tính trạng nông học như tính kháng bệnh, nâng cao năng suất và chất lượng quả.

Đối với QTL kháng bệnh sương mai của cà chua cũng được một số tác giả nghiên cứu Brouwer et al (2004) đã sử dụng phương pháp bản đồ cách quãng kết hợp xác định được các QTL kháng bệnh sương mai trên cả 12 nhiễm sắc thể

ở cà chua, trong đó có 6 QTL ở quần thể BC- E (lb1a, lb2a, lb3, lb4, lb5b, lb11b)

và hai QTL trong quần thể BC- H (lb5ab, lb6ab) Tác giả kết luận rằng, một vài QTL kháng với Phytophthora infestans được phát hiện ở cà chua trùng với các

vị trí nhiễm sắc thể của các gen kháng đã được lập bản đồ trước đó và trùng với các QTL kháng Phytophthora infestans trên khoai tây, chứng tỏ có sự bảo tồn chức năng kháng trong họ cà Cũng trong năm 2004, nhóm tác giả đã sử dụng dòng NILs và sub- NILs để thực hiện “fine mapping” ba QTL lb4, lb5b, lb11b Kết quả cho thấy, các QTL kháng được phát hiện trong cả ba bộ của các dòng NIL Trong đó, lb4 định vị gần với chỉ thị TG609 và giữa hai chỉ thị TG182 và CT194 trên nhiễm sắc thể số 4 với quãng 6.9 cM; lb5b định vị với quãng 8.8 cM, giữa hai chỉ thị TG69a và TG413 trên nhiễm sắc thể số 5, rất gần với chỉ thị TG23; và lb11 định vị với quãng 15.1 cM trên nhiễm sắc thể số 11 giữa hai chỉ thị TG194 và TG400 với đỉnh nằm giữa hai chỉ thị CT182 và TG147 (Brouwer et al., 2004).

Bên cạnh đó, các chỉ thị DNA đã được dùng để đánh dấu và lập bản đồ

cho nhiều gen kháng bệnh, sử dụng các quần thể F2 hoặc quần thể lai lại

BC1 Mức độ liên kết giữa chỉ thị phân tử và gen kháng bệnh làm cơ sở cho việc chọn tạo giống thông qua phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử Bản đồ phân giải cao của cà chua được lập đầu tiên năm 1991 gồm 1030 chỉ thị RFLP và một số chỉ thị kiểu hình để định vị nhóm liên kết gen trên nhiễm sắc thể Các chỉ thị trên bản đồ này có thể ứng dụng trong bất kì quần thể nào trong loài Lycopersicon spp (Tanksley et al., 1992).

Chungwonse et al (2002) đã sử dụng quần thể F 2 của cặp lai CLN657 (nhiễm bệnh) × L3708 (kháng bệnh) để khảo sát 120 mồi AFLP cho thấy 5 mồi

có băng đặc trưng cho nguồn gen kháng bệnh và 1 mồi liên quan đến nguồn gen nhiễm bệnh Đồng thời, xác định được 1 chỉ thị RFLP là TG591 nằm trên nhiễm sắc thể số 9 liên kết với gen Ph3 (hình 2.5) (Chunwongse et al., 2002).

Hình 2.5 Vị trí của gen Ph3 trong bản đồ chỉ thị phân tử RFLP tại vai

dài của nhiễm sắc thể số 9

Nguồn: Botstein et al (2006)

Zhu et al (2006) đã phân tích “di truyền và xác định chỉ thị SSR liên kết với tính kháng bệnh sương mai trên cà chua” Nghiên cứu được tiến hành trên 241 cá thể trên quần thể F 2 từ phép lai giữa dòng cận giao thứ năm mẫn cảm với bệnh sương mai và một dòng kháng CLN2037E Kết quả cho thấy gen kháng bệnh sương mai Ph- ROL định vị ở nhiễm sắc thể số 9 với khoảng cách di truyền so với chỉ thị SSR TOM236 là 5.7 cM (Zhu et al., 2006).

Cũng với dòng kháng CLN2037, QIU et al (2009) đã tiến hành xác định chỉ thị RAPD liên kết với tính kháng bệnh sương mai trên cà chua Nghiên cứu được thực hiện trên quần thể F 2 gồm 147 cá thể từ phép lai giữa CLN2037 (dòng kháng) × T2- 03 (dòng mẫn cảm với bệnh) Kết quả cho thấy, chỉ thị CCPB272-03740 liên kết chặt với gen Ph3 với khoảng cách di truyền là 5.8 cM (Raposo et al., 1993) Tính kháng bệnh sương mai còn được tìm thấy

ở mẫu cà chua dại LA1033 (L.hirutum) (Kim and Mutschler, 2000) Tuy nhiên nhóm cà chua này có đặc điểm tự bất hợp nên gặp khó khăn khi lai với giống

cà chua trồng trọt Các gen kháng và QTL kháng bệnh sương mai đã được lập bản đồ liên kết trên các nhiễm sắc thể khác nhau (hình 2.6).

Hình 2.6 Bản đồ liên kết các gen (QTL) liên quan đến tính kháng bệnh sương mai của cà chua: LB-1 và LB-2- QTL kháng bệnh sương mai (Fray et al., 1998); Ph1, Ph2, Ph3- gen kháng bệnh

sương mai (Chunwongse et al., 2002).

Để có thể sử dụng được trong chọn tạo giống cà chua, Park et al (2010) xuất phát từ chỉ thị AFLP liên kết với gen Ph3 (Chunwonse et al.,2002) để

chuyển đổi thành chỉ thị SCAR Trong số 6 chỉ thị AFLP, chỉ có 1 chỉ thị (L87) được chuyển đổi thành công sang chỉ thị SCAR Tuy nhiên, chỉ thị này chỉ xác định được allen kháng bệnh, không xuất hiện allen nhiễm bệnh nên là chỉ thị trội và ít có ý nghĩa trong chọn tạo giống (hình 2.7) (Park et al., 2010).

Hình 2.7 Ảnh điện di của chỉ thị SCAR phát triển từ chỉ thị AFLP (L87) ( Park et al., 2010) (1- kháng bệnh, 2-6 nhiễm bệnh, 7-16 kháng bệnh) 2.4.2 Các nghiên cứu trong nước

Công tác chọn tạo giống rau của nước ta trải qua từng giai đoạn đã thay đổi về chất Từ năm 1968- 1985 chủ yếu là thu thập, khảo nghiệm và tuyển chọn giống; từ năm 1986- 1995 tập trung tạo giống thuần (giống cà chua Hồng Lan, CS1); từ năm 1996- 2000 quan trọng nhất là đã tạo ra giống cà chua lai chịu nóng

F 1 đầu tiên HT7; từ năm 2001- 2005 tiếp tục tiến hành nghiên cứu các giống cà chua chất lượng cao, một số giống cà chua F 1 đã được tạo ra Nhiều giống được công nhận cho phép phát triển ra sản xuất là do kết quả tuyển chọn các giống cà chua nhập nội (CS1, VT3, PT18, XH5 từ nguồn giống cà chua F 1 của trại nghiên cứu thuộc tập đoàn Syngenta ở Thái Lan), một số giống khác sử dụng phương pháp lai tạo truyền thống thông qua đánh giá biểu hiện kiểu hình của nguồn vật liệu ngoài đồng ruộng Trong từng giai đoạn, các giống mới đã giữ vai trò nhất định trong sản xuất (Trần Khắc Thi, 2004).

Những năm qua trong nhiều chương trình, dự án chọn tạo giống rau, các

cơ quan thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, trường Đại học đã đưa

ra một số giống cà chua mới vào sản xuất như: Giống cà chua phục vụ chế biến PT18 (Viện Nghiên Cứu Rau Quả), giống C95, VT3 (Viện Cây Lương Thực và Cây Thực Phẩm), các giống cà chua lai F 1 : FM20, FM29, lai số 4, lai số 9 (Viện

Nghiên Cứu Rau Quả), HT21 (Đại học Nông nghiệp Hà Nội) So với các giống cà chua truyền thống (Ba lan, Hồng Lan), các giống mới tạo ra thể hiện vượt trội về năng suất và chất lượng Điều đáng chú ý là hầu hết các giống được chọn tạo trên chưa hoặc ít chú ý đến tính kháng bệnh sương mai (Hà Nội, 2001-2003).

Trước thực trạng dịch bệnh đang phát triển mạnh mẽ, nghiên cứu phòng trừ bệnh sương mai ở nước ta chủ yếu tập trung vào tìm hiểu quy luật phát sinh, phát triển bệnh và đề ra các biện pháp phòng trừ (hóa học là chủ yếu) (Nguyễn Văn Viên

và Đỗ Tấn Dũng, 2008) Sử dụng giống kháng bệnh là một hợp phần quan trọng trong quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), nhưng chọn tạo giống kháng bệnh nói chung

và kháng bệnh sương mai trên cà chua nói riêng chưa được chú ý.

Ở nước ta, đã có một số nghiên cứu một số nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cũng đã và đang được tiến hành ở một vài Viện nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lâm nghiệp, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Viện nghiên cứu Rau quả (Báo cáo tổng kết đề tài KC06- 10NN, 2001- 2005).

Năm 2012, nước ta nhập khẩu khoảng 1.600 kg hạt giống cà chua (F 1 ) với hai giống chính là Savior và Anna Giống Savior được chọn tạo và thương mại bởi công ty Syngenta, sinh trưởng bán hữu hạn, thích hợp với vụ sớm ở khu vực sông Hồng, chống chịu bệnh xoăn vàng lá (mang gen Ty1), nhưng rất mẫn cảm với bệnh sương mai Qua điều tra 200 hộ sản xuất ở miền Bắc và 120 hộ ở miền Nam, cho thấy giống này đạt năng suất lần lượt 36 tấn và 42 tấn/ha Giống Anna do công ty Seminis phát triển và thương mại; chủ yếu được trồng ở Lâm đồng, sinh trưởng vô hạn cho năng suất cao (55 tấn/ha), dạng quả đẹp nhưng rất mẫn cảm với bệnh sương mai và xoăn vàng lá.

Nhận thức được vấn đề quan trọng của việc sử dụng giống chống chịu bệnh, bên cạnh các giống cà chua được đưa vào sản xuất, tại Viện Nghiên cứu Rau quả còn có trên 1000 dòng, giống cà chua đã xác định có các tính trạng quý: Kháng bệnh héo xanh vi khuẩn, kháng bệnh virus xoăn vàng lá, bệnh sương mai, chất lượng quả tốt Tại đây đã chọn tạo được một số dòng cà chua mang gen Ph3 ưu tú dựa trên chỉ thị phân tử và thể hiện tính kháng bệnh sương mai ngoài đồng ruộng Để tiếp tục tạo

ra sản phẩm hoàn thiện phục vụ cho sản xuất, cần nghiên cứu thêm về chỉ thị phân

tử để xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng Ph3 và phát triển giống cà chua mang gen Ph3 kháng bệnh sương mai.

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học

và khu đồng ruộng thuộc Viện Nghiên cứu Rau quả, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội.

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2017 đến tháng 10/2017 Thí nghiệm được tiến hành vào vụ Xuân Hè năm 2017.

3.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Đối tượng nghiên cứu bao gồm các mẫu giống cà chua nhập nội, các tổ hợp lai cà chua (F 1 , F 2 ) và gen Ph3 kháng bệnh sương mai của Viện nghiên cứu Rau quả (tên và nguồn gốc giống được liệt kê trong từng thí nghiệm cụ thể).

- Hóa chất phục vụ nghiên cứu được đặt mua của hãng Sigma

và Fermentas Các cặp mồi đặt mua từ công ty Invitrogen cung cấp.

- Thiết bị sử dụng như máy PCR, máy điện di, máy nghiền, máy

ly tâm, tủ định ôn… tại Viện Nghiên cứu Rau quả.

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

-Khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử.

-Xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng bệnh sương mai cà chua Ph3.

-Ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen kháng Ph3 xác định kiểu gen Ph3 của các tổ hợp lai cà chua.

-Đánh giá năng suất, đặc điểm nông sinh học và tình hình sâu bệnh của các tổ hợp lai cà chua mang gen Ph3 ở vụ Xuân Hè tại Gia Lâm- Hà Nội.

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3

3.5.1.1 Phương pháp khảo sát sự đa hình với gen Ph3 của các chỉ thị phân tử

a Mẫu giống

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các giống cà chua kháng, chống chịu và nhiễm bệnh sương mai tiến hành thí nghiệm như danh sách trong bảng 3.1:

Bảng 3.1 Danh sách các giống cà chua nghiên cứu

Nguồn: DNA này sẽ được dùng để khảo sát các chỉ thị phân tử liên

kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai

b Chỉ thị phân tử

Sử dụng 5 chỉ thị phân tử đã được xác định từ các nghiên cứu trước đó bao gồm TOM236 (Zhu et al., 2006), SCU602F3R3 (Trương Thị Hồng Hải và cs, 2015) và 3 chỉ thị còn lại là SSR383, SSR69, LB3 (Kết quả đề tài, 2009-2012) Các chỉ thị lựa chọn tập trung trên vai dài nhiễm sắc thể số 9, gần vị trí chỉ thị TG591 (chỉ thị RFLP).

Hình 3.1 Vùng khảo sát chỉ thị phân tử liên kết với gen Ph3

trên nhiễm sắc thể số 9

c Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách chiết DNA được thực hiện sử dụng mẫu lá non giai đoạn 2 đến 3 lá thật phục vụ xác định chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Ph3, theo phương pháp của Dorokhov and Klocke (1998), có cải tiến.

Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Để kiểm tra độ tinh sạch của DNA, tiến hành điện di trên gel agarose 1% Dưới tác dụng của điện trường, do tích điện âm nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Đoạn DNA nào lớn thì di chuyển chậm, ngược lại đoạn DNA ngắn sẽ di chuyển nhanh và tách nhau ra Do

đó có thể phân tách được các đoạn DNA trong hỗn trên gel agarose.

d Thực hiện phản ứng PCR với các cặp mồi liên kết với gen Ph3 kháng bệnh sương mai và các mẫu giống khác nhau

Phản ứng PCR qua 5 chỉ thị nghiên cứu xác định trên các mẫu giống được liệt kê trong bảng 3.1 Thành phần mỗi phản ứng 10µl như bảng 3.2 dưới đây:

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với mồi

Hóa chất Nước (Di H2O)

Đệm (Buffer 10X)

dNTPs (10mM)

Mồi xuôi (F- Primer 50µM)

Mồi ngược (R- Primer 50µM)

Taq Polymerase (5U/µl)

DNA mẫu (20ng/µl)

Tổng thể tích

Sau khi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành

đặt chương trình chạy cho máy Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước 1

2

3 Bảo quản

( * ): Nhiệt độ gắn mồi- có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi cụ thể

- Kiểm tra kết quả điện di sản phẩm PCR của từng chỉ thị Điện di trên gel

agarose1,5%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dưới hiệu điện thế 160V trong 70

phút Sau đó, các băng DNA được quan sát khi đưa vào máy Geldoc.

3.5.1.2 Phương pháp xác định mức độ liên kết của chỉ thị phân tử thông

qua đánh giá sự tương đồng giữa kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh

Trong thí nghiệm này lựa chọn trong 5 chỉ thị phân tử đã công bố liên kết