Xác định các gen alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa việt nam

TRÍCH YẾU LUẬN ÁNTên Tác giả: Phùng Thị Phương Nhung Tên Luận án: Xác định các gen-alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa Việt Nam Chuyên ngành: Di truyền và Ch

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả nghiên cứuđược trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được sử dụng đểbảo vệ bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Phùng Thị Phương Nhung

LỜI CẢM ƠN

Tác giả luận án xin trân trọng cảm ơn: Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, BanQuản lý Đào tạo, Khoa Nông học, Bộ môn Di truyền và Chọn giống cây trồng; Viện Ditruyền Nông nghiệp, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, PhòngThí nghiệm Liên kết Việt - Pháp (LMI - Rice); Trung tâm Tài nguyên Thực vật; Trungtâm Hợp tác Quốc tế Nghiên cứu Nông nghiệp vì sự Phát triển (CIRAD - Pháp), đã tạođiều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin cảm ơn: Học bổng GRiSS - Chương trình Đối tác Nghiên cứu Lúa gạoToàn cầu (GRiSP), Trung tâm Hợp tác Quốc tế Nghiên cứu Nông nghiệp vì sự Pháttriển (CIRAD - Pháp),Viện Nghiên cứu Phát triển (IRD - Pháp), “Chương trình Trọngđiểm Phát triển và Ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và PTNTđến năm 2020” - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam, đã tài trợ kinh phícho các phần nghiên cứu của tôi

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: GS.TS Đỗ Năng Vịnh, GS.TS Pascal Gantet những người thầy đã chỉ bảo, định hướng khoa học cho nghiên cứu của tôi, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này.

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của tôi đến TS Brigitte Courtois, người đã trựctiếp hướng dẫn, tập huấn cho tôi các kỹ năng về phân tích hệ gen, phân tích đa dạng ditruyền, sử dụng các phần mềm tin sinh học và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trìnhthực tập của tôi tại CIRAD - Pháp

Tôi xin chân thành cảm ơn: Các thầy cô, đồng nghiệp đã quan tâm, giúp đỡ,động viên và đóng góp nhiều ý kiến cho việc hoàn thành luận án này; Các cộng tác viên,

kỹ thuật viên, tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Phòng Thínghiệm Liên kết Việt - Pháp, Viện Di truyền Nông nghiệp; Bộ môn Quản lý Ngân hànggen - Trung tâm Tài nguyên Thực vật; Phòng Nghiên cứu Di truyền - CIRAD - Pháp, đãgiúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm và hoàn thành luận án này

Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn các thành viên trong gia đình, người thân,bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện và hoànthành luận án này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả luận án

Phùng Thị Phương Nhung

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận án ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3

1.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 4

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5

Phần 2 Tổng quan tài liệu 6

2.1 Vai trò và đặc điểm bộ rễ ở lúa 6

2.1.1 Vai trò của bộ rễ ở cây lúa 6

2.1.2 Đặc điểm cấu trúc của bộ rễ lúa 7

2.1.3 Đặc điểm phát triển của bộ rễ lúa 10

2.2 QTLs và gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ lúa 12

2.2.1 Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ lúa 12

2.2.2 Các gen liên quan đến sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa 16

2.3 Nguyên lý và ứng dụng của GBS 24

2.3.1 Phương pháp giải trình tự NGS – nền tảng của GBS 24

2.3.2 Nguyên lý của phương pháp GBS 28

2.3.3 Các ứng dụng của GBS trong chọn giống cây trồng 33

2.4 Nguyên lý và ứng dụng của GWAS 35

2.4.1 Nguyên lý 35

2.4.2 GWAS là một công cụ mới hữu hiệu 36

2.4.3 Các bước xây dựng một nghiên cứu GWAS 38

2.4.4 Ý nghĩa và tiềm năng của GWAS trong chọn tạo giống lúa 42

2.5 Nguồn gen lúa và tình hình nghiên cứu bộ rễ lúa ở Việt Nam 44

2.5.1 Nguồn gen lúa Việt Nam 44

2.5.2 Tình hình nghiên cứu đặc điểm bộ rễ lúa ở Việt Nam 45

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 48

3.2 Thời gian nghiên cứu 48

3.3 Vật liệu nghiên cứu 49

3.4 Nội dung nghiên cứu 49

3.5 Phương pháp nghiên cứu 51

3.5.1 Đánh giá đặc điểm nông sinh học 51

3.5.2 Chiết tách ADN tổng số 52

3.5.3 Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT 52

3.5.4 Phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS) 55

3.5.5 Phân tích cấu trúc di truyền của tập đoàn mẫu giống nghiên cứu 56

3.5.6 Xác định mức độ phân rã của Linkage Disequilibrium 57

3.5.7 Phương pháp đánh giá kiểu hình bộ rễ 57

3.5.8 Lập bản đồ liên kết (GWAS) 60

3.5.9 Phương pháp xác định các gen ứng viên 61

Phần 4 Kết quả và thảo luận 62

4.1 Đặc điểm của bộ sưu tập giống lúa 62

4.1.1 Đặc điểm thu được qua thông tin hồ sơ mẫu giống 62

4.1.2 Đặc điểm nông sinh học cơ bản 63

4.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền với chỉ thị DART 68

4.2.1 Kết quả phân tích đa hình và cấu trúc di truyền 68

4.2.2 Xây dựng cây phân loại cho các mẫu giống lúa nghiên cứu 69

4.3 Kết quả phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS – Genotyping By Sequencing) 72 4.3.1 Kết quả phân tích đa hình và cấu trúc di truyền với SNPs marker 72

4.3.2 Đặc điểm của các mẫu giống lúa trong các phân nhóm khác nhau 75

4.3.3 Kết quả phân tích Linkage Disequilibrium (LD) 82

4.4 Kết quả đánh giá kiểu hình các tính trạng liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở các mẫu giống nghiên cứu 86 4.4.1 Kết quả phân tích phương sai và các thống kê cơ bản 86

4.4.2 Kết quả phân tích thành phần chính cho các tính trạng nghiên cứu 97

4.5 Kết quả phân tích liên kết toàn hệ gen (GWAS) 100

4.5.1 Các QTLs liên kết với tính trạng liên quan đến sự phát triển bộ rễ 100

4.5.2 Các gen ứng viên liên quan đến đặc điểm phát triển bộ rễ 113

4.5.3 Điểm đặc biệt của vùng QTLs liên kết với NCR trên NST số 11 119

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 129

5.1 Kết luận 129

5.2 Kiến nghị 130

Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án 131

Tài liệu tham khảo 132

DANH MỤC BẢNG

3.1 Các giống lúa được dùng để xây dựng thư viện DArT markers 544.1 Phân nhóm mẫu giống theo thời gian sinh trưởng 644.2 Phân nhóm mẫu giống theo số nhánh hữu hiệu 654.3 Đặc điểm hình dạng hạt của các mẫu giống lúa Việt Nam trong bộ sưu

tập giống nghiên cứu 674.4 Chỉ số FST giữa các phân nhóm và mức ý nghĩa P-value 754.5 Đặc điểm của các phân nhóm trong hai nhóm giống thuộc loài phụ indica

và japonica 814.6 Sự phân rã của LD trên 12 nhiễm sắc thể trong nhóm giống indica và

japonica 834.7 Kết quả phân tích ANOVA và hệ số di truyền theo nghĩa rộng của các

tính trạng nghiên cứu 874.8 Các giá trị thống kê cơ bản của các tính trạng liên quan đến đặc điểm

phát triển bộ rễ ở các mẫu giống nghiên cứu 884.9 Giá trị thống kê cơ bản của các tính trạng nghiên cứu theo 2 nhóm giống

indica (ind) và japonica (jap) 914.10 So sánh giá trị trung bình của các tính trạng giữa các phân nhóm thuộc

nhóm giống indica và japonica 944.11 Hệ số tương quan giữa các tính trạng theo dõi ở cả tập đoàn và riêng cho

từng nhóm giống indica và japonica 954.12 Danh sách các QTLs đã xác định được với P-value < 1E-04 ở cả tập đoàn

và hai nhóm giống indica và japonica 1024.13 Các QTLs liên kết với nhiều hơn một tính trạng nghiên cứu ở cả tập đoàn

và hai nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica và japonica 1114.14 Danh sách các gen ứng viên đã được khẳng định về vai trò và chức năng

đối với sự phát triển bộ rễ 1154.15 Các giống lúa có kiểu hình tương phản và haplotype khác biệt tại vùng

QTLs liên kết chặt với tính trạng NCR trên NST số 11 1224.16 Danh sách các gen nằm trong vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng

NCR trên NST số 11 125

DANH MỤC HÌNH

2.1 Thành phần rễ cấu trúc nên bộ rễ lúa 8

2.2 Cấu trúc xuyên tâm của rễ lúa 9

2.3 Tổ chức mô theo chiều dọc và mô hình phân chia tế bào ở rễ lúa 10

2.4 Số lượng QTLs liên kết với đặc điểm bộ rễ ở lúa trên các vùng nhiễm sắc thể 14

2.5 Các bước giải trình tự theo phương pháp Sanger (a) và NGS (b) 27

2.6 Các bước chính trong quá trình thực hiện GBS 29

2.7 So sánh phương pháp xác định QTLs truyền thống và GWAS 37

3.1 Sơ đồ tổng quát quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu 50

3.2 Sơ đồ các bước thực hiện phân tích đa dạng di truyền với DArT 53

3.3 Các chỉ tiêu và vị trí thu thập số liệu các tính trạng liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống nghiên cứu 59

4.1 Đặc điểm phân bố của 214 mẫu giống lúa Việt Nam sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 63

4.2 Biểu đồ tần số phân bố mẫu giống lúa theo chiều cao cây 66

4.3 Tỷ lệ và số lượng các mẫu giống chia theo tính chất nội nhũ 67

4.4 Thành phần kiểu gen của các mẫu giống nghiên cứu 69

4.5 Cây phân loại di truyền của 270 mẫu giống với 241 DArT marker 70

4.6 Phân bố của GBS marker trên 12 nhiễm sắc thể và hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của chúng trong ma trận haplotype chuẩn bị cho nghiên cứu GWAS 73

4.7 Các phân nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica 77

4.8 Các phân nhóm trong nhóm mẫu giống thuộc loài phụ japonica 80

4.9 Sự phân rã LD theo khoảng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST ở nhóm giống indica 84

4.10 Sự phân rã LD theo khoảng cách vật lý giữa các cặp marker trên 12 NST ở nhóm giống japonica 85

4.11 Hình ảnh biểu diễn mối tương quan giữa thân và rễ của 194 mẫu giống trong tập đoàn sử dụng phần mềm RASTA 89

4.12 Tần số phân bố của một số tính trạng nghiên cứu trong hai nhóm loài phụ indica và japonica 93

4.13 Vòng tròn tương quan xây dựng bằng phân tích thành phần chính (PCA) cho các tính trạng nghiên cứu 98 4.14 Phân bố của các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu trên mặt phẳng

4.15 Hình biểu diễn QQ-Plot cho cả tập đoàn và hai nhóm giống thuộc loài

phụ indica và japonica 1014.16 Manhattan Plot của tính trạng số lƣợng rễ (NCR) ở cả tập đoàn và hai

nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica và japonica 1074.17 Manhattan Plot của tính trạng độ dày rễ (THK) ở cả tập đoàn và hai

nhóm mẫu giống thuộc loài phụ indica và japonica 1084.18 Tỷ lệ các dạng alen ở các vị trí đánh dấu xung quanh q45 121

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên Tác giả: Phùng Thị Phương Nhung

Tên Luận án: Xác định các gen-alen đặc thù liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các

giống lúa Việt Nam

Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số: 9 62 01 11

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Sự phát triển của các nghiên cứu Lập bản đồ liên kết toàn hệ gen Genome-wide Association Study) ở cây trồng đã mở ra khả năng khai thác các gen/alen

(GWAS-có vai trò quan trọng trong sinh trưởng, phát triển của cây ẩn giấu trong nguồn tài

nguyên di truyền thực vật trong các ngân hàng gen Lúa (Oryza sativa L.) là một cây

trồng quan trọng với nguồn gen phong phú, nhưng cho đến nay chỉ một phần rất nhỏ sự

đa dạng nguồn gen lúa ở các quốc gia được khai thác trong các nghiên cứu GWAS.Luận án được thực hiện nhằm phát triển một tập đoàn các giống lúa Việt Nam phục vụcho nghiên cứu GWAS, từ đó xác định các QTLs/gen ứng viên liên quan đến sự pháttriển bộ rễ của các giống lúa Việt Nam

Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

Một bộ sưu tập gồm 270 giống lúa trong đó có 214 giống lúa Việt Nam đã đượcgieo trồng và đánh giá về các đặc điểm nông sinh học cơ bản Sau đó, các giống nàyđược chiết tách ADN và được phân tích đa dạng di truyền với chỉ thị DArT (sử dụng

6144 marker) Kết quả phân tích đa dạng di truyền với DArT, tập đoàn nghiên cứu được

chia làm 2 nhóm giống thuộc loài phụ indica và japonica Kết hợp các đặc điểm nông

sinh học và cây phân loại lựa chọn được 200 giống lúa không có sự trùng lặp về kiểugen để làm vật liệu cho các nghiên cứu phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS).Kết quả phân tích GBS đã xây dựng được một ma trận haplotype đáp ứng yêu cầu củamột nghiên cứu GWAS bằng cách loại bỏ các marker có tỷ lệ “Minor Allele” nhỏ hơn5% và khôi phục dữ liệu bị thiếu Tập đoàn 200 giống lúa này cũng được đánh giá kiểuhình bộ rễ trong điều kiện nhà lưới có mái che, sử dụng phương pháp ống rễ với 3 lầnnhắc lại Nghiên cứu GWAS được thiết lập trên cơ sở dữ liệu kiểu gen GBS và dữ liệuđánh giá kiểu hình bộ rễ, sử dụng mô hình phân tích hỗn hợp có sự điều chỉnh tỷ lệdương tính giả dựa trên cấu trúc quần thể (Q) và quan hệ họ hàng (K), để xác định cácliên kết quan trọng Các phân tích GWAS được tiến hành trên 3 ma trận dữ liệu được

thành lập cho: 1) cả tập đoàn gồm 185 mẫu giống, 2) nhóm giống indica gồm 115 mẫu giống, 3) nhóm giống japonica gồm 64 mẫu giống.

Kết quả chính và kết luận

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Bộ dữ liệu đa hình kiểu gen với 25971 SNPs phân bố trong toàn hệ genđã

được công bố là cơ sở để phát triển các nghiên cứu GWAS liên quan đến các tính trạng nông sinh học quan trọng khác.

- Đề tài đã khám phá ra các QTLs/ gen ứng viên liên kết với các tính trạng chínhđóng vai trò quan trọng trong sự phát triển bộ rễ ở một tập đoàn nguồn gen lúa ViệtNam Kết quả này là cở sở thúc đẩy các nghiên cứu tiếp theo nhằm làm rõ mạng lướicác gen liên quan đến quá trình điều khiển sự phát sinh, phát triển bộ rễ ở lúa

- Trong chọn tạo giống lúa, các QTLs/SNPs/gen ứng viên liên quan đến các đặcđiển nông sinh học đã được xác định thông qua GWAS trong luận án sau khi được hoạthóa và xác nhận bởi các nghiên cứu chức năng gen sẽ được đưa vào các chương trìnhchọn giống nhằm tăng cường khả năng thích nghi và năng suất lúa trong tương lai

Kết luận

2) Đề tài đã đánh giá được sự đa dạng về đặc điểm hình thái và đặc điểm nôngsinh học cơ bản của 270 mẫu giống lúa, trong đó có 214 mẫu giống lúa Việt Nam Đồngthời đánh giá được sự đa dạng di truyền của các mẫu giống lúa trên thông qua sử dụng

241 chỉ thị DArT Kết quả xây dựng được cây phân loại di truyền có cấu trúc lưỡng

cực, trong đó 168 mẫu giống thuộc loài phụ indica, 88 mẫu giống thuộc loài phụ japonica, còn lại là các dạng trung gian Aus/Bros và Sadri/Basmati.

3) Kết quả về phân tích kiểu gen thông qua giải trình tự (GBS) đã xây dựng được

bộ dữ liệu haplotype với 25971 chỉ thị cho đa hình, hàm lượng thông tin đa hình (PIC)trung bình đạt 32,0% Sử dụng số lượng lớn các chỉ thị SNPs trong bộ dữ liệu này để

phân tích cấu trúc và đa dạng di truyền của nhóm giống indica, japonica ở Việt Nam cho thấy 114 mẫu giống lúa indica Việt Nam được phân thành 6 phân nhóm từ I1 đến I6, 62 mẫu giống japonica Việt Nam được phân thành 4 phân nhóm từ J1 đến J4 với

phân nhóm I1 và I4 cũng như J2 và J4 có biểu hiện kém ở các tính trạng này Đặc biệt

đã xác định được một số giống lúa có bộ rễ dài và dày thuộc phân nhóm I3 có ý nghĩatrong chọn giống như: Blề Blậu Chớ (G205), Tẻ nương (G153), Khẩu Năm Rinh

(G189), Khẩu Pe Lạnh (G155)

5) Đã xác định được 88 QTLs liên kết với 18 tính trạng nghiên cứu, trong đó có

28 QTLs đồng thời liên kết với nhiều hơn một tính trạng, 33 QTLs nằm trong vùng trình

tự của gen chức năng, 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng số lượng rễ (NCR) trênNST số 11, và 1 vùng QTLs liên kết chặt với độ dày rễ (THK) trên NST số 2 Căn cứ vịtrí của QTLs, xác định được 889 gen ứng viên, trong đó có 407 gen đã được xác định

và phân nhóm chức năng giả định, 24 gen trong số này đã có các công bố chứng minhchức năng hóa sinh và sinh học liên quan đến sự phát triển bộ rễ

THESIS ABSTRACT

PhD Candidate: Phung Thi Phuong Nhung

Thesis title: Identification of new genes and alleles associated with root development in

a core collection of rice varieties in Vietnam

Major: Genetic and Plant breeding Code: 9.62.01.11

Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

The development of Genome-wide Association Study (GWAS) in crops hasmade it possible to mine interesting alleles hidden in gene bank resources However,only a small fraction of the rice genetic diversity of any given country have beenexploited in the studies with worldwide sampling conducted to date The thesis aimed todevelop a panel of Vietnamese rice varieties for GWAS purposes for identifying somenew QTLs and candidate genes associated with root development

Materials and Methods

The panel, initially composed of 270 rice accessions (214 Vietnamese ricevarieties), was characterized for agronomic traits (maturity class, grain shape andendosperm type) commonly used to classify rice varieties We first genotyped the panelusing DArT markers (Diversity Array Technology) (6144 clones) We analyzed the

panel structure, identified two subpanels corresponding to the indica and japonica

sub-species and selected around 200 non-redundant accessions for Genotyping BySequencing (GBS) (with 50000 marker) A matrix adapted for GWAS was built byeliminating the markers with a minor allele frequency below 5% and imputing themissing data The panel of 200 rice varieties was phenotyped under greenhouseconditions for several root traits in an experimental design with 3 replicates The resultswere submitted to association mapping using a mixed model involving structure andkinship to enable the identification of significant associations The analyses were

conducted successively on the whole panel (185 accessions) and on its indica (115 accessions) and japonica (64 accessions) subpanel.

Main findings and Conclusions

Scientific and practical significance

The publicly available panel constitutes an imprortant resource giving access tooriginal allelic diversity It will be use for GWAS on root, panicle traits, grain and yieldtraits, or abiotic stress adaption

Some of the major QTLs detected through this GWAScontain promisingcandidate genes encoding regulatory elements of known key regulators of rootformation and development

In rice breeding, major QTLs and candidate SNPs, candidate genes associatedwith such agronomy traits, identified though GWAS in this thesis (after confirmed byfunctional studies and validations), have been deployed to enhance adaption andproductivity of rice in future.

Conclusions

1) The studied rice varieties showed a significantdiversity in agronomic traitssuch as plant height, flowering time, branching, effective branching, growth duration,grain shape andendosperm characteristics The 270 rice varieties exhibited genetic

diversity with bipolar structure, mainly indica (168 germplasms), and japonica (88 germplasms), the remaining were Aus/Boros and Sadri/Basmati.

2) GBS analysis produced a set of genetic data consisting of a polymorphicmatrix of 25971 markers species with nearly 200 Vietnamese rice varieties The PICvalue of these markers was 32% in average Population structure analysis with SNP

markers divided indica group into 6 sub-populations (from I1 to I6) and japonica into 4

sub-populations (from J1 to J4) Each group had its own unique characteristics ofagronomic traits, ecological regions and source of collection

3) The phenotypic assessment provided a set of phenotypic data of 18 traitsdirectly or indirectly related to rice root development in 194 rice varieties The mean

comparisons showed that subpopulations I3 and I6 in the indica subpanel and subpopulations J1 and J3 in the japonica subpanel had the deepest, longest and thickest

roots while subpopulations I1 and I4 as well as J2 and J4 registered the poorest

performances in this respect The indica types from group I3 constitute interesting

donors of deep and thick root that may be used as parents in crosses in root breedingprogrames, example: Ble Blau Cho (G205), Te Nuong (G153), Khau Nam Rinh (G189),Khau Pe Lanh (G155)

4) Identified 88 significant QTLs for 18 traits, of which 28 QTLs commonacross traits for the three panels, 33 QTLs were in genes with predicted functions Thetwo associations with the highest significance were for crown root numbers (NCR) onchromosome 11 and for root thickness (THK) on chromosome 2 Based on the location

of QTLs, LD was calculated, 899 candidate genes were identified in the high confidenceregion of 88 QTLs, of which 407 genes were identified function in hypothetical and 24genes were reported for biological function in consistent with the associated phenotype,

the rice gene or its predicted Arabidopsis ortholog.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chính nuôi sống hơn một nửa dân

số thế giới Tổng diện tích gieo trồng của lúa trên toàn thế giới trong 10 năm gầnđây dao động trong khoảng 156 đến 161,7 triệu hecta (STATISTAT, 2018) Câylúa được gieo trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới với nhiều hệ sinh thái khácnhau (tưới tiêu, nước trời ở đồng bằng, ngập nước, nương rẫy vùng cao) So vớicác cây trồng khác, cây lúa có nhu cầu nước lớn hơn Sự thích nghi với các chế

độ thủy văn khác nhau trở thành một trong những đặc điểm của giống tích lũyqua quá trình thuần hóa và chọn lọc tự nhiên Ngày nay, trước những diễn biếnphức tạp khó kiểm soát của Biến đổi khí hậu toàn cầu (BĐKH), các cây trồng đặcbiệt là cây lúa đang đứng trước nguy cơ bị tổn hại nghiêm trọng về năng suất vàsản lượng do những ảnh hưởng của hạn, mặn, và ngập lụt kéo dài

Bộ rễ đóng vai trò quan trọng trong đời sống cây lúa, giúp cây bám vào đất,hút nước, dinh dưỡng và nhiều hoạt động trao đổi chất khác ảnh hưởng trực tiếpđến khả năng sinh trưởng, phát triển, năng suất, đặc biệt là khi cây gặp các điềukiện ngoại cảnh bất lợi Một bộ rễ có khả năng ăn sâu, rễ dày và khả năng phânnhánh rộng có thể giúp cây lúa khai thác được nước từ những lớp đất sâu hơntrong điều hiện hạn hán (Fukai and Cooper, 1995; Gowda et al., 2011) Bộ rễ

hoạt động tốt hơn trong điều kiện ngập nước sẽ giúp tăng khả năng chống chịu

và duy trì năng suất lúa trong điều kiện ngập lụt (Bailey-Serres and Voesenek,2010) Tạo ra những giống lúa có kiểu hình bộ rễ phù hợp với mỗi điều kiện gieotrồng là mục tiêu của các nhà chọn tạo giống lúa trong bối cảnh diễn biến phứctạp của BĐKH nhưng rất khó thực hiện vì những hạn chế trong quan sát trực tiếp

bộ rễ Hiểu biết về các yếu tố di truyền có liên quan đến các đặc điểm phát triển

và thích nghi của bộ rễ là cơ sở để phát triển và ứng dụng phương pháp chọn lọcphân tử trong các nghiên cứu chọn tạo, cải tiến bộ rễ lúa

Trong những năm gần đây nghiên cứu về rễ cây trồng nói chung và lúa nóiriêng ngày càng được quan tâm Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng

để khám phá các yếu tố di truyền liên quan đến bộ rễ lúa, như phương pháp gâyđột biến (Guiderdoni and Gantet 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013),

phương pháp phân tích sản phẩm phiên mã (transcriptomic) (Takehisa et al.,

et al., 1995; Kamoshita et al., 2008; Khowaja et al., 2009) Nhiều gen liên quan

đến đặc điểm hình thái và chức năng sinh lý của rễ đã được xác định, mở ra cơ

hội để cải tiến năng suất ở lúa (Coudert et al., 2010; Orman-Ligeza et al., 2013;

Mai et al., 2014; Wu and Cheng, 2014) Hàng trăm QTLs liên quan đến các tínhtrạng bộ rễ lúa đã được công bố trên các quần thể lập bản đồ khác nhau (Courtois

et al., 2009) Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của các QTLs được thiết lập bằng các

quần thể lập bản đồ là độ dài của đoạn NST mang QTLs/gen ứng viên có kíchthước rất lớn (Courtois et al., 2009) Mặt khác, số lượng alen được đánh giá

trong mỗi nghiên cứu xác định QTLs sử dụng quần thể lập bản đồ rất hạn chế,thời gian nghiên cứu kéo dài (Buckler and Thornsberry, 2002)

Phương pháp GWAS (Genome-wide Association Study) xuất hiện lần đầutiên trong một nghiên cứu di truyền ở người (Hirschhorn and Daly, 2005) sau sựkiện giải trình tự hệ gen người thành công GWAS nhanh chóng được đưa vào

các nghiên cứu ở thực vật, đặc biệt là ở các cây mô hình như Arabidopsis (Atwell et al., 2010) Bản chất của GWAS là thiết lập mối quan hệ thống kê liên kết giữa sự dao động của các tính trạng định lượng phức tạp với các kiểu gen

trong quần thể (Nordborg and Weigel, 2008) Bằng việc sử dụng số lượng chỉ thịlớn, mật độ cao, bao phủ toàn hệ gen và sử dụng các quần thể tự nhiên có sự suygiảm liên kết mất cân bằng một cách nhanh chóng, GWAS đã mạnh mẽ cải tiến

độ phân giải tại mỗi vị trí QTLs xuống còn từ 1 đến vài chục kilo-base thay vìđược tính bằng mega-base trong các nghiên cứu trước đó (Buckler andThornsberry, 2002;Zhu et al., 2008) Những QTLs đầu tiên liên quan đến sự phát

triển của bộ rễ lúa được xác định bằng phương pháp GWAS đã được công bốtrên các tạp chí uy tín (Clark et al., 2013; Courtois et al., 2013), cho thấy tiềm

năng ứng dụng của phương pháp này trong nghiên cứu di truyền các tính trạngliên quan đến sự phát triển bộ rễ ở lúa

Sự tiến bộ và ngày càng hoàn thiện của công nghệ phân tích hệ gen thônglượng cao, sự phát triển các hệ thống phương pháp luận và phần mềm phân tích,

là điều kiện thúc đẩy ngày càng nhiều các nhà khoa học lựa chọn sử dụng GWAStrong các nghiên cứu của mình (Zhu et al., 2008) Các bộ dữ liệu kiểu gen đại diện cho sự đa dạng của về địa lý của Oryza đã được xây dựng (Tung et al.,

2010; Courtois et al., 2013) và được sử dụng trong GWAS với các tính trạng rễ

lúa (Famoso et al., 2011; Courtois et al., 2013) Mặc dù các tác giả đã sử dụng

quần thể có kích thước khá lớn (từ 200 đến 400 mẫu giống), nhưng vẫn chỉ khaithác được một phần nhỏ sự đa dạng của lúa trên thế giới

Nền văn minh Việt Nam gắn liền với cây lúa nước Các giống lúa địaphương Việt Nam khá đa dạng (Đoàn Thanh Quỳnh và cs., 2016) Tuy chưaphản ánh hết sự đa dạng của lúa trên thế giới nhưng những nguồn gen lúa địaphương, đáng chú ý là từ những vùng có điều kiện địa lý, sinh thái khác nhau cóthể mang các tính trạng, các QTLs, các gen có ý nghĩa quyết định trong các tínhtrạng nông học quan trọng cần được khám phá, khai thác (Myint et al., 2012;

Radanielina et al., 2013) Đây là nguồn tài nguyên quý giá để xác định các yếu tố

di truyền kiểm soát sự phát triển bộ rễ và khả năng chống chịu với các stress phi

sinh học ở cây lúa Xác định các QTLs/gen ứng viên liên quan đến sự phát triển

rễ ở các giống lúa Việt Nam sẽ cung cấp nền tảng quan trọng để làm sáng tỏ cơchế phân tử về sự phát triển bộ rễ và tạo điều kiện để cải tiến khả năng chốngchịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi ở lúa

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

- Lựa chọn các mẫu giống phù hợp để phát triển bộ dữ liệu kiểu gen và dữliệu kiểu hình phục vụ cho các nghiên cứu GWAS thông qua khảo sát sự đa dạng

về đặc điểm nông sinh học cơ bản và di truyền của một tập đoàn các mẫu giốnglúa Việt Nam

- Xây dựng bộ dữ liệu kiểu gen (haplotype) của tập đoàn mẫu giống đượcchọn, làm cơ sở dữ liệu để phát triển các nghiên cứu GWAS với các tính trạngquan tâm

- Xây dựng bộ dữ liệu kiểu hình của một số tính trạng chính liên quan đến

sự phát triển bộ rễ của các mẫu giống lúa được chọn, làm cơ sở cho nghiên cứuGWAS liên quan đến sự phát triển bộ rễ của các giống lúa Việt Nam

- Sử dụng phương pháp GWAS để lập bản đồ liên kết toàn hệ gen, từ đóxác định các QTLs và gen ứng viên liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cácgiống lúa Việt Nam

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở một tập đoàn gồm 214 mẫu giốnglúa được thu thập từ nhiều vùng của Việt Nam, 33 mẫu giống lúa đối chứng đại

diện cho đa dạng của Oryza sativa trên thế giới do CIRAD cung cấp và 23 mẫu

giống khác được cung cấp bởi Viện Di truyền Nông nghiệp Các mẫu giống đãđược đánh giá về các đặc điểm nông sinh học cơ bản và đa dạng di truyền bằngchỉ thị DArT Các giống có sự trùng lặp về kiểu gen và kiểu hình sẽ bị loại bỏ,

các giống còn lại được lựa chọn để thiết lập bộ dữ liệu kiểu gen và dữ liệu kiểu hình phục vụ cho phát triển các nghiên cứu GWAS.

- Một tập đoàn gồm 200 mẫu giống lúa được chọn đã được phân tích kiểugen bằng 50000 chỉ thị SNPs, sử dụng phương pháp phân tích kiểu gen thôngqua giải trình tự GBS, và được đánh giá biểu hiện của 18 tính trạng chính liênquan đến sự phát triển bộ rễ

- Phân tích GWAS được tiến hành đồng thời trên 3 ma trận dữ liệu cho tất cả

tập đoàn (185 mẫu giống x 21623 marker), nhóm giống indica (115 mẫu giống

x 13842 marker), nhóm giống japonica (64 mẫu giống x 8821 marker).

- Kết quả nghiên cứu giới hạn ở mức xác định được các QTLs/gen ứng viênliên quan đến sự phát triển bộ rễ của các mẫu giống lúa Việt Nam trong tập đoànnghiên cứu

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đã khảo sát và đánh giá một cách có hệ thống các đặc điểm nông sinh học

cơ bản của tập đoàn 270 giống lúa, trong đó có 214 giống lúa Việt Nam

- Đã xác định được mức độ đa dạng di truyền và cây phân loại của một tậphợp nguồn gen lúa Việt Nam bằng một lượng lớn chỉ thị hiện đại như DArT vàSNPs marker

- Sử dụng phương pháp GBS xây dựng được bộ dữ liệu kiểu gen với 25971SNPs marker, bao phủ toàn hệ gen với mật độ cao, là cơ sở để phát triển nghiêncứu GWAS với các mục tiêu khác nhau (năng suất, cấu trúc bông, khả năngchống chịu với sâu bệnh và điều kiện bất lợi) trên tập đoàn lúa nghiên cứu

- Luận án đã cung cấp một bộ dữ liệu gồm các thông số, thông tin của 18tính trạng chính liên quan đến sự phát triển bộ rễ của hơn 190 mẫu giống lúa ViệtNam

- Kết quả lập bản đồ liên kết toàn hệ gen (GWAS) cung cấp một danh sáchgồm 88 QTLs liên kết với 18 tính trạng theo dõi, trong đó có 33 QTLs nằm trongvùng mã hóa gen chức năng, 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng số lượng rễ(NCR) ở NST số 11 và 1 vùng QTLs liên kết chặt với tính trạng độ dày rễ (THK)

ở NST số 2 Xác định được 889 gen ứng viên, trong đó có 407 gen đã được xácđịnh và phân nhóm chức năng giả định, 24 gen trong đó đã có những công bố

chứng minh chức năng hóa sinh và sinh học liên quan đến sự phát triển bộ rễ

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Những đóng góp về đặc điểm nông sinh học cơ bản, đặc điểm phát triển

bộ rễ, đa dạng di truyền của các giống lúa trong luận án sẽ mở rộng và nâng caonhững hiểu biết về sự đa dạng của nguồn gen lúa Việt Nam cũng như thế giới Là

cơ sở để lựa chọn vật liệu cho các chương trình chọn tạo giống lúa

- Bộ dữ liệu kiểu gen gồm hơn 25000 SNPs marker được đăng tải trên trangTropGenDB là nguồn dữ liệu mở, có thể được cung cấp cho các nhà khoa họckhác để tiếp tục phát triển các nghiên cứu GWAS trên tập đoàn nghiên cứu vớinhiều mục tiêu khác như: xác định các QTLs liên quan đến khả năng chống chịu,năng suất, chất lượng, cấu trúc bông,…

- Dữ liệu thông tin về đặc điểm bộ rễ có ý nghĩa tham khảo và là cơ sở lựa chọn vật liệu cho các chương trình lai tạo giống cải tiến tính trạng bộ rễ ở lúa

- Kết quả của luận án cung cấp một danh sách các QTLs/gen ứng viên cóliên quan đến sự phát triển bộ rễ ở các giống lúa Việt Nam, bổ sung thêm thôngtin hữu ích và chi tiết giúp các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu di truyền bộ rễlúa ở Việt Nam và trên thế giới có hiểu biết toàn diện, chính xác và đầy đủ hơn vềmạng lưới các gen liên quan Đặc biệt, những đặc điểm riêng biệt của các giốnglúa Việt Nam có thể mang đến những phát hiện mới, đặc trưng, mà các nghiêncứu sử dụng các nguồn vật liệu lúa khác trên thế giới không thể tìm thấy

- Nhìn chung, luận án cung cấp một mô hình áp dụng những công nghệ, kỹthuật hiện đại trong phân tích hệ gen để đưa vào khai thác đa dạng nguồn gen lúaViệt Nam, làm rõ mối quan hệ giữa kiểu gen và kiểu hình, nhằm khai thác cácgen/alen đặc thù ẩn trong nguồn gen đó Kết quả của luận án mở ra con đườngtriển vọng trong khai thác hệ gen để ứng dụng vào các chương trình chọn giốngphân tử tạo ra các giống lúa có bộ rễ thích hợp làm tăng khả năng thích ứng vớicác điều kiện ngoại cảnh bất lợi

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 VAI TRÕ VÀ ĐẶC ĐIỂM BỘ RỄ Ở LÚA

2.1.1 Vai trò của bộ rễ ở cây lúa

Bộ rễ là cơ quan đặc biệt quan trọng với cây lúa, có chức năng bám giữgiúp cho cây đứng vững và khai thác, vận chuyển nước, chất dinh dưỡng cungcấp cho cây trong quá trình quang hợp Ngoài ra, bộ rễ còn có các chức năng thứcấp khác như dẫn truyền, tổng hợp các chất điều hòa sinh trưởng, chất dự trữtrong cây Sự tổng hợp các chất hữu cơ này rất quan trọng đối với quá trình sinhtrưởng và phát triển ở cây lúa Việc giải phóng các chất hữu cơ từ rễ có thể làmthay đổi các đặc tính vật lý, hóa học và sinh hóa của đất ở bên trong vùng rễ (Wuand Cheng, 2014) Bộ rễ rất nhạy cảm, nó cảm nhận và phản ứng lại với cácstress phi sinh học và sinh học, và giao tiếp với các bộ phận trên mặt đất thôngqua các kênh tín hiệu bởi các hoocmon (Bailey-Serres and Voesenek, 2010;Parent et al., 2010; Zhao et al., 2012; Hong et al., 2013; Sun et al., 2014) Bộ rễ

còn góp phần điều chỉnh độ dẫn khí, đồng thời ảnh hưởng đến tư thế của lưỡi lá

và hiệu suất quang hợp dưới sự tác động của điện trở đất, dinh dưỡng, các điềukiện bất lợi như hạn hoặc mặn (Wu and Cheng, 2014)

Với vai trò khai thác nước và các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinhtrưởng phát triển của toàn bộ cây, đặc điểm cấu trúc và hoạt động của bộ rễ cótính quyết định đến toàn bộ quá trình sinh trưởng phát triển và năng suất của cácgiống lúa Bộ rễ có thể có nhiều cơ chế khác nhau để tác động vào quá trình hìnhthành, tích lũy và duy trì năng suất ở cây lúa, nhất là khi đối mặt với các yếu tốbất lợi (Yang et al., 2012; Jeong et al., 2013; Ju et al., 2015) Mặt khác, nhiều

nhà khoa học cũng cho rằng cây lúa có bộ rễ ăn sâu hơn, số lượng rễ bất địnhnhiều hơn, đường kính rễ lớn hơn, và khả năng phân nhánh tốt hơn có thể có khảnăng chống chịu tốt hơn với điều kiện hạn hán do khả năng khai thác nước củachúng được tăng lên (Fukai and Cooper, 1995; Gowda et al., 2011).

Tầm quan trọng của bộ rễ trong đời sống cây lúa được nhìn nhận toàn diệntrong nhiều nghiên cứu, ở nhiều khía cạnh khác nhau Các kết quả đã công bố là

cơ sở để khẳng định không thể bỏ qua các tính trạng liên quan đến bộ rễ trongcác nghiên cứu chọn tạo giống lúa, đặc biệt là trong các chương trình chọn tạogiống lúa chống chịu với các stress sinh học và phi sinh học hiện nay

2.1.2 Đặc điểm cấu trúc của bộ rễ lúa

Bộ rễ lúa mang những đặc điểm điển hình của bộ rễ chùm ở các cây ngũ cốc

một lá mầm (Coudert et al., 2010) Đặc điểm hình thái học, giải phẫu học, quá

trình hình thành và phát triển bộ rễ lúa đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

từ nhiều năm nay Theo mô tả của Reboillat et al (2009), bộ rễ lúa được thiết lập

chủ yếu từ 5 loại rễ chính gồm: rễ mầm (radicle – ra), rễ bất định mọc trong giaiđoạn nảy mầm (embryonic crown root – ecr), rễ bất định hình thành từ đốt thânđầu tiên trên mặt đất của cây lúa sau khi quá trình nảy mầm kết thúc (crown root– cr), rễ bên lớn và rễ bên nhỏ Rễ bất định mọc trong giai đoạn nảy mầm (ecr) làcác rễ bất định phát sinh trong khoảng thời gian cây lúa xuất hiện lá thật thứ nhất

và lá thật thứ 2, tức là sau nảy mầm từ 2-3 ngày Rễ bên lớn (lager lateral root –llr) được hình thành từ rễ chính, có đường kính nhỏ hơn, nhưng có cấu tạo giảiphẫu gần giống rễ chính Rễ bên nhỏ (small lateral root –slr) có đường kính rấtmảnh, chiều dài ngắn hơn Hình 2.1 mô tả cụ thể từng loại rễ cấu trúc nên một bộ

xuyên tâm này đảm bảo rễ lúa có thể phát triển tốt trong cả điều kiện hảo khí vàyếm khí Đặc biệt, các mô khí có khả năng trao đổi khí với thân cây lúa khi câysinh trưởng và phát triển trong điều kiện yếm khí Ngoài ra, ở phần đầu của chóp

rễ có một vùng nằm ở trung tâm của mô phân sinh rễ được gọi là QC (QuiescentCenter), đây là một vùng tế bào đặc biệt (Hình 2.3), chúng phân chia rất chậmhoặc không phân chia, nhưng sẽ khôi phục trạng thái hoạt động và dịch chuyểntheo dạng đường kinh tuyến khi các tế bào xung quanh chúng bị tổn thương

(Coudert et al., 2010) Đặc điểm, chức năng và hoạt động của các loại mô này đã

được mô tả và chứng minh trong nhiều nghiên cứu, và được tổng hợp bởi

Rebouillat et al (2009).

Chú thích: (a) Hình thái bộ rễ lúa ở giai đoạn 1 tuần sau nảy mầm của giống lúa Nipponbare (b) Hình thái bộ rễ lúa ở 40 ngày sau nảy mầm (c) Hình ảnh của một rễ bất định ở cây lúa 40 ngày sau nảy mầm Các ký hiệu: ra – rễ mầm, ecr – rễ bất định xuất hiện trong giai đoạn nảy mầm, cr- rễ bất định, llr – rễ bên lớn, slr – rễ bên nhỏ Tỷ lệ kích thước: (a) tương đương 1cm, (b) tương đương 5cm,

(c) tương đương 1cm.

Hình 2.1 Thành phần rễ cấu trúc nên bộ rễ lúa

Nguồn: Rebouillat et al (2009)

Chú thích: (a) Hình giải phẫu lát cắt ngang của một rễ chính, điểm cắt cách đầu rễ 2 cm, được nhuộm bởi formandehyde safranin glycerin acetic axit; lignins bắt màu đỏ, cellulose bắt màu xanh (b) Phóng to phần trung trụ (c) Chi tiết của một phloem (d) Sơ đồ tóm tắt cấu trúc xuyên tâm của rễ lúa Ký hiệu tương ứng: ep, epidermis (biểu bì); ex, exodemis (ngoại bì); sc, sclerenchyma layer (lớp cương mô); me, mesodermis (lớp vỏ); ae, aerenchyma (tế bào mô khí); en,endodermis (nội bì); pe, pericycle (trụ bì);

mx, metaxylem (xylem);cmx, center metaxylem;pp, protoploem; cc, companion cells; mp, metaphloem;

pc, endodermis passage cell; px, protoxylem; ph, phloem Kích thước chuẩn: (a) 50 µm; (b) 25 µm; (c) 5

µm; (d) 50 µm.

Hình 2.2 Cấu trúc xuyên tâm của rễ lúa

Nguồn: Rebouillat et al (2009)

Chú thích: (a) Hình giải phẫu phần chóp rễ theo chiều dọc, các phần mô tương ứng với tên được mã hóa theo bảng màu tương ứng (b) Hướng phân hóa tế bào từ tế bào mô phân sinh (vùng được giới hạn bằng nét đứt) thành các loại mô khác nhau Các chữ viết tắt: xyl = xylem, st = Stele tissues (phloem),

pe = pericycle (trụ bì), en = endodermis (nội bì), co = Cortex (vỏ), scl = Sclerenchyma (lớp cương mô),

ex = Exodermis (lớp vỏ), ep = epidermis (biểu bì), QC = Quiescent Center (trung tâm tĩnh)

Hình 2.3 Tổ chức mô theo chiều dọc và mô hình phân chia tế bào ở rễ lúa

Nguồn Coudert et al (2010)

Trải qua quá trình tiến hóa, di thực và chọn lọc tự nhiên trong suốt hơn 10.000năm (Sweeney and McCouch, 2007), cây lúa đã có những biến đổi để thích nghirộng rãi với nhiều loại môi trường sinh thái và điều kiện gieo trồng khác nhau (canhtác có tưới tiêu, canh tác nước trời trên đất thấp, canh tác nương rẫy, canh tác ởvùng đất ngập nước, và vùng ngập mặn ven biển) cũng như với các mức đầu tưkhác nhau của các hộ nông dân trong thực tế sản xuất Hiện nay, đã có tới trên100.000 giống lúa khác nhau đang được lưu giữa trong Ngân hàng gen lúa quốc tếtại Viện Nghiên cứu Lúa gạo Quốc tế (IRRI) - Philippines Một phần nhỏ các giốngtrong ngân hàng gen này đã được nghiên cứu đánh giá kiểu hình rễ, kết quả cho thấycác kiểu gen nghiên cứu có sự biến đổi về kiến trúc bộ rễ theo giống và điều kiệnkhác nhau của môi trường sống (O'Toole and Bland, 1987; Lafitte et al., 2001).

Điều này có thể liên quan đến các cơ chế di truyền khác nhau tác động đến quá trìnhhình thành và phát triển bộ rễ ở cây lúa

2.1.3 Đặc điểm phát triển của bộ rễ lúa

Cây lúa có bộ rễ chùm đặc trưng cho các cây họ Hòa thảo Khi hạt lúa nảymầm thì rễ mầm (radicle) sẽ xuất hiện Rễ mầm không ăn sâu, chỉ dài khoảng

15cm, trên bề mặt rễ mầm rất ít rễ bên, nhưng các lông hút rất phát triển Rễmầm chủ yếu làm nhiệm vụ hút nước cung cấp cho phôi phát triển trong quátrình nảy mầm của hạt và sẽ chết sau 10-15 ngày, lúc cây mạ được 2-4 lá thật(Nguyễn Đình Đệ, 2009) Sau khi mầm xuất hiện khoảng 2-3 ngày, sẽ có khoảng

5 rễ bất định đâm ra từ đốt lá bao mầm, chính được gọi là “Embryonic CrownRoot” - ECR, quá trình này diễn ra trong suốt thời gian xuất hiện lá thật thứ nhất

và thứ hai (Rebouillat et al., 2009) Các rễ bất định sau đó mọc ra từ đốt thân

chính hoặc từ các đốt thân của các nhánh lúa được gọi là “crown root” – CR Sốlượng rễ bất định CR gấp nhiều lần rễ bất định mọc ở giai đoạn nảy mầm (ECR),chịu trách nhiệm chính trong việc hoàn thành chức năng của bộ rễ lúa, do đó sựhình thành và phát triển của rễ CR có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong đời sốngcây lúa Đây là lý do khiến các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứu về rễ

CR (Inukai et al., 2005; Kitomi et al., 2011; Gao et al., 2014).

Sự xuất hiện của rễ CR và số lượng rễ CR có liên quan trực tiếp đến hoạtđộng đẻ nhánh của cây lúa Quy luật phát sinh rễ và hoạt động đẻ nhánh ở cây lúa

đã được nghiên cứu bởi Yoshida et al (1982) Theo đó, khi lá thứ n xuất hiện, thì

rễ sẽ bắt đầu đâm ra từ đốt thứ (n-3) Mỗi đốt thường có thể phát sinh

5-25 rễ Có hai vòng rễ trên một đốt thân, rễ phát sinh từ vòng rễ trên to và khỏe, rễphát sinh từ vòng rễ dưới nhỏ và kém quan trọng hơn (Yoshida and Hasegawa,1982) Trong quá trình sinh trưởng sinh dưỡng, các đốt thân này thường xếp rấtxít nhau và nằm ở dưới mặt đất, do đó bộ rễ hình thành dạng chùm

Ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây lúa, mức độ phát triển của bộ

rễ cũng rất khác nhau Bộ rễ lúa phát triển và đạt kích thước tối đa về khối lượngcũng như về biểu hiện hình thái ở xung quanh giai đoạn trỗ, mặc dù sau đó cácnhánh, các vùng hoạt động mới của rễ vẫn tiếp tục được sản sinh cho đến khi câyđược thu hoạch Các vùng rễ mới được sản sinh này có thể đóng vai trò quan trọngtrong quá trình vào chắc của hạt lúa Điều kiện dinh dưỡng của môi trường

đất cũng trực tiếp ảnh hưởng đến sự phân nhánh của rễ lúa Môi trường đất cóđầy đủ chất dinh dưỡng sẽ hạn chế sự phân nhánh của rễ, ngược lại, môi trường

có sự thiếu hụt về nước và dinh dưỡng sẽ kích thích sự phân nhánh của rễ.Đường kính của rễ giảm dần theo cấp phân nhánh, tức là ở các cấp phân nhánhcàng cao thì đường kính rễ càng nhỏ Các giống lúa khác nhau có tập tính khác

nhau trong quá trình phát triển bộ rễ cả về chiều ngang và chiều dọc do đó đặcđiểm hình thái và giải phẫu cũng có những điểm khác nhau (Uga et al., 2009).

Bộ rễ nằm dưới mặt đất nên rất khó để có thể quan sát hết các đặc điểm của

nó, vì vậy, sẽ rất hữu ích nếu chúng ta biết mối quan hệ giữa dạng hình cây vàđặc điểm phát triển của bộ rễ Những thông tin này sẽ làm cho việc tìm hiểu biểuhiện của năng suất ở các giống lúa dưới các chế độ nước khác nhau được dễdàng hơn, giúp cho các nhà chọn tạo giống cây trồng những thuận lợi bước đầutrong việc lựa chọn các giống lúa thích hợp với sự thay đổi của môi trường Tuynhiên cho đến nay, vẫn chưa có căn cứ thuyết phục để thiết lập các chỉ dẫntương tự Một cách tiếp cận khác đó là tìm kiếm các chỉ thị phân tử đặc trưngcho các biểu hiện của tính trạng bộ rễ và sử dụng chúng để nhận biết đặc điểm bộ

rễ của giống nghiên cứu Đây cũng là lý do vì sao hiện nay trong các chươngtrình nghiên cứu cải tiến giống lúa, các nghiên cứu về di truyền rễ lúa đang đượcđặc biệt quan tâm Những năm gần đây nhiều QTLs/gen có liên quan đến sự hìnhthành, phát triển bộ rễ ở lúa đã được công bố

2.2 QTLs VÀ GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ LÚA 2.2.1 Các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ lúa

2.2.1.1 Các nghiên cứu xác định QTLs

Ban đầu, để xác định được các gen điều khiển kiến trúc của bộ rễ các nhànghiên cứu chủ yếu sử dụng phương pháp di truyền học truyền thống với các phéplai và sơ đồ phả hệ qua từng thế hệ Với phương pháp này, QTLs được thiết lập dựatrên mối tương quan giữa sự phân ly giữa kiểu gen và kiểu hình được tạo ra từ mộtquần thể lai được gọi là "quần thể lập bản đồ", tạo ra bằng phương pháp lai thuậnnghịch và lai lại (backcrossing) Nghiên cứu đầu tiên về kiến trúc bộ rễ

ở lúa được công bố bởi Champoux et al (1995) đã mở đầu cho hàng loạt các

công bố khác sau đó Kết quả của những nghiên cứu này đã được tóm tắt bởi

Kamoshita et al (2008), cho quần thể lập bản đồ CT9993/IR622266 (Kamoshita

et al., 2008); và bởi Khowaja et al (2009) cho quần thể lập bản đồ Bala/Azucena Trong bài tổng quan của mình Courtois et al (2009) đã phân tích

những điều kiện thiết lập của 675 QTLs trong 24 nghiên cứu ở 12 quần thể lậpbản đồ riêng biệt; những hệ thống đánh giá kiểu hình rất đơn giản, thông thường

là sử dụng hệ thống thủy canh, hoặc hệ thống thí nghiệm chậu vại, ống rễ với giá thểchủ yếu là đất, là đặc trưng cho những nghiên cứu trong giai đoạn này Phần lớn cáctrường hợp (368 trong tổng số 675 QTLs) điều kiện đánh giá kiểu hình là để đánhgiá và ước lượng khả năng di truyền; chỉ có rất ít các nghiên cứu phân tích cụ thểcác QTLs liên quan đến khả năng cảm ứng với các điều kiện thiếu hụt về nước hoặc

là khả năng đâm sâu của rễ (147 và 160 QTLs, tương ứng) Các chỉ tiêu được đođếm thường là: Chiều dài rễ, độ dày của rễ, số lượng rễ, khối lượng rễ ở các độ sâukhác nhau, tỷ lệ giữa phần rễ và phần thân của cây Quần thể lập bản đồ thườngđược sử dụng là các dòng thuần tự phối (RILs) hoặc là các dòng quần thể đơn bộikép (DHLs) bởi vì bản chất tự nhiên ổn định của các dòng cho phép lặp lại các phép

đo Để tối đa hóa sự khác biệt giữa hai bố mẹ và đơn giản hóa việc xác định sự đahình, hầu hết các quần thể (8/12 quần thể, tương ứng với

560 QTLs) đã sử dụng được tạo ra từ phép lai giữa một indica và một japonica.

Kích thước của các quần thể lập bản đồ này thường ở mức nhỏ (khoảng từ 100đến 150 cá thể), cho phép xác định một vài QTLs với hiệu ứng rộng nhưng có độphân giải thấp (Courtois et al., 2009) Mặc dù sự tương tác giữa QTLs x Môi

trường đã được khẳng định là khá lớn (Kamoshita et al., 2002; MacMillan et al.,

2006) nhưng có một vài vùng nhiễm sắc thể thường xuyên xuất hiện ở các quầnthể và/hoặc ở các môi trường thí nghiệm khác nhau, điều này được rút ra sau khitổng hợp và so sánh kết quả QTLs ở các nghiên cứu khác nhau (Courtois et al.,

2009; Khowaja et al., 2009) Các tính trạng có số lượng QTLs đã được xác định

nhiều nhất theo từng cụm QTLs trên các nhiễm sắc thể khác nhau (Chr1 (30-40Mb), Chr2 (25-35 Mb), Chr3 (0-5 Mb), Chr4 (30-35 Mb), Chr9 (15-20 Mb),được trình bày thông qua đồ thị ở Hình 2.4

Gần đây, những hệ thống đánh giá hình thái bộ rễ thông lượng cao và côngnghệ dựng ảnh 3D đã được sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá kiểu hình làmtăng độ tin cậy và ý nghĩa của các QTLs xác định được, mở ra một hướng đi mớiđầy triển vọng, tập trung chủ yếu ở các tính trạng bước đầu như: mật độ rễ vàmức độ lan sâu, rộng của rễ; thêm vào đó là các chỉ tiêu cơ bản như: các đặctrưng cho độ dài của rễ, và các chỉ tiêu đặc trưng cho diện tích của rễ (Topp et al., 2013) Nghiên cứu này sử dụng quần thể lập bản đồ Bala/Azucena và đã xác

định được một số QTLs có liên quan đến các tính trạng đơn giản, và xác địnhđược một số QTLs hoàn toàn mới

Chú thích: R/S, là tỷ lệ khối lượng giữa phần rễ và phần thân; RN, là số lượng rễ bất định;

MRL, chiều dài bộ rễ; THK, đường kính rễ.

Hình 2.4 Số lượng QTLs liên kết với đặc điểm bộ rễ ở lúa trên các vùng

nhiễm sắc thể

Nguồn: Mai et al (2014)

Hạn chế cơ bản của các QTLs được thiết lập bằng cách sử dụng các quầnthể lập bản đồ là khoảng tin cậy của QTLs có kích thước rất lớn Ngay cả cácphân tích tổng hợp, sử dụng giá trị trung bình cũng không có khả năng làm giảmkhoảng tin cậy của các QTLs tổng hợp xuống còn một nửa kích thước ban đầucủa nó (Courtois et al., 2009) Phương pháp GWAS sử dụng các quần thể tự

nhiên cho thấy sự phân rã LD (Linkage Disequilibrium) một cách nhanh chóng

đã xuất hiện như một công cụ mạnh mẽ để cải tiến độ phân giải tại mỗi vị tríQTLs so với phương pháp sử dụng quần thể lập bản đồ GWAS đòi hỏi số lượngmarker với mật độ rất lớn trên mỗi nhiễm sắc thể, điều này chỉ có thể thực hiệnđược nhờ sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ giải trình tự hiện đại ngày nay.Những kết quả đầu tiên của phương pháp phân tích GWAS trên các tính trạng bộ

rễ lúa vừa được công bố (Shen et al., 2001; Clark et al., 2013; Courtois et al.,

2013)

2.2.1.2 Các gen được phân lập từ các QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ

Các kết quả lập bản đồ QTLs liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở lúa đãđược tiếp tục nghiên cứu thông qua phát triển các dòng NILs có chứa các QTLstrên các nền di truyền khác nhau, các QTLs liên kết chặt với các vị trí cloning

(Shen et al., 2001; Steele et al., 2006; Steele et al., 2013) Hầu hết các QTLs có

tác động đến một số tính trạng kiểu hình quan trọng đã được công bố vị trí chínhxác để có thể phân lập Ví dụ đầu tiên phải kể đến là gen liên quan đến khả năng

hút photphos của lúa ở đất có hàm hượng photphos thấp PUP1 (PHOSPHORUS UPTAKE 1), sau đó là gen PSTOL1 (PHOSPHORUS-STARVATION TOLERANCE 1), đã được clone và được chứng minh mã hóa một “receptor-like

cytoplasmic kinase” (Gamuyao et al., 2012) Gen này không thấy biểu hiện ở

Nipponbare Cây mang gen siêu biểu hiện của gen này có hàm lượng lân (P)trong thân tăng lên đáng kể và năng suất tăng 60% trong điều kiện thiếu lân (P)

so với cây đối chứng Các gen này có tác dụng làm tăng sự phát triển ở giai đoạnsớm của rễ, làm cho bộ rễ có kích thước lớn hơn, chiều dài và diện tích bề mặtcủa rễ tăng, góp phần làm tăng khả năng hút lân (P), và các dinh dưỡng khác nhưđạm (N), kali (K) Gen này biểu hiện ở vùng phát sinh rễ bất định (CR) và tại môphân sinh của nó tại vùng gốc thân Vị trí biểu hiện của gen này chứng tỏ nó liênquan đến sự điều khiển việc hình thành và và kéo dài của rễ bất định

Một gen khác đã được clone từ một QTLs liên kết với tính trạng phát triển

bộ rễ là gen DRO1 (DEEPER ROOTING 1) (Uga et al., 2013; Uga et al., 2015) Biểu hiện của DRO1 được điều khiển bởi auxin thông qua yếu tố phiên mã ARF (Auxin Response Factor -ARF transcription factors) DRO1 điểu khiển tính

hướng địa của rễ, cũng như thông qua việc điều khiển sự kéo dài của tế bào biểu

bì theo khả năng tăng trưởng của rễ định hướng theo sự lôi kéo của trọng lực Sự

biểu hiện của DRO1 trên nền di truyền IR64 làm tăng độ mở của góc giữa rễ và

trục ngang trên mặt đất, là nguyên nhân dẫn đến sự ăn sâu hơn của bộ rễ So với

IR64, các dòng đẳng gen (dòng NILs) mang gen DRO1 có một số hiệu ứng

không mong muốn như lá rủ, thời gian ra hoa chậm hơn (kéo dài thời gian sinhtrưởng), tuy nhiên, trong điều kiện hạn thì có năng suất cao hơn, và không suygiảm năng suất so với cây đối chứng ở điều kiện thường

Quá trình cloning hai QTLs có tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên kiếntrúc bộ rễ này là tiêu biểu cho các khó khăn gặp phải trong quá trình xác định cácQTLs liên quan đến các tính trạng rễ lúa Khó khăn thứ nhất, là khó khăn chungđối với tất cả các tính trạng, đó là sự sai lệch khá lớn giữa vị trí marker với vị trígen liên kết với tính trạng quan tâm Khó khăn thứ hai, là bởi sự khác biệt trongcấu trúc của các nhóm giống khác nhau (Schatz et al., 2014), và trong một nhóm, giữa các giống, sự vắng mặt của gen PSTOL1 trong giống lúa đối chứng

Nipponbare là một minh họa Một lý do nữa, đó là có rất nhiều gen trong genome

hiện nay chưa được làm rõ chức năng Ví dụ, sản phẩm của gen DRO1 là một

protein không có sự tương đồng về chức năng với các protein đã được biết đến

(Uga et al., 2013) Mặc dù số lượng các gen được clone từ các QTLs còn khá hạn chế, nhưng sự xuất hiện của DRO1 và PSTOL1 với những chức năng quan

trọng liên quan đến sinh trưởng và phát triển bộ rễ đã chứng minh hiệu quả và ýnghĩa của phương pháp này Do đó, để khắc phục các nhược điểm và nâng caohiệu quả nghiên cứu cần làm giảm kích thước của khoảng cách từ điểm đánh dấuđến các gen quan tâm, sử dụng GWAS là một biện pháp trong đó; bên cạnh đócác nghiên cứu di truyền, khai thác sự đa dạng của lúa cần kết hợp với cácphương pháp phân tích chức năng gen hiện đại để kiểm tra và chứng thực chứcnăng sinh học của gen như phương pháp làm câm gen hoặc gây siêu biểu hiệngen trong các điều kiện đặc thù

2.2.2 Các gen liên quan đến sự hình thành và phát triển bộ rễ lúa

Giải trình tự và giải mã genome lúa (Yu et al., 2002; Itoh et al., 2007), cũng

như việc tạo ra một bộ sưu tập các đột biến (Hirochika et al., 2004; Krishnan et al., 2009; Guiderdoni and Gantet, 2012; Lorieux et al., 2012; Wei et al., 2013) vàcác nghiên cứu sàng lọc sự biến đổi của kiểu hình rễ của các dạng đột biến đócho phép chúng ta xác định được các gen chính điều khiển sự hình thành, sự xuấthiện và sự phát triển của rễ lúa (Rebouillat et al., 2009; Coudert et al., 2010;

Orman-Ligeza et al., 2013) Căn cứ vào phương thức tác động và vai trò của gen

đó trong quá trình hình thành và phát triển bộ rễ ở lúa mà có thể phân thànhnhững nhóm gen khác nhau

2.2.2.1 Các gen điều khiển sự hình thành và phát triển bộ rễ cảm ứng với auxin

Các nghiên cứu sinh lý, hóa sinh và di truyền ở thực vật đã lần lượt khẳngđịnh vai trò của auxin trong sự hình thành và phát triển bộ rễ ở thực vật nói

chung và ở lúa nói riêng Quá trình sinh tổng hợp và vận chuyển auxin và tínhiệu của nó đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sự tăng trưởng và pháttriển của rễ, có thể nói auxin như một chất điều hòa tổng thể trong quá trình này.Những công bố gần đây đang dần hé lộ cơ chế tác động của auxin đến quá trìnhhình thành và phát triển bộ rễ lúa thông qua hoạt động của một mạng lưới gen vàcác yếu tố phiên mã cảm ứng với auxin được tìm thấy.

Đột biến crown root less 4 (crl4) được biến đổi từ OsGNOM1, gen mã hóa

sự vận chuyển guanine-nucleotide qua màng cho ARFs (ADP-ribosylation fator),một thành viên của gia đình protein G (Kitomi et al., 2008; Liu et al., 2009).

Protein G, hay còn gọi là “protein nucleotide-binding guanine”, là một gia đìnhcác protein hoạt động như một thiết bị chuyển mạch phân tử bên trong tế bào, cóliên quan trong việc truyền tín hiệu từ một loạt các kích thích bên ngoài một tếbào vào bên trong qua màng tế bào Hoạt động của chúng được quy định bởi cácyếu tố kiểm soát khả năng gắn kết và thủy phân guanosine triphosphate (GTP)thành guanosine diphosphate (GDP) Protein G là một thành viên của nhóm lớncác enzyme có tên là GTPases Sau yếu tố này là một dạng tương đồng củaGNOM1, nó điều khiển mạng lưới vận chuyển nội bào của protein vận chuyển

auxin PIN1 (PINFORMED1) trong Arabidopsis Đổi lại, PIN1 là yếu tố cần thiết

để tập trung auxin vào các tế bào hình thành rễ bên (Steinmann et al., 1999;

Kitomi et al., 2008; Liu et al., 2009) Đột biến crl1 và Osgnom1 đã được đánh

giá dựa trên sự vắng mặt của các rễ bất định và sự suy giảm số lượng các rễ bên

Trong các đột biến này, sự biểu hiện của một vài gen OsPIN đã bị thay đổi Trong đột biến crl4, sự vận chuyển auxin bị suy yếu đi làm cho sự phân bố auxin trong

các tế bào gốc rễ bị thay đổi (Kitomi et al., 2008) Kết quả cho thấy vị trí vận

chuyển auxin có liên quan tới sự hình thành rễ bất định và rễ bên ở lúa

OsWOX3A (WUSCHEL-releted homeobox 3A) được mã hóa bởi NAL2 (NARROW LEAF2) và NAL3 là một cặp gen lặp Cặp đôi đột biến nal2/nal3 biểu

hiện một kiểu hình phức tạp, làm thay đổi sự phát triển của các bộ phận khácnhau của cây, đáng chú ý là nó làm giảm mạnh mật độ của các rễ bên Một hiệuứng đáng chú ý khác của đột biến này là làm tăng số lượng và chiều dài của cáclông hút (Cho et al., 2013) Trong đột biến nal2/nal3 sự biểu hiện của các gen OsPIN khác nhau đã được biến đổi Kết quả của sự biến đổi này được giải thích

bằng giả thuyết cho rằng có sự tăng vận chuyển auxin tới các mô biểu bì, nơi phátsinh lông hút, đồng thời làm giảm lượng auxin vận chuyển tới trụ bì

(pericycle) nơi các rễ bên được phân hóa (Yoo et al., 2013) OsTIR1 và OsAFB2

là hai gen ở lúa có cùng nguồn gốc với các cơ quan cảm thụ auxin (receptor)TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1) và AUXIN SIGNALING F-

BOX2 (AFB2) ở Arabidopsis, được làm bất hoạt bằng OsMir393a và OsMir393b (Bian et al., 2012; Xia et al., 2012) Cây siêu biểu hiện OsMir393 thể

hiện kiểu hình biến đổi do tác động dây chuyền của các tín hiệu liên quan đến

auxin, bao gồm cả sự suy giảm số lượng rễ bất định OsMir393a biểu hiện rõ ở các vị trí phát sinh rễ chính và rễ bên, điều này chỉ ra rằng OsMir393a có liên

quan đến việc điều khiển sự hình thành của rễ ở sau giai đoạn rễ mầm thông quaviệc phủ định sự điều khiển của các chất nhận (receptor) auxin ở lúa Các chấtnhận auxin TIR1 và AFB2 được định vị trong nhân, nơi mà chúng có thể tươngtác với OsIAA1 - một protein điều khiển AUXIN/INDOLE ACETIC ACID(AUX/IAA) (Bian et al., 2012; Xia et al., 2012) Protein AUX/IAA tương tác và

ức chế ARF (Auxin Response Factors), có chức năng như một yếu tố phiên mã

Ở Arabidopsis, khi các chất nhận này được tạo phức hợp với auxin, nó có thể tương tác với các protein AUX/IAA Kết quả của sự ràng buộc này là do sự hoạt

động của enzyme gắn ubiquitin (là các protein điều khiển có kích thước nhỏ,khoảng 8,5 kDa) SKP1- CULLIN- FBOX (SCF), mà các ubiquitin sử dụng là cácAUX/IAA, mục tiêu của nó là làm suy giảm hàm lượng auxin trong các tế bàophát sinh rễ, từ đó có thể làm giảm số lượng rễ hình thành Những sự tương tácnày đòi hỏi phải có một hoặc vài protein đi kèm (chaperone hoặc co-chaperone)

(Guilfoyle and Hagen, 2007; Mockaitis and Estelle, 2008; Vanneste and Friml,2009; Lavenus et al., 2013).

Ở lúa, một sàng lọc các đột biến mất khả năng cảm ứng với auxin để đánh giá

đặc điểm của của hai đột biến (Oscyclophilin2 (Oscyp2) và lateral root less2 (lrl2))

đã được xác định dựa vào sự vắng mặt của các rễ bên mà nguyên nhân của sự vắng

mặt này là do đột biến ở trên cùng một gen (Kang et al., 2013; Zheng et al., 2013) Ngoài ra, Oscyp2 còn thể hiện một loạt các kiểu hình không cảm ứng với auxin mà

tương quan với sự suy giảm nồng độ của OsIAA11 để phản hồi lại với auxin.OsCYP2/LRL2 là một protein đi kèm, nó có thể tương tác với co-chaperoneOsSGTS (SUPPRESSOR OF G2 ALLELE OF SKP1) Một số giả

thiết cho rằng phức hợp này có liên quan đến sự suy giảm của OsIAA11 doSCFTIR trong quá trình phản hồi lại với auxin trong giai đoạn sớm của sự phânhóa rễ bên (Kang et al., 2013).

OsIAA11 hoặc OsIAA13 gia tăng chức năng đột biến, trong đó, các axitamin có liên quan đến sự suy giảm của các protein cảm ứng với auxin đã đượcbiến đổi, mang đến dạng kiểu hình có rất ít rễ bên (lateral rootless) (Kitomi et al.,

2012; Zhu et al., 2012) OsIAA11 và OsIAA13 là cần thiết cho sự hình thành rễ bên Hai đột biến crl1(crown root less 1) (Inukai et al., 2005) và arl1(adventitious less1) (Liu et al., 2005) đều được biến đổi từ gen OsLBD3-2,

đây là gen mã hóa một yếu tố phiên mã LBD (LATERAL ORGAN BOUNDARYDOMAIN transcription factor) phục vụ cho việc hình thành các cơ quan bên ởvùng biên LBD là một nhóm gen đặc thù chịu trách nhiệm kiểm soát sự hìnhthành rễ ở các loài khác nhau (Coudert et al., 2013b) Các cây lúa có chứa đột biến crl1 và arl1 không có sự hình thành rễ bất định (để tạo thành bộ rễ chùm), đồng thời số lượng rễ bên cũng giảm đi đáng kể Hoạt động của CRL1 cảm ứng

với auxin Sự cảm ứng này bị mất đi trong cây gây siêu biểu hiện một loại protein

đã được biến đổi có tên là OsIAA3, không suy giảm sau khi điều trị bằng auxin,

điều này chỉ ra rằng sự biểu hiện cảm ứng của CRL1 với auxin là hoàn toàn độc lập với sự suy giảm của protein AUX/IAA Ngoài ra, promotor của CRL1 còn

chứa một trình tự cảm ứng với auxin (ARE), trình tự này có khả năng tương tác

in vitro với yếu tố phiên mã OsARF16 (Inukai et al., 2005).

Tất cả các dữ liệu trên cho thấy sự hình thành rễ bất định và rễ bên ở lúaliên quan đến một mạng lưới gen điều khiển bởi auxin, nó bao gồm các receptorthụ cảm auxin ARF và LDB Mạng lưới gen điều hòa này được bảo tồn rất tốt ởcác loài cây hai lá mầm và một lá mầm khác nhau (Hochholdinger and Tuberosa,2009; Péret et al., 2009; Lavenus et al., 2013) Ở lúa, một số thành phần trong

mạng lưới điều hòa này tham gia vào điều khiển sự hình thành cả rễ bất định và

rễ bên, tuy nhiên cũng có một số thành phần khác chỉ đặc hiệu cho một loại rễnhất định Vì những lý do này, cây lúa trở thành một mô hình đầy hứa hẹn đểnghiên cứu mạng lưới gen tham gia đến quá trình hình thành và phát triển bộ rễcủa cây xuất phát từ cả hai bộ phận thân và rễ ở sau giai đoạn rễ mầm

2.2.2.2 Các gen điều khiển sự hình thành và phát triển bộ rễ cảm ứng với các chất điều hòa sinh trưởng khác

Bên cạnh auxin, các hoocmon thực vật khác như cytokinin, ethylen, axitabscisic, gibberellin, axit jasmonic, cũng tham gia điều khiển quá trình hìnhthành và phát triển bộ rễ Chúng thông qua sự tương tác tương hỗ, hoặc đối

kháng với auxin để tác động đến hình thái và cấu trúc bộ rễ Một số gen đã đượccông bố chịu sự điều khiển của các phytohoocmon này như:

Đột biến crl5 (crown root less 5) biểu hiện một kiểu hình với số lượng rễ

chính giảm đáng kể, nguyên nhân là do có sự suy giảm quá trình phân hóa rễchính tại gốc rễ (Kitomi et al., 2011) Gen CRL5 mã hóa yếu tố phiên mã

AP2/ERF (APETALA/ETHYLENE RESPONSE FARTOR transcription factor),biểu hiện của nó cảm ứng với auxin thông qua yếu tố phiên mã AFR Cytokinincản trở sự hình thành rễ bất định và rễ bên ở lúa (Rani Debi et al., 2005; Kitomi

et al., 2011), nhưng những cây có sự xuất hiện của CRL5 lại có thể hình thành rễ bên một cách bình thường Nguyên nhân là do CRL5 kích hoạt biểu hiện của hai

dạng ARRs (A RESPONSE REGULATOR) - một chất ức chế các tín hiệu củacytokinin (To et al., 2004).

Tương tự, yếu tố phiên mã WOX11 (WUSCHEL-related Homeoboxtrancription factor) kiểm soát sự biểu hiện của các ARRs khác nhau và điều khiển

cả quá trình hình thành lẫn quá trình phát triển của rễ bất định ở lúa (Zhao et al.,

2009) Biểu hiện của WOX11 được gây ra bởi auxin và cytokinin Kết quả này cho thấy CRL5 và WOX11 là một sự giao cắt giữa hai đường hướng điều hòa đối

lập của auxin và cytokinin đối với sự hình thành các rễ bất định ở lúa

Gen HOX1 (HEME OXYGENASE 1) điều khiển sự hình thành của rễ bên thông qua quá trình tạo khí CO (carbon monoxide) HOX1 được điều hòa bởi

auxin và các tín hiệu stress, cũng như axit jasmonic và nitric oxit (Chen et al.,

2012; Hsu et al., 2013), đây là một đường hướng rất đáng quan tâm, chúng ta có

thể ứng dụng đường hướng này vào để góp phần xây dựng các mô hình kiến trúc

rễ ứng phó với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (stress)

2.2.2.3 Các gen liên quan đến sự hình thành mô phân sinh rễ

Sau bước khởi đầu, tế bào phân chia và trở thành một bộ phận có hình dạngcủa một mô phân sinh rễ Trong mô phân sinh rễ có một trung tâm được tạo thành từmột lượng nhỏ tế bào mô phân sinh nhưng đang ở trạng thái không phân chia(quiescent center - QC), trung tâm này là cần thiết để duy trì trạng thái ổn định củacác tế bào rễ được tạo thành (van den Berg et al., 1997) Tại trung tâm QC của rễ

lúa, vai trò của auxin được thể hiện thông qua sự hoạt động của gen OsIAA23 (Jun

et al., 2011) Gen QHB (QUIESCENT CENTER HOMEOBOX) là một gen tương đồng với WUSCHEL-related WOX5, một gen QC đặc trưng ở

Arabidopsis, gen đóng góp trong việc kiểm soát hoạt động của các tế bào QC và

mô rễ (Kamiya et al., 2003a; Breuninger et al., 2008; Ditengou et al., 2008) Gen QHB được biểu hiện trong giai đoạn sớm của quá trình phân hóa rễ ở QC, và những biểu hiện của nó độc lập với CRL1/ARL1 ở giai đoạn hình thành rễ bất

định (Kamiya et al., 2003b; Inukai et al., 2005; Liu et al., 2005; Ni et al., 2014).

Mối quan hệ này cho thấy CLAVATA/WOX là một đơn vị tín hiệu điều hòa hoạtđộng của mô phân sinh ở đỉnh rễ ở lúa Tương tự như một đơn vị điều hòa hoạt

động của mô phân sinh đỉnh chồi đã được mô tả ở Arabidopsis Trong phạm vi

này, sự vận chuyển tín hiệu peptide CLV3 được đảm bảo bởi LRR RLK(LEUCINE RICH REPEAT RECEPTOR - LIKE KINASE) CLV1 (Müller et al.,

2006) Trong những dòng lúa siêu biểu hiện OsRPK1, gen mã hóa LRR RLK, mức độ biểu hiện của các gen OsPIN khác nhau được điều chỉnh giảm xuống, sự

vận chuyển auxin theo cực bị hỗn loạn và chiều dài của các rễ hình thành tronggiai đoạn nảy mầm, cũng như số lượng các rễ bất định và mật độ của rễ bên (Zou

et al., 2014) Tuy nhiên, người ta không xác định được cụ thể gen này có liênquan đến bước nào trong quá trình phát triển của bộ rễ (có thể là giai đoạn bắtđầu hình thành rễ, quá trình duy trì các mô phân sinh, hay các quá trình khác của

sự phát triển) Một điều đặc biệt là OsRPK1 được điều hòa bởi auxin, axits abscisic (ABA) và các stress về mặn Vai trò ảnh hưởng của gen OsRPK1 đến

khả năng thích ứng của hình thái rễ đối với các điều kiện stress còn cần đượcnghiên cứu thêm (Zou et al., 2014).

Ở Arabidopsis, SCARECROW (SCR), một yếu tố phiên mã (transcription

factor) của GRAS (GRAS family), cũng đặc trưng cho vùng QC (Sabatini et al.,

2003) Ở lúa, OsSCR1 được biểu hiện ở QC và cũng có thể tham gia vào việc xác

định vùng QC (Ni et al., 2014) Sự biểu hiện của OsSCR1 bị suy giảm ở vùng mô phân sinh rễ tại các đốt thân gần gốc của các cây mang đột biến arl1 (Liu et al.,

2005) Cùng với SHORTROOT (SHR), một yếu tố phiên mã GRAS khác,SCARECROW điểu khiển sự phân chia của nội bì/ tế bào ban đầu của lớp vỏ và

sự biệt hóa nội bì ở Arabidopsis (Di Laurenzio et al., 2007; Cui et al., 2007) Ở lúa, cơ chế này cũng được bảo tồn, OsSCR1 cũng biểu hiện ở nội bì, tế bào ban

đầu của lớp vỏ và ở giai đoạn sớm của sự biệt hóa của các tế bào nội bì (Ni et al.,

2014) Hơn nữa, OsSCR1 có thể tương tác với OsSHR1, điều này được quan sát

thấy tại vùng trung trụ của rễ nhưng có thể đây chỉ là quá trình dịch chuyển để điđến các tế bào phân sinh ở nội bì (Kamiya et al., 2003a; Cui et al., 2007; Ni et al.,

nằm ngay bên trong biểu bì (Rebouillat et al., 2009; Coudert et al., 2010) Huang

et al (2009) đã xác định được một đột biến cảm ứng với nhôm, ký hiệu là c68,

trong đột biến này sự biệt hóa của biểu bì và ngoại bì bị rối loạn, gen tương ứng

với đột biến này là DEFECTIVE IN OUTERCELL LAYER SPECIFICATION 1 (DOCS1), mã hóa một protein LRR RLK (Huang et al., 2012a) Kết quả này chỉ

ra rằng nghiên cứu sâu hơn về các gen liên quan đến hoạt động của mô phân sinh

và các mô rễ theo cấu trúc xuyên tâm có thể sẽ giúp chúng ta xác định đượcnhững nguồn gen mới cho tính kháng và nâng cao khả năng thích ứng của câylúa trong điều kiện đất đai bị nhiễm độc

2.2.2.4 Các gen liên quan đến sự xuất hiện của rễ hậu phôi

Các rễ xuất hiện sau giai đoạn nảy mầm được gọi là rễ hậu phôi, đối với câylúa, bộ rễ hình thành sau giai đoạn nảy mầm chủ yếu là rễ bất định phát sinh từ đốtthân sát mặt đất (CR), và các rễ bên (lateral root - LR) phát sinh từ các rễ chính(thường là rễ bất định - CR) Khi hình thành, các mô phân sinh rễ phải phát triểnxuyên qua thân (đối với rễ bất định - CR) hoặc các mô rễ (đối với các rễ bên -LR)

Sự xuất hiện của rễ bất định (CR) bị kích thích trong môi trường ngập nước Sựkích thích này phải thông qua tác động của ethylen, liên quan đến biểu hiện của cácgen điều hòa chu trình tế bào của các mô phân sinh rễ bất định (CR) và thúc đẩy,trong quá trình đồng tổng hợp với axit gibberellic, sự chết của tế bào biểu bì ở vùng

rễ xuất hiện (Lorbiecke and Sauter, 1999; Mergemann and Sauter, 2000; Steffens et al.,

2006) Nitric oxit (NO) cũng có tác động thúc đẩy sự xuất hiện của rễ bất định

(CR), trong khi axit abscisic ức chế quá trình này (Steffens et al., 2006; Xiong et al., 2009) Một chức năng vận chuyển auxin phân cực thông qua sự điều hòa của gen OsPIN1 cũng cần thiết cho sự xuất hiện và phát triển rễ bất định (Xu et al., 2005) Trong đột biến Oscand1, mô phân sinh rễ bất định bị ức chế hoàn toàn và chúng

hình thành nhưng không hề xuất hiện (Wang et al., 2010) Ở Arabidopsis, OsCAND1 mã hóa một protein điều hòa (ubiquitin ligase) có tên CULLIN-

ASSOCIATED AND NEDDYLATION-DISSOCIATIED 1 (CAND1) SCFTIR1 liênquan đến sự suy giảm của AUX/IAA trong quá trình đáp ứng với auxin (Cheng et al.,

2004) Trong đột biến Oscand1, sự phân bố của auxin bị thay đổi trong mô phân

sinh rễ bất định, như là một biểu hiện của các gen đều hòa chu trình tế bào Trong

những cây đã bị phá vỡ hoạt động của gen origin recognition complex subunit3 (orc3), sự xuất hiện của các rễ bên đã bị kìm hãm bởi sự rối loạn các hoạt động

trong chu trình tế bào trong việc hình thành

các mô phân sinh rễ bên mới (Chen et al., 2013) OsORC3 cũng được biểu hiện ở

rễ mầm và tại mầm rễ bất định, có vẻ như nó tham gia vào nhiều quá trình khácnhau trong sự phát triển của bộ rễ

Sự hình thành và xuất hiện rễ là những quá trình cơ bản quyết định sốlượng và sự phát triển bộ rễ ở thực vật Nghiên cứu về quá trình này là cần thiết

để xác định các yếu tố di truyền quyết định đến khả năng tăng cường số lượngnhánh bên của bộ rễ

2.2.2.5 Các gen liên quan đến sự phát triển của bộ rễ lúa

Các đột biến khác nhau liên quan đến sự phát triển bộ rễ cho phép xác địnhđược các gen liên quan đến các chức năng sinh học khác nhau Một số gen này làmgiảm sự phát triển của rễ bằng cách tác động nên quá trình hình thành vách ngăn ở tế

bào rễ Gen OsDGL1 là gen mã hóa tiểu đơn vị

DOLICHYLDIPHOSPHO-OLIGO-SACCHARIDE-PROTEIN GLYCOSYLTRANSFERASES 48 kDa, tiền thân củacấu trúc polisaccharide trong vách ngăn của tế bào rễ lúa Các cây chứa gen đột biến

Osdgl1 biểu hiện một kiểu hình rễ ngắn bởi vì đã có một lỗi xảy ra trong quá trình

kéo dài và phân chia của tế bào rễ (Qin et al., 2013).

Một gen khác tác động nên sự hình thành vách ngăn tế bào trong quá trìnhphân bào của rễ lúa đã được phân lập bằng phương pháp sàng lọc các đột biến

có kiểu hình rễ ngắn được đặt tên là OsGLU3 Gen này mã hóa một protein giả

định MEMBRANE-BOUND ENDO 1,4-B-GLUCANASE (Zhang et al., 2012a) Trong đột biến Osglus3, hàm lượng tinh thể cellulose bị suy giảm trong vách ngăn tế bào và quá trình kéo dài rễ bị ức chế Điều này cho thấy rằng OsGLUS3

có thể đóng góp vào quá trình điều chỉnh sự phát triển của bộ rễ trong môitrường thiếu hụt photphate (lân) (Zhang et al., 2012b).

Mở rộng cũng là một nhân tố quan trọng của quá trình kéo dài rễ lúa, Shin

et al (2005) trong nghiên cứu của mình đã xác nhận gen OsEXPANNSIN8 (OsEXPA8) biểu hiện đặc hiệu ở đầu rễ (Shin et al., 2005) Cây siêu biểu hiện gen OsEXPA8 có khả năng tăng trưởng đều theo không gian hình cầu tốt hơn cây đối

chứng, mang lại sự cải tiến đáng chú ý trong hệ rễ của chúng, sự kéo dài và phânnhánh bộ rễ được kích thích mạnh mẽ (Ma et al., 2013) Kiểu hình này là kết quả

của sự tăng khả năng kéo dài của vách tế bào

Đột biến Osspr1(Oryza sativa short postembryonic root 1) cũng mang đến một

kiểu hình rễ ngắn do quá trình kéo dài tế bào rễ bị lỗi, điều này được xác định

dựa vào sự rối loạn cân bằng sắt nội mô (Jia et al., 2011) OsSPR1 mã hóa một protein ti thể có chứa một Armadillo-like repeat domain, nhưng chức năng đặc hiệu của nó cho đến nay vẫn chưa được xác định Trong đột biến rss3 (rice salt sensitive 3), sự kéo dài của tế bào rễ lúa bị ức chế mạnh mẽ trong môi trường chứa muối, kết

quả cho chúng ta một bộ rễ có kích thước rất ngắn (Toda et al., 2013).

RSS3 là một nuclear factor, nó có thể tương tác với các thành phần phân tử

chính trong con đường dẫn truyền axit jasmonic (một hoocmon ức chế sự sinhtrưởng của rễ) Ở rễ, có thể RSS3 góp phần làm kìm hãm sự dẫn truyền axitjasmonic trong điều kiện có hàm lượng muối cao, từ đó góp phần duy trì khả

năng sinh trưởng của rễ trong điều kiện stress này Tương tự, đột biến rss1 cũng

biểu hiện sự suy giảm mạnh mẽ về khả năng sinh trưởng của rễ và thân trongđiều kiện mặn (Ogawa et al., 2011).

RSS1 đóng vai trò duy trì sự phân chia tế bào ở vùng mô phân sinh trong

điều kiện nồng độ muối tăng, có thể là do nó ngăn cản con đường phản hồi vớicác tín hiệu cytokinin

Siêu biểu hiện của các yếu tố phiên mã NAC (NO APICAL MERISTEM,ATAF1-2,CUP-SHAPED COTYLEDON) như OsNAC5, OsNAC9, OsNAC10 ở

rễ có thể làm tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện thiếu hụt nước củacây (Jeong et al., 2010; Redillas et al., 2012; Jeong et al., 2013) Siêu biểu hiện

của các yếu tố phiên mã này có tương quan chặt với sự gia tăng đường kính rễ,điều này làm cho quá trình thâm nhập trong đất và sự vận chuyển nước của rễ trởlên dễ dàng Tất cả các gen liên quan đến sự sinh trưởng của bộ rễ kể trên chochúng ta thấy việc tạo ra một bộ rễ sâu hơn, có khả năng khai thác nước tốt hơn

là hoàn toàn có khả năng, đồng thời các ví dụ trên cũng cho thấy chúng ta có thểchủ động tạo ra những bộ rễ đáp ứng với các điều kiện đất đai khác nhau

2.3 NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG CỦA GBS

2.3.1 Phương pháp giải trình tự NGS – nền tảng của GBS

Phương pháp phân tích kiểu gen dựa vào giải trình tự GBS (Genotyping BySequencing) được phát triển từ phương pháp giải trình tự NGS (Next GenerationSequencing) Dựa vào việc giải trình tự nhiều mẫu trong cùng một lần và so sánhcùng lúc nhiều genome để xác định sự khác nhau về kiểu gen giữa các mẫu giốngdựa trên sự đa hình của genome đã phân tích

Những hạn chế về trang thiết bị và giá thành cao của phương pháp giảitrình tự Sanger đã hạn chế sự phát triển của các nghiên cứu giải trình tự toàn bộgenome ở các loài sinh vật Nhất là khi nhu cầu giải trình tự không chỉ dừng lại ởmột giống/loài mô hình mà mong muốn đi sâu nghiên cứu và can thiệp vàogenome của chúng ngày càng mạnh mẽ Phương pháp NGS (Next – Generation –Sequencing) ra đời đã mang đến hai cải tiến lớn nhất trong lĩnh vực giải trình tựADN hiện nay: 1) sự gia tăng đáng kể số lượng mẫu được đưa vào trong cùngmột lần giải trình tự; 2) chi phí cho mỗi base được giải trình tự ngày càng giảm.Phương pháp này dựa trên kỹ thuật giải trình tự song song, đồng thời giải trình tựcủa nhiều đoạn ADN và phân tích hình ảnh với hiệu suất làm việc có thể từ hàngtrăm triệu đến hàng tỷ nucleotide trong một lần chạy (Shendure and Ji, 2008).Hiện nay, hệ thống giải trình tự bằng công nghệ NGS có thể được chia thành hailoại được gọi là “second-generation” và “third-generation”, sự phân chia này chủyếu dựa trên nguồn gốc ADN khuôn được cố định trước khi đưa vào giải trình

tự, và thế hệ nhân dòng của ADN được đọc trình tự (Niedringhaus et al., 2011).

Các phương pháp giải trình tự NGS có thể được tiến hành thông qua nhiều hệthống đọc trình tự khác nhau nhưng chúng đều tuân theo một mô hình tương tựcho việc chuẩn bị ADN khuôn, cả hai đầu của đoạn ADN đã được cắt ngẫu nhiênđều được gắn với với các đoạn tiếp hợp (adapter) Các đoạn phân tử ADN đãđược khuếch đại được cố định trên một bề mặt sau đó sẽ tạo ra hàng tỷ đoạntrình tự trong cùng một thời gian Giải trình tự được thực hiện lặp đi lặp lại nhiềulần trên các đoạn tổng hợp từ 1 hoặc 1 chuỗi nucleotide thông qua việc xác địnhcác tín hiệu phát ra bằng các máy đọc trình tự (Metzker, 2010)

Giải trình tự bằng phương pháp NGS lần đầu tiên được thực hiện thànhcông trên hệ thống máy Roche 454 GS20, và sau đó được thay thế bằng hệ thốngmáy Roche 454 FLX Titanium (Margulies et al., 2005) Hệ thống máy Roche

454 FLX Titaniumcó khả năng tổng hợp khoảng 450 Mbp các trình tự trong thờigian 10 giờ hoạt động, chiều dài trình tự được đọc có thể lên đến 600 bp với độchính xác tới 99,99% (Thudi et al., 2012) Phương pháp giải trình NGS được

thực hiện bằng Illumina (Bentley et al., 2008) có chiều dài trình tự được đọc

ngắn hơn, chỉ từ 50 đến 150 bp, nhưng lượng tổng trình tự đầu vào có thể lênđến 1.5 Gbp đến 600 Gbp, tùy từng hệ thống máy móc sử dụng Hai hệ thốngmáy giải trình tự Illumina hay được sử dụng nhất hiện nay là Illumina MiSeq vàHiSeq2500 Trong phương pháp Illumina, chu kỳ giải trình tự được thực hiện

dựa trên sự tổng hợp các đoạn trình tự có khuôn mẫu từ các dòng ADN đơn lẻđược khuếch đại nhờ phản ứng PCR Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện

sử dụng một quy trình khuếch đại có chứa pha rắn được gọi là “bridgeamplification” (Fedurco et al., 2006), phương pháp này có thể tổng hợp được

1000 bản sao từ một phân tử ADN khuôn ban đầu, các bản sao này sẽ được phânthành một nhóm Việc giải trình tự được thực hiện nhờ các deoxyribonucleotidekết thúc được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang (có màu khác nhau chotừng loại) trong hàng loạt các chu kỳ tổng hợp ADN mà mỗi lần đoạn trình tựđược tổng hợp chỉ hơn kém nhau 1 nucleotide, việc xác định các tín hiệu huỳnhquang và sự phân tách giữa các nhãn huỳnh quang cùng với các gốc hóa học tạiđầu 3’ của mạch ADN được tổng hợp cho phép chu kỳ tiếp theo tiếp tục đượcthực hiện bình thường Bên cạnh dòng máy giải trình tự Illumina, chúng ta có thể

kể đến một số hệ thống giải trình tự khác như: Life Technologies 5500xl (Thudi

et al., 2012), Iron Torrent PCM (Rothberg et al., 2011)

Hiện nay, phương pháp giải trình tự NGS, đặc biệt là phương pháp giảitrình tự NGS ở thế hệ thứ hai (second- generation sequencing) được sử dụng phổbiến và ứng dụng vào nhiều nghiên cứu khác nhau, từ những nghiên cứu hệ gen ởsinh vật tiền nhân và sinh vật nhân chuẩn đến các nghiên cứu so sánh, khám phá

sự biến đổi của các của các vùng gen đích, gen chức năng; từ các nghiên cứu cácyếu tố phiên mã và các “small RNAs” đến các nghiên cứu epigenetics, nghiêncứu cấu trúc nhiễm sắc thể, các nghiên cứu phân loại loài thông qua các nghiêncứu metagenomics

Có thể hình dung quá trình giải trình tự theo phương pháp NGS theo sơ đồtại Hình 2.5

ADN tổng số trong genome được cắt thành từng đoạn bởi các enzyme giớihạn, tại đầu của các điểm cắt sẽ được gắn với các bộ tiếp nối (adapter) phù hợp

có gắn mã vạch, sau đó hai đầu có adapter của các đoạn oligo này được cố địnhlên một bề mặt được gọi là “Cluster Station”; phản ứng PCR sẽ được thực hiệntrực tiếp trên các “Cluster Station” nhờ sự có mặt của các kênh dẫn nucleotide tự

do trên bề mặt “Cluster Station” và enzyme ADN polymerase; mỗi một sợi ADN

sẽ là mạch khuôn để tổng hợp nên một cụm các phân tử ADN có cùng nguồngốc, mỗi một cụm có khoảng 1 triệu các bản sao từ sợ ADN ban đầu, số lượngnày đủ để xác định chính xác tín hiệu thu được trong quá trình giải trình tự

Chú thích: (a) các bước giải trình tự theo phương pháp của Sanger: ADN được cắt sau đó được biến nạp vào

vetor plasmid và được chuyển vào E coli để nhân bản Mỗi dòng ADN được clone sẽ được khuếch đại bằng

phản ứng PCR, sau đó mỗi một dòng ADN sẽ được đưa vào một chu trình giải trình tự riêng biệt (b) các bước giải trình tự theo phương pháp NGS: ADN sẽ được cắt, sau đó được gắn các bộ tiếp nối, và được gắn lên một mảng có các điểm tiếp nối giữ chặt đoạn ADN, sau đó quá trình nhân bản ADN được diễn ra trên mảng cùng một lúc các đoạn ADN khác nhau, sử dụng nu bổ sung có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, sản phẩm nhân bản

được đưa vào máy quét để xác định trình tự của đoạn ADN gốc.

Hình 2.5 Các bước giải trình tự theo phương pháp Sanger (a) và NGS (b)

Nguồn: Shendure and Ji (2008)

Các nucleotide tự do được đánh dấu huỳnh quang bởi 4 màu khác nhau đặctrưng cho bốn loại nucleotide khác nhau Tại đầu 3’ nhóm –OH bị chặn hóa họckhiến cho mạch ADN mới tổng hợp được sẽ dừng lại tại các nucleotide đượcđánh dấu Máy nhận biết tín hiệu huỳnh quang bằng laze sẽ chịu trách nhiệm