Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh in vitro cây hoa hồng pháp (rose gallica l )

trong khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ cây hoa hồng Pháp.Xác định được nồng độ chế phẩm nano và các chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho nhân giống in vitro giống hoa hồng P

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học: TS Đồng Huy Giới

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kì học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc.

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Dương Thị Mến

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo,

sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc đến TS.Đồng Huy Giới, người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ Môn sinh học, Khoa công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, các Thầy Cô giáo khoa Công nghệ sinh học đặc biệt là các Thầy Cô trong Bộ môn Sinh học – Học viện nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên, khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.

Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017

Tác giả luận văn

Dương Thị Mến

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract. x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Lý do chọn đền tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu về cây hoa hồng pháp (Rosa gallica.L) 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2. Một số đặc tính sinh học của cây hoa hồng và yêu cầu ngoại cảnh 3

2.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây hoa hồng và một số cây trồng khác 8

2.2.1. Nghiên cứu về nhân nhanh in vitro cây hoa hồng và một số cây trồng khác 8

2.2.2 Nghiên cứu về tạo mô sẹo. 11

2.2.3 Giới thiệu về công nghệ nano và nano bạc, nano đồng 12

2.2.4 Cơ chế diệt khuẩn, nấm của nano bạc, nano đồng và ứng dụng. 13 2.2.5 Công nghệ nano trong nuôi cấy in vitro 15

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Địa điểm nghiên cứu 19

3.2 Thời gian nghiên cứu 19

3.3 Đối tượng nghiên cứu 19

3.4 Nội dung nghiên cứu 19

3.5 Phương pháp thí nghiệm 20

3.5.1 Thiết kế thí nghiệm 20

3.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu 20

3.5.3 Bố trí thí nghiệm 21

3.5.4 Phân tích số liệu 26

Phần 4 Kết quả và thảo luận 27

4.1. Nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu hoa hồng pháp của hỗn hợp dung dịch nano bạc-đồng 27

4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp. 27

4.1.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp. 28

4.2. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng ba và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng pháp. 30

4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp. 30

4.2.2. Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp. 31

4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng iba và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng pháp. 33

4.3.1. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp. 33

4.3.2. Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp 34

4.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng ba và nano bạc đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hống pháp. 36 4.4.1. Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp. 36

4.4.2. Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp. 38

4.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng -naa và nano bạc lên sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng pháp. 40

4.5.1 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2

hoa hồng Pháp. 40

4.5.2 Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp. 42 Phần 5 Kết luận và kiến nghị 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

Tài liệu tham khảo 45

Phụ lục 50

Gibberellin Indole – 3 – acetic acid Indole – 3 – butylic acid

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%Murashige and Skoog

α – naphthalene acetic acid Nồng độ

Nhà xuất bản Trung bình Thidiazurol Nano bạc Hỗn hợp nano bạc-đồng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng

mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần). 27 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lí hợp nano bạc -đồng đến hiệu quả khử

trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần). 29 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi

từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp (sau 4 tuần) 30 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nano bạc đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt

ngủ hoa hồng Pháp (sau 4 tuần). 32 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo

hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 33 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp

(sau 6 tuần). 35 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến quá trình nhân

nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 37 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên quá trình nhân nhanh chồi in vitro

hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 39Bảng 4.9 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp

2 hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 41 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 giống

hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.1 Khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ trong các môi trường

có nồng độ BA khác nhau (sau 4 tuần). 31 Hình 4.2 Khả năng tái sinh chồi từ mắt ngủ từ đoạn thân trong môi trường nuôi

cấy với nồng độ nano bạc khác nhau (sau 4 tuần) 33 Hình 4.3 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo

hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 34 Hình 4.4 Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp (sau

6 tuần). 36 Hình 4.5 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến quá trình nhân nhanh

chồi in vitro hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 38 Hình 4.6 Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa

hồng Pháp (sau 6 tuần). 40Hình 4.7 Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp

2 hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). 42 Hình 4.8 Ảnh hưởng của nano bạc đến sự ra rễ chồi cấp 2 giống hoa hồng Pháp

(sau 6 tuần) 43

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Dương Thị Mến.

Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh

in vitro cây hoa hồng pháp (Rosa gallica L.).

Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành, mỗi thí nghiệm được bố trí 5 công thức, mỗi công thức 20 mẫu, 3 lần lặp lại Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, IRRISTAT 5.0.

Kết quả chính và kết luận:

Đã bố trí được các thí nghiệm theo mục đích đề ra và đã xác định được: i) Nồng

độ hỗn hợp nano bạc – đồng và thời gian thích hợp nhất để khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ là 200 ppm trong 60 phút với tỷ lệ mẫu sống sạch 90%, ii) Nồng độ BA và nano bạc thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi đoạn thân mang mắt ngủ là 2 mg/l và 2 ppm với tỷ lệ bật chồi 91,7% , iii) Nồng độ IBA và nano thích hợp nhất cho quá trình tạo

mô sẹo từ lá in vitro là 0,5 mg/l và 4 ppm với tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 86,7%, iv) Nồng độ BA

và nano thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi là 1,5 mg/l BA và 2ppm cho hệ số nhân chồi 5,23 lần v) Xác định nồng độ NAA và nano thích hợp nhất cho sự ra rễ tương ứng

là 2 mg/l và 2 ppm cho tỷ lệ ra rễ là 76,67%, số rế trung bình trên chồi là 4.23.

THESIS ABSTRACT

Author: Duong Thi Men.

Thesis title: Study on the use of nanoparticles in French rose (Rosa

gallica L.) Tissue Culture.

Field of study: Biotechnology. Code: 60.42.02.01

Training center: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Main results and conclusion:

This study identified: (i) Concentration of 200 ppm of mixed nanosilver and nanocopper for 1 hour after surface sterilization was the best treatment of the French rose explants, which made 90% samples clean and survival ; (ii) 91.7% of French rose explants formed shoots on the medium supplemented with 2 mg/l BA and 2 ppm silvernano; (iii) The formation of callus from the in vitro leaf piece of French rose were best in medium added with 0,5 mg/l IBA and

4 ppm silvernano; (iv) The optimal medium for micropropagation of French rose was medium containing 1,5 mg/l BA and 2 ppm of nanosilver; (v) On the medium supplemented with 2 mg/l NAA and 2 ppm nanosilver, rooting rate of shoots in vitro French rose was 76.7%, with an average of 4.23 roots/shoot.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀN TÀI

Cây hoa hồng Pháp là loài thực vật có hoa tên khoa học là Rosa gallica L thuộc chi Rosa, họ Rosaceae Cây hoa hồng Pháp thuộc loại cây bụi, thân leo, có gai, lá cây màu xanh tươi, hoa có nhiều màu nhưng chủ yếu là màu hồng và màu tím Loài hoa này dễ canh tác, dễ chăm sóc và có sức sống mạnh mẽ Hoa hồng Pháp có thể dùng trồng làm cảnh sân vườn, tiểu cảnh, trồng trong khuôn viên đô thị, công viên hoặc trồng trong chậu trang trí nội thất văn phòng, cây ban công Hiện nay một số phương pháp nhân giống chủ yếu của hoa hồng Pháp là nhân giống bằng hạt, ghép cành, chiết cành Tuy nhiên, hạt chủ yếu là nhập khẩu nên ở Việt Nam chưa chủ động được việc nhân giống bằng hạt, với phương pháp chiết ghép thì số lượng nhân chưa được nhiều, bên cạnh đấy các cây con được tạo ra thường chưa sạch bệnh, hay bị nhiễm khuẩn và nấm.

Nuôi cấy mô là biện pháp kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để nhân giống cây trồng sạch bệnh Tuy nhiên, trong quá trình nhân giống hoa hồng Pháp cũng như các loại cây trồng khác bằng nuôi cấy mô, vấn đề mà chúng ta luôn gặp phải là sự nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu cấy gây ảnh hưởng lớn tới hiệu suất nuôi cấy và chất lượng cây khi ra vườn ươm Hiện nay, chúng ta thường sử dụng một số hóa chất khử trùng (HgCl 2 , CaClO 2 , …) Tuy nhiên, việc sử dụng các hóa chất trên gây ô nhiễm môi trường, gây độc hại cho người và các sinh vật khác.

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu vật liệu nano và ứng dụng

nó trong đời sống của con người đang được qua tâm Một trong những ứng dụng trong sử dụng vật liệu nano là ứng dụng trong nông nghiệp Nano bạc và đồng dùng cho nông nghiệp được biết đến với những công dụng trong sản xuất cây trồng như: Phòng trừ và tiêu diệt các loại vi rút, vi khuẩn, nấm bệnh gây hại cây trồng Trong những năm gần đây nano bạc và đồng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Ngoài ra nano bạc còn được biết đến

có tác động tích cực đến quá trình phát sinh hình thái của cây in vitro.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài

“Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh in vitro cây hoa hồng pháp (Rosa gallica L.)”.

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Xác định được nồng độ, thời gian xử lý chế phẩm nano thích hợp nhất

trong khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ cây hoa hồng Pháp.

Xác định được nồng độ chế phẩm nano và các chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho nhân giống in vitro giống hoa hồng Pháp 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.); chế phẩm nano bạc và nano đồng với nồng độ 500 ppm được cung cấp bởi Bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7/2016 đến tháng 5/2017.

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC

Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chế phẩm nano trong nuôi cấy in vitro hoa hồng Pháp.

Xác định được nồng độ chế phẩm nano thích hợp nhất cho việc khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ, tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ, nhân chồi in vitro, ra rễ từ chồi cấp 2 và tạo mô sẹo từ mẫu lá in vitro của hoa hồng Pháp.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY HOA HỒNG PHÁP (Rosa gallica.L)

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Hoa hồng Pháp thuộc chi Rosa, họ Rosacaea, phân họ hoa hồng (Subrosaceae) Nó có nguồn gốc ôn đới và nhiệt đới vùng Bắc bán cầu (Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương, 2006) thuộc loại cây bụi có gai, lá cây màu xanh tươi, hoa nhiều màu đỏ, hồng, vàng, trắng…, thân có gai và lông mao Hiện nay nó được phân bố rộng rãi trên thế giới và đã được du nhập và trồng ở Việt Nam từ lâu, có giá trị kinh tế cũng như tinh thần rất cao.

2.1.2 Một số đặc tính sinh học của cây hoa hồng và yêu cầu ngoại cảnh 2.1.2.1 Đặc điểm sinh học

Thân:

Cây hoa hồng thuộc cây thân gỗ, cây bụi thấp, thẳng hoặc leo, có nhiều

cành, có gai hoặc không có gai Đa số các loài hoa hồng thân đều rỗng ở giữa khi hóa gỗ (Mai Thị Ngoan, 2009).

Rễ

Rễ hoa hồng thuộc rễ chùm, chiều ngang tương đối rộng, khi bộ rễ lớn phát triển nhiều rễ phụ, phân bố nông trên lớp mặt đất mặt từ 5 – 30cm Bộ rễ hoa hồng không chịu được ngập úng, ưa đất ẩm nhưng phải thông thoáng, thoát nước.

Lá

Lá hoa hồng có dạng kép lông chim với 3, 5, 7, 9, 11, 13 lá chét và đính lá kèm ở gốc, xung quanh lá chét có nhiều răng cưa nhỏ và thường có những gai trên gân lá Kích thước chiều dài và chiều rộng lá chét cũng thay đổi tùy thuộc vào các mẫu giống và nhóm giống chẳng hạn như giống hoa cắt cành có lá chét to hơn nhóm hoa tiểu muội Tùy giống mà lá có màu xanh đậm hay nhạt, răng cưa nông hay sâu hay có hình dạng lá khác (Lê Xuân Thiệu, 2007).

Gai

Gai hoa hồng là do biểu bì biến thành, nó giống móc câu, thường là một gai hoặc bụi gai Gai hoa hồng giúp cho cây hoa hồng có khả năng chống chịu tốt với côn trùng và giúp cây thích nghi với điều kiện hạn hán.Hoa

Theo như khảo sát nghiên cứu của Nguyễn Mai Thơm (2009) đã cho kết quả

về đường kính hoa, số cánh hoa, số nhị, số nhụy,… ở một số giống hoa hồng,

hoa hồng thường có cánh bộ 5, ví dụ như hoa hồng Rosa sericea có 4 cánh nhưng hoa hồng Rosa gallica lại có vô số cánh, đó là nét đặc trưng của loại hoa hồng này Hoa thức của phụ hoa hồng Rosoideae là K 4-5 C 5 A 4 G . Hoa hồng Pháp có

hoa dạng đơn, có nhiều cánh sắp xếp hình xoắn ốc cánh hoa mềm, dễ bị dập nát và gãy thuộc loại hoa lưỡng tính, nhị đực và nhị cái trên cùng một hoa, phân hóa đài hoa rõ rệt, nhị hoa nhiều xếp hình xoắn ốc dính vào nhau, nhuỵ hoa nhiều, rời nhau xếp hình xoắn ốc quanh đế hoa, đế hoa lõm hình chén, hoa có màu phớt hồng hay anh đào, có mùi thơm nhẹ

Quả và hạt

Quả hình trái xoan có các cánh đài còn lưu lại, có màu xanh, khi chín có

màu nâu vàng hoặc đỏ tùy theo màu sắc hoa Mỗi quả chứa nhiều hạt nhỏ, có lớp lông trắng bao phủ khả năng nảy mầm của hạt rất kém

do có lớp vỏ dày (Đặng Văn Đông và cs., 2002).

2.1.2.2 Yêu cầu về điều kiện ngoại cảnh

Ánh sáng

Đa số các giống hồng rất chịu nắng, hồng là cây ưa sáng, ánh sáng đầy đủ giúp cây phát triển tốt, đây là yếu tố quan trọng nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của hoa hồng Ánh sáng cung cấp năng lượng cho phản ứng quang hợp, tạo chất hữu cơ cho cây Có tới 90% chất khô trong cây là do quang hợp tạo nên, cường độ quang hợp phụ thuộc và điều kiện ánh sáng Thiếu ánh sáng cây không thể quang hợp được Cường độ quang hợp của cây hoa tăng khi cường độ chiếu sáng tăng, song nếu cường độ ánh sáng vượt quá giới hạn thì cường độ quang hợp bắt đầu giảm đồng nghĩa với việc năng suất và chất lượng hoa đều giảm Sự phân hóa hoa, sự phát dục của hoa, thời gian giãn cách giữa hai lần cắt hoa, trọng lượng và chiều dài cành, màu sắc và diện tích lá đều phụ thuộc ánh sáng Khi cây con còn nhỏ yêu cầu về cường độ ánh sáng thấp hơn, khi tuổi cây càng cao càng yêu cầu ánh sáng nhiều hơn (Đặng Văn Đông và cs., 2002).

- Cường độ quang hợp

Tất cả các giống hoa hồng đều có yêu cầu lượng bức xạ là 1000 Mmol m

-2 S -1 PAR Ở nhiệt độ 22 0 C và điều kiện kéo dài bức xạ, mức quang hợp thuần của hoa hồng khi nồng độ CO 2 là 360 mg/l Sức sinh trưởng của hoa hồng và mùa thu

– đông – xuân cao hơn mùa hè (Đặng Văn Đông và cs., 2002).

Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng đối với sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng bao gồm các yếu tố: nhiệt độ ngày, đêm, chênh lệnh nhiệt độ ngày đêm và nhiệt độ đất (Đặng Văn Đông và cs., 2002)

thương phẩm cao hơn 20,8%.

- Nhiệt độ đêm: nhiệt độ đêm quan trọng hơn nhiệt độ ngày Đa số các

giống thích hợp với nhiệt độ đêm là 16 0 C, nhiệt độ này có ảnh hưởng tốt đến số lượng và chất lượng hoa Thấp hơn nhiệt độ tối thích này cây sinh trưởng chậm, sản lượng thấp nhưng chất lượng hoa cao Nếu cao hơn nhiệt độ tối thích thì cây sinh trưởng nhanh nhưng chất lượng hoa kém.

- Nhiệt độ đất: nhiệt độ đất thích hợp thì sức sống của rễ cao, tăng năng suất

và chất lượng hoa Nhiệt độ đất trên 210C thì nhiệt độ không khí chỉ

5-80C vẫn có hoa chất lượng cao Nhiệt độ đất có thể cao hơn 260C cây vẫn có thể sinh trưởng tốt nhưng cao quá 300C thì ảnh hưởng xấu.

CO2 là yếu tố quan trọng sau nhiệt độ và ánh sáng Lượng CO2 ảnh hưởng tới quang hợp, sinh trưởng và phát dục của cây Nhìn chung các loại hoa có phản ứng với việc bổ sung CO2, phản ứng trực tiếp làm tăng quang hợp, tích lũy chất khô và phản ứng gián tiếp là phản ứng hình thái với đặc trưng làm tăng sự nảy mầm và tăng số lượng hoa Bổ sung thêm

CO2 có thể làm tăng sản lượng và chất lượng hoa, CO2 còn làm tăng hiệu quả của ánh sáng (Đặng Văn Đông và cs., 2002).

Độ ẩm

Độ ẩm của không khí và đất đều ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của cây hoa Độ ẩm thích hợp thì cây hoa sinh trưởng, phát triển tốt ít sâu bệnh, hoa đẹp, chất lượng hoa cao.

Nước đóng vai trò quan trọng trong cơ thể thực vật Nước giữ vai trò quan trọng trong phân chia và dãn của tế bào Khi có đầy đủ nước và môi trường thích hợp, tế bào phân chia, phát triển thuận lợi, cây sinh trưởng nhanh Khi thiếu nước các quá trình sinh lý, hóa trong cây hoa giảm, các hợp chất hữu cơ được tạo thành ít, cây còi cọc, phát triển kém Nếu sự thiếu nước kéo dài, cây hoa có thể khô héo và chết Nhưng, nếu quá nhiều nước, cây sẽ bị úng ngập, sinh trưởng phát triển của cây bị ngừng trệ Mỗi loại hoa yêu cầu độ ẩm khác nhau Hoa hồng thuộc cây ôn đới nên yêu cầu

độ ẩm đất thường khoảng 70 - 80% (Đặng Văn Đông và cs., 2002), nếu khống chế độ ẩm thích hợp thì độ dài cành tăng thêm trung bình 8,2%.

Đất

Đất là yếu tố môi trường quan trọng nhất, là nơi nâng đỡ cây trồng, cung cấp nước, dinh dưỡng cơ bản và không khí cho sự sống của cây hoa Phần lớn các cây hoa yêu cầu đất tơi xốp, thoát nước, có khả năng giữ ẩm, tầng canh tác dày.

Nhìn chung hoa hồng đều thích nghi và phát triển tốt trên những loại đất trung tính và ít chua, rễ phân bố chủ yếu ở tầng đất 60 cm trở lên, một số ít giống phân bố trên 1m Đất trồng hoa hồng tốt nhất là đất đen, đỏ vôi (đất fegazit) hoặc đất đồi giàu mùn Loại đất này kết cấu viên tốt, khối lượng riêng nhỏ, khả năng giữ mùn tốt, thoáng khí, có lợi cho sự phát triển của bộ rễ (Lê Xuân Thiệu, 2007).

Dinh dưỡng khoáng

Nhu cầu dinh dưỡng khoáng và đặc điểm hút dinh dưỡng của cây có liên quan đến nguồn gốc cây và giống Nhu cầu và tác dụng sinh lý của các nguyên tố khoáng với hoa hồng có đặc điểm sau:

- Nitơ (N): là nguyên tố quan trọng nhất của cây, là thành phần của axit amin, protein, axit nucleic, enzym, chất kích thích sinh trưởng, vitamin (chiếm

khoảng 1 – 2% khối lượng chất khô), cây có thể hút N dưới các dạng: NO 3 - ,

NH 4 + , N ảnh hường rất lớn tới sản lượng và chất lượng hoa hồng Thiếu N cây sinh trưởng chậm, phân cành yếu, cành, lá nhỏ, diệp lục ít, lá biến vàng,

lá già và dễ bị rụng, rễ nhỏ dài và ít, cây thấp, khả năng quang hợp giảm.

- Phospho (P): tham gia vào thành phần quan trọng của axit nucleic và màng tế bào, tạo thành ATP là vật chất mang và tải năng lượng P thường chiếm từ 1 – 1,4% khối lượng chất khô của cây Cây hút P dưới dạng H 2 PO 4 - và HPO 4 2- , P có

thể di chuyển trong cây, chủ yếu tập trung ở phần non Khi thiếu P thì phần già biểu hiện trước P cũng ảnh hưởng lớn đến phẩm chất cây, thiếu P dẫn tới tích lũy N dạng nitrat gây trở ngại cho việc tổng hợp protein, cành, lá, rễ sinh trưởng chậm, cây thấp, lá có màu tím tối hoặc tím đỏ ảnh hưởng đến tổng hợp chất tinh bột, hoa nở khó, nhiều P quá sẽ ức chế sinh trưởng dẫn tới thừa sắt, lá biến vàng, ảnh hưởng tới sự hút sắt.

- Kali (K): không tham gia thành phần cấu tạo cây, thường tồn tại trong dịch bào dưới dạng ion Tác dụng chủ yếu của K là điều tiết áp suất thẩm thấu của tế bào, thúc đẩy quá trình hút nước, hút dinh dưỡng của cây Khi ánh sáng yếu K có tác dụng kích thích quang hợp, tăng sức đề kháng cho cây Trong cây, K di động tự do Nếu thiếu K, sự sinh trưởng, phát dục của cây giảm sút, mép lá thiếu màu xanh, ngọn lá khô héo sau đó lan ra toàn lá, các đốt ngắn lại, nụ hoa nhỏ và dễ trở thành hoa mù K là nguyên tố mà cây hút nhiều nhất, (gấp 1,8 lần N) K ít ảnh hưởng tới sự phát triển của cây so với N và P Tuy nhiên, thiếu

K cây sinh trưởng kém, ít nhiều ảnh hưởng tới việc hút canxi và magie từ đó ảnh hưởng đến

độ cứng của thân, cành và chất lượng hoa.

- Canxi (Ca): chủ yếu tham gia vào sự tạo vách tế bào và hoạt hóa nhiều loại enzym, có tác dụng tới việc duy trì công năng của màng tế bào và duy trì cân bằng với môi trường bên ngoài Trong cây, Ca không di động tự do Nếu thiếu Ca, phần bị hại trước tiên là chóp rễ sau đó là đỉnh ngọn chồi bị xám đen và chết, quanh mép lá non xuất hiện những vết màu tím tối rồi lá khô và rụng, nụ bị teo và rụng (Hoàng Minh Tấn và Nguyễn Quang Thạch, 1993).

- Magie (Mg): tham gia vào hoạt chất của nhiều loại enzym và tham gia vào thành phần của chất diệp lục Thiếu Mg ảnh hưởng tới quang hợp, mặt dưới của gân lá màu vàng, nếu thiếu quá, gân lá sẽ thâm đen, lá bị rụng.

- Sắt (Fe): là thành phần của nhiều loại enzym có liên quan tới quang hợp Nếu thiếu sắt, quang hợp sẽ giảm, lá non thiếu màu xanh Sắt không di động được trong cây Triệu chứng thiếu sắt trước hết biểu hiện ở các phần non Trong đất sắt thường tồn tại ở dạng Fe 2 O 3 , cây hút sắt ở dạng FeSO 4 Nói chung trong đất sắt không thiếu nhưng

do có nhiều hợp chất cây không hút được dẫn tới thiếu Khi hàm lượng axit phospho cao, sắt không hòa tan được, khi pH trên 6,5 sắt cũng sẽ bị kết tủa (Mai Thị Ngoan, 2009).

- Mangan (Mn): không phải là thành phần của diệp lục nhưng có quan hệ chặt chẽ với sự hình thành diệp lục và quá trình quang hợp Nếu thiếu Mn, quang

7

hợp sẽ giảm Mn làm tăng hoạt tính của rất nhiều loại enzym Trong cây, Mn

và sắt có tính đối kháng, nhiều Mn thì thiếu sắt, sắt quá nhiều thì thiếu Mn Khi thiếu Mn, trên lá xuất hiện nhiều vết vàng (Lê Xuân Thiệu, 2007).

- Đồng (Cu): có trong các coenzym, trong nhiều loại enzym oxidase, tham gia vào quá trình oxy hóa khử trong cây Cu có quan hệ rất chặt chẽ với việc hình thành chất diệp lục, quan hệ tới hiệu suất quang hợp đồng thời còn tham gia vào quá trình trao đổi của đường và protein (Mai Thị Ngoan, 2009).

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY IN VITRO CÂY HOA HỒNG VÀ

MỘT SỐ CÂY TRỒNG KHÁC

2.2.1 Nghiên cứu về nhân nhanh in vitro cây hoa hồng và một số cây trồng khác

Nghiên cứu nước ngoài

Theo Gerard C Douglas et al (1989), sử dụng đỉnh sinh trưởng của hoa hồng Queen Elizabeth nuôi cấy trong môi trường MS + 1mg/l

BA + 0,1mg/l α-NAA + 0,1mg/l GA3 và thấy rằng ở môi trường này tỷ

lệ sống là cao nhất, một chu kì cấy chuyển là 3 tuần Nồng độ BA cao

có ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng của chồi và rễ.

Theo Robert et al (1990), tiến hành nuôi cấy in vitro giống hoa hồng nhị bội Rosa Wichuraiana trong môi trường lỏng chứa 0,005 Colchicine trong 12h, sau 7 ngày, hình thành khối tế bào tứ bội (4n) chiếm 32,7% từ đó

có thể tạo ra giống mới có ý nghĩa trong công tác lai tạo giống.

Theo G Y Wang et al (2002), đã nghiên cứu cảm ứng ra hoa của hoa hồng trong nuôi cấy in vitro Thí nghiệm được bố trí, các cây con được nuôi trong ống nghiệm với môi trường MS cơ bản có bổ sung 400 mg/l- myo-inositol

và phytohormone kết hợp với chất điều tiết sinh trưởng khác nhau như sau: BA kết hợp với α-NAA; Thidiazuron (TDZ) với α-NAA và zeatin (ZT) với α-NAA Kết quả cho thầy, tỷ lệ mẫu có hoa cao nhất là 49,1% và 44,1% trong môi trường bổ sung 0,5 mg/l TDZ và 0,1 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l ZT và 0,1 mg/l α-NAA cho kết quả tương tự Nụ hoa được phát sinh từ ngày thứ 15 đến 30 trong môi trường nuôi cấy và phát triển hoa bình thường Nghiên cứu cũng cho thấy môi trường nuôi cấy ban đầu và thời gian nuôi cấy trước ra hoa là hai yếu tố quan trọng cho việc rạo hoa in vitro Các cây trồng 156-561 ngày từ môi trường gốc và nuôi cấy trong môi trường ra hoa trong 45 ngày là tốt nhất cho việc tạo hoa.

Theo Soomro et al (2003), để tạo rễ của cây Rosa indica đã sử dụng 0,6 mg/l

IBA và 0,1 mg/l α-NAA sau khoảng thời gian 12 tuần thì rễ sẽ tăng 50%, để tạo chồi của cây Rosa indica đã sử dụng 2,0 mg/l IBA và 2,0 mg/l IAA sau khoảng 12 tuần tỷ lệ chồi 70%.

Theo kết quả của Roy et al (2004), khi sử dụng 1 mg/l và 0,5 mg/

l IAA để tạo rễ cho cây Rosa sp thì sau 4 tuần đã cho kết quả cao (85% rễ của cây Rosa sp được tạo ra).

Theo Ali Nikbakht et al (2005), nghiên cứu về khả năng tái sinh của hai giống hoa hồng “Azaran” và “Ghamsar” trong ống nghiệm của BA, α- NAA, GA3 đến sinh trưởng của chồi Nhóm tác giả đã kết hợp các chất trên với các nồng độ khác nhau Số lượng chồi cao nhất đạt được trên môi trường MS có bổ sung 1-2 mg/l BA; 0,1 mg/l GA3; 0 – 0,1 mg/l α-NAA đối với giống “Azaran” và 1 – 2 mg/l BA; 0,1 mg/l GA3 đối với giống “Ghamsar”.Theo Al-Khalifah et al (2005), nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên sự sinh trưởng của hoa hồng (Rosa hybrid L.) trong ống nghiệm cho thấy, khi sử dụng 3,0 mg/l BA kết hợp với 2,0 mg/l kinetin và 40 g/l sucrose thì cây Rosa hybrid có tỷ lệ chồi tăng 71,1%.Theo Zohreh Jabbarzadeh and Morteza Khosh-Khui (2005), nghiên cứu Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô của hoa hồng Damask (Rosa damascena Mill.) Nghiên cứu này đã được tiến hành để đánh giá khả năng tái sinh của hoa hồng Damask Các mẫu được khử trùng bằng 10% clorox trong 15 phút và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung với nồng độ khác nhau BA hoặc kinetin riêng biệt hoặc kết hợp với các nồng độ IBA Sự kết hợp của BA 2,5-3 mg/l và IBA 0,1 mg/l là nồng độ thích hợp nhất cho sự tăng sinh Một số thí nghiệm đã được thực hiện để kích thích

sự ra rễ trong ống nghiệm của hoa hồng Damask Nghiên cứu trong môi trường khác nhau như MS, 1/2 MS, 1/3 MS và 1/4 MS với nồng độ khác nhau của acid indolo-3-acetic (IAA), IBA và NATPT không đạt được kết quả khả quan Phương pháp nhân nhanh sử dụng các giải pháp IAA, IBA và α-NAA đã khử trùng 0-2000 mg/l Các phương pháp điều trị khác như sử dụng các nồng độ khác nhau của abscisic acid (ABA) kết hợp với các nồng độ khác nhau của IAA, IBA và NAA, và sử dụng các nồng độ khác nhau của sucrose và agar không tạo ra bất kỳ rễ nào Cách

xử lý tốt nhất để rễ của chồi là 2,5 mg 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) trong

2 tuần trong môi trường MS và sau đó chuyển các mẫu đến môi trường MS mà không có bổ sung chất điều tiết tăng

trưởng Cây ươm đã được làm quen với đất trong hỗn hợp đất gồm rong than bùn và cát 1: 1 (v / v) và chuyển thành công vào nhà kính sau 3 tuần.

Theo Hamed et al (2006), để tạo chồi của cây Rosa indica đã sử dụng 1,5 mg/l BAP sau 7 ngày đã cho kết quả cao (100% chồi hình thành) Còn khi sử dụng 5 mg/l BAP và 0,5 mg/l kinetin thì sau 10 ngày có 98% chồi hình thành Theo kết quả nghiên cứu của Khosravi et al (2007), trên cây Rosa hybryd sử dụng 4 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M BAP kết hợp với 0,5 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.

Theo Naphaporn (2009), nuôi cấy tạo chồi từ mắt thân của hoa hồng (Rosa hybrida L cv “Perfume Delight) đã đưa ra kết luận: chồi phát triển tốt trên môi trường MS có bổ sung 3 mg/l BA và 0,003 mg/l α-NAA Một chu kì cấy chuyển là 4 tuần, môi trường ra rễ thích hợp là

¼ MS không bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, sau 2 tuần ra rễ phát triển đầy đủ có thể đem ra trồng ngoài vườn ươm.

Theo Murali et al (2011), sử dụng môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP, 30 g/l adenine sunphate, 30% sucrose để nhân nhanh chồi hoa hồng Rosa bourboniania đạt hiệu quả cao.

Theo nghiên cứu của Anchalee Jala et al (2014), Ảnh hưởng của α-NAA,

BA và 2,4D trong nuôi cấy mô hoa hồng nhỏ (Rosa miniature) cho thấy 100% mẫu bật chồi trong môi trường MS có bổ sung 1,0mg/l BA và 1,0mg/l α-NAA Sau đó các chồi này được chuyển vào môi trường MS có chứa α-NAA (0,5 và 1,0mg/l) và BA (0,5 và 1,0mg/l) hoặc chỉ chứa 2,4-D (0,1; 0,5; 1,0mg/l) trong 6 tuần Môi trường có nồng độ 0,5mg/l 2,4-D thích hợp để tạo callus.

Nghiên cứu trong nước

Đến nay các nghiên cứu về hoa hồng ở nước ta chủ yếu là nghiên cứu

về công tác chọn tạo giống để chọn tạo ra các giống hoa hồng có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt, chất lượng hoa cao, ít bị sâu bệnh hại Ngoài các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết, ghép…, các nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cũng đã được chú ý phát triển.

Theo Nguyễn Thị Kim Thanh và cs (2005), tiến hành nhân nhanh in vitro trên giống hoa hồng trắng (Rosa alba) và hoa hồng đỏ (Rosa rubus), sử dụng các nồng

độ BA và Kinetin khác nhau đánh giá khả năng tạo chồi với cả 2 giống Kết quả cho thấy đối với giống hồng đỏ sử dụng nồng độ là 2 ppm BA cho hệ số nhân cao nhất

là 3,47, với giống hồng trắng là 1,5 ppm BA cho hệ số nhân cao nhất là

5,94 pH = 6 là thích hợp cho cả hai loại hoa hồng Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh: môi trường bổ sung 2 mg/l α-NAA hoặc 2 mg/l IBA cho hiệu quả tạo rễ trên 60% Ngoài ra các quy trình nhân giống in vitro đối với đoạn cành hoa hồng tạo ra giống sạch bệnh cũng đã được nghiên cứu.

Theo Nguyễn Kim Hằng (2005), trên cây hoa hồng (Rosa chinensis) sử dụng 1,5 mg/l BA cho hệ số nhân chồi cao nhất, sử dụng α-NAA riêng lẽ (1 mg/l) hoặc α- α-NAA (2mg/l) kết hợp với than hoạt tính (2 g/l) để tạo cây hoàn chỉnh là tốt nhất Nguyễn Mai Thơm và cs (2006), tiến hành nghiên cứu các đặc điểm thực vật học trên mẫu hoa hồng tiểu muội (Rosa floribunda hybyd) trồng trong chậu

có nguồn gốc địa phương và nhập nội Kết quả cho thấy, hồng tiểu muội có sức sống và khả năng sinh trưởng tốt hơn các giống hồng khác, ra hoa từng chùm nhưng tỷ lệ nhiễm bệnh cao hơn các giống hồng khác.

Theo Lê Minh Lý (2007), trong giai đoạn nhân chồi của giống hoa hồng Rosa hybride bổ sung thêm 1-2 mg/l BA là thích hợp để nhân chồi Nguyễn Hữu Tính (2008), đối với cây hoa hồng nhung (Rosa chinensis L): sử dụng 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,15 mg/l α-NAA cho

hệ số nhân chồi cao nhất, sử dụng 0,5 mg/l α-NAA kết hợp với 2 mg/l than hoạt tính để tạo cây hoàn chỉnh là tốt nhất.

Theo Nguyễn Thị Phương Thảo và cs (2015), đối với hoa hồng cơm (Rosa sericea LINDL), sử dụng môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l

BA và 0,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ tạo chồi 99,78%, với nồng độ 1,5 mg/l

BA nhân nhanh chồi tốt nhất với hệ số 2,73 và chiều cao chồi 1,69

cm, còn môi trường ¼ MS là môi trường tốt nhất cho sự ra rễ (100%) 2.2.2 Nghiên cứu về tạo mô sẹo.

Theo G.R.Ruot et al (1991), tạo callus từ mô sinh dưỡng giống Rosa hybrid, từ lá và phần thân non, nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung thêm 2,2 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M BA, 5,4 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M α-NAA và 2,2-9,0 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M 2,4-D, sau đó callus được nuôi trong môi trường 1/2 MS + 2,2 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M BA + 0,05 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M α-NAA + 0,3 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M GA3 + 200-

800 mg/l proline trong 8 tuần rồi được nhân lên trong môi trường thiếu proline 16 tháng thì có 25% mô nảy mầm trên môi trường 1/2 MS + 2,2 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M

L-BA + 0,3 μM L-BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M GA3 + 24,7 μM L-BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M adenine sulfat sau 4 ngày.

Theo Chi-ni Hsia and Schuyler S Korban (1996), các tế bào sinh dưỡng nuôi trong môi trường có 10, 100 hoặc 200 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M 2,4-D tạo ra sự phát triển callus

của giống hoa Rosa hybrida và Rosa chinensis minima Sau đó chuyển khối callus sang môi trường có chứa 23 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M TDZ và 3 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M GA3 có 3,3%

mô sẹo hình thành cơ quan, 6,6% phát sinh tế bào sinh dưỡng.

Lê Minh Lý và cs (2007), nghiên cứu tạo mô sẹo đối với mẫu lá và cành

in vitro thuộc giống Rosa hybrida gồm hai màu đỏ và trắng tìm ra được nồng

độ 2,4 – D bổ sung vào môi trường nền thích hợp nhất tạo nên callus là 0,5mg/l.

Theo Yaghoob Safdari and Seyed Kamal Kazemitabar (2010), kích thích tạo callus hoa hồng bằng môi trường MS bổ sung với 30 g /

l sucrose, 8 g / l agar kết hợp với chất điều tiết sinh trưởng α-NAA ở hai nồng độ (5 và 10 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M) và BAP ở ba nồng độ (2,5, 5 và 10 μM BAP kết hợp với 0,5 μM α-NAA cho hệ số nhân chồi cao nhất.M).

Theo Anchalee Jala (2014), nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến sự kích thích và tạo thành callus với hoa hồng mini (Miniature) in vitro Thí nghiệm được bố trí như sau: Gốc có mắt được nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản được bổ sung nồng độ )0,1; 0,2; 0,5; 2, 5; 10 mg/l) 2,4- D, kết quả thu được, ở môi trường bổ sung 2,5mg/l 2,4-D cho số lượng callus lơn nhất Khi nuôi callus trong môi trường MS có

bổ sung α-NAA với nồng độ (0,1; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l) và BA (0,1; 0,5; 1,0mg/l) kích thích tạo chồi từ mô sẹo, kết quả cho thấy callus nuôi trong môi trường MS được

bổ sung α-NAA 1,0 mg/l và BA 1,0 mg/l khi cấy xuống đất tất cả các chồi được hình thành có cùng kích cỡ với môi trường bổ sung nồng độ α-NAA khác nhau (0,5 và 1,0 mg / l) và (0,5 và 1,0 mg / l) BA, và (0,1, 0,5 và 1,0 mg / l) 2,4-D trong 6 tuần Chiều cao của cây và tỷ lệ phần trăm của sự hình thành rễ, nhưng thời gian của chúng là khác biệt nhưng thời gian ra hoa là không đáng kể.

2.2.3 Giới thiệu về công nghệ nano và nano bạc, nano đồng

Công nghệ nano là một khoa học phát triển nhanh chóng của sản xuất và sử dụng các hạt nano có kích thước đo bằng nm Một vật liệu nano có ứng dụng rộng rãi trong sản xuất và nghiên cứu là nano bạc.

Theo Nguyễn Ngọc Tú (2009), Nguyễn Ngọc Hùng (2012) công nghệ nano dựa trên ba cơ sở khoa học chính:

+ Chuyển tiếp từ tính chất cổ điển đến tính chất lượng tử: khác với vật liệu khối, khi ở kích thước nano thì các tính chất lượng tử được thể hiện rất rõ ràng Càng ở kích thước nhỏ thì các tính chất lượng tử càng thể hiện một cách rõ ràng hơn.Ví

dụ một chấm lượng tử có thể được coi như một đại nguyên tử, nó có các mức năng lượng giống như một nguyên tử.

+ Hiệu ứng bề mặt: Cùng một khối lượng nhưng khi ở kích thước nano chúng có diện tích bề mặt lớn hơn rất nhiều so với khi chúng ở dạng khối Điều này, có ý nghĩa rất quan trọng trong các ứng dụng của vật liệu nano có liên quan tới khả năng tiếp xúc

bề mặt của vật liệu như các ứng dụng của vật liệu nano làm chất diệt khuẩn Đây là một trong những tính chất quan trọng làm nên sự khác biệt của vật liệu có kích thước nanomet so với vật liệu ở dạng khối.

+ Kích thước tới hạn: Kích thước tới hạn là kích thước mà ở đó vật giữ nguyên các tính chất về vật lý, hóa học khi ở dạng khối Nếu kích thước vật liệu mà nhỏ hơn kích thước này thì tính chất của nó hoàn toàn bị thay đổi Mỗi vật liệu đều có những kích thước tới hạn khác nhau và bản thân trong một vật liệu cũng có nhiều kích thước tới hạn ứng với các tính chất khác nhau của chúng Bởi vậy khi nghiên cứu vật liệu nano chúng ta cần xác định rõ tính chất sẽ nghiên cứu là gì Vật liệu nano có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích thước tới hạn của các tính chất của vật liệu Chính nhờ những tính chất lý thú của vật liệu ở kích thước tới hạn nên công nghệ nano có ý nghĩa quan trọng và thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu.

Theo Pham Van Viet et al (2016) đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của hạt nano đồng được tổng hợp bằng phương pháp hoá học Kết quả thí nghiệm cho thấy quá trình tổng hợp các hạt nano đồng Cu Nps trong thời gian phản ứng ngắn bằng phương pháp giảm hóa học với sự hỗ trợ của tác nhân khử CTAB Các tính chất của chúng được xác định bằng phổ hấp thụ UV-Vis có tia cực tím, phân tích XRD X-quang, quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier FT-IR, và ảnh TEM bức xạ điện tử Hoạt tính kháng nấm của Cu Nps được đánh giá bằng cách kiểm tra Fusarium sp Hạt nano Cu được thu được với kích thước trung bình trong khoảng 20-50 nm có hình dạng hình cầu Khảo sát cho thấy khi nano Cu được sử dụng ở nồng độ 450 ppm trong 9 ngày ủ, 93,98% nấm phát triển đã bị ức chế.

2.2.4 Cơ chế diệt khuẩn, nấm của nano bạc, nano đồng và ứng dụng.

Theo J.O Noyce et al (2006), nghiên cứu khả năng sử dụng bề mặt đồng

để giảm sự tồn tại của bệnh Staphylococcus aureus kháng meticillin trong y tế Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá hiệu quả của đồng tới sự tồn tại của 3 chủng MRSA (MRSA (NCTC 10442), EMRSA-1 (NCTC 11939) và EMRSA-16 (NCTC 13143)] ở nhiệt độ 22 o C hoặc 4 o C Kết quả cho thấy, ở 22 o C trong thời gian 45, 60 và 90 phút đã giết chết hoàn toàn MRSA, EMRSA-1 và EMRSA-16, còn ở 4 o C đã giết chết 3 chủng hoàn toàn trong 6 giờ.

Theo S Anita et al (2011), nghiên cứu tính chất kháng khuẩn của hạt nano CuO trên vải bông cho thấy, các hạt nano đồng oxit được điều chế bằng phương pháp hoá ướt với kích thước 50 nm được phủ lên vải bông có tính kháng khuẩn cao và có thể được ứng dụng trong may mặc.

Theo Nguyễn Đình Lâm và cs (2012), bạc là kháng sinh tự nhiên và không gây tác dụng phụ Nano bạc không gây phản ứng phụ, không gây độc cho người và vật nuôi khi nhiễm lượng nano bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ < 100 ppm) Nano Bạc có đặc tính ưu việt hơn nhiều lần so với các sản phẩm kháng khuẩn khác trong việc làm sạch khuẩn và ngăn vi khuẩn phát triển tới 99.9% Công nghệ Nano bạc giúp chia nhỏ các phân tử bạc, dàn mỏng thành một lớp tráng siêu mỏng trên đồ dùng, làm tăng tính năng làm sạch khuẩn của bạc Đồng thời, nano bạc có khả năng hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, tấn công và phá vỡ màng tế bào của gần 650 loại vi khuẩn đơn bào gây hại, đặc biệt là 2 chủng Staphylococcus (gây ung thư) và E coli (gây tiêu chảy) và đặc biệt hơn còn có tính năng khử mùi khi sử dụng.

Theo Lê Quang Luân và cs (2014), nghiên cứu hiệu ứng kháng nấm Phytophthora capsici gây bệnh chết nhanh ở cây hồ tiêu của chế phẩm nano bạc – chitosan chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ cho thấy, trong khoảng nồng độ nano bạc bổ sung từ 20 đến 100 ppm đều có tác dụng ức chế sự phát triển khuẩn lạc nấm P capsici tương ứng từ 22,6% đến 92,9% Hiệu lực ức chế sự phát triển của nấm gia tằng khi giảm kích thước của hạt nano từ 15 nm xuống 5

nm Ở kích thước 5 nm hiệu lực ức chế nấm đạt 100% ở nồng độ 40 ppm, trong khi đó ở kích thước 10 nm đạt 92,9% ở nồng độ 100 ppm.

Theo Karimiyan A et al (2015), nghiên cứu tác dụng kháng nấm của Oxit Magiê, Oxit kẽm, Oxit Silicon và Oxit đồng chống lại nấm Candida albicans cho thấy, nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ ức chế tối đa của nano CuO là 400 µg/mL, hạt nano ZnO và CuO có đặc tính chống lại C albicans và có thể được

sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm trùng do nấm này.

Theo Pegah Kalatehjari et al (2015), đã nghiên cứu đánh giá hiệu quả kháng nấm của hạt nano đồng đến sự phát triển của nấm Saprolegnia sp trên trứng cá trắng (Rutilus frisii kutum) cho thấy, nấm Saprolegnia sp được phân lập từ trứng cá trắng (Rutilus frisii kutum) nuôi trong môi trường có sổ sung nồng độ

Nghiên cứu này cho thấy các tính chất chống nấm của hạt nano đồng

có thể thay thế cho chất malachite green là chất gây ưng thư.

2.2.5 Công nghệ nano trong nuôi cấy in vitro.

Theo Shin HS et al (2004), tác dụng diệt khuẩn của ion bạc được thể hiện ở chỗ ion bạc có khả năng biến đổi cấu trúc tế bào Các ion bạc sẽ kết hợp và tác dụng với nhóm sulfate của enzyme có trong màng tế bào và làm biến đổi hình thái của màng dẫn đến việc cố định enzyme từ đó gây tổn thương cho màng tế bào của

vi khuẩn, giúp ion bạc xâm nhập vào trong cơ thể của vi khuẩn dễ hơn Bên trong

cơ thể của vi khuẩn các hạt ion bạc sẽ tiếp tục tác dụng với các bộ phận khác của

tế bào bằng việc tác dụng với nhóm sulfate và các vị trí hoạt động của enzyme Chính sự tương tác đó là nguyên nhân để khử hoạt tính của enzyme dẫn đến giết dần vi khuẩn Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA

và trung hòa điện tích của gốc phosphate trong tế bào Ion bạc tác dụng với DNA làm cho vi khuẩn không thể tái tạo mARN để sao chép tạo các protein mới Biến đổi

đó sẽ làm cho vi khuẩn phát triển chậm và cuối cùng sẽ bị tiêu diệt Các hạt nano bạc có kích thước từ 1 – 10 nm thì thể hiện tác động rất mạnh đối với vi khuẩn Do

ở kích thước nhỏ thì khả năng tác động và thâm nhập của hạt nano bạc qua lớp màng của vi khuẩn là rất tốt Vì thế, tác dụng diệt khuẩn ở bên trong cơ thể vi khuẩn là rất hiệu quả Đồng thời, ở kích thước nano thì diện tích bề mặt của hạt nano là lớn hơn rất nhiều so với khối hạt của nó Cho nên khả năng tương tác với

vi khuẩn thông qua việc tiếp xúc bề mặt tăng lên Nếu kích thước của hạt nano bạc càng nhỏ thì càng tốt Bởi vì, kích thước càng nhỏ thì đặc tính diệt khuẩn đã nêu trên là rất lớn Khi các hạt nano kim loại ở kích thước 5nm chúng sẽ có khả năng gây nên các hiệu ứng điện tử tức là sự biến đổi cấu trong trúc điện tử của bề mặt.

Do đó, khả năng hoạt động của bề mặt hạt nano phân tử được tăng cường mạnh

mẽ Kích thước hạt nano giảm thì phần trăm tiếp xúc của các phân tử tương tác tăng lên Các hạt nano bạc thường có dạng hình khối, số lượng các mặt hình khối cho thấy khả năng tác dụng với vi khuẩn ở mức độ cao hay thấp Số lượng mặt càng nhiều thì khả năng diệt khuẩn càng cao Đồng thời, trong quá trình sử dụng hạt nano bạc thường ở trong dung dịch phân tán Nơi mà một lượng nhỏ ion bạc

đã được che dấu và đóng góp một phần cho khả năng diệt khuẩn của phân tử nano bạc.

Theo J Montag et al (2006), nghiên cứu cơ chế tác động của đồng ôxit

và đồng sunphat lên bào tử đỉnh của Venturia inaequalis được phân lập từ vỏ táo Các kết quả được đánh giá bằng 2 phương pháp nhuộm huỳnh quang: Fluorescein diacetate (FDA) cho thấy hoạt tính esterase, tính toàn vẹn của

màng bào tử và cyanoditolyl tetrazolium chloride (CTC) được đưa vào để kiểm tra sự toàn vẹn của chuỗi hô hấp ty lạp Dung dịch đồng sunphat hoặc đồng ôxit được phun lên bào tử đỉnh với nồng độ 1, 10, 25 mol/l sau 24h, kết quả cho thấy các bào tử đỉnh đều không nảy mầm ở các nồng độ trên Với ôxit đồng thấy có biểu hiện một số huỳnh quang dư khi nhuộm FDA, trong khi đó chúng không phát huỳnh quang khi nhuộm bằng CTC Điều đó chứng tỏ thuốc trừ nấm từ đồng diệt các bào tử bằng cách ức chế sự hô hấp ti thể.

Theo Humberto H Lara et al (2009), đã nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn của hạt nano bạc đến các vi khuẩn kháng thuốc Dung dịch huyền phù nano bạc đã tiêu diệt được các vi khuẩn kháng thuốc Pseudomonas aeruginosa , Escherichia coli O157: H7 và Streptococcus pyogenes kháng với erythromycin Nghiên cứu cho thấy nano bạc có thể tiêu diệt được các vi khuẩn Gram âm và Gram dương.

Nguyễn Thị Thành Loan và cs (2010) Nghiên cứu chế tạo vật liệu khử khuẩn AG/TIO 2 kích thước nano và đánh giá hiệu lực diệt khuẩn E Coli Thí nghiệm thực hiện như sau, vật liệu nano Ag/TiO 2 được điều chế ở nhiệt độ thấp bằng natri Citrat làm chất khử Kết quả cho thấy, kích thước hạt trung bình của TiO 2 trong số các vật liệu nano này khoảng 80-120 nm, và kích thước hạt trung bình của nano bạc là khoảng 10 nm Bằng hoạt tính kháng khuẩn thấy rằng tỷ lệ

ức chế tăng trưởng đối với E coli là 100% như ban đầu trong nồng độ E coli là 2,6 x 10 6 CFU/ml và thời gian tiếp xúc là 10 phút.

Theo Ali Sorooshzadeh et al (2012), nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc đến sự phát triển của nghệ tây trong điều kiện ngập úng Khỉ xử lý nano bạc với nồng độ 50–100 ppm giúp tăng trưởng chiều cao cây, chiều dài của rễ, trọng lượng của lá…

Theo A.A.Rostami and A.Shahsavar (2009) đã bổ sung nồng độ nano bạc (0,

4, 8, 16 mg/l) vào môi trường nuôi cấy cành Olive, theo dõi trong 30 ngày Kết quả ở nồng độ 4mg/l môi trường 100% mô cấy không nhiễm và trên 90% mô cấy phát triển bình thường Ngâm mẫu trong các nồng độ nano bạc (0, 100, 200, 300, và 400 mg/l) sau khi rửa mẫu với ethanol 70% và Clorox 10% với thời gian tiếp xúc 1 giờ Kết quả cho thấy: Ngâm mẫu trong các nồng độ nano bạc sau khi rửa với ethanol 70%

và Clorox 10%, hoàn toàn ngăn chặn các loại nấm và vi khuẩn nhiễm bẩn Tuy nhiên, nano bạc cũng ảnh hưởng đến khả năng phát triển

của mô cấy ô liu và rất ít mô cấy phát triển (nano bạc ở nồng độ 100 mg/L chỉ gần 20% mô cấy phát triển).

Theo Nabeel K.Al-Ani (2011), đã ngiên cứu sử dụng nano để tăng hiệu quả khử trùng in vitro đối với cây lá máu Khi bổ sung vào môi trường nano bạc với nồng độ 4, 8, 12 mg/l cho thấy tỷ lệ chồi không nhiễm đạt từ 45- 100% Tuy nhiên ở nồng độ 4 mg/l, cây phát triển tốt nhất ở 28 ngày.

Theo Kamran Safavi et al (2011), nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của nano bạc và đánh giá sử dụng nano bạc trong môi trương nuôi cấy cơ bản cho thấy, ở nồng độ 50 mg/l bổ sung vào môi trường

MS có khả năng kiểm soát hoàn toàn vi khuẩn.

Theo Masoud Fakhrfeshani et al (2012), đã nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu nuôi cấy hoa huệ ở các nồng độ 25, 50, 100, 200 ppm với thời gian tương ứng 15, 30, 60, 180 phút Kết quả cho thấy ở nồng độ

200 ppm và thời gian 60 phút cho tỷ lệ mẫu sạch bệnh là 89,1%.

Theo Hediat M H Salama (2012), nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc trong khử trùng mẫu lạc và ngô Khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy hạt nồng độ nano bạc 20, 40, 60, 80, 100 ppm thấy từ nồng độ 20 đến 60 ppm làm tăng chiều dài của chồi, diện tích bề mặt lá, hàm lượng prôtêin và cacbohidrat Ở nồng độ 40 – 60 ppm làm tăng tuổi thọ của cành và gốc Theo Saber Shokri et al (2014), nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc khác nhau trong việc loại bỏ vi khuẩn và dịch phenol của hoa hồng (Rosa hybrida L.) trong nuôi cấy mô Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng nồng độ nano tương ứng 0, 100, 200, 400 ppm để ngâm ngập mẫu hoặc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nano với nồng độ 0, 50, 100,

150 ppm làm giảm khả năng nhiễm khuẩn từ 70% đến 17,5%, tỷ lệ mẫu sạch trong môi trường nuôi cấy bổ sung 150 ppm là 87,5%, tỷ lệ sống sót trong tổng số mẫu sạch ở nồng độ này là 100% Còn ở nồng độ 200 ppm khi khử trùng mẫu là 80% và tỷ lệ sống trong tổng số mẫu sạch là 90%, ở nồng độ

400 ppm tỷ lệ mẫu sạch là 90%, nhưng tỷ lệ mẫu sống sạch là 75%.

Theo Emad A Ewais et al (2015), đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các hạt nano bạc biosynthesized (BạcNPs) vào tăng trưởng, giải phẫu học,

và protein và DNA của Solanum nigrum Môi trường MS + 3.0 mg/l NAA + 5.0 mg/l BA bổ sung thêm nano bạc với các nồng đô 0, 2, 4, 8 mg/l được đánh giá

tác động cảm ứng mô sẹo từ các mẫu cấy lá của Solanum nigrum Kết quả cho thấy sau 10 ngày ở môi trường không bổ sung nano bạc đã xuất hiện mô sẹo nhỏ màu trắng, xanh trong khi đó sau 10-13 ngày trên các môi trường có bổ sung nano bạc đã xuất hiện mô sẹo lớn hơn, có màu trắng, xanh hoặc vàng Ở môi trường bổ sung 8mg/l nano bạc mô sẹo xốp có màu trắng xanh.

Theo Ahmadian M et al (2015), cho kết quả khử trùng mẫu cây cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.), sau khi khử trùng bằng 70% ethanol và 2.5% Clorox, sử dụng 200 ppm nano bạc trong thời gian 20 phút là tốt nhất.

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Địa điểm: phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian: 7/2016 – 5/2017.

3.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Giống hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.) thu thập tại Sapa tỉnh Lào Cai.

nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Khử trùng mẫu.

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử hỗn hợp nano đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.

bạc-Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.

Nội dung 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Nội dung 4: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng

BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

Nội dung 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến

sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp

Tỉ lệ số mô bật chồi (%) = (Tổng số mô bật chồi/Tổng số mẫu thí nghiệm)

Hệ số nhân chồi = Số chồi nhân lên/Tổng số mẫu ban đầu.

Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = (Tổng chồi ra rễ/Tổng số mẫu in vitro)*100.Chiều dài trung bình của chồi (cm) = Tổng chiều dài của chồi/Số chồi.

Số lá/chồi = tổng số lá của chồi/Số chồi.

Chiều dài trung bình của rễ (cm) = Tổng chiều dài của rễ/Số rễ 3.5.3 Bố trí thí nghiệm

3.5.3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu

Trước khi tiến hành thực hiện thí nghiệm nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu của nồng độ và thời gian xử lý hỗn hợp nano Chúng tôi thực hiện các bước sau:

B1 Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch bụi đất.

B2 Đưa mẫu vào phòng nuôi và rửa lại bằng nước cất vô trùng thêm 2-3 lần nữa.

B5 Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần cho sạch cồn.

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Khử trùng mẫu với các công thức khác nhau:

- CT1: javen thương mại 5% lắc mẫu trong vòng 5 phút (đối chứng).

(CT2, CT3,CT4, CT5 thực hiện trong 1 giờ, cú 15 phút lắc một lần).

Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần tiên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp.

Sử dụng nồng độ hỗn hợp nano tốt nhất ở thí nghiệm 1.1 và xử lý ở 5 thời gian khác nhau là (30, 45, 60, 75, 90 phút) tương ứng với 5 công thức Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần liên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu.

Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống.

3.5.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng PhápThí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp Đoạn thân mang mắt ngủ sau khi được khử trùng ở nồng độ và thời gian hỗn hợp nano bạc -đồng thích hợp nhất ở thí nghiệm (3.5.3.1.) được dùng để tái sinh chồi.

Chất điều tiết sinh trưởng BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 5 công thức tương ứng như sau:

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu.

Mẫu được đánh giá sau 2, 3,4 tuần trên môi trường nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi.

Sau khi xử lý số liệu thu được sẽ tìm được công thức với nồng độ

BA thích hợp nhất (M1) cho sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ.

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp.

Sau khi tìm được môi trường có nồng độ BA thích hợp nhất cho bật chồi hoa hồng Pháp là M1, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M1 đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ với các nồng độ nano bạc tương ứng như sau:

CT1: M1 + 0 ppm NS.

CT2: M1 + 2 ppm NS.

CT3: M1 + 4 ppm NS.

CT4: M1 + 6 ppm NS.

3.5.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA

và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Để nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng hình thành mô sẹo của mẫu lá cây hoa hồng in vitro, lá mầm in vitro có kích thước khoảng 0,5 cm-1,5

cm được cắt bỏ răng cưa và tạo vết thương được đưa vào môi trường tạo callus được bố trí với 5 nồng độ IBA khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo

mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp.

Sau khi tìm được môi trường bổ sung BA phù hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp là M2, chúng tôi tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M2 đến quá trình tạo mô sẹo với các nồng độ nano như sau:

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng

BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

Chồi được bật ra từ mắt ngủ có chiều dài khoảng 1,5 - 2,0 cm, số

lá là 3–4 lá được cắt ra và nuôi trong môi trường tái sinh chồi in vitro có

bổ sung BA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

Sau khi xử lý số liệu, chúng tôi tìm được ra công thức thích hợp nhất (M3) cho quá trình tái sinh chồi in vitro.

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp.

Sau khi tìm được môi trường bổ sung BA thích hợp nhất cho quá trình

nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp là M3, em tiếp tục bố trí thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M3 đến quá trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp với các nồng độ nano như sau:

3.5.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.

Chồi bật ra từ mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh, sau 6 tuần cắt các chồi chuyển sang nuôi trong môi trường ra rễ

có bổ sung -NAA với các nồng độ khác nhau tương ứng 5 CT như sau:

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu theo dõi sự phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần.

Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi.

Sau khi xử lý kết quả thu được sẽ tìm được môi trường có nồng độ NAA thích hợp nhất (M4) cho sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.

-Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp

Sau khi tìm được môi trường có nồng độ -NAA thích hợp nhất,

em tiếp tục bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano bạc được bổ sung vào môi trường M4 tới sự ra rễ của chồi cấp

2 hoa hồng Pháp với các công thức như sau:

- Các số liệu được tính toán trên máy tính theo chương trình IRRISTAT 5.0.

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU HOA HỒNG PHÁP

CỦA HỖN HỢP DUNG DỊCH NANO BẠC-ĐỒNG

4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả

khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Để đánh giá khả năng khử trùng mẫu của dung dịch nano bạc–

đồng khác nhau, các đoạn thân mang mắt ngủ được lắc trong hỗn

hợp nano tương ứng (0, 100, 150, 200, 250 ppm) trong 60 phút Công

thức 1(CT1- ĐC) sử dụng dung dịch javen 5% làm đối chứng Sau 4

tuần theo dõi thu được kết quả thể hiện ở bảng 4.1.

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu

quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần)

Ghi chú: So sánh các giá trị trong cùng một cột, các giá trị công thức mang cùng một chữ cái thì khác

nhau không có ý nghĩa, các giá trị công thức mang khác chữ thì khác có ý nghĩa ở mức α = 0, 05.

Từ kết quả thu được ở bảng 4.1 cho thấy, hỗn hợp nano bạc-đồng có khả

năng khử trùng vào mẫu ở tất cả nồng độ sử dụng, tỉ lệ mẫu sống sạch dao động

từ 35% đến 90%; đặc biệt công thức 4 (200 ppm) có tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu

sống sạch đều là 90% Tỷ lệ này cao hơn rất nhiều so với công thức đối chứng sử

dụng Javen 5% (20%) Ở công thức 5 (250 ppm) mặc dù cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 95%,

không sai có ý nghĩa về mặt thống kê với công thức 4 (90%) Tuy nhiên ở công thức

này tỷ lệ mẫu sống sạch chỉ đạt 70% trong khi đó ở công thức 4 tỷ lệ

sống là 90% Sở dĩ có kết quả như vậy, theo chúng tôi khi nồng độ nano tăng thì khả năng diệt khuẩn và nấm cũng tăng lên nhưng lại ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây, ức chế cây, do đó tỷ lệ mẫu chết tăng lên tỷ lệ mẫu sống sạch giảm đi chỉ còn 70%.

Như vậy, ở nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng là 200 ppm có tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất, đây là nồng độ hỗn hợp nano thích hợp nhất để khử trùng mẫu hoa hồng Pháp Kết quả này cũng tương tự với kết quả của Saber Shokri et al (2014), nhóm tác giả đã sử dụng đối tượng là hoa hồng Rosa hybrida L, khi khử trùng chồi mang mắt ngủ bằng nano bạc ở nồng độ 200 ppm cho tỷ lệ mẫu sạch là 80% và tỷ lệ mẫu sống trong tổng số mẫu sạch là 90%, còn ở nồng độ nano cao hơn cho tỷ lệ mẫu sạch là 90% nhưng tỷ lệ mẫu sống giảm (75%) Một số tác giả khác như Masond Fakhrfeshani et al (2012) khi làm thí nghiệm trên mẫu cây hoa nghệ tây cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sạch cao nhất là 89,1% khi ngâm mẫu ở dung dịch nano

200 ppm trong 1 giờ Tuy nhiên, kết quả của A.A Rostami và A Shahsavar (2013) khi nghiên cứu khử trùng mắt ngủ cây Oliu, cành được cắt nhỏ, loại bỏ lá, chúng chỉ cần được ngâm trong dung dịch nano 100 ppm với thời gian 1 giờ đã cho hiệu quả khử trùng mẫu cao nhất Vậy với mỗi loại cây trồng khác nhau thì nồng độ chế phẩm nano có khả năng khử trùng mẫu khác nhau.

Tóm lại, việc sử dụng nano bạc và đồng ở nồng độ 200 ppm trong thời gian là 60 phút là nồng độ và thời gian thích hợp nhất để khử trùng mẫu từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa hồng Pháp.Việc dùng chế phẩm nano không gây ô nhiễm môi trường, không gây độc hại cho người và các sinh vật khác vì thế có thể dùng hỗn hợp nano này để khử trùng mẫu thay thế cho dùng các hoá chất độc hại và gây ô nhiễm môi trường khác như HgCl 2 …

4.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp

Để xác định thời gian sử dụng hỗn hợp nano bạc-đồng thích hợp nhất cho việc khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ của hoa hồng Pháp, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp nano 200 ppm (kết quả của thí ngiệm 1.1) để

xử lý mẫu với 5 thời gian xử lý khác nhau là 30, 45, 60, 75, 90 phút Sau 4 tuần theo dõi thu được kết quả trình bày ở bảng 4.2.

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lí hợp nano bạc -đồng đến

hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần)

Ghi chú: So sánh các giá trị trong cùng một côt, các giá trị công thức mang cùng một chữ cái thì khác

nhau không có ý nghĩa, các giá trị công thức mang khác chữ thì khác có ý nghĩa ở mức α = 0, 05.

Từ kết quả thu được ở bảng 4.2 cho thấy, sau 4 tuần theo dõi với 3 lần lặp lại, từ thời gian 30 phút đến 90 phút cho tỉ lệ mẫu sống sạch dao động từ 43,33%

đến 90%, trong đó ở CT 3 (60 phút) cho tỷ lệ mẫu sống sạch cao nhất (90%), tỷ lệ

này cao hơn nhiều so với CT1 (30 phút) (43,33%) Với CT5 (90 phút) có tỷ lệ mẫu

sạch cao nhất 93,33%, sai khác có ý nghĩa thống kê so với công thức khác nhưng

tỷ lệ mẫu sống sạch là 71,67% Kết quả cũng cho thấy, khi tăng thời gian xử lý mẫu

bằng hỗn hợp nano bạc-đồng thì tỷ lệ mẫu sạch cũng tăng lên, tuy nhiên khi thời

gian quá dài thì tỉ lệ mẫu sống sạch lại giảm đi Theo chúng tôi, nguyên nhân có thể

do thời gian xử lý mẫu càng dài thì khả năng diệt nấm và vi khuẩn càng tăng lên

nhưng chúng lại ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của mẫu, ở thời gian quá

dài sẽ ức chế sinh trưởng của mẫu dẫn đến mẫu bị chết nên

ở CT5 có tỉ lệ mẫu sạch là 93,33% nhưng tỉ lệ mẫu sống sạch chỉ đạt 71,67% Kết

quả thí nghiệm cũng giống với kết quả của Masond Fakhrfeshani et al (2012), ngâm mẫu ở

nồng độ 200 ppm trong 1 giờ cũng cho tỷ lệ mẫu sạch cao nhất là 89,1% ở hoa nghệ tây, hay

với kết quả của A.A Rostami and A Shahsavar (2013) nghiên cứu khử trùng mắt ngủ cây

Oliu, cành được cắt nhỏ, loại bỏ lá ngâm trong nồng độ dung dịch nano 100 ppm với thời

gian 1 giờ cho khả năng khử trùng mẫu cao nhất Như vậy thời gian xử lý mẫu đoạn thân

mang mắt ngủ của hỗn hợp nano bạc-đồng thích hợp nhất là 60 phút.

Tóm lại, việc sử dụng nano bạc và đồng ở nồng độ 200 ppm trong thời gian là 60 phút là nồng độ và thời gian thích hợp nhất để

khử trùng mẫu từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa hồng Pháp.