Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY PRRS 06 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị ThảoTên luận văn: “ Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường độc KTY-PRRS-06 gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sin

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ

HOÀNG THỊ THẢO

PHÂN T C A CH NG VIRUS C Ử Ủ Ủ ƯỜ NG Đ C Ộ KTY-PRRS-06 GÂY H I CH NG R I LO N HÔ Ộ Ứ Ố Ạ

H P VÀ SINH S N L N Ấ Ả Ở Ợ

Ngườ ưới h ng d n khoa h c :ẫ ọ PGS.TS Nguy n H u Namễ ữ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thảo

i

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đếncác Thầy, Cô giáo - những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình tôi học tập tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng như trong thờigian tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn HữuNam, người hướng dẫn khoa học, về sự giúp đỡ nhiệt tình và có trách nhiệm đối vớitôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Lời cảm ơn của tôi cũng xin gửi tới Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các anh, chị, em phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú

y nơi tôi thực hiện đề tài đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất.

Cuối cùng tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, giúp

đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2016

Tác giả luận văn

Hoàng Thị Thảo

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ viết tắt vi

Danh mục bảng viii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận văn x

Thesis Abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tình hình nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 3

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam 4

2.1.3 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài 6

2.1.4 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam 8

2.2 Virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV) 8

2.2.1 Hình thái, cấu tạo virus PRRS 8

2.2.2 Phân loại virus PRRS 10

2.2.3 Khả năng gây bệnh của virus PRRS 11

2.2.4 Sức đề kháng của virus PRRS 11

2.2.5 Đặc tính nuôi cấy virus PRRS 12

2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản 12

2.3.1 Đặc điểm chung 12

2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13

2.3.3 Chất chứa mầm bệnh. 13

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây 13

2.3.5 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS 15

iii

2.3.6 Bệnh tích của lợn mắc PRRS 17

2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 18

2.3.8 Biện pháp phòng và trị bệnh 19

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 21

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 22

3.1.4 Thời gian nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 22 3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22

3.3.1 Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145 22

3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 24

3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển24 3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS 24

3.3.5 Phương pháp RT- PCR 25

3.3.6 Phương pháp giải trình tự Gen 27

3.3.7 Phương pháp đọc kết quả 28

Phần 4 Kết quả và thảo luận 29

4.1 Kết quả nghiên cứu chủng virus prrs nghiên cứu 29

4.1.1 Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 29

4.1.2 Kết quả kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác 32

4.2 Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 33 4.2.1 Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển 33

4.2.2 Kết quả xác định hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 36

4.3 Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng

virus KTY-PRRS-06 39

4.3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY-PRRS-06 40

4.3.2 Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06 41

4.3.3 Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển 43

4.3.4 Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển47 4.3.5 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 50

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Kiến nghị 52

Tài liệu tham khảo 53

v

Công nghệ sinh họcCyto Pathogenic EffectDulbecco,s Modified Eagle’s MediumDimethylsulfoxide

Deoxynucleotide AcidDeoxynucleotide triphotphatEquine Arteritis virusEthylenediaminetetraacetic AcideEnzyme Linked Immunosortbent AssayFetal Bovine Serum

Fetal Calf SerumGlycoproteinIndirect Immunofluoresence AssayKilodalton

Lactate Dehydlogenase – elevating virusLogarit (cơ số 10)

Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10Multiplicity Of Infection

Acid Ribonucleic thông tin

vi

Polymerase Chain ReactionPorcine Endemic Abortion and Respiratory SyndromePorcine Reproductive and Respiratory SyndromePorcine Reproductive and Respiratory Syndrome virusRibonucleic Acid

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain ReactionSimian Hemorrhaghic Fever Virus

Tissue Culture Infectious Dose 50Virus Neutralization Test

vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Protein cấu trúc của PRRSV 10

Bảng 2.2 Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh 11

Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR 25

Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR 26

Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR 26

Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 29

Bảng 4.2 Kết quả chẩn đoán RT- PCR các lợn nghi mắc PRRS 31

Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 32

Bảng 4.4 Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, FED, TGE 32

Bảng 4.5 Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển 33 Bảng 4.6 Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 tại thời điểm thu hoạch 37

Bảng 4.7 Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển 38

Bảng 4.8 Sai khác về vị trí nucleotide ở các đời của chủng KTY-PRRS-06 46

Bảng 4.9 So sánh sự tương đồng về nucleotide của virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển 46 Bảng 4.10 Sai khác về vị trí axit amin ở các đời của chủng KTY-PRRS-06 49 Bảng 4.11 So sánh sự tương đồng về axit amin của virus KTY-PRRS-06 ở các

đời cấy chuyển49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 4

Hình 2.2 Cấu trúc hạt của PRRS virus 9

Hình 2.3 Cấu trúc hệ gen của virus PRRS 9

Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào 14

Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 35

Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm 35

Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm 35

Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm 35

Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây nhiễm 35

Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng của virus KTY-PRRS-06 37

Hình 4.7 Log10 hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-06 39

Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 40

Hình 4.9 Kết quả phản ứng RT- PCR với mồi ORF5 41

Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-06 ở đời cấy chuyển thứ 10 43 Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển 45 Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin của chủng KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển 48 Hình 4.13 Cây sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06 51

ix

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Hoàng Thị Thảo

Tên luận văn: “ Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus

cường độc KTY-PRRS-06 gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn”

Phương pháp nghiên cứu

Bằng các phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môitrường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinhtrưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ genvirus PRRS; RT- PCR; phương pháp giải trình tự Gen

Kết quả chính và kết luận

1 Đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06:

Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus nghiên cứu có tính ổn định caoqua các đời cấy chuyển trên môi trường Marc-145 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao

và ổn định, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145.Hiệu giá virus thu được cao nhất tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm

2 Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-06:

Xác định được trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng virus sau các đờicấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 của chủng virusKTY-PRRS-06 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin của protein khángnguyên GP5 Trình tự nucleotide và axit amin của trong đoạn gen ORF5 của chủngnghiên cứu qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 ổn định, mức độtương đồng về nucleotide từ 98,15% đến 100%; về axit amin từ 96,88% đến 100%

THESIS ABSTRACT Master candidate: Hoang Thi Thao

Thesis title: "Research biology and molecular biology of the virulent strain

KTY-PRRS-06 cause Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome"

Major: Veterinary Medicine Code: 60 64 01 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

Topic purpose assess the stability of some biological characteristics andmolecular biology of the virulent strain KTY-PRRS-06 cause reproductive disordersand respiratory in pigs, over the lifetime subcultures environment on Marc-145 cells

Materials and Methods

KTY-PRRS-06 virus cultured on environmental Marc-145 cells;

TCID50 virus titre determined; determine the growth curve over the lifetime ofPRRSV inoculation;

Total RNA extraction of PRRS virus genome; RT- PCR; Gen

Main findings and conclusions

1 Biological characteristics of KTY-PRRS-06 virus strain:

Ability to cause cell lesions of viral strains studied high stability over thelifetime subcultures on Marc-145 environment PRRSV strains have high titre andstable, able to grow and multiply well on environmental Marc-145 cells Virus titrehighest obtained at the time of 72 hours after infection

2 Molecular biology of virus KTY-PRRS-06:

Determining the nucleotide sequences of the strains ORF5 gene segments afterthe transplant continuous life ORF5 gene segments defined antigens of strain GP5KTY-PRRS-06 size 603 bp encoding 200 amino acids of protein for antigen GP5 Thesequence of nucleotides and amino acids of ORF5 gene segments of strains in researchover the lifetime environmental subcultures on Marc-145 cells is stable, the degree ofsimilarity of nucleotides from 98.15% to 100%; the amino acid from 96.88% to 100%

xi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong nhiều năm trở lại đây, chăn nuôi lợn giữ vai trò then chốt trong cơ cấungành nông nghiệp, đồng thời là nguồn sinh kế chủ yếu của đa số các hộ gia đìnhnông thôn Việt Nam Tuy nhiên, chăn nuôi lợn của nước ta nói riêng cũng như thếgiới nói chung luôn chịu sự đe dọa của nhiều dịch bệnh khác nhau Một trongnhững dịch bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn về hiệu quả kinh tế trong chăn nuôilợn là Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn hay còn gọi là bệnh “Tai xanh”(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) được xác nhận lần đầu

tiên ở Mỹ giữa những năm 1987, virus PRRS được xếp vào bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins JE, 1992).

PRRS là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn với mọi nòi giống, lứa tuổitiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao.Bệnh làm ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh sản ở lợn nái gây sảy thai ở giaiđoạn cuối hoặc đẻ sớm, lợn con sơ sinh yếu, chết thai, thai gỗ, khó thở đôi khi cótriệu chứng thần kinh, tỷ lệ chết cao, lợn thịt sốt, giảm ăn, sút cân, ở lợn đực giống

số lượng và chất lượng tinh dịch giảm, Từ năm 2005 trở lại đây, bệnh lây đã lannhiều nước trên thế giới, gây ra nhiều thiệt hại nặng nề

Hiện nay, nước ta đã có vacxin PRRS nhập ngoại, song chưa có nhiều nghiêncứu về khả năng bảo hộ cho đàn lợn của các sản phẩm vacxin này, bên cạnh đó, dophương thức chăn nuôi ở nước ta chủ yếu nhỏ lẻ, phân tán nên dịch bệnh lây lancàng mạnh Vì vậy, Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn vẫn sảy ra ở nhiềutỉnh, thành trong cả nước

Thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy virus PRRS có sự đột biến cao,tạo ra nhiều chủng có độc lực khác nhau, rất khó để kiểm soát dịch bệnh Vì vậy đểchủ động đạt hiệu quả cao trong công tác phòng chống dịch PRRS, nước ta cần cóvacxin chế từ các chủng phân lập được

Do đó, để tìm ra được các chủng virus có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thìviệc nghiên cứu một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus PRRS qua cácđời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 để xác định sự biến đổi hay khôngbiến đổi hệ gen trong cấu trúc gen của virus PRRS sau các đời cấy chuyển

trên môi trường tế bào Marc-145 để làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn cácchủng virus PRRS để chế tạo các loại vacxin thế hệ mới phù hợp với PRRSV đanglưu hành góp phần vào công cuộc khống chế dịch bệnh trên đàn lợn là việc làmcần thiết Xuất phát từ yêu cầu trên của thực tiễn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus cường

độc KTY-PRRS-06 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn”.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP

VÀ SINH SẢN Ở LỢN

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive andRespriratory Syndrome - PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn ở mọinòi giống và lứa tuổi PRRS là một loại virus có nhân là RNA, đích tấn công củachúng là các tế bào đại thực bào dẫn đến hiện tượng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạođiều kiện cho các loại virus và vi khuẩn khác tấn công PRRS gây thiệt hại nặng nề

về kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là lợn nái Chúng gây nên hậu quảnghiêm trọng như: Lợn con sinh ra yếu ớt, giảm số con sơ sinh/lứa, tình trạng bệnhkéo dài âm ỉ; rối loạn sinh sản, động dục kéo dài hoặc chậm động dục trở lại Đốivới lợn đực giống, làm giảm số lượng và chất lượng tinh dịch, ảnh hưởng đến tỷ lệthụ thai và chất lượng đàn con sinh ra

PRRS được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng Bắc của bang California,bang Iowa và Minnesota vào năm 1987 Bệnh đã lây lan nhanh sang các nước nhưCanada năm 1988 và các nước Châu Âu cũng xuất hiện bệnh: Ở Đức năm 1990,

Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và năm 1992 ở Pháp (Nguyễn Bá Hiên

và cs., 2011) Cho đến nay, dịch bệnh này đã lan tràn và lưu hành ở nhiều quốc giatrên thế giới

Kể từ khi xuất hiện cho đến nay, bệnh đã được gọi với nhiều tên khác nhau Thờigian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên người ta đặt tên gọi cho dịch bệnhnày là Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease - MSD); một số tác giả khác căn

cứ vào bệnh tích ở tai thì gọi là bệnh Tai xanh (Blue Ear Disease -BED); hoặc căn cứvào các hậu quả dịch bệnh gây ra thì gọi là Hội chứng hô hấp và xảy thai ở lợn(Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome - PEARS)

Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế về hội chứng này tổ chức tại Minesota(Mỹ), tổ chức Dịch tễ học thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rốiloạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome -Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản) Kể từ đó cho đến nay, tên này đã trở thànhtên gọi chính thức của bệnh

Theo Cục Thú y (2008), từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ

thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch PRRS lưu hành (trừ Châu Úc vàNewzeland) Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh tếcho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên vàHuỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007).

Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

(2006 màu đỏ, 2007 màu hồng, 2009 màu xanh, 2010 màu xanh nhạt).

Hiện nay, Hội chứng rối loạn Hô hấp và sinh sản đã trở thành dịch địaphương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn pháttriển như: Mỹ, Hà Lan, Anh, Đan Mạch, Pháp, Đức…, đã gây ra những tổn thất rấtlớn về kinh tế cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đôla Các nước trongkhu vực có tỷ lệ PRRS lưu hành rất cao như: Trung Quốc 80%, Đài Loan 76,4%,Phillippines 90%, Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Hàn Quốc 73,1%

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

Lần đầu tiên PRRS được phát hiện ở Việt Nam vào năm 1997, trên đàn lợn

4

nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhậpkhẩu có huyết thanh dương tính với PRRS theo Cục Thú y (2007) Toàn bộ số lợnnày đã được xử lý ngay sau đó.

Như vậy, có thể thấy virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trongmột thời gian dài Dịch xuất hiện từng đợt tại cả 3 miền Bắc, Trung, Nam gây thiệthại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là ảnh hưởng đến phát triển đàngiống Cụ thể:

Năm 2007, nước ta xảy ra hai đợt dịch:

Đợt dịch thứ nhất: Dịch PRRS bắt đầu xảy ra ở tỉnh Hải Dương sau đó phát

triển mạnh tại 146 xã, phường thuộc 25 huyện, thị xã của 9 tỉnh là: Hải Dương,Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Bắc Kạn, Nam Định vàHải Phòng Số lợn mắc bệnh là 31.928 con, số lợn chết và xử lý là 7.464 con

Đợt dịch thứ 2: Xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam, Cà Mau, Long An, Bà Rịa

-Vũng Tàu, Khánh Hoà, Bình Định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, Đà Nẵng, ThừaThiên Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình, Hải Dương Tổng số lợn ốm

là 57.017 con, số chết và xử lý là 11.753 con.

Như vậy, trong năm 2007, dịch PRRS đã xuất hiện tại 405 xã, thuộc 75huyện của 21 tỉnh, thành phố Tổng số gia súc mắc bệnh là 88.945 con, số chết vàphải tiêu huỷ là 19.217 con

Năm 2008

Đầu năm 2008 dịch tái xuất hiện ở nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh Đến tháng4/2008 dịch đã bùng phát ở 949 xã, phường của 99 huyện, thị xã của 28 tỉnh là:Bạc Liêu, Lâm Đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Hà Tĩnh, Nghệ An, ThanhHoá, Ninh Bình, Nam Định, Thái Bình, Thái Nguyên… Tổng số lợn mắc bệnh

là 298.095 con, số chết và phải tiêu huỷ là 286.351 con Tình hình cho thấy virusgây bệnh đã phân tán rộng và có khả năng bùng phát thành dịch lớn trên cả nướcnếu không có biện pháp can thiệp kịp thời

Năm 2009

Dịch PRRS trên lợn đã tái xuất hiện trở lại ở tỉnh Quảng Ninh sau đó dịchxảy ra ở 49 xã thuộc 14 huyện của 8 tỉnh, thành phố: Hưng Yên, Quảng Ninh, BắcGiang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 5.044lợn mắc bệnh và 4.363 lợn buộc phải tiêu huỷ

Năm 2010

Tháng 3/2010 dịch bệnh PRRS tái xuất hiện ở Hải Dương sau một thời gianlắng xuống, rất nhanh chóng phát tán cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Theo Cục thú ytính đến 05/10/2010 cả nước trên 621.000 lợn mắc dịch, chết và tiêu hủy trên336.000 con Tình hình dịch PRRS vẫn đang diễn biến phức tạp và không có chiềuhướng giảm xuống (Nguồn: Phòng dịch tễ Cục thú y).

Năm 2011

Dịch được ghi nhận nổ ra đầu tiên khi tỉnh Quảng Trị công bố dịch vào ngày25/3/2011 Sau đó, Nghệ An công bố dịch vào ngày 16/4/2011 tiếp đó các tỉnhThái Bình, Hải Dương, Hà Tĩnh, Bắc Ninh đồng loạt công bố Tổng số lợn mắcbệnh là 14.704 con, số con chết và tiêu hủy là 13.831 con

Năm 2012

Dịch bệnh Tai xanh bắt đầu xảy ra từ 11/01 tại tỉnh Lào Cai; những thángcuối năm toàn quốc đã ghi nhận 14 tỉnh có dịch lợn Tai xanh là: Điện Biên, YênBái, Nam Định, Phú Thọ, Lào Cai, Lai Châu, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hòa Bình,Lạng Sơn, Bạc Liêu, Đồng Nai, Nghệ An, Bình Dương Cục Thú y cũng nhận địnhdịch Tai xanh năm 2012 có diễn biến bất thường hơn so với năm 2011, tốc độ lâylan rất nhanh, số lượng lợn mắc bệnh phải tiêu hủy cao gấp 2,5 lần so cùng kỳ năm

2011 Tính đến cuối năm 2012 còn 6 tỉnh: Đắk Lắk, Quảng Nam, Phú Yên, KhánhHòa, Thái Bình và Long An có dịch Tai xanh chưa qua 21 ngày với tổng số lợnmắc bệnh là gần 6.000 con

Năm 2013

Năm 2013, tình hình dịch bệnh Tai xanh diễn ra khá phức tạp Tỉ lệ lợn chết

và lợn tiêu hủy đã lên đến 6.000 con, bùng phát mạnh thành dịch ở 6 tỉnh (ThanhHóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Ninh, Thái Bình)

Năm 2014 - 2016

Từ năm 2014 đến nay, dịch Tai xanh đã được khống chế trên cả nước, thỉnhthoảng có xuất hiện một số ổ dịch nhỏ lẻ và đã được xử lý, ngăn chặn lây lan kịp thời

2.1.3 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đi sâu nghiên cứu về nguyên nhân, cơchế truyền lây, các phương pháp chẩn đoán và phòng chống Hội chứng rối loạn hôhấp và sinh sản ở lợn

6

Joo Han Soo (1997) đã đưa ra phương pháp điều chế vacxin sử dụng ngaychính virus Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản được làm yếu đi.

Eichhorn - G and Frost - JM (1997) nghiên cứu sử dụng sữa non của lợn náivào giai đoạn thích hợp để chẩn đoán huyết thanh phát hiện Hội chứng rối loạn hôhấp và sinh sản

Segales.J et al (1998) nghiên cứu siêu cấu trúc đại thực bào ở túi phổi lợn bị

nhiễm in-vitro với virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản đối với trườnghợp có hoặc không có Haemophilus parasuis

Calvert Jay G et al (2007) thuộc khoa Thú y trường Đại học Minnesota của

Mỹ đã nghiên cứu về những đặc điểm phân loại, cấu tạo, khả năng gây bệnh củavirus cũng như những triệu chứng lâm sàng thường gặp khi lợn bị bệnh ở Mỹ vàmột số nước Châu Âu, thấy rằng các chủng virus ở Mỹ và châu Âu có sự khác biệtnhau về bộ gen, tức là virus ở 2 nơi này đã có sự biến đổi về cấu trúc

Lunney Joan K et al (2007) chỉ ra các thông số miễn dịch giúp giải thích

được nguyên nhân tại sao một số lợn trên cùng một đàn lại không bị nhiễm virusHội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản

Calvert Jay G et al (2007) nghiên cứu về trình tự gen của chủng virus cường

độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở Bắc Mỹ cho biết: Ở một số

ổ dịch bộ gen của virus PRRS tương đồng 93,2% - 94,2% với bộ gen của chủngVR-2332 (Bắc Mỹ) nhưng ở một số ổ dịch khác thì bộ gen của virus Hội chứng rốiloạn hô hấp và sinh sản tương đồng 63,4 - 64,5% với chủng gây bệnh Lelystad(Châu Âu) và các virus phân lập được đã có sự đột biến ở một số axit amin

Năm 2009, người ta đã nghiên cứu 28 chủng virus PRRS được phân lập từcác trang trại lợn khác nhau tại Trung Quốc từ năm 2002-2003, đã giải trình tựđoạn gene ORF5 và full gene, so sánh với virus PRRS trong nhiều báo cáo từ Bắc

Mỹ, Châu Âu và Châu Á Nghiên cứu đã chứng minh rằng chủng virus PRRS ởBắc Mỹ đã xâm nhiễm vào lợn ở Hàn Quốc một thời gian trước và đã phát triểnthành một nhánh độc lập so với các chủng virus PRRS ở các nước Châu Á khác.Như vậy, sự khác biệt về địa lý có thể ảnh hưởng đến sự tiến hóa của virus PRRS

Năm 2009, các chuỗi nucleotide đã được nghiên cứu hoàn chỉnh trong haichủng virus PRRS phân lập được ở Thái Lan: 01CB1 và 01NP0 về kiểu gene đãxác định: 01CB1 và 01NP0 chứa 14.943 và 15.412 nucleotide tương ứng Kết

quả cũng cho thấy 01CB1 có thể tiến hóa từ các mẫu thử nghiệm EU, virusLelystad, trong khi 01NP0 có thể có nguồn gốc tiến hóa từ MLV hoặc các subtype

có quan hệ gần gũi với nó

2.1.4 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam

Căn bệnh lần đầu tiên được phát hiện tại Bộ môn Hoá sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú y vào ngày 19/3/2007, khi phân lập được xác định là dương tínhvới RT- PCR đặc hiệu, nhưng chỉ chính thức được Cục Thú y công bố vào tháng4/2007 trong Hội thảo chuyên ngành

-Về chẩn đoán Hội chứng PRRS, trước tháng 3/2007, cả 9 phòng thí nghiệmcủa Cục Thú y (Trừ phòng thí nghiệm của Cơ quan thú y vùng VI) không chẩnđoán bệnh này do các lý do trên Hiện nay, các phòng thí nghiệm chẩn đoán đều sửdụng kỹ thuật RT- PCR để chẩn đoán bệnh PRRS.Trung tâm chẩn đoán Thú yTrung ương và Cơ quan thú y vùng VI tiến hành phân lập PRRSV đều đặn từ bệnhphẩm trên tế bào Marc-145

Hiện tại, chúng ta chưa có một biện pháp hữu hiệu phòng chống được bệnhnày, mặc dù theo đánh giá không chính thức Hội chứng PRRS đã trở nên khá phổbiến ở các trại chăn nuôi lợn tại Việt Nam

2.2 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)

2.2.1 Hình thái, cấu tạo virus PRRS

Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn dương, virus được xếp vào bộ

Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins JE, 1992) Virus có cấu trúc gần giống với virus Equine Arteritis Virus gây viêm khớp ở ngựa (EAV), Lactic Dehydrogenase virus gây tăng hoạt enzyme của chuột (LDHV) và Simian Hemorrhagic Fever Virus gây sốt xuất huyết trên khỉ (SHFV) (Rossow KD et al.,

1998)

Quan sát virus PRRS dưới kính hiển vi điện tử thấy: Virus có cấu trúc dạnghình cầu, có vỏ bọc, kích thước 45nm-80nm và chứa nhân nucleocapcid cùng kíchthước có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính 35nm, được bao bọc bên ngoài bởimột lớp vỏ bọc dính chặt với cấu trúc bề mặt nucleocapcid nên trông hạt virusgiống như tổ ong

Bộ gen của virus PRRS là chuỗi dương RNA có kích thước từ 13-15kb SợiRNA của virus được bắt đầu bằng vùng không mã hóa có đầu 5’ và kết thúc bằng

8

vùng không mã hóa đầu 3’ Gen RNA polymeraza chiếm khoảng 75% đầu 5’ của

bộ gen, gen này mã hoá cho các protein cấu trúc của virus nằm ở đầu 3’

Hình 2.2 Cấu trúc hạt của PRRS virus

Hạt virus bao gồm:

 Một protein nucleocapsid N có khối lượng phân tử 1.200bp

 Một protein màng không có đường glucose hình cầu M với khối lượng phân tử 16.000bp

 Hai protein peplomer N - Glycosylate là GS có khối lượng phân tử

25.000bp và GL có khối lượng phân tử 42.000

Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp chất ức chế tổng hợpDNA là 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2-deoxyuridin và mitomycin C chứng tỏaxit nucleic đó là RNA Sợi RNA này có kích thước khoảng 15kb

Hình 2.3 Cấu trúc hệ gen của virus PRRS (www.porcilis-prrs.com/pathogenesis-prrs.asp)

Cấu trúc hệ gen của PRRSV bao gồm 7 khung đọc mở (ORF) gồm: ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7 Trong đó:

* ORF1 được chia làm hai phần bao gồm ORF1a và ORF1b, chiếm tớikhoảng 80% tổng số độ dài hệ gen của virus, chịu trách nhiệm mã hoá RNA thôngtin tổng hợp các enzym RNA polymerase của virus

* ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 là các phần gen tạo nên khung đọc

mở mã hoá các protein tương ứng, đó là GP2 (Glycoprotein 2), GP3, GP4, GP5 (haycòn gọi là Glycoprotein vỏ (E, envelope)), protein màng M (Membrane protein) vàprotein cấu trúc nucleocapsid N (nucleocapsid protein) Các protein được Glycosylhóa (là hiện tượng gắn thêm hydratcacbon vào một vị trí axit amin xác định) là: GP2,GP3, GP4, GP5 và các protein không được Glycosyl hóa là M và N

Bảng 2.1 Protein cấu trúc của PRRSV

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn, có màng bọc, thuộc giống

Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales.

Hiện nay có 2 kiểu gen PRRS chính được công nhận là:

Kiểu gen 1 (Nhóm 1): Các nhóm virus thuộc dòng Châu Âu với tên gọi phổ

thông là virus Lelystad (Meulenberg et al., 1993).

Kiểu gen 2 (Nhóm 2): Các nhóm virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu cho

chủng này là chủng virus VR-2332 (Nelsen et al., 1999).

Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta đã chứng minh được có sựbiến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập, được khẳng định qua phân tíchtrình tự nucleotide và axit amin của các khung đọc mở (ORFs) của LV và

10

VR-2332 Trình tự axit amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72%(ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) Phân tích trình tự cho thấycác virus đang tiến hóa do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen Các chủngvirus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau.

2.2.3 Khả năng gây bệnh của virus PRRS

PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn Lợn tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưnglợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợn rừng cũng mắcbệnh, đây có thể coi là nguồn dịch bệnh thiên nhiên

Về mặt độc lực người ta thấy virus PRRS tồn tại dưới 2 dạng:

+ Dạng cổ điển: Có độc lực thấp, ở dạng này khi mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1-5% trong tổng đàn

+ Dạng biến thể độc lực cao: Gây bệnh thực nghiệm và chết nhiều lợn

(Kegong Tian et al., 2007); (Tô Long Thành và Nguyễn Văn Long, 2008).

2.2.4 Sức đề kháng của virus PRRS

Mặc dù virus PRRS là một virus có vỏ bọc ngoài, nhưng sự sống sót củachúng bên ngoài vật chủ vẫn chịu tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với cácchất sát trùng

Bảng 2.2 Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh

Điều kiện môi trường

PRRSV có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở nhiệt

độ dao động trong khoảng -700C đến -200C, 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 300C và 6ngày ở 210C (Benfield et al., 1992) Tuy nhiên, khả năng sống của virus PRRS

giảm nhanh khi nhiệt độ tăng lên

PRRSV bền vững ở pH dao động trong khoảng 6,5 đến 7,5 Tuy nhiên, tính

gây bệnh thực nghiệm giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Paton et al., 1991).

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệtvirus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

2.2.5 Đặc tính nuôi cấy virus PRRS

PRRSV có thể nhân lên trên hai loại môi trường tế bào là đại thực bào phế

nang (PAM - Pulmnary Alveolar Macrophage) và tế bào dòng của thận khỉ Châu

Phi

PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất,virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virusPRRS trên thế giới Nhưng nhược điểm của nó là phải chuẩn bị môi trường từnhững con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của

tế bào là có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài (Kim et al., 1993).

Với môi trường là các tế bào dòng như: MA-104, Marc-145, CL-2621 hiệnđang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bào PAM.MA-104 chỉ có thể phân lập được các chủng virus của Bắc Mỹ CL-2621 có thểphân lập virus PRRS chủng châu Âu nhưng hiệu quả phân lập của chúng thấp hơn

so với PAM Ở môi trường Marc-145 có thể phân lập được 11 dòng virus của cả 2chủng châu Âu và Bắc Mỹ hơn nữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, sốlượng virus thu được sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này

đang được ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu (Kim et al., 1993) Đối

với chủng virus PRRS thể độc lực cao của Việt Nam và Trung Quốc thì môi trườngMarc-145 là môi trường nuôi cấy được sử dụng nhiều nhất hiện nay vì khả năngthích ứng rất cao và gây bệnh tích tế bào điển hình của virus

2.3 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN

2.3.1 Đặc điểm chung

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn là bệnh phức tạp, có đặc trưng

là gây sẩy thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hoặc lợn con sinh ra yếu.Bệnh có triệu chứng đặc trưng ở hệ hô hấp ở lợn con theo mẹ, lợn cai sữa, lợn thịt

vấn đề phát tán virus ra diện rộng là khó tránh khỏi (Zimmerman et al., 1997).

2.3.3 Chất chứa mầm bệnh.

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn mắc bệnh hoặclợn mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn đực giống cũng đượcxác định là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm sangbào thai

Ở lợn bệnh hoặc lợn mang trùng, virus tập trung chủ yếu ở phổi, hạch phổi, hạch Amidan, hạch Lympho, lách, tuyến ức và ở huyết thanh

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây

* Cơ chế sinh bệnh:

Sau khi virus xâm nhập vào cơ thể, đích tấn công của virus là các đại thựcbào, đặc biệt là đại thực bào ở vùng phổi Bình thường các đại thực bào với cácchân giả có tác dụng bắt giữ và tiêu diệt tất cả các tác nhân gây bệnh là vi khuẩn,virus, xâm nhập vào cơ thể Tuy nhiên đối với virus PRRS, các đại thực bào ởphế nang, phế quản là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus,

vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ

nó Virus nhân lên ngay trong đại thực bào, sau đó phá hủy và giết chết đại thựcbào (tới 40%)

Lúc đầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngàyvirus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng và ồ ạt xâm nhiễm sang các tếbào khác Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệugiá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơthể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch

13

Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối vớicác bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn.

Hình 2.4 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào

Đối với cơ thể, hệ thống miễn dịch được xem là hàng rào tự nhiên giúp cơthể chống lại các vi sinh vật gây bệnh, trong đó đại thực bào là tế bào có thẩmquyền miễn dịch, đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc đáp ứng miễn dịch kể

cả đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu

mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Khi bị virus phá huỷ, tế bào đại thực bào không còn các chân giả, mất khảnăng bắt giữ và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh làm cho các phản ứng miễn dịchkhông xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch nghiêmtrọng và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát

Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilusparasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida vàActinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky), PorcineCytomegalovirus, Porcine Respiratory Coronavirus và Porcine Paramyxovirus.Điều này cũng có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi

bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vikhuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp

Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007) trong nghiên cứu về PRRS chorằng, phổi chắc đặc làm suy giảm sự trao đổi khí ở các phế nang chính là nguyênnhân gây khó thở dẫn đến thiếu oxy tại máu và các mô bào làm máu của gia súcbệnh có màu sẫm, màu này có thể nhìn được từ bên ngoài tại các vùng da mỏng,các vùng da có nhiều mạch quản như vùng tai, bẹn, bụng Vì vậy mà có triệuchứng Tai xanh.

Mặt khác, viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai

bị suy dinh dưỡng và gây chết thai, sảy thai Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxytăng cao vì phải nuôi dưỡng thai, hơn nữa thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanhnên nhu cầu về oxy cũng tăng lên gấp bội vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêmtrọng nên hay bị sảy thai Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tửnên làm chậm các quá trình sinh lý khác

* Phương thức truyền lây

Bệnh có thể lây lan trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn bệnh, lợn mangtrùng với lợn khỏe và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị ô nhiễmvirus như: Phân, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi,…

Bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp, qua thụ tinh nhân tạo, tiếp xúc trực tiếp

Ở lợn mẹ mang trùng virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn kỳ giữa trở đi

và virus cũng được bài xuất qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành có thể bài thảivirus trong 14 ngày, trong khi đó lợn con và lợn choai bài thải virus tới 1-2 tháng

Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mangtrùng, phân tán theo gió (có thể đi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng cụ chănnuôi và dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một

số chim hoang dã

Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua không khí được coi như làphương tiện truyền lây phổ biến nhất

2.3.5 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS

Theo ghi nhận của nhiều nghiên cứu về các triệu chứng lâm sàng ở lợn mắcPRRS cho thấy, lợn bệnh thường có các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn, mẩn

đỏ da, khó thở, táo bón hoặc ỉa chảy và một số triệu chứng khác tuỳ thuộc vàobệnh kế phát và từng loại lợn:

15

- Lợn nái:

Các triệu chứng chủ yếu là: Tím âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai gỗ hàngloạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độtuổi của thai: Thai dưới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai trên 2,5 tháng tỷ lệ chết

là 93,75% (Phạm Ngọc Thạch và Đàm Văn Phải, 2007)

Lợn nái trong giai đoạn nuôi con thường có các biểu hiện như: Lười uốngnước, viêm vú, mất sữa, viêm tử cung âm đạo, mí mắt sưng, có thể táo bón hoặc ỉachảy, viêm phổi

- Lợn đực giống:

Sốt cao, bỏ ăn, đờ đẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện tượng tai xanh Đặcbiệt xuất hiện tượng viêm dịch hoàn, bìu dái nóng đỏ (chiếm 95%), dịch hoàn sưngđau, lệch vị trí (85%), giảm hưng phấn (Lê Văn Năm, 2007)

Lượng tinh ít, chất lượng kém biểu hiện: Nồng độ tinh trùng C < 80.106,Hoạt lực của tinh trùng A < 0.6, Sức kháng của tinh trùng R < 3000, Tỷ lệ kỳ hình

K > 10%, Tỷ lệ sống của tinh trùng < 70%, Độ nhiễm khuẩn cao 20.103 Lợn đựcgiống rất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản của mình (Nguyễn Như Thanh,2007)

- Lợn con theo mẹ:

Lợn con sinh ra chết sau vài giờ Số con sống sót tiếp tục chết vào tuần thứnhất sau khi sinh, một số tiếp tục sống đến lúc cai sữa nhưng có triệu chứng khó

thở và tiêu chảy (Kamakawaa et al., 2006)

Lợn có triệu chứng biếng ăn, ho nhẹ, lông xơ xác, gầy yếu, sưng mí mắt và kếtmạc, đôi khi đây là triệu chứng mang tính chẩn đoán đối với lợn con dưới 3 tuần tuổimắc PRRS, tai xanh tím, rối loạn hô hấp, tiêu chảy phân màu nâu đỏ hoặc xám Tỷ lệlợn chết là 15% hoặc cao hơn do viêm phổi và bội nhiễm vi khuẩn kế phát

- Lợn con cai sữa và lợn choai:

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ… Trong những trường hợpghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ ápse, thểtrạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt, tỉ lệ chếtkhoảng 15%

Triệu chứng lâm sàng được thể hiện rất khác nhau, theo ước tính cứ 3 đàn

lần đầu tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện, một đàn có biểuhiện mức độ vừa và một đàn biểu hiện ở mức độ nặng Lý do của việc này đến nayvẫn chưa có lời giải thích Tuy nhiên, với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnhcũng giảm nhẹ hơn hoặc có thể virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhaudẫn đến triệu chứng lâm sàng khác nhau Thực tế, nhiều đàn có huyết thanh dươngtính nhưng không có dấu hiệu lâm sàng (Nguyễn Văn Thanh, 2007).

2.3.6 Bệnh tích của lợn mắc PRRS

* Lợn nái mang thai

Trường hợp đẻ non thì thấy có nhiều thai đã chết, trên cơ thể chúng cónhiều đám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp đẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn

so với đẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc đẻ do thờigian đẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử vàtích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

* Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũngthấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp sethường có màu xám đỏ, rắn chắc Mô phổi lồi ra và có màu đỏ xám loang lổ nhưtuyến ức hay như đá grannito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổichìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách của lợn mắc PRRS có bệnh tích không đặc trưng tuỳ thuộcvào sự kế phát các bệnh khác

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột

bị viêm nhưng ở những lợn tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt có phủ mộtlớp nhầy màu nâu

- Triệu chứng đường hô hấp: Viêm phổi ở lợn con và lợn thịt Ta có thể dùngphương pháp chẩn đoán lâm sàng nghi vấn để chẩn đoán xác định bệnh trong cáctrường hợp như: sảy thai muộn > 20%; chết khi sinh > 5%; chết trước lúc cai sữa >25%.

Tuy nhiên, do tính đa dạng của các loại bệnh ở lợn nên việc chẩn đoán dựavào lâm sàng thường rất khó, dễ nhầm lẫn (về các bệnh phổi, bệnh sinh sản khác).Ngoài ra việc phân lập virus cũng rất khó

* Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh

Đối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấyphổi rắn, chắc và có vùng xám và hồng

Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan trànlàm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào Lympho trong các tổ chứcLympho…

* Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học

Để phát hiện sự có mặt của virus PRRS người ta có thể sử dụng phương phápkháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm

tế bào một lớp và phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp (VNT);phương pháp miễn dịch bệnh lý khi sử dụng kháng thể chuẩn để phát hiện virus có

trong mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS (Bưtner et al., 2000), (Anette, 1997).

Phương pháp ELISA có thể chẩn đoán một số lượng mẫu huyết thanh lớn vàkết quả nhanh Khi dùng phương pháp này có thể phát hiện được cả chủng virus cónguồn gốc Bắc Mỹ và chủng có nguồn gốc từ Châu Âu

Phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp (VirusNeutralization Test) là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ

vì kháng thể trung hòa có thể tồn tại ít nhất một năm (Anette, 1997) Tuy nhiên,phản ứng trung hòa virus kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác vì khángthể trung hòa xuất hiện chậm hơn.

Có một thực tế là khi đánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh phảicân nhắc đến trạng thái miễn dịch của đàn sau khi được tiêm phòng vacxin vì hiệntại chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể do lợn mắcbệnh tự nhiên hay do tiêm phòng vacxin (Anette, 1997)

Kỹ thuật RT- PCR: Dùng phản ứng RT- PCR phân tích mẫu máu (được lấytrong giai đoạn đầu của pha cấp tính) để xác định sự có mặt của virus, đây là phảnứng tương đối nhạy và chính xác

* Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức

Là phương pháp khoa học tiên tiến được sử dụng rộng rãi trong Y học đểnghiên cứu các virus như: Phương pháp này được sử dụng nhằm mục đích nuôicấy, phân lập, giám định, chuẩn độ, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus vàđặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức để nuôi cấy các vacxin virus

Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoáihoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất đặc trưng Nhữngbiến đổi có tính chất đặc trưng đó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ (CytoPathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử Có những tế bào bị nhiễmvirus chưa đến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này đã bị thay đổi

Căn cứ vào CPE khi quan sát trên kính hiển vi quang học có thể đánh giáđược hiệu quả nuôi cấy virus

Khi có dịch thì phải công bố dịch Cơ sở chăn nuôi phải thống kê số lợn ốm,lợn chết, báo cáo cho chính quyền và thú y địa phương để xử lý theo hướng dẫnphòng chống bệnh tai xanh của Cục thú y

19

- Phòng bệnh bằng vacxin:

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm vacxin được dùng để phòng bệnh PRRS như:

* Vacxin BSL-PS100

Vacxin PRRS nhược độc đông khô thế hệ mới có nguồn gốc từ chủng

JKL-100 thuộc họ Châu Mỹ, một liều chứa ít nhất 105TCID50/1ml Có độ an toàn rất cao, vacxin an toàn dù chủng cao gấp 20 liều

* Vacxin BSK-PS100

Vacxin vô hoạt chứa chủng PRRSV dòng Châu Âu Một liều vacxin chứa ítnhất 107,5TCID50/1ml Vacxin có độ an toàn rất cao, thử nghiệm đã chứng minhBSK-PS100 an toàn dù chủng cao gấp 10 liều, vacxin an toàn đối với vật mangthai

* Vacxin Amervac-PRRS (nhà sản xuất Laboratorias HIPRA, Si–Tây Ban Nha) Vacxin nhược độc dạng đông khô, chứa PRRSV chủng Châu Âu

VP046BIS, mỗi liều chứa ít nhất 103,5TCID50/1ml

* Vacxin Solvente/A3 (Blanco), Solvent/A3 (White), lọ 20ml.

Tiêm bắp cổ sâu, liều 2ml/con

* Vacxin Porcillis PRRS của Hà Lan.

2.3.8.2 Trị bệnh

Hiện nay chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại của bệnhchủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâmsàng, giảm nhẹ và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát

- Đối với lợn nái trong giai đoạn chửa kỳ cuối, dùng Antiprostaglandin,Acetylsalicylic để làm giảm sốt và kéo dài việc mang thai khi ở giai đoạn đầu của

ổ dịch (Tô Long Thành)

- Có thể dùng Clotetracylin bổ sung vào trong thức ăn để phòng vi khuẩn kế phát (Tô Long Thành)

- Giai đoạn lợn ăn ít cần bổ sung các thức ăn có năng lượng cao

- Đảm bảo đủ sữa cho lợn con bú

- Điều trị ỉa chảy ở những lợn bệnh

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng virus KTY-PRRS-06 được phân lập tại ổ dịch ở Hải Phòng năm 2015

và lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Khoa Thú y - Học việnNông nghiệp Việt Nam

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

* Mẫu virus nghiên cứu

Chủng virus KTY-PRRS-06 đã được phân lập được từ mẫu bệnh phẩm củalợn mắc PRRS được bảo quản ở phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y -Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

* Dụng cụ, máy móc, thiết bị

- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet

- Tủ ấm 370C/ 5% CO2, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -40C, -200C, -800C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào

- Sử dụng buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc

ấm, máy PCR,

- Máy giải trình tự tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ), máy tính vàcác phần mềm xử lý dữ liệu như phần mềm CEQ 8000 (version 9.0), phần mềmGenetyx (version 5.0.4), MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysisversion 5.10)

* Hóa chất, môi trường

- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay 24 giếng

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM,FCS, kháng sinh (Penicillin (100 U/µl), Streptomycin (100 µg/ml), EDTA,Trypsin, DMSO),…

- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%

- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Mồi xuôi, mồi ngược, enzyme…

21

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Bệnh lý Thú y - Khoa Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

- Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y - Khoa Thú Y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145

- Hồ sơ giống virus KTY-PRRS-06 lựa chọn nghiên cứu

- Khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển

- Hiệu giá virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển

3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus

KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145

- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06;

- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus

KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển

- So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus

KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển

- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY-PRRS-06

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1.Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145

* Chuẩn bị tế bào Marc-145

- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy

Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.

Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và

giữ lại cặn tế bào

Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế

bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS Đóng chặt bìnhnuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi dậy lên nắp bình nuôi cấy.

Bước 4: Giữ tế bào ở tủ ấm 370C với 5% CO2, hàng ngày theo dõi sự pháttriển của tế bào Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào

để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới

- Cấy chuyển tế bào

Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định đểphục vụ nghiên cứu

Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.

Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA Thêm 7ml môi

trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm

Bước 3: Loại bỏ Trypsin, đem ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn

màu trắng

Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi

trường đầy đủ Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môitrường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tếbào trong 1ml

Bước 5: Cấy chuyển tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môitrường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bìnhT75)

Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 370C, 5% CO2

hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào

* Gây nhiễm virus KTY-PRRS-06

Khi tế bào một lớp Marc-145 (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôicấy, không chồng chéo lên nhau) trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gâynhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung100µl mẫu đã chuẩn bị Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 60phút

Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và

ủ ở 370C với 5% CO2

Hằng ngày theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổivào các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ sau khi gây nhiễm

23