Nghiên cứu đặc tính sinh học và phân tử của chủng virus nhược độc kty prrs 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” Phương pháp nghiên cứu Bằng cá

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ

HÀ VĂN THỊNH

Ngườ ưới h ng d n khoa h c:ẫ ọ PGS.TS Nguy n Th Lanễ ị

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các kết quả, số liệunêu trong bản luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được bảo vệ ở một học vịnào khác

Tôi cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõnguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Hà Văn Thịnh

LỜI CẢM ƠN

Quá trình học tập và rèn luyện dưới mái trường Học viện Nông nghiệp ViệtNam đã giúp tôi hòa thiện hơn về nhân cách và trình độ chuyên môn Tôi đã nhậnđược sự quan tâm, dạy dỗ tận tình của các Thầy, Cô giáo đặc biệt là các Thầy, Cô giáocông tác tại Khoa Thú y

Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cao học chuyên ngành Thạc sỹ thú ycho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến các Thầy, Cô giáo –những người đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi họctập tại Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam cũng như trong suốt quá trình tôi thựchiện khóa luận này

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cô PGS TS Nguyễn Thị Lan, Bộ mônBệnh lý, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Hà Nội, cô đã tận tình hướng dẫn tôitrong suốt thời gian thực hiện khóa luận Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn đếncác Thầy, Cô trong bộ môn Bệnh lý – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam,các anh chị phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH – khoa Thú Y (B213 – B214) nơi tôithực hiện đề tài, đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành đề tài tốt nhất

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè nhữngngười đã luôn động viên, tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình họctập và hoàn thành khóa luận này

Trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Hà Văn Thịnh

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài: 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 3

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam 4

2.1.3 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài 6

2.1.4 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam 8

2.2 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRSV) 8

2.2.1 Hình thái, cấu tạo 8

2.2.2 Phân loại virus PRRS 11

2.2.3 Khả năng gây bệnh của virus PRRS 11

2.2.4 Sức đề kháng của virus PRRS 11

2.2.5 Đặc tính nuôi cấy virus PRRS 12

2.3 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản 13

2.3.1 Đặc điểm chung 13

2.3.2 Động vật cảm nhiễm 13

2.3.3 Chất chứa mầm bệnh. 13

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây 14

2.3.5 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS 16

2.3.6 Bệnh tích của lợn mắc PRRS 17

2.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 18

2.3.8 Biện pháp phòng và trị bệnh 20

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22

3.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu 22

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23

3.1.4 Thời gian nghiên cứu 23

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145 23

3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY -PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145 23

3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 25

3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển 25 3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS 25

3.3.5 Phương pháp giải trình tự Gen 28

3.3.6 Phương pháp đọc kết quả 30

Phần 4 Kết quả và thảo luận 31

4.1 Kết quả nghiên cứu chủng virus PRRS nghiên cứu 31

4.1.1 Kết quả lựa chọn mẫu PRRS cho nghiên cứu 31

4.1.2 Kiểm tra khả năng tạp nhiễm với các loại virus khác 34

4.2 Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus kty -PRRS - 04 34

4.2.1 Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển. 34

4.2.2 Kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển. 38

4.3 Kết quả nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04 41

4.3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số của chủng virus KTY – PRRS - 04 41

4.3.2 Kết quả giải trình tự đoạn ORF5 của chủng virus KTY - PRRS - 04 42

4.3.3 Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide qua các đời cấy chuyển 45

4.3.4 Kết quả nghiên cứu so sánh trình tự axit amin của virus KTY - PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển 48

4.3.5 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử 51

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Kiến nghị 53

Tài liệu tham khảo 55

DMEM : Dulbecco,s Modified Eagle Medium

ELISA : Enzyme Immunosortbent Linking Assay

EVA : Equine virus

FCS : Fetal Calf Serum

IFA : Indirect Immunofluoresence Assay

kDa : Kilodalton

LDHV : Lactate Dehydlogenase – elevating virus

MK : Monkey kidney cell

MSD : Mistery Swine Disease

OIE : Tổ chức thú y thế giới

ORF : Open reading frame (khung đọc mở)

PAM : Pulmnary alveolar macrophage

PEARS : Porcine Endemic abortion and Respiratory syndromePRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus

RNA : Ribonucleic acid

SHFV : Simian hemorrhaghic fever virus

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Protein cấu trúc của PRRSV 10

Bảng 2.2 Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh 12

Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT-PCR 27

Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR 27

Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT-PCR 27

Bảng 4.1 Mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 31

Bảng 4.2 Kết quả chẩn đoán RT-PCR các lợn nghi mắc PRRS 33

Bảng 4.3 Hồ sơ giống virus PRRS lựa chọn nghiên cứu 34

Bảng 4.4 Kết quả xác định sự có mặt của virus PRRS, CSF, FMD, PED và TGE 34 Bảng 4.5 Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua các đời 35 Bảng 4.6 Hiệu giá của chủng virus KTY – PRRS – 04 tại các thời điểm thu hoạch 38 Bảng 4.7 Hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển 40

Bảng 4.8 Sai khác về vị trí nucleotide ở các đời của chủng PRRS nghiên cứu 47

Bảng 4.9 So sánh sự tương đồng về nucleotide của virus KTY - PRRS – 04 các đời cấy chuyển 47 Bảng 4.10 Sai khác về vị trí axit amin ở các đời của chủng KTY - PRRS - 04 50 Bảng 4.11 So sánh sự tương đồng về axit amin của virus PRRS – 04 các đời

cấy chuyển 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 4

Hình 2.2 Cấu trúc hạt của PRRS virus 9

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PRRS virus 9

Hình 2.4: Bộ gen của virus PRRS 10

Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào 14

Hình 4.1 Tế bào Marc-145 chưa gây nhiễm virus 36

Hình 4.2 Bệnh tích tế bào sau 36 giờ gây nhiễm 36

Hình 4.3 Bệnh tích tế bào sau 48 giờ gây nhiễm 37

Hình 4.4 Bệnh tích tế bào sau 60 giờ gây nhiễm 37

Hình 4.5 Bệnh tích tế bào sau 72 giờ gây gây nhiễm 37

Hình 4.6 Đường cong sinh trưởng của virus KTY – PRRS - 04 39

Hình 4.7 Log10 hiệu giá của chủng virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển40 Hình 4.8 Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết RNA tổng số 42

Hình 4.9 Kết quả phản ứng RT-PCR với mồi ORF5 43

Hình 4.10 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng KTY-PRRS-04 ở đời cấy chuyển thứ 10 44 Hình 4.11 So sánh trình tự nucleotide của chủng KYT-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển46 Hình 4.12 So sánh trình tự axit amin của chủng KTY-PRRS-04 ở các đời cấy chuyển49 Hình 4.13 Cây sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 52

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

1. Tên tác giả: Hà Văn Thịnh

2. Tên luận văn: “Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus

nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn”

Phương pháp nghiên cứu

Bằng các phương pháp nghiên cứu: nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môitrường tế bào Marc-145; xác định hiệu giá virus TCID50; xác định đường cong sinhtrưởng của virus PRRS qua các đời cấy truyền; tách chiết RNA tổng số của hệ genvirus PRRS; RT-PCR; phương pháp giải trình tự Gen

Kết quả chính và kết luận

1.Đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04:

Khả năng gây bệnh tích tế bào của chủng virus nghiên cứu có tính ổn định caoqua các đời cấy chuyển trên môi trường Marc-145 Chủng virus PRRS có hiệu giá cao

và ổn định, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc-145.Hiệu giá virus thu được cao nhất tại thời điểm 72 giờ sau gây nhiễm

2 Đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04:

Xác định được trình tự nucleotide đoạn gen ORF5 của chủng virus sau các đời cấy chuyển liên tục Đoạn gen ORF5 quy định kháng nguyên GP5 của chủng virus KTY

- PRRS - 04 có kích thước 603 bp mã hóa cho 200 axit amin của protein kháng nguyên GP5 Trình tự nucleotide và axit amin của trong đoạn gen ORF5 của chủng nghiên cứu qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145 tương đối ổn định, mức độ tương đồng về nucleotide từ 98,15% đến 100%; về axit amin từ 96,88% đến 100%.

THESIS ABSTRACT

1.Master candidate: Hà Văn Thịnh

2.Thesis title: "Research biology and molecular biology of the low virulent strain

KTY - PRRS - 04 cause Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome"

4. Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

Research Objectives

Topic purpose assess the stability of some biological characteristics andmolecular biology of the low virulent strain KTY - PRRS - 04 cause reproductivedisorders and respiratory in pigs, over the lifetime subcultures environment on Marc-

145 cells

Materials and Methods

KTY - PRRS - 04 virus cultured on environmental Marc-145 cells;

TCID50 virus titre determined; determine the growth curve over the lifetime ofPRRSV inoculation;

Total RNA extraction of PRRS virus genome; RT-PCR; Gen

Main findings and conclusions

1 Biological characteristics of KTY - PRRS – 04 virus strain:

Ability to cause cell lesions of viral strains studied relatively high stability overthe lifetime subcultures on Marc-145 environment PRRSV strains have relativelyhigh titre and stable, able to grow and multiply well on environmental Marc-145 cells.Virus titre highest obtained at the time of 72 hours after infection

2 Molecular biology of virus KTY - PRRS - 04:

Determining the nucleotide sequences of the strains ORF5 gene segments afterthe transplant continuous life ORF5 gene segments defined antigens of strain GP5KTY - PRRS - 04 size 603 bp encoding 200 amino acids of protein for antigen GP5.The sequence of nucleotides and amino acids of ORF5 gene segments of strains inresearch over the lifetime environmental subcultures on Marc-145 cells is relativelystable, the degree of similarity of nucleotides from 98.15% to 100%; the amino acidfrom 96.88% to 100%

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Đất nước ta đang trong quá trình hội nhập và phát triển, cùng với chiến lượctăng cường phát triển công nghiệp và dịch vụ thì ngành nông nghiệp đặc biệt làlĩnh vực chăn nuôi cũng được Nhà nước và toàn xã hội chú trọng đầu tư Trong đóngành chăn nuôi lợn ngày càng chiếm một vị trí quan trọng trong cơ cấu kinh tếđất nước do hiệu quả kinh tế mà nó mang lại Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn củanước ta nói riêng cũng như thế giới nói chung luôn chịu sự đe dọa của các dịchbệnh khác nhau

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn hay còn gọi là bệnh “Tai xanh”(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh truyềnnhiễm nguy hiểm trên lợn với mọi nòi giống, lứa tuổi và có những diễn biến phứctạp, xảy ra nghiêm trọng gây ra nhiều thiệt hại nặng nề

PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệmắc bệnh cao Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thaichết và lợn con sơ sinh yếu, lợn con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn

Hiện nay đã có vacxin, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về khả năngbảo hộ cho đàn lợn của các sản phẩm vacxin PRRS thương mại Bên cạnh đó đã cónhiều nghiên cứu cho thấy virus PRRS có sự đột biến cao, tạo ra nhiều chủng cóđộc lực khác nhau, rất khó để kiểm soát dịch bệnh

Trong những năm gần đây, nước ta đã có nhiều loại vacxin nhập ngoại tuynhiên dịch bệnh vẫn sảy ra Vì vậy để chủ động đạt hiệu quả cao trong công tácphòng chống dịch PRRS, Việt Nam cần có vacxin chế từ các chủng phân lập được

Do đó, để hiểu rõ về các chủng virus PRRS, để tìm ra được các chủng virus

có đủ tiêu chuẩn để sản xuất vacxin thì việc nghiên cứu một số đặc tính sinh học

và sinh học phân tử của virus PRRS qua các đời cấy chuyển trên tế bào Marc-145,xác định sự biến đổi hay không biến đổi hệ gen trong cấu trúc gen của virus PRRSsau các đời cấy chuyển trên tế bào Marc-145 sẽ là cơ sở khoa học cho việc lựachọn các chủng virus PRRS để chế tạo vacxin phòng bệnh

Xất phát từ các yêu cầu thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của chủng virus nhược độc KTY - PRRS - 04 gây hội chứng rối loạn Hô hấp và sinh sản ở lợn”.

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Đánh giá được sự ổn định một số đặc tính sinh học và sinh học phân tử củachủng virus nhược độc KTY - PRRS – 04 gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinhsản ở lợn qua các đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP

VÀ SINH SẢN Ở LỢN

2.1.1 Tình hình dịch PRRS trên thế giới

Hội chứng rối loạn Hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive andRespriratory Syndrome - PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên lợn ở mọinòi giống và lứa tuổi PRRS là một loại virus có nhân là RNA, đích tấn công củachúng là các tế bào đại thực bào dẫn đến hiện tượng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạođiều kiện cho các loại virus và vi khuẩn khác tấn công PRRS gây thiệt hại nặng nề

về kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là lợn nái Chúng gây nên hậu quảnghiêm trọng như: Lợn con sinh ra yếu ớt, giảm số con sơ sinh/lứa, tình trạng bệnhkéo dài âm ỉ; rối loạn sinh sản, động dục kéo dài hoặc chậm động dục trở lại Đốivới lợn đực giống, làm giảm số lượng và chất lượng tinh dịch, ảnh hưởng đến tỷ lệthụ thai và chất lượng đàn con sinh ra

PRRS được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng Bắc của bang California,bang Iowa và Minnesota vào năm 1987 Bệnh đã lây lan nhanh sang các nước nhưCanada năm 1988 và các nước Châu Âu cũng xuất hiện bệnh: Ở Đức năm 1990,

Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và năm 1992 ở Pháp (Nguyễn Bá Hiên

và cs., 2011) Cho đến nay, dịch bệnh này đã lan tràn và lưu hành ở nhiều quốc giatrên thế giới

Kể từ khi xuất hiện cho đến nay, bệnh đã được gọi với nhiều tên khác nhau.Thời gian đầu do chưa xác định được nguyên nhân nên người ta đặt tên gọi chodịch bệnh này là Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Swine Disease – MSD); một số tácgiả khác căn cứ vào bệnh tích ở tai thì gọi là bệnh Tai xanh (Blue Ear Disease –BED); hoặc căn cứ vào các hậu quả dịch bệnh gây ra thì gọi là Hội chứng hô hấp

và xảy thai ở lợn (Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome –PEARS)

Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế về hội chứng này tổ chức tại Minesota(Mỹ), tổ chức Dịch tễ học thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rốiloạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome -Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản) Kể từ đó cho đến nay, tên này đã trở thànhtên gọi chính thức của bệnh

Theo Cục Thú y (2008), từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổthuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch PRRS lưu hành (trừ Châu Úc vàNewzeland) Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh tếcho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên vàHuỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007).

Hình 2.1 Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

(2006 màu đỏ, 2007 màu hồng, 2009 màu xanh, 2010 màu xanh nhạt).

Hiện nay, Hội chứng rối loạn Hô hấp và sinh sản đã trở thành dịch địaphương ở nhiều nước trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn pháttriển như Mỹ, Hà Lan, Anh, Đan Mạch, Pháp, Đức…, đã gây ra những tổn thất rấtlớn về kinh tế cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đôla Các nước trongkhu vực có tỷ lệ PRRS lưu hành rất cao như: Trung Quốc 80%, Đài Loan 94,7 –76,4%, Philippin 90%, Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Hàn Quốc 67,4 – 73,1%

2.1.2 Tình hình dịch PRRS tại Việt Nam

Lần đầu tiên PRRS xuất hiện ở Việt Nam vào năm 1997, PRRS được pháthiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy

10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS theo Cục Thú y(2007) Toàn bộ số lợn này đã được xử lý vào thời gian đó.

Như vậy, có thể thấy virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta trongmột thời gian dài Dịch xuất hiện từng đợt tại cả 3 miền Bắc, Trung, Nam gây thiệthại đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là ảnh hưởng đến phát triển đàngiống Cụ thể:

Năm 2007, nước ta xảy ra hai đợt dịch:

Đợt dịch thứ nhất: Dịch PRRS bắt đầu xảy ra ở tỉnh Hải Dương sau đó phát

triển mạnh tại 146 xã, phường thuộc 25 huyện, thị xã của 9 tỉnh là: Hải Dương,Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Bắc Kạn, Nam Định vàHải Phòng Số lợn mắc bệnh là 31.928 con, số lợn chết và xử lý là 7.464 con

Đợt dịch thứ 2: Xuất hiện tại tỉnh Quảng Nam, Cà Mau, Long An, Bà Rịa

-Vũng Tàu, Khánh Hoà, Bình Định, Quảng Ngãi, Quảng Nam, Đà Nẵng, ThừaThiên Huế, Quảng Trị, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình, Hải Dương Tổng số lợn ốm

là 57.017 con, số chết và xử lý là 11.753 con.

Như vậy, trong năm 2007, dịch PRRS đã xuất hiện tại 405 xã, thuộc 75huyện của 21 tỉnh, thành phố Tổng số gia súc mắc bệnh là 88.945 con, số chết vàphải tiêu huỷ là 19.217 con

Năm 2008

Tính từ ngày 20/3/2008 khi dịch xuất hiện ở nhiều xã thuộc tỉnh Hà Tĩnh.Dịch đã xuất hiện ở 949 xã, phường của 99 huyện, thị xã thuộc 28 tỉnh là: BạcLiêu, Lâm Đồng, Quảng Nam, Thừa Thiên Huế, Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hoá,Ninh Bình, Nam Định, Thái Bình, Thái Nguyên… Tổng số lợn mắc bệnh là298.095 con, số chết và phải tiêu huỷ là 286.351 con Tình hình cho thấy virus gâybệnh đã phân tán rộng và có khả năng bùng phát thành dịch lớn trên cả nước nếukhông có biện pháp can thiệp kịp thời

Năm 2009

Dịch PRRS trên lợn đã tái xuất hiện trở lại ở tỉnh Quảng Ninh sau đó dịchxảy ra ở 49 xã thuộc 14 huyện của 8 tỉnh, thành phố: Hưng Yên, Quảng Ninh, BắcGiang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tầu và Đắk Lắk với 5.044lợn mắc bệnh và 4.363 lợn buộc phải tiêu huỷ

Năm 2010

Tháng 3/2010 dịch bệnh PRRS tái xuất hiện ở Hải Dương sau một thời gian

lắng xuống, rất nhanh chóng phát tán cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Theo Cục thú ytính đến 05/10/2010 cả nước trên 621.000 lợn mắc dịch, chết và tiêu hủy trên336.000 con Tình hình dịch PRRS vẫn đang diễn biến phức tạp và không có chiềuhướng giảm xuống (nguồn phòng dịch tễ Cục thú y).

Năm 2011

Dịch được ghi nhận nổ ra đầu tiên khi tỉnh Quảng Trị công bố dịch vào ngày25/3/2011 Sau đó, Nghệ An công bố dịch vào ngày 16/4/2011 tiếp đó các tỉnhThái Bình, Hải Dương, Hà Tĩnh, Bắc Ninh đồng loạt công bố Tổng số lợn mắcbệnh là 14.704 con, số con chết và tiêu hủy là 13.831 con

Năm 2012

Dịch tai xanh bắt đầu xảy ra từ 11/01 tại tỉnh Lào Cai; đến những tháng cuốinăm toàn quốc đã ghi nhận 14 tỉnh có dịch lợn tai xanh là Điện Biên, Yên Bái,Nam Định, Phú Thọ, Lào Cai, Lai Châu, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Hòa Bình, LạngSơn, Bạc Liêu, Đồng Nai, Nghệ An, Bình Dương Cục Thú y cũng nhận định dịchtai xanh năm 2012 có diễn biến bất thường hơn so với năm 2011, tốc độ lây lan rấtnhanh, số lượng lợn mắc bệnh phải tiêu hủy cao gấp 2,5 lần so cùng kỳ năm 2011.Tính đến cuối năm 2012 còn 6 tỉnh: Đắk Lắk, Quảng Nam, Phú Yên, Khánh Hòa,Thái Bình và Long An có dịch Tai xanh chưa qua 21 ngày với tổng số lợn mắcbệnh là gần 6.000 con

Năm 2013

Năm 2013, tình hình dịch bệnh Tai xanh diễn ra khá phức tạp Tỉ lệ lợn chết

và lợn tiêu hủy đã lên đến 6.000 con, bùng phát mạnh thành dịch ở 6 tỉnh (ThanhHóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Nam Định, Bắc Ninh, Thái Bình)

Năm 2014 - 2016

Từ năm 2014 đến nay, dịch Tai xanh đã được khống chế cả nước, thỉnh thoảng

có xuất hiện một số ổ dịch nhỏ lẻ và đã được xử lý, ngăn chặn lây lan kịp thời

2.1.3 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở nước ngoài

Nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đi sâu nghiên cứu về nguyên nhân, cơchế truyền lây, các phương pháp chẩn đoán và phòng chống Hội chứng rối loạn hôhấp và sinh sản ở lợn

Joo Han Soo (1997) đã đưa ra phương pháp điều chế vacxin sử dụng ngaychính virus Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản được làm yếu đi

Eichhorn – G and Frost – JM (1997) nghiên cứu sử dụng sữa non của lợn náivào giai đoạn thích hợp để chẩn đoán huyết thanh phát hiện Hội chứng rối loạn hôhấp và sinh sản.

Segales.J et al (1998) nghiên cứu siêu cấu trúc đại thực bào ở túi phổi lợn bị

nhiễm in – vitro với virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản đối vớitrường hợp có hoặc không có Haemophilus – Parasuis

Calvert Jay G et al (2007) thuộc khoa Thú y trường Đại học Minesota của

Mỹ đã nghiên cứu về những đặc điểm phân loại, cấu tạo, khả năng gây bệnh củavirus cũng như những triệu chứng lâm sàng thường gặp khi lợn bị bệnh ở Mỹ vàmột số nước Châu Âu, thấy rằng các chủng virus ở Mỹ và châu Âu có sự khác biệtnhau về bộ gen, tức là virus ở 2 nơi này đã có sự biến đổi về cấu trúc

Lunney Joan K et al (2007) chỉ ra các thông số miễn dịch giúp giải thích

được nguyên nhân tại sao một số lợn trên cùng một đàn lại không bị nhiễm virusHội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản

Calvert Jay G et al (2007) nghiên cứu về trình tự gen của chủng virus cường

độc gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở Bắc Mỹ cho biết: Ở một số ổ dịch

bộ gen của virus PRRS tương đồng 93,2 – 94,2% với bộ gen của chủng VR2332(Bắc Mỹ) nhưng ở một số ổ dịch khác thì bộ gen của virus Hội chứng rối loạn hôhấp và sinh sản tương đồng 63,4 – 64,5% với chủng gây bệnh Lelystad (châu Âu)

và các virus phân lập được đã có sự đột biến ở một số axit amin

Năm 2009, người ta đã nghiên cứu 28 chủng virus PRRS được phân lập từcác trang trại lợn khác nhau tại Trung Quốc từ năm 2002 - 2003, đã giải trình tựđoạn gene ORF5 và full gene, so sánh với virus PRRS trong nhiều báo cáo từ Bắc

Mỹ, Châu Âu và Châu Á Nghiên cứu đã chứng minh rằng chủng virus PRRS ởBắc Mỹ đã xâm nhiễm vào lợn ở Hàn Quốc một thời gian trước và đã phát triểnthành một nhánh độc lập so với các chủng virus PRRS ở các nước Châu Á khác.Như vậy, sự khác biệt về địa lý có thể ảnh hưởng đến sự tiến hóa của virus PRRS

Năm 2009, các chuỗi nucleotide đã được nghiên cứu hoàn chỉnh trong haichủng virus PRRS phân lập được ở Thái Lan: 01CB1 và 01NP0 về kiểu gene đãxác định: 01CB1 và 01NP0 chứa 14.943 và 15.412 nucleotide tương ứng Kết quảcũng cho thấy 01CB1 có thể tiến hóa từ các mẫu thử nghiệm EU, virus Lelystad,trong khi 01NP0 có thể có nguồn gốc tiến hóa từ MLV hoặc các

subtype có quan hệ gần gũi với nó.

2.1.4 Những nghiên cứu về dịch PRRS ở Việt Nam

Căn bệnh lần đầu tiên được phát hiện tại Bộ môn Hoá sinh Miễn dịch Bệnh lý, Viện Thú y vào ngày 19/3/2007, khi phân lập được xác định là dương tínhvới RT – PCR đặc hiệu, nhưng chỉ chính thức được Cục Thú y công bố vào tháng4/2007 trong Hội thảo chuyên ngành

-Về chẩn đoán Hội chứng PRRS, trước tháng 3/2007, cả 9 phòng thí nghiệmcủa Cục Thú y (trừ phòng thí nghiệm của Cơ quan thú y vùng VI) không chẩnđoán bệnh này do các lý do trên Hiện nay, các phòng thí nghiệm chẩn đoán đều sửdụng kỹ thuật RT- PCR để chẩn đoán bệnh PRRS

Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương và Cơ quan thú y vùng VI tiến hànhphân lập PRRSV đều đặn từ bệnh phẩm trên tế bào Marc – 145

Hiện tại, chúng ta chưa có một biện pháp hữu hiệu phòng chống được bệnhnày, mặc dù theo đánh giá không chính thức Hội chứng PRRS đã trở nên khá phổbiến ở các trại chăn nuôi lợn tại Việt Nam

2.2 VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)

2.2.1 Hình thái, cấu tạo

Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn dương, virus được xếp vào bộ

Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins JE, 1992) Virus có cấu trúc gần giống với virus Equine arteritis virus gây viêm động mạch ở ngựa (EAV), Lactic dehydrogenase virus của chuột (LDHV) và Simian hemorrhagic fever virus gây sốt xuất huyết trên khỉ (SHFV) (Rossow KD et al., 1998).

* Cấu trúc hạt: Quan sát virus PRRS dưới kính hiển vi điện tử thấy virus có

cấu trúc dạng hình cầu, có vỏ bọc, kích thước 45nm – 80nm và chứa nhânnucleocapcid cùng kích thước có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính 35nm,được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc dính chặt với cấu trúc bề mặtnucleocapcid nên trông hạt virus giống như tổ ong

Bộ gen của virus PRRS là chuỗi dương RNA có kích thước từ 13- 15kb SợiRNA của virus có đầu 5’ và đầu 3’ Gen RNA polymeraza chiếm khoảng 75% đầu5’ của bộ gen, gen này mã hoá cho các protein cấu trúc của virus nằm ở đầu 3’

Hình 2.2 Cấu trúc hạt của PRRS virus

Hạt virus bao gồm:

• Một protein nucleocapsid N có khối lượng phân tử 1.200bp.

• Một protein màng không có đường glucose hình cầu M với khối lượng phân tử 16.000bp.

• Hai protein peplomer N – glycosylate là GS có khối lượng phân tử 25.000bp và GL có khối lượng phân tử 42.000.

* Acid Nucleic: Sự nhân lên của virus không bị ảnh hưởng khi dùng hợp

chất ức chế tổng hợp DNA là 5-bromo-2-deoxyuridin, 5-iodo-2-deoxyuridin vàmitomycin C chứng tỏ axit nucleic đó là RNA Sợi RNA này có kích thước khoảng15kb

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen của PRRS virus

Cấu trúc hệ gen của PRRSV bao gồm 7 khung đọc mở (ORF), gồm: ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7 Trong đó:

* ORF1 được chia làm hai phần bao gồm ORF1a và ORF1b, chiếm tớikhoảng 80% tổng số độ dài hệ gen của virus, chịu trách nhiệm mã hoá RNA thôngtin tổng hợp các enzym RNA polymerase của virus

* ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 là các phần gen tạo nên khungđọc mở mã hoá các protein tương ứng, đó là GP2 (glycoprotein 2), GP3, GP4, GP5(hay còn gọi là glycoprotein vỏ (E, envelope), protein màng M (membrane protein)

và protein cấu trúc nucleocapsid N (nucleocapsid protein) Các protein đượcglycosyl hóa (là hiện tượng gắn thêm hydratcacbon vào một vị trí axit amin xácđịnh) là: GP2, GP3, GP4, GP5 và các protein không được glycosyl hóa là M và N

Hình 2.4: Bộ gen của virus PRRS (www.porcilis-prrs.com/pathogenesis-prrs.asp) Bảng 1.1 Protein cấu trúc của PRRSV

Là protein liên kết vỏ bọc có tính kháng nguyên cao

Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, virus sinh ra 6 mRNA Tất cả 6mRNA có trình tự sắp xếp chung ở đầu 5' của hệ gen RNA và tất cả chúng đều cóđuôi 3' polyA Muelenberg kết luận rằng dựa trên chuỗi nucleotit, tổ chức hệ

gen, cũng như cách nhân lên của virus thì có thể xếp chúng vào nhóm virus động

mạch (Arterivirus) mới (Meulenberg et al., 1993).

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn, có màng bọc, thuộc giống

Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales.

Hiện nay có 2 kiểu gen PRRS chính được công nhận là:

Kiểu gen 1 (Nhóm 1): Các nhóm virus thuộc dòng Châu Âu với tên gọi phổ

thông là virus Lelystad (Meulenberg et al., 1993).

Kiểu gen 2 (Nhóm 2): Các nhóm virus thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu cho

chủng này là chủng virus VR-2332 (Nelsen et al., 1999).

Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta đã chứng minh được có sựbiến dị di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập, được khẳng định qua phân tíchtrình tự nucleotide và axit amin của các khung đọc mở (ORFs) của LV và VR-

2332 Trình tự axit amin của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3),80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) Phân tích trình tự cho thấy các virusđang tiến hóa do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen Các chủng virus nàygây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau

2.2.3 Khả năng gây bệnh của virus PRRS

PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn Lợn tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưnglợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Loài lợn rừng cũng mắcbệnh, đây có thể coi là nguồn dịch bệnh thiên nhiên

Về mặt độc lực người ta thấy virus PRRS tồn tại dưới 2 dạng:

+ Dạng cổ điển: Có độc lực thấp, ở dạng này khi mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1-5% trong tổng đàn

+ Dạng biến thể độc lực cao: Gây bệnh thực nghiệm và chết nhiều lợn

(Kegong Tian et al., 2007); (Tô Long Thành và Nguyễn Văn Long, 2008).

2.2.4 Sức đề kháng của virus PRRS

Mặc dù virus PRRS là một virus có vỏ bọc ngoài, nhưng sự sống sót củachúng bên ngoài vật chủ vẫn chịu tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với cácchất sát trùng

PRRSV có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở

nhiệt độ dao động trong khoảng – 700C đến – 200C, 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 300C

và 6 ngày ở 210C (Benfield et al., 1992) Tuy nhiên, khả năng sống của virus

PRRS giảm nhanh khi nhiệt độ tăng lên

Bảng 2.2 Sức đề kháng của virus với điều kiện ngoại cảnh

Điều kiện môi trường

PRRSV bền vững ở pH dao động trong khoảng 6,5 đến 7,5 Tuy nhiên, tính

gây bệnh thực nghiệm giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Paton et al., 1991).

Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệtvirus Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng

2.2.5 Đặc tính nuôi cấy virus PRRS

PRRSV có thể nhân lên trên hai loại môi trường tế bào là đại thực bào phế

nang (PAM - Pulmnary alveolar macrophage) và tế bào dòng của thận khỉ Châu Phi (PAGMK – Primary Afican Green Monkey kidney cell).

PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất,virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virusPRRS trên thế giới Nhưng nhược điểm của nó là phải chuẩn bị môi trường từ

những con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của

tế bào là có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài (Kim et al., 1993).

Với môi trường là các tế bào dòng như: MA-104, Marc-145, CL-2621 hiệnđang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bào PAM.MA-104 chỉ có thể phân lập được các chủng virus của Bắc Mỹ CL-2621 có thểphân lập virus PRRS chủng châu Âu nhưng hiệu quả phân lập của chúng thấp hơn

so với PAM Marc-145 có thể phân lập được 11 dòng virus của cả 2 chủng châu

Âu và Bắc Mỹ hơn nữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, số lượng virusthu được sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này đang được

ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu (Kim et al., 1993) Đối với chủng

virus PRRS thể độc lực cao của Việt Nam và Trung Quốc thì môi trường Marc-145

là môi trường nuôi cấy được sử dụng nhiều nhất hiện nay vì khả năng thích ứng rấtcao và gây bệnh tích tế bào điển hình của virus

2.3 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN

vấn đề phát tán virus ra diện rộng là khó tránh khỏi (Zimmerman et al., 1997).

2.3.3 Chất chứa mầm bệnh.

Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn mắc bệnh hoặclợn mang trùng và phát tán ra môi trường Tinh dịch của lợn đực giống cũng đượcxác định là nguồn phát tán mầm bệnh, virus ở tinh dịch cũng có thể lây nhiễm sangbào thai

Ở lợn bệnh hoặc lợn mang trùng, virus tập trung chủ yếu ở phổi, hạch phổi, hạch amidan, hạch lympho, lách, tuyến ức và ở huyết thanh.

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây

*Cơ chế sinh bệnh:

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, đích tấn công của virus là các đại thực bào, đặcbiệt là đại thực bào ở phế nang, phế quản Đây là tế bào duy nhất có receptor phùhợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉtrong tế bào này và phá huỷ nó Virus nhân lên ngay trong đại thực bào, sau đó pháhủy và giết chết đại thực bào (tới 40%)

Hình 2.5 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào

Lúc đầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngàyvirus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng và ồ ạt xâm nhiễm sang các tếbào khác Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệugiá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơthể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch.Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối vớicác bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Đối với cơ thể, hệ thống miễn dịch được xem là hàng rào tự nhiên giúp cơthể chống lại các vi sinh vật gây bệnh, trong đó đại thực bào là tế bào có thẩm

quyền miễn dịch, đóng vai trò vô cùng quan trọng trong việc đáp ứng miễn dịch kể

cả đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu

mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch không xảy

ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch nghiêm trọng và dễdàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát Có nhiều báo cáo về nhiễm trùng kế phát

ở đàn lợn trong ổ dịch PRRS, đặc biệt ở chuồng nuôi lợn sơ sinh

Tác nhân chủ yếu liên quan đến nhiễm trùng kế phát là: Haemophilusparasuis, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Pasteurella multocida vàActinobacillus pneuropneumoniae, SIV, EMCV, virus giả dại (Aujeszky), Porcinecytomegalovirus, Porcine respiratory coronavirus và Porcine paramyxovirus.Điều này cũng có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi

bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vikhuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp

Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007) trong nghiên cứu về PRRS chorằng, phổi chắc đặc chính là nguyên nhân gây khó thở dẫn đến thiếu oxy tại máu

và các mô bào Do suy giảm sự trao đổi khí tại phổi làm máu của gia súc bệnh cómàu sẫm, màu này có thể nhìn được từ bên ngoài tại các vùng da mỏng, các vùng

da có nhiều mạch quản như vùng tai, bẹn, bụng Vì vậy mà có triệu chứng taixanh

Mặt khác, viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai

bị suy dinh dưỡng và gây chết thai, sảy thai Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxytăng cao vì phải nuôi dưỡng thai, hơn nữa thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanhnên nhu cầu về oxy cũng tăng lên gấp bội vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêmtrọng nên hay bị sảy thai Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tửnên làm chậm các quá trình sinh lý khác

* Phương thức truyền lây

Bệnh có thể lây lan trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn bệnh, lợn mangtrùng với lợn khỏe và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị ô nhiễmvirus như: Phân, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi,…

Bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp, qua thụ tinh nhân tạo, tiếp xúc trực tiếp

Ở lợn mẹ mang trùng virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn kỳ giữa trở đi

và virus cũng được bài xuất qua nước bọt và sữa Lợn trưởng thành

có thể bài thải virus trong 14 ngày, trong khi đó lợn con và lợn choai bài thải virustới 1 – 2 tháng.

Virus có khả năng phân tán thông qua các hình thức: vận chuyển lợn mangtrùng, phân tán theo gió (có thể đi xa tới 3 km), qua bụi, bọt nước, dụng cụ chănnuôi và dụng cụ bảo hộ lao động nhiễm trùng, thụ tinh nhân tạo và có thể do một

số chim hoang dã

Sự vận chuyển lợn bệnh, sự lây lan cục bộ qua không khí được coi như làphương tiện truyền lây phổ biến nhất

2.3.5 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS

Theo ghi nhận của nhiều nghiên cứu về các triệu chứng lâm sàng ở lợn mắcPRRS cho thấy, lợn bệnh thường có các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn, mẩn

đỏ da, khó thở, táo bón hoặc ỉa chảy và một số triệu chứng khác tuỳ thuộc vàobệnh kế phát và từng loại lợn:

- Lợn nái:

Các triệu chứng chủ yếu là: Tím âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai gỗ hàngloạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độtuổi của thai: Thai dưới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai trên 2,5 tháng tỷ lệ chết

Lượng tinh ít, chất lượng kém biểu hiện: nồng độ tinh trùng C < 80.106, hoạtlực của tinh trùng A < 0,6, sức kháng của tinh trùng R < 3000, tỷ lệ kỳ hình K >10%, tỷ lệ sống của tinh trùng < 70%, độ nhiễm khuẩn cao 20.103 Lợn đực giốngrất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản của mình (Nguyễn Như Thanh, 2007)

- Lợn con theo mẹ:

Hầu như lợn con sinh ra chết sau vài giờ Số con sống sót tiếp tục chết vàotuần thứ nhất sau khi sinh, một số tiếp tục sống đến lúc cai sữa nhưng có

triệu chứng khó thở và tiêu chảy (Kamakawaa et al., 2006)

Lợn có triệu chứng biếng ăn, ho nhẹ, lông xơ xác, gầy yếu, sưng mí mắt và kếtmạc, đôi khi đây là triệu chứng mang tính chẩn đoán đối với lợn con dưới 3 tuần tuổimắc PRRS, tai xanh tím, rối loạn hô hấp, tiêu chảy phân màu nâu đỏ hoặc xám Tỷ lệlợn chết là 15% hoặc cao hơn do viêm phổi và bội nhiễm vi khuẩn kế phát

- Lợn con cai sữa và lợn choai:

Lợn chán ăn, lông xơ xác, có biểu hiện ho nhẹ… Trong những trường hợpghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi cấp tính, hình thành nhiều ổ áp xe, thểtrạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, thở nhanh, chảy nước mắt, tỉ lệ chếtkhoảng 15%

Triệu chứng lâm sàng được thể hiện rất khác nhau, theo ước tính cứ 3 đàn lầnđầu tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện, một đàn có biểu hiệnmức độ vừa và một đàn biểu hiện ở mức độ nặng Lý do của việc này đến nay vẫnchưa có lời giải thích Tuy nhiên, với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũnggiảm nhẹ hơn và cũng có thể virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau.Thực tế, nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có dấu hiệu lâm sàng(Nguyễn Văn Thanh, 2007)

2.3.6 Bệnh tích của lợn mắc PRRS

* Lợn nái mang thai

Trường hợp đẻ non thì thấy có nhiều thai đã chết, trên cơ thể chúng cónhiều đám thối rữa (thai chết lưu) Trường hợp đẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn

so với đẻ non song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc đẻ do thờigian đẻ kéo dài

Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử vàtích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

* Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũngthấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp xethường có màu xám đỏ, rắn chắc Mô phổi lồi ra và có màu đỏ xám loang lổ nhưtuyến ức hay như đá grannito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổichìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng

Tim, gan, lách của lợn mắc PRRS có bệnh tích không đặc trưng tuỳ thuộcvào sự kế phát các bệnh khác.

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột

bị viêm nhưng ở những lợn tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt có phủ mộtlớp nhầy màu nâu

- Triệu chứng đường hô hấp: Viêm phổi ở lợn con và lợn thịt Ta có thể dùngphương pháp chẩn đoán lâm sàng nghi vấn để chẩn đoán xác định bệnh trong cáctrường hợp như: sảy thai muộn > 20%; chết khi sinh > 5%; chết trước lúc cai sữa >25%

Tuy nhiên, do tính đa dạng của các loại bệnh ở lợn nên việc chẩn đoán dựavào lâm sàng thường rất khó, dễ nhầm lẫn (về các bệnh phổi, bệnh sinh sản khác).Ngoài ra việc phân lập virus cũng rất khó

* Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh

Đối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấyphổi rắn, chắc và có vùng xám và hồng

Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan trànlàm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào Lympho trong các tổ chứcLympho…

* Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học

Để phát hiện sự có mặt của virus PRRS người ta có thể sử dụng phương phápkháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm

tế bào một lớp và phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp (VNT);phương pháp miễn dịch bệnh lý khi sử dụng kháng thể chuẩn để phát hiện virus có

trong mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS (Bưtner et al., 2000), (Anette, 1997).

Phương pháp ELISA có thể chẩn đoán một số lượng mẫu huyết thanh lớn vàkết quả nhanh Khi dùng phương pháp này có thể phát hiện được cả chủng virus cónguồn gốc Bắc Mỹ và chủng có nguồn gốc từ Châu Âu

Phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp (Virusneutralization test) là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vìkháng thể trung hòa có thể tồn tại ít nhất một năm (Anette, 1997) Tuy nhiên, phảnứng trung hòa virus kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác vì kháng thểtrung hòa xuất hiện chậm hơn

Có một thực tế là khi đánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh phảicân nhắc đến trạng thái miễn dịch của đàn sau khi được tiêm phòng vacxin vì hiệntại chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể do lợn mắcbệnh tự nhiên hay do tiêm phòng vac-xin (Anette, 1997)

Kỹ thuật RT- PCR: Dùng phản ứng RT- PCR phân tích mẫu máu (được lấytrong giai đoạn đầu của pha cấp tính) để xác định sự có mặt của virus, đây là phảnứng tương đối nhạy và chính xác

* Phương pháp nuôi cấy virus trên tế bào tổ chức

Là phương pháp khoa học tiên tiến được sử dụng rộng rãi trong Y học đểnghiên cứu các virus như: Nuôi cấy, phân lập, giám định, chuẩn độ, quan sát hìnhthái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt dùng các môi trường tế bào tổ chức để nuôicấy các vacxin virus

Với nhiều loại virus sự nhân lên của chúng tiến triển song song với sự thoáihoá của các tế bào nuôi, một số virus gây bệnh cho tế bào rất đặc trưng Nhữngbiến đổi có tính chất đặc trưng đó gọi là sự huỷ hoại của tế bào chủ (CytoPathogenic Effect - CPE) hoặc các ổ tế bào bị hoại tử Có những tế bào bị nhiễmvirus chưa đến mức bị chết nhưng chức năng của tế bào này đã bị thay đổi

Căn cứ vào CPE khi quan sát trên kính hiển vi quang học có thể đánh giáđược hiệu quả nuôi cấy virus.

Khi có dịch thì phải công bố dịch Cơ sở chăn nuôi phải thống kê số lợn ốm,lợn chết, báo cáo cho chính quyền và thú y địa phương để xử lý theo hướng dẫnphòng chống bệnh tai xanh của Cục thú y

- Phòng bệnh bằng vacxin, hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm vacxin được dùng để phòng bệnh PRRS như:

* Vacxin BSL-PS100

Vacxin PRRS nhược độc đông khô thế hệ mới có nguồn gốc từ chủng

JKL-100 thuộc họ Châu Mỹ, một liều chứa ít nhất 105TCID50/1ml Có độ an toàn rấtcao, vacxin an toàn dù chủng cao gấp 20 liều

* Vacxin BSK-PS100

Vacxin vô hoạt chứa chủng PRRSV dòng Châu Âu Một liều vacxin chứa ítnhất 107,5TCID50/1ml Vacxin có độ an toàn rất cao, thử nghiệm đã chứng minhBSK-PS100 an toàn dù chủng cao gấp 10 liều, vacxin an toàn đối với vật mangthai

Nha)

Vacxin nhược độc dạng đông khô, chứa PRRSV chủng Châu Âu VP046BIS, mỗi liều chứa ít nhất 103,5TCID50/1ml

* Vacxin Solvente/A3 (Blanco), Solvent/A3 (White), lọ 20ml.

Tiêm bắp cổ sâu, liều 2ml/con

* Vacxin Porcillis PRRS của Hà Lan.

b Trị bệnh

Hiện nay chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại của bệnh

chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâmsàng, giảm nhẹ và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát.

- Đối với lợn nái trong giai đoạn chửa kỳ cuối, dùng Antiprostaglandin,Acetylsalicylic để làm giảm sốt và kéo dài việc mang thai khi ở giai đoạn đầu của

ổ dịch (Tô Long Thành)

- Có thể dùng Clotetracylin bổ sung vào trong thức ăn để phòng vi khuẩn kế phát (Tô Long Thành)

- Giai đoạn lợn ăn ít cần bổ sung các thức ăn có năng lượng cao

- Đảm bảo đủ sữa cho lợn con bú

- Điều trị ỉa chảy ở những lợn bệnh

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng virus KTY - PRRS - 04 được phân lập tại ổ dịch tại Bắc Giang năm

2014 và lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y – Khoa Thú y Học viện Nông nghiệp Việt Nam

-3.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu

* Mẫu virus nghiên cứu

Chủng virus KTY - PRRS - 04 đã được phân lập được từ mẫu bệnh phẩmcủa lợn mắc PRRS được bảo quản ở phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y –Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

* Dụng cụ, máy móc, thiết bị

- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet

- Tủ ấm 370C/ 5% C02, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -40C, -200C, -800C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào

- Buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR

- Máy giải trình tự tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ), máy tính vàcác phần mềm xử lý dữ liệu như phần mềm CEQ 8000 (version 9.0), phần mềmgenetyx (version 5.0.4), MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysisversion 5.10)

* Hóa chất, môi trường

- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay 24 giếng

- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM,FCS, kháng sinh (penicillin (100 U/µl), Streptomycin (100 µg/ml), EDTA,Trypsin, DMSO…

- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%

- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Mồi xuôi, mồi ngược, enzyme…

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

-Bộ môn Bệnh lý Thú y – Khoa Thú y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

- Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y - Khoa Thú Y – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145

- Hồ sơ giống virus KTY - PRRS - 04 lựa chọn nghiên cứu

- Khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển

- Hiệu giá virus KTY - PRRS – 04 qua các đời cấy chuyển

3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY - PRRS - 04 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc -145

- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY - PRRS - 04;

- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus PRRS - 04 qua các đời cấy chuyển

KTY So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS

- 04 qua các đời cấy chuyển

- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY - PRRS - 04

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nuôi cấy virus KTY - PRRS - 04 trên môi trường tế bào Marc - 145

* Chuẩn bị tế bào Marc 145

- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 370C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy

Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.

Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và

giữ lại cặn tế bào

Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế

bào và bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường DMEM + 5% FCS Đóng chặt bìnhnuôi cấy lại, ghi tên tế bào và ngày gọi dậy lên nắp bình nuôi cấy

triển của tế bào Khi thấy tế bào mọc dày, kín bề mặt đáy bình là có thể thu tế bào

để bảo quản hoặc cấy chuyển tế bào sang bình nuôi cấy mới

- Cấy chuyển tế bào

Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định đểphục vụ nghiên cứu

Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.

Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA Thêm 7ml môi

trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm

Bước 3: Loại bỏ Trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu

trắng

Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml môi

trường đầy đủ Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môitrường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tếbào trong 1ml

trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/bìnhT75)

hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào

* Gây nhiễm virus KTY - PRRS - 04

Khi tế bào một lớp Marc-145 (tế bào phủ kín thành một lớp trên bề mặt nuôicấy, không chồng chéo lên nhau) trong giếng đã chuẩn bị cho việc tiến hành gâynhiễm mọc kín hầu hết mặt giếng nuôi thì hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung100µl mẫu đã chuẩn bị Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 60phút

Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và

ủ ở 370C với 5% CO2