TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Lê Thu Hương Tên luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin”
Trang 1H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ
LÊ THU HƯƠNG
Ngườ ưới h ng d n khoa h c:ẫ ọ TS Tr nh Đình Thâuị
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, các kết quả nghiên cứu, các số liệu được trình bàytrong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất cứ mộtcông trình khoa học nào cũng như chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã đượccảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày … tháng … năm 2016
Tác giả luận văn
Lê Thu Hương
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhậnđược sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên củabạn bè, đồng nghiệp và gia đình
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Thâu, trưởng Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam,người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôitrong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Ban giám đốc, Ban quản lý đàotạo, Khoa Thú Y - Học viện nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quátrình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn
Tôi xin chân thành cám ơn TS Tạ Hoàng Long, giám đốc Trung tâm kiểmnghiệm thuốc thú y trung ương I, tập thể lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên chứctrong trung tâm, đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện
đề tài
Tôi cũng xin phép được gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân,bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, độngviên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn
Hà Nội, ngày … tháng ….năm 2016
Tác giả luận văn
Lê Thu Hương
Trang 4MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
Trích yếu luận văn viii
Thesis extract x
Phần 1 Mở đầu 1
Phần 2 Tổng quan tài liệu 3
2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan vịt 3
2.1.1 Lịch sử và phân bố bệnh 3
2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới 5
2.1.3 Tình hình bệnh Viêm gan vịt ở Việt Nam 8
2.2 Virus viêm gan vịt 9
2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt 9
2.2.2 Cấu trúc hệ gen Picornavirus 9
2.2.3 Quá trình nhân lên của virus 11
2.2.4 Đặc tính nuôi cấy 13
2.2.5 Đáp ứng miễn dịch 15
2.2.6 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt type I (DHV-1) 16
2.2.7 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt 21
2.2.8 Chẩn đoán 21
2.2.9 Vắc xin và chế phẩm sinh học phòng bệnh 22
Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 25
3.1 Vật liệu nghiên cứu 25
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 25
3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu 25
3.1.3 Thiết bị, máy móc 26
3.1.4 Địa điểm nghiên cứu 27
Trang 53.2 Nội dung nghiên cứu 27
3.2.1 Xác định đặc tính sinh học của giống virus Viêm gan vịt cường độc 27
3.2.2 Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 27
3.3 Phương pháp nghiên cứu 27
3.3.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống 27
3.3.2 Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của giống 28
3.3.3 Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền virus giống 28
3.3.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp 28
3.3.5 Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm 29
3.3.6 Phương pháp giải trình tự gen của virus 30
3.3.7 Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Theo TCVN 8685-2:2011 32
3.3.8 Xử lý số liệu trong nghiên cứu 33
Phần 4 Kết quả và thảo luận 34
4.1 Kết quả xác định đặc tính sinh học; giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ liệu sinh học của giống virus viêm gan vịt cường độc 34
4.1.1 Kết quả xác định đặc tính sinh học của virus Viêm gan vịt cường độc 34
4.1.2 Kết quả giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống Viêm gan vịt cường độc. 39
4.2 Ứng dụng giống virus viêm gan vịt cường độc trong công tác kiểm nghiệm 45 4.2.1 Kết quả kiểm tra cảm quan 47
4.2.2 Kết quả kiểm tra thuần khiết 47
4.2.3 Kiểm tra tính an toàn của vắc xin (Theo TCVN 8685-2:2011) 48
4.2.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường độc 48
Phần 5 Kết luận và đề nghị 51
5.1 Kết luận 51
5.2 Đề nghị 51
Tài liệu tham khảo 52
Phụ lục 55
Trang 6DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt
EID50 50 percent Embryo Infectious Dose
ELD50 50 percent Embryo Lethal Dose
RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction
Trang 7DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các chủng viêm gan vịt của Việt Nam và thế giới cung cấp chỉ thị gen
để phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ 20
Bảng 4.1 Kết quả kiểm tra vô trùng giống virus Viêm gan vịt cường độc 35
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra thuần khiết giống virus Viêm gan vịt cường độc 36
Bảng 4.3 Kết quả xác định LD50 của virus Viêm gan vịt cường độc ở 2 đợt thí nghiệm 37 Bảng 4.4 Danh sách các mồi dùng cho phản ứng PCR/RT-PCR trong nghiên cứu virus Viêm gan vịt 40
Bảng 4.5 Trật tự sắp xếp nucleotide và amino acid trong hệ gen virus Viêm gan vịt cường độc 45
Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 47
Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin Viêm gan vịt nhược độc 48
Bảng 4.8 Kết quả công cường độc bằng virus Viêm gan vịt cường độc 49
Trang 8DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1 Vịt chết thời điểm 48 giờ giống virus Viêm gan vịt cường độc và hình
ảnh Gan xuất huyết hoại tử 38Hình 4.2 Sơ đồ bố trí mồi thực hiện PCR và quá trình giải mã hệ gen virus viêm
gan vịt cường độc thuộc DHAV-3 39Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR/PCR nhân gen kháng nguyên VP1. 40Hình 4.4 Điện di kiểm tra kết quả cắt ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzyme
giới hạn EcoRI 41Hình 4.5 Trình bày chuỗi gen VP1 chủng virus viêm gan vịt cường độc 42Hình 4.6 Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng viêm gan vịt cường độc -
DN2 của Việt Nam và thế giới (thuộc DHAV-3) dựa trên cơ sở phân
tích chuỗi gen VP1 về thành phần nucleotide bằng chương trình
Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR hệ gen virus viêm gan vịt cường độc 44Hình 4.8 Vịt ở lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh và vịt lô đối chứng chết
49
Trang 9TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Lê Thu Hương
Tên luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus
Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin”
Nội dung nghiên cứu
-Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc thôngqua các bước cấy truyền, gây nhiễm trên tế bào, xác định độc lực, xác định đặc tính ổnđịnh, tính kháng nguyên của giống; Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh họcphân tử của giống Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu giữ
- Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cườngđộc với chủng cường độc viêm gan vịt
Phương pháp
-Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp
-Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm
- Phương pháp giải trình tự gen của virus: tách chiết ARN tổng số; Phương pháp RT- PCR
- Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Kiểm tra độ thuần khiết; an toàn; hiệu lực.
-Xử lý số liệu trong nghiên cứu
Kết quả chính và kết luận
- Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với các vi khuẩn hay gặp Về độ tinh khiết giống không lẫn Mycoplasma và Salmonella
-Xác định liều gây chết 50% vịt (LD50): 106,31
-Giải mã gen kháng nguyên VP1 của chủng viêm gan vịt cường độc có độ dài
là 720 bp và được xác định thuộc genotype III (DHAV-3) Truy cập Ngân hàng gen sử
Trang 10dụng chuỗi nucleotide mới thu nhận cho thấy chủng virus phân tích thuộc virus viêm gan vịt nhóm A (duck hepatitis A), genotype III (DHAV-3).
-Đã giải mã toàn bộ hệ gen thu được chuỗi ADN của toàn bộ hệ gen virusviêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide Dựa vào trật tự các gen trong hệ gencủa các chủng virus viêm gan vịt đã công bố, xác định được trật tự sắp xếp của cácgen trong hệ gen của chủng virus viêm gan vịt cường độc
- Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy: Vị trí phân loại của chủngvirus cường độc: Group IV:ss RNA positive-strand viruses; Order: Nidovirales;Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3)
- Ứng dụng thành công giống cường độc Viêm gan vịt trong kiểm nghiệm vắcxin Qua kết quả này đã chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăngcường và lưu giữ vẫn giữ được đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độccủa giống
Trang 11THESIS EXTRACT
Author: Le Thu Huong
Thesis title: "Study of some biological characteristics, molecular biology of virulent
Duck Hepatitis Virus and use the virulent Duck Hepatitis Virus in quality control ofthe vaccine"
University: Vietnam National University of Agriculture
Research purposes
Determine some of biological characteristics of virulent duck hepatitis virus(DHV) Determine genes characteristic of virulent DHV Use the virulent DuckHepatitis Virus in control the vaccine
Research content
- Determine the biological characteristics of virulent DHV including thecultures, the ability to infect cells, virulence, stability, antigenicity of the strain;Genome decoding features built molecular biological data Decoding the genome ofthe virulent DHV is stored
- Quality control of duck hepatitis vaccine, inactivated by virulent strains of duck hepatitis virus
Method
-Method of culture of chicken embryo fibroblasts a layer
-Method of determining the 50% lethal dose
- Methods of gene sequencing of the virus: the total RNA extraction; RT-PCR method
-Methods of testing vaccines: purity; safe; effect
-Data processing research
Main results and conclusions
- Duck hepatitis virus strain is not contaminated with common bacteria Mycoplasma and Salmonella are not appearing
-Determination of the lethal dose 50% duck (LD50): 106.31
- Decoding of the VP1 gene virulent duck hepatitis is 720 bp in length and
Trang 12belong to genotype III (DHAV-3) Access the gene bank using the new nucleotidesequence obtained showed the analysis of duck hepatitis virus A (duck hepatitis A),genotype III (DHAV-3).
- Decoded the DNA sequence obtained by whole virulent duck hepatitis virusconsists of 7777 nucleotides Follow the duck hepatitis virus was published, we havearranged to determine the order of genes in the genome of the virulent duck hepatitisvirus
- Results of research on molecular biology shows: Position classification ofvirulent strains: Group IV: positive-strand RNA viruses ss; Order: Nidovirales;Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3)
- Successful application of the virulent DHV in quality control of the Duck Hepatitis vaccines, Inactivated Through this result proved the virulent DHV after enhancing still retains biological characteristics, antigenic properties, virulence of strain.
Trang 13PHẦN 1 MỞ ĐẦU
Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI được thành lập năm 1984 theoquyết định số 58 NN-TCCB/QĐ ngày 28 tháng 3 năm 1984 của Bộ trưởng BộNông nghiệp nay là Bộ Nông nghiệp và PTNT Ngoài nhiệm vụ kiểm nghiệmthuốc và nguyên liệu làm thuốc, các chế phẩm sinh học thú y, Trung tâm là nơi lưugiữ giống vi sinh vật thú y để phục vụ cho kiểm nghiệm, chẩn đoán cũng như chếtạo vắc xin và các chế phẩm sinh học cho ngành thú y trong cả nước và được nhập
từ nước ngoài
Hiện nay, Trung tâm lưu trữ và bảo tồn 48 chủng giống vi sinh vật thú y.Phần lớn các giống vi sinh vật thú y này có xuất xứ từ Trung Quốc, một số khác docán bộ thú y mang từ nước ngoài về theo con đường không chính thức (hoặc chínhthức) và một số do Viện Thú y, Trung tâm Chẩn đoán thú y quốc gia cung cấp
Do sự eo hẹp về kinh phí, hàng năm Trung tâm chỉ có thể bảo tồn giống visinh vật bằng các phương pháp truyền thống rồi đông khô, lưu giữ Gần như tất cảcác giống vi sinh vật hiện có chưa được giám định đầy đủ về kháng nguyên tính,độc lực, tính ổn định và cấu trúc gen một cách có hệ thống Những năm gần đây,
do sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học phân tử Các chủng
vi sinh vật được lưu giữ tại Trung tâm đã và đang được tiêu chuẩn hoá, dần dần tiệm cận với chuẩn hoá của quốc tế
Trước đây, nhưng nghiên cứu virus viêm gan vịt chỉ dừng ở mức độ lâmsàng, bệnh tích, chẩn đoán virus học và sản xuất vắc xin truyền thống để phòngchống (OIE, 2008) Tuy nhiên, trong vòng 5 năm nay, virus viêm gan vịt đượcnghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụngsinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan
hệ sinh học trong họ Picornaviridae Theo quan điểm phân loại hiện nay, virusviêm gan vịt trên thế giới gồm ba genotype khác nhau: Genotype I (DHAV-1),genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3)
Tại Việt Nam, chủng virus viêm gan vịt đang lưu giữ từ trước tới nay mớichỉ xác định được virus gây bệnh viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1) Việcxác định chủng virus thuộc genotype I như đã công bố hay đã biến đổi hoặc cónhững khác biệt so với các chủng trên thế giới?
Trang 14Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịtcường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin" Đề tài được thực hiện vớinhững mục tiêu và nội dung sau:
Mục tiêu nghiên cứu:
Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Giải
mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống Ứng dụng chủngcường độc trong kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt
Nội dung nghiên cứu:
1. Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc(gồm các bước cấy truyền, khả năng gây nhiễm trên tế bào, độc lực, tính ổn định,tính kháng nguyên của giống); Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh họcphân tử của giống Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưugiữ
2. Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cường độc bằng chủng cường độc viêm gan vịt
Những đóng góp mới của luận văn:
Là nghiên cứu về sinh học phân tử và giải mã hệ gen virus đầy đủ và chi tiết nhất của chủng virus cường độc viêm gan vịt thuộc nguồn gen quốc gia
Trang 15PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT
Levine, 1957 ; Levine et al., 1950; Asplin, 1965; 1970 ; Toth, 1969; Haider,
Calnek, 1979) Virus viêm gan vịt serotype 2 và serotype 3 mới được tìm thấy ởAnh và Mỹ, gây tỷ lệ chết không đáng kể (Woolcock, 2003) Virus viêm gan vịtserotype 1 còn được gọi chung là virus viêm gan vịt
Ngày nay, nhờ công nghệ sinh học phân tử, đã xác định virus gây bệnhviêm gan vịt trên thế giới gồm có 3 genotype khác nhau, bao gồm genotype I(DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3) Phổ biến nhất làvirus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 chủng đã được phân lập từ năm
1950 đến nay, virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ởĐài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm 15 chủng vừa phân lập ở TrungQuốc và Hàn Quốc
Bệnh có biểu hiện đặc trưng: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết
ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng Mổ khám thấy gan sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử
Bệnh viêm gan do virus ở vịt (Duck Hepatitis Virus) được phát hiện lần đầutiên vào năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945),nhưng chưa phân lập được mầm bệnh Mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricanttheo dõi một bệnh tương tự trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island (Mỹ) và cótới 70 trại vịt lớn mắc bệnh gây thiệt hại nặng nề Ban đầu ở những trại mắc bệnhnặng tỷ lệ chết lên tới 95%, thời điểm cuối ổ dịch ở một số trại còn sót lại khi vịtmắc bệnh tỷ lệ chết giảm dần chỉ còn 15% Tổng số vịt chết trong ổ dịch lên tới75.000 con (Levine và Fabricant, 1950)
Trang 16Hình 2.1 Hình ảnh vịt chết khi
nhiễm virus viêm gan vịt
Hình 2.2 Gan vịt xuất huyết khi
mắc bệnh
(Nguồn:
Nanovet)
(Nguồn:ww w.mekovet com.vn)
Năm 1950, bằngphương pháp nuôi cấy trênphôi gà, Levine vàFabricant đã phân lậpđược virus viêm gan vịttype I (Nguyễn Đức Lưu
và Vũ Như Quán, 2002)
Năm 1953, bệnhxảy ra trên các ñàn vịt xảy
ra ở các vùng khác củanước Mỹ Sau đó bệnhcũng được phát hiện ởnhiều nước trên thế giới:Anh, Canada, Niderland,
Ai Cập và Tây Ban Nha, ở
Bỉ Ở Liên Xô cũ bệnhđược xác định trên lãnhthổ Ucraina và nước cộnghoà Nga Ở Mỹ, Canada,Anh bệnh viêm gan vịtcon thuộc bệnh truyềnnhiễm bắt buộc phải đăng
ký như bệnh Newcastle
Trang 17Năm 1956, bệnh tiếp tụcđược phát hiện ở bangMassachuset, Illinois vàMichigan; sau đó bệnh xảy ra trênkhắp cả nước Mỹ.
Năm 1965, ở Norfolk(Anh) hiện tượng bệnh viêm ganvịt vẫn xảy ra trên những đàn vịtcon đã được tiêm phòng vắc xinnhược độc viêm gan vịt serotype1
Năm 1969, ở đảo Long(Mỹ), bệnh viêm gan vịt đã xảy ratrên đàn vịt con đã được tiêmphòng vắc xin nhược độc typ I(Toth, 1969) Bệnh xảy ra nhẹ hơn
so với bệnh viêm gan vịt của virustyp I, tỉ lệ chết của vịt con hiếmkhi vượt quá 30% Haider vàCalnek đã đặt tên virus này làvirus viêm gan vịt typ III và chođến nay virus viêm gan vịt typ IIImới chỉ được công bố ở Mỹ(Haider và Calnek, 1979)
Ở Trung Quốc, virus viêmgan vịt lần đầu tiên được phân lập
và xác nhận năm 1982 (Guo, Pan,1984) Theo các báo cáo gần đâynhất, bệnh viêm gan vịt xảy ra ởkhắp nơi trên thế giới, trong đó có
cả Trung Quốc và Triều Tiên(OIE, 2003)
Trang 182.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới
Có nhiều phương pháp được áp dụng trong nghiên cứu xác định virus viêmgan vịt (Toth, 1969; Rispens, 1969), đặc biệt là sử dụng phản ứng ngưng kết hồngcầu (hemagglutination test, HA), phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phảnứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay –ELISA) Gần đây, khoa học ngày càng phát triển với nhiều phương pháp mới hiệnđại hơn, chính xác hơn trong nghiên cứu sâu về sinh học phân tử virus Viêm ganvịt Phổ biến hơn cả là phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerasechain reaction) và PCR cho phép xác định chính xác virus gây bệnh cũng nhưnghiên cứu sâu về sinh học phân tử của virus
Đến nay, bệnh Viêm gan vịt do virus serotype 1 (còn được gọi là virus Viêmgan vịt) đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam
2.1.2.1 Đường xâm nhập và cách lây lan
Virus Viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễmbệnh rất cao (100%) Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá, hô hấp hoặcqua vết thương (Levine, Fabricant, 1950) Đường lây nhiễm qua không khí củabệnh Viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm
ở gà con; có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp.Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽmắc bệnh và chết sau đó ít ngày
Bệnh Viêm gan vịt không lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ trứngcủa vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958) Ở những vịt khỏi bệnh,virus được bài xuất ra ngoài theo phân trong 8 tuần Các loài chim hoang dã mangvirus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, đâychính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa (Asplin, 1961) Chuột cốngnâu có thể là vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type I Ở loại động vật này virusđược thu nhận vào cơ thể, tồn tại 35 ngày, sau ñó ñược bài tiết ra bênh ngoài trongkhoảng thời gian 18 – 22 ngày sau khi nhiễm Trong huyết thanh của chuột cókháng thể và kháng thể tồn tại 12 – 24 ngày
Priz, 1973 đã gây bệnh cho vịt con bằng đường gây nhiễm qua không khí.Trong các trường hợp này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và đường hôhấp trên (Priz, 1973) Có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống (Asplin, 1958).Virus viêm gan vịt type II xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá và
Trang 19đường lỗ huyệt Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất theo phân ít nhất 1tuần sau khi nhiễm bệnh.
Thời kỳ nung bệnh từ 1-5 ngày, đôi khi kéo dài 8 ngày thậm chí 13 ngày.Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào độc lực của virus, liều lượng tiêm và phươngpháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể
2.1.2.4 Bệnh tích
* Bệnh tích đại thể
Bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi
ấn nhẹ Trong một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin Bề
Trang 20mặt loang lổ do có nhiều xuất huyết, kích thước và hình dạng khác nhau Xuấthuyết lan rộng không có ranh giới Sự xuất huyết gan không phải có ở tất cả vịtchết do bệnh viêm gan virus Sự xuất huyết ở gan rõ rệt nhất khi nhỏ bệnh phẩmvào niêm mạc mũi Khi tiêm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương vàcàng ít hơn khi gây ra bệnh qua ñường miệng Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử
do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn Lách có thể sưng, thận
tụ máu (Nguyễn Thát, 1975)
* Bệnh tích vi thể
Những biến đổi vi thể trong viêm gan virus ở vịt con chủ yếu thấy ở gan vàđại não Trong gan có những đám tế bào bị hoại tử, viêm tăng sinh ống mật vàxung quanh mạch, lúc đầu là những bạch cầu hạt sau đó là tế bào lympho và cáctương bào Ở một nửa số vịt con thấy các bệnh tích viêm tăng sinh quanh mạch vàviêm tăng sinh mô thần kinh đệm Sự tổn thương của tế
bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêmgan của người Bệnh tích trong não vịt chết do viêm gan giống viêm não thể thanh
dịch (Fabricant et al., 1957).
Phôi vịt 10 – 14 ngày tuổi ñược tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoangniệu mô, phôi chết trong khoảng 24 – 72 giờ sau khi tiêm và có biểu hiện xuấthuyết dưới da, gan xuất huyết có nhiều điểm hoại tử
* Bệnh tích siêu vi thể
Lấy gan làm tiêu bản siêu vi thể kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử Kết quả
là sau 1 giờ có hiện tượng vỡ glycogen trong tế bào gan và quan sát thấy những hạt
có ñường kính 100 - 300nm, các tế bào hoại tử sau 12 giờ nhiễm Các hạt virusđược tìm thấy sau 1 giờ và 18 đến 24 giờ gây bệnh (Adamiker, 1969) Sau khi gâynhiễm virus vào tế bào lách thì tế bào lách bị biến đổi sau 6 giờ, bị hoại tử sau 24giờ, thoái hóa nhân, tương bào, không tìm thấy tiểu thể virus, có những biến đổinhẹ trong cơ
Không tìm thấy thể bao hàm trong tế bào gan vịt bệnh, đây là điểm khác đốivới bệnh dịch tả vịt Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt type II bệnh tích vi thể đặctrưng ở gan: các tế bào gan bị hoại tử lan tràn, tế bào ống dẫn mật tăng sinh trênmột phạm vi rộng
Trang 212.1.3 Tình hình bệnh Viêm gan vịt ở Việt Nam
Tại Việt Nam, năm 1978 đã ghi nhận có bệnh Viêm gan vịt, nhưng chưaphân lập được virus tại thời điểm đó (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1987).Năm 1979 - 1983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương làm chết nhiều vịt con (LêThanh Hoà và cs, 1984) Năm 1985, Trần Minh Châu và cộng sự đã phân lập đượcmột chủng virus Viêm gan vịt cường độc ở một trại vịt ở Phú Xuyên - Hà SơnBình cũ Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu đi, không gây bệnh chovịt con mà tạo được đề kháng cho vịt con
Qua điều tra cho biết từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2001 khi điều tra 20 ổdịch tại các địa phương: Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tuyên Quang kếtluận đó chính là bệnh viêm gan vịt do virus với tỷ lệ nhiễm trong đàn lên tới100%, lứa tuổi mắc bệnh từ 1 - 21 ngày tuổi, tỷ lệ chết từ 48,57 - 90% (NguyễnVăn Cảm và cs 2001) Theo một số nghiên cứu đã công bố, bệnh Viêm gan vịt chođến nay vẫn xảy ra ở nước ta, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (NguyễnVăn Cảm và cs 2001) Đặc biệt, gần đây nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vàonước ta chưa thích ứng được với điều kiện môi trường nên bệnh viêm gan vịt càngxảy ra nhiều hơn, nhất là ở các địa phương là Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình và cáctỉnh đồng bằng sông Cửu Long gây tổn thất rất lớn (Nguyễn Hữu Vũ và cs., 2001;Nguyễn Đức Lưu và cs., 2002)
Từ cuối năm 2003, đầu năm 2004, khi bệnh cúm gia cầm bùng phát, gâythiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm cũng như ảnh hưởng đến sứckhỏe con người khiến bệnh viêm gan vịt cũng như một số bệnh khác của gia cầm ítđược quan tâm chú ý nhiều như trước Tuy nhiên, trên thực tế bệnh viêm gan vịtvẫn tồn tại và có nhiều biến đổi phức tạp Trong những năm gần đây, đặc biệt là từnăm 2006 - 2007 đến nay, trên thế giới đặc biệt đi sâu nghiên cứu về sinh học phân
tử virus viêm gan vịt và đã đồng loạt đưa ra nhiều công bố khẳng định sự biến đổimạnh mẽ và khác nhau trong quần thể và hệ gen của virus, đến mức tạo ra một chimới và các genotype mới trong họ Picornaviridae Tuy nhiên, các loại vắc xinphòng bệnh viêm gan vịt cho đến nay đều thuộc một loại genotype (DHAV-1) Do
đó, việc sản xuất vắc xin từ chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype mới là rất cầnthiết
Trong các năm gần đây, các công trình nghiên cứu về virus viêm gan vịt ởViệt Nam không có nhiều và các nghiên cứu này chỉ đi sâu vào nghiên cứu bệnh
Trang 22tích đại thể, vi thể của virus gây bệnh, các đặc tính sinh học của virus nhược độc(Trần Thị Lan Hương, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007) và một số nghiên cứu về sinhhọc phân tử, giải mã hệ gen.
2.2 VIRUS VIÊM GAN VỊT
2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt
Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck hepatitis virus - DHV) là một bệnhtruyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con Bệnh lây lan nhanh và gây tỷ lệ chết rấtcao, virus gây bệnh viêm gan vịt là một loại ARN virus thuộc họ Picornaviridae,
có 3 type virus gây bệnh khác nhau, bao gồm type I (DHV-1), type II (DHV-2) vàtype III (DHV-3), phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I (Fabricant andLevine, 2002) Đây là một Picornavirus nên có hình thái giống với hình thái chung
Là loại virus có kích thước nhỏ, khoảng 20 - 30nm, không có vỏ bọc ngoài, có 32capxome, hệ gen chứa axit ribonucleic (ARN), sợi đơn dương, có độ dài khoảng7.690 nucleotide, ở đầu cuối 3’có thêm đuôi poly (A) dài khoảng 18 nucleotide.Hiện nay, họ Picornaviridae gồm có 23 loại virus và được nhóm vào 9 chi, đó làEnterovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus,Erbovirus, Kobuvirus và Teschovirus (Stanway và cs, 2005) Ngoài ra, đã có giảthuyết nên nhóm 3 loại virus là Porcine Enterovirus 8 (PEV-8), Simianvirus2 (SV-2) và Duck Picornavirus (DPV) để xếp chung vào một chi mới và dự kiến đặt tên
nhóm là “Sapelovirus” (Krumbholz et al., 2002).
2.2.2 Cấu trúc hệ gen Picornavirus
Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ màthay vào đó là là một protein nhỏ (khoảng 23 amino acid) gọi là VPg (virionprotein genome-link) VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốctyrosine Ở cả hai đầu của hệ gen picornavirus đều có vùng không dịch mã (UTR).Vùng 5’UTR dài hơn, có độ dài khoảng 600 – 1200 bp, trong khi vùng 3’UTR có
độ dài chỉ từ 50 – 100 bp Vùng 5’UTR có vai trò quan trọng đối với quá trình sao
mã và vùng 3’UTR có vai trò trong quá trình tổng hợp sợi âm Tuy nhiên đầu 5’cũng có thể có vai trò trong việc làm tăng cường độc lực của virus(http://en.wikipedia.org/wiki/Picornavirus.com) Trong hệ gen của picorna-virus cómột vùng nucleotide làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES –Internal Ribosome Entry Site, đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạpdạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho quá trình dịch mã không phụ
Trang 23thuộc điểm mũ của hệ gen virus Nằm giữa hai vùng 5’, 3’ là một khung đọc mởlớn, mã hoá cho một chuỗi polypeptide chung, có chiều dài khoảng 2100 – 2400amino acid chứa các protein cấu trúc và protein không cấu trúc Giống như mRNA
ở tế bào nhân chuẩn, đầu cuối 3’ của virus có gắn thêm đuôi poly A, dài khoảng 18nucleotide
Hình 2.1 Hình ảnh Poliovirus, RNA virus thuộc họ Picornaviridae
Nguồn: http://pathmicro.med.sc.edu
Trong chuỗi polypeptide, phần protein đầu tiên là protein dẫn, ký hiệu là L(Leader protein), tiếp theo là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4 (1A), VP2 (1B),VP3 (1C) và VP1 (1D) Đoạn cuối cùng gồm 7 protein không cấu trúc là protein2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D Tuy nhiên, ở giữa các chi khác nhau thì trật tự này
sẽ có sự thay đổi nhỏ Chuỗi polypeptid chung của picornavirus thường bị phângiải bởi một, hai hoặc ba trong số ba enzyme protease là 3Cpro, 2Apro và Lprothành 10, 11 hoặc 12 chuỗi polypeptide (thành 10 chuỗi polypeptide đối vớiKobuvirus và Parechovirus, hoặc thành 12 chuỗi polypeptide đối với Aphthovirus,
Cardiovirus, Erbovirus, Tescho virus - Krumbholz et al., 2002) Số lượng chuỗi
protein được tạo thành phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như sự có mặt hay vắngmặt protein L; số lượng protein 2A và sự phân cắt hay không phân cắt VP0 thànhVP4 và VP2 Phần lớn ở các virus trong họ Picornaviridae, VP0 là một proteinđược myristyl hoá, tức là được gắn thêm acid béo bão hòa gồm 14 cacbon tại vị tríGlycine theo quy lụât (GxxxS/T) thông qua mối liên kết amid, từ đó VP0 có thể tựphân tách thành protein VP4 và VP2 Hầu hết những virus trong họ Picornaviridaeđều có một protein 2A, riêng Ljunganvirus có thể có 2 loại protein 2A (Jonhansson
et al., 2003).
Trang 24Hình 2.2: Cấu trúc không gian của picorrnavirus
Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm ngay trên bề mặt vỏ kháng nguyên; còn protein VP4 lặn sâu vào bên trong (Nguồn: Swiss Institute of Bioinformatics, 2008).
2.2.3 Quá trình nhân lên của virus
Virus nhân lên trong tế bào chất Đầu tiên, virus gắn vào thụ thể nằm trênmàng sinh chất của tế bào chủ, sau đó theo cơ chế nhập bào và tiến hành quá trình
“cởi áo” virus trong endosome hoặc lysosome
Sau khi được giải phóng khỏi capsid, RNA hệ gen của virus được dịch mã,sản suất các protein của virus; tiếp theo đó, các phức hợp sao chép của virus đượctập hợp; RNA virus được nhân lên và hệ gen RNA mới sau tổng hợp sẽ được bao
gói tạo thành các thế hệ virus con cháu (Barton, Flanegan, 1995; Molla et al.,
1991)
Trước tiên, RNA ngay lập tức khởi động quá trình dịch mã ở vị trí gần đầu5’ để tạo thành một polyprotein – tiền thân của các protein chức năng của virus.Polyprotein này ban đầu được phân cắt thành 3 protein tiền chất là P1, P2 và P3.Tiếp theo đó, mỗi protein lại tiếp tục tiến hành phân cắt để tạo ra các sản phẩmprotein đặc hiệu có chức năng
-P1 được cắt ra tạo thành VP0, VP1 và VP3 Đó là các protein capsid
- P2 được cắt ra tạo thành 2A, P2B – là các kháng nguyên của vật chủ và 2C tham gia vào quá trình tổng hợp RNA
- P3 tiến hành tự cắt thành 3A, 3B (VPg), 3C (một protease dùng để phâncắt hầu hết các protein) và 3D (RNA polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi RNAmới tổng hợp trên khuôn RNA)
Trang 25Để lắp ráp, trước hết virus phân cắt P1 tạo thành một đơn phân gốc(protome) 5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3 Các protome này sẽ liên kếtvới genome RNA để tạo thành tiền virion (provirion) Trong quá trình hoàn thiện,phần lớn hoặc tất cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt tạo thành VP2 và VP4 Saulắp ráp, virion trưởng thành thoát ra khỏi tế bào nhờ sự tan bào (cell lysis) Một sốpicornavirus, ví dụ virus viêm gan A (Hepatitis A Virus, HAV) có thể gây nhiễmnhưng không gây ra sự tan bào.
Đồng thời với quá trình dịch mã để tổng hợp các protein, RNA của hệgen virus cũng được nhân lên để tạo thành vật liệu di truyền cho các hạt virus mới.Các virus thuộc nhóm picornavirus đều có chung một cơ chế sao chép, tuy nhiên,chỉ có Poliovirus – một virus gây bệnh bại liệt trên người, là được nghiên cứu kỹnhất cho đến nay
Hệ gen RNA của picornavirus là các RNA thông tin, chúng có chức năngnhư là các khuôn mẫu cho quá trình sao chép RNA của virus Các RNA sợi dương– hệ gen của picornavirus nhân lên thông qua các RNA sợi âm trung gian đượctổng hợp ngay bên trong các phức hợp sao chép gắn trên màng lipid trong bàotương của các tế bào nhân thật của vật chủ Điều đặc biệt là trong quá trình nhânlên của các picornavirus, có sự bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm trung gian
và RNA sợi dương – hệ gen của virus được tổng hợp trong các phức hợp sao chépcủa virus Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy, có rất nhiều yếu tố liên quanđến quá trình sao chép RNA, trong đó, đặc biệt đã phát hiện các phân đoạn RNAhoạt hóa có cấu trúc không gian dạng cis, gọi tắt là cis-RNA hoạt hóa (CREs – cisactive RNA elements), nằm trong hệ gen của các picornavirus Sự góp mặt của cáctiểu phần cis-RNA hoạt hóa tham gia vào sự ổn định của các RNA thông tin cũngnhư quá trình dịch mã RNA thông tin của virus Các trình tự cis-RNA (CREs) nàytương tác mạnh mẽ với các protein sao chép của virus, gián tiếp tác động lên sựsao chép RNA của virus (Steil, Barton, 2009) Có 4 loại CREs, mà một trong số đó
có vai trò trong việc chuyển hoá VPg thành VPgpUpUOH (dạng uridyl hoá của
VPg) (Richards et al., 2006) Hai loại protein này có vai trò vô cùng quan trọng,
làm mồi cho quá trình sao chép RNA Trong đó, VPg khởi động cho quá trình tổnghợp RNA sợi âm, và VPgpUpUOH khởi động cho quá trình tổng hợp RNA sợidương Sự tổng hợp bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm và RNA sợi dươngtrong quá trình nhân lên của virus, là do sự quyết định về số lượng bản sao RNAcủa các mồi VPg và VPgUpUOH
Trang 26Mỗi RNA sợi dương của virus đều được sao chép thành một RNA sợi âm bổ sung
và sau đó RNA sợi âm được sao chép thành 40 đến 70 phân tử RNA sợi dương thế
hệ con cháu Một phân tử VPg có một liên kết đồng hóa trị gắn với đầu tận 5’ của
mỗi phân tử RNA cả sợi dương và sợi âm (Pettersson et al., 1978) Bên cạnh đó,
có hàng trăm phân tử VPgpUpUOH được tích hợp với mỗi phân tử RNA sợi âm
trung gian (Lyons et al., 2001) Do đó, mỗi phức hợp sao chép RNA của màng tế
bào có sự tích lũy nhiều bản sao tiền VPg trước khi bắt đầu quá trình sao chép(Novak, Kirkegaard, 1991)
Cuối cùng, các RNA sợi dương – hệ gen virus được kết hợp với các protein
và bao gói thành các hạt virus mới, phá vỡ tế bào (tan bào), thoát ra ngoài tiếp tụcxâm nhiễm trên các tế bào thích ứng của vật chủ, khởi động một chu trình mới,giúp cho virus tồn tại và gây ra bệnh lí trên vật chủ của chúng
2.2.4 Đặc tính nuôi cấy
Virus viêm gan vịt là loại kí sinh nội bào tuyệt đối (Nguyễn Đường, 1990)
Để gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do bệnh viêmgan vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lí bằng kháng sinh Có thể cấy chuyển virusviêm gan vịt trên động vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào
2.2.4.1 Nuôi cấy trên phôi trứng
Virus viêm gan vịt có thể phát triển được trên cả phôi gà và phôi vịt Để gâybệnh, người ta dùng huyễn dịch các cơ quan của vịt con đã chết do bệnh viêm ganvịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lý bằng kháng sinh rồi gây bệnh chủ yếu vàomàng nhung niệu Tiêm bệnh phẩm vào màng nhung niệu, vào túi noãn hoàngcũng có hiệu quả như tiêm vào niệu nang (Reuss U, 1959)
- Trên phôi vịt:
Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi,
24 - 72 giờ sau khi gây nhiễm phôi chết với bệnh tích: phôi còi cọc, xuất huyếtdưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phôi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơivàng, có thể có điểm hoại tử Ở những phôi chết muộn nước xoang niệu mô có màxanh nhạt, bệnh tích rõ hơn Ở phôi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước
ối có màu xanh và gan bị xanh - đen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà(Nguyễn Đức Lưu và cs, 2001)
Trang 272.2.4.2 Nuôi cấy trên môi trường tổ chức tế bào
Năm 1963, Fitzgerald đã sử dụng tế bào thận của phôi vịt để nuôi cấy virus
và ông đã chứng minh rằng virus có thể phát triển và gây huỷ hoại tế bào sau 8 lầncấy truyền Các tác giả cho rằng virus viêm gan vịt phát triển theo mô hình đườngcong trên môi trường tế bào thận phôi vịt Với virus cấy truyền lần thứ 25 trên tếbào thận phôi vịt không còn khả năng gây huỷ hoại tế bào trên tế bào thận phôi gà.Năm 1968, Maiboroda và Kontrimacachus đã nuôi cấy và quan sát được sự pháhủy tế bào thận ở phôi ngỗng Năm 1972, Maiboroda và cộng sự đã theo dõi sựphát triển của virus viêm gan vịt trên tế bào thận phôi vịt một lớp với kỹ thuậtkháng thể huỳnh quang thấy virus gây biến đổi bệnh tích tế bào, hàm lượng viruscao nhất sau 2 ngày (Maiboroda, 1972) Kurilenco và Strelnikov cũng đưa ra kếtquả tương tự ở tế bào thận lợn con (Woolcock and Fabricant, 1997)
2.2.4.3 Nuôi cấy trên động vật cảm thụ
Virus viêm gan vịt chỉ có thể phát triển tốt trên vịt con dưới 7 ngày tuổi.Sau 2 - 4 ngày nung bệnh, vịt có biểu hiện đặc trưng: con vật mệt mỏi nghiêmtrọng, nằm một chỗ, đầu ngoẹo ra đằng sau hay về một bên, co giật toàn thân rồichết Khi mổ khám quan sát bệnh tích đặc trưng ở gan thấy: gan sưng nhũn, dễ bịnát khi ấn nhẹ, trên mặt gan có những điểm xuất huyết, đôi khi có những điểm hoại
tử màu trắng xen kẽ
Quan sát những biến đổi vi thể trên gan thấy tổ chức gan bị viêm tụ máu,tăng sinh ống mật, các mạch máu bị sưng, các tế bào gan bị tích mỡ Một số
Trang 28trường hợp trong nguyên sinh tế bào gan xuất hiện những thể bao hàm Ngoài ralách có thể hơi sưng.
2.2.4.4 Đặc tính kháng nguyên
Theo Asplin (1965), tính kháng nguyên của virus luôn thay đổi Virus viêmgan vịt không làm ngưng kết hồng cầu gà, vịt, thỏ, cừu nên đã cho phép phân biệtvới virus Newcastle Huyết thanh của vịt nhiễm virus khỏi bệnh có khả năng trunghòa virus viêm gan vịt
2.2.5 Đáp ứng miễn dịch
Quá trình đáp ứng miễn dịch là kết quả của sự hợp tác giữa đại thực bào vớicác loại quần thể lympho bào Khi một tác nhân xâm nhập vào cơ thể, tự cơ thể sẽbảo vệ mình bằng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như: Da, niêm mạc, dịch tiếtcủa các tuyến, đặc biệt là vai trò của tế bào làm nhiệm vụ thực bào Sau đó cơ thểbảo vệ mình bằng cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với sự hoạt động của các cơquan tế bào có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể đặc hiệu để loại trừ khángnguyên
Trong bệnh viêm gan vịt, miễn dịch thụ động của vịt con được nhận từ mẹ
đã được nghiên cứu rất nhiều Việc tiêm nhắc lại vắc xin cho vịt mẹ sẽ tạo đượckháng thể thụ động tốt cho vịt con Theo khuyến cáo của OIE (2014), nên tiêm vắcxin nhược độc viêm gan vịt type I cho vịt mẹ trước khi đẻ 12, 8 và 4 tuần để tạomiễn dịch thụ động cho vịt con trong suốt chu kỳ đẻ trứng
2.2.5.2 Miễn dịch chủ động
Là loại miễn dịch thu được khi con vật bị mắc bệnh nhưng có đủ sức chốnglại bệnh và khỏi bệnh hoặc là miễn dịch mà vịt có được sau khi tiêm vắc xin.Những vịt sống sót sau khi mắc bệnh đều có miễn dịch chắc chắn với virus củatype gây bệnh
Tạo miễn dịch chủ động cho đàn vịt bằng cách sử dụng các loại vắc xinnhược độc và vắc xin vô hoạt Vắc xin sau khi vào cơ thể sẽ đi đến các cơ quan
Trang 29miễn dịch như hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc và kích thích cơ thể sinh
ra kháng thể đặc hiệu
Theo Gough et al 1981, việc sử dụng vắc xin viêm gan vịt nhược độc tiêm
cho vịt lúc 2 - 3 ngày tuổi và tiêm nhắc lại bằng vắc xin vô hoạt vào thời điểm 22tuần tuổi sẽ tạo được lượng lớn kháng thể trung hoà Trong huyết thanh của vịtkhỏi bệnh có kháng thể trung hoà
Việc kiểm tra đáp ứng miễn dịch được thực hiện bằng nhiều phương pháp:
-Phản ứng trung hoà kiểm tra hàm lượng kháng thể sau khi tiêm vắc xin
- Phản ứng huyết thanh học (sử dụng ELISA) để xác định hiệu giá kháng thể
-Thử thách cường độc (Theo TCVN 8685-2:2011), xác định khả năng bảo
hộ của vắc xin viêm gan vịt đối với vịt được tiêm phòng
2.2.6 Sinh học phân tử virus viêm gan vịt type I (DHV-1)
Trình tự hệ gen của virus viêm gan vịt type I đã được xác định với sự cấu tạo đặc trưng của một Picornavirus, gồm có những vùng sau:
- Vùng không dịch mã ở đầu 5’ (5’UTR - 5’ Untranslational Region): Làmột vùng gen độ dài khoảng 625 nucleotide, không mã hoá nhưng có vai trò quantrọng trong quá trình sao mã, tăng cường độc lực và tạo khung vỏ capsid DHV-1cũng bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà thay vào đó là một protein nhỏ gọi là VPg(viral protein genome-linked) Ở đầu 5’ của hệ gen DHV-1 có bộ mã khởi đầu đểbắt đầu cho quá trình dịch mã, bộ mã này được đặt ở vị trí nucleotid thứ 627 của
hệ gen Mặt khác, đầu 5’ hệ gen ARN của DHV-1 chứa vùng gen làm vị trí choribosome đi vào gọi là IRES (Internal Ribosome Entry Site) (Racaniello, 2001),được đặt ở trong miền Kozak tối ưu (GxxAUGG), tại vị trí nucleotide thứ 626 vàđược bao bọc trong một cấu trúc bậc hai (Ding và Zhang, 2007) IRES được phânthành 4 loại dựa trên cấu trúc sơ cấp và cấu trúc thứ cấp Có một yếu tố hoạt độngduy trì ở dạng cis nằm ngay cạnh yếu tố IRES là motif Yn-Xm-AUG Trong đó,
Yn là một vùng giàu pyrimidine, Xm là một đoạn dài 15-25 nucleotide, theo sau là
mã khởi đầu AUG Trình tự motif Yn-Xm-AUG ở DHV-1 là AUG-CA-AUG(Tseng và cs, 2007) Tại vùng 5’UTR hệ gen có cấu trúc bậc hai tạo ra cấu trúcvòm khép kín (stem-loop) Những Picornavirus type I không có cấu trúc hình “lásồi” ở đầu 5’UTR, do vậy, đầu
Trang 305’UTR của DHV-1 có thể sở hữu một IRES loại II và cũng duy trì một bản sao thứhai của cấu trúc tetranucleotid GNRA (RNRA2) (Tseng và Tsai, 2007a; Tseng và
cs, 2007)
- Vùng không dịch mã ở đầu cuối 3’ (3’UTR - 3’ Untranslational Region):Vùng này có độ dài khoảng 315 nucleotide, lớn hơn vùng 3’UTR khác của nhữngPicornavirus có nguồn gốc động vật Mặt khác, đầu cuối 3’UTR ở DHV-1 có thểtạo ra năm cấu trúc ARN bậc hai, còn đầu cuối 3’UTR của DPV (DuckPicornavirus) chỉ có thể tạo thành 4 cấu trúc ARN bậc hai Vùng 3’UTR có vai tròtrong quá trình nhân lên của những Picornavirus (Rohll và cs, 1995)
- Protein L (Leader Protein): Trong họ Picornaviridae, protein L xuất hiệntrong 5 chi virus là Teschovirus, Aphthovirus, Erbovirus, Cadiovirus và Kobuvirus.Trong DPV, protein L có chiều dài khoảng 451 axit amin, lớn nhất trong họPicornaviridae Một số có kích thước khoảng 67 axit amin (ởEncephalomyocarditis virus) đến 219 axit amin (ở Equine Rhinitis B virus) và sởhữu một motif GxCG có chức năng như enzym protease – trypsin (Tseng và Tsai,2007b)
- Protein 2A: Protein này có 3 phân đoạn protein là protein 2A1, 2A2 vàprotein 2A3 Đây là một trong những đặc điểm đặc trưng của DHV-1 (Tseng vàTsai, 2007a)
- Protein cấu trúc của DHV-1: Có 3 vùng protein cấu trúc gồm protein VP0,VP3 và protein VP1 Trong đó, vùng VP1 có tính ổn định cao và có tính sinh miễndịch, nằm trên bề mặt ngoài cùng của tất cả các Picornavirus, chứa đựng hầu hếtnhững motif mà có chức năng tương tác với thụ thể của tế bào và kháng thể trunghòa đơn dòng Trình tự protein VP1 này là khác nhau trong giữa các chi virus(Tseng và Tsai, 2007b)
Ở virus viêm gan vịt, motif GxCG được định vị tại axit amin thứ 142-145(GSCG) của protein 3C, còn bộ ba xúc tác thì được đặt tại vị trí H38-D69-C144trong enzym 3Cpro Một số motif được bảo tồn đặt trong protein 3Cpol làKDELR, PSG, YGDD và FLKR (Krumbholz và cs, 2002) Motif YGDD được đặt
ở vị trí axit amin thứ 281-320 trong protein 3Cpro, còn motif KDELR ở vị trí axitamin 150 - 154 và motif FLKR đặt ở vị trí axit amin thứ 365-368 Trong motifPSG, Prolin được thay thế bởi Cystein tại axit amin thứ 280-282
Trang 31VP0 VP3 VP1 2A1 2A2 2A3 2B 2C 3A 3B 3C 3D
VPg
Dịch mã Protein chung
3 – VP
1 – – 2B – 2C – 3A – 3B – 3C – 3D
– CO OH
(1A) (1B) (1C) (1D)
Hình 2.3.
Mô tả hệ gen và phân bố các tổ hợp gen mã hoá protein cấu trúc
và không
Trang 32cấu trúc trong chuỗi polypeptide của virus viêm gan
vịt
- Protein không cấu trúc: Một số protein khôngcấu trúc như protein 2C, 3C và 3D, chứa đựng nhữngmotif đặc trưng khác hẳn với những motif trong cácprotein đã biết ở Picornavirus khác, gồm có motifGxxGxGK (S/T) - kéo dài từ axit amin thứ 145 đến
152 và motif DDLxQ - từ axit amin thứ 192 đến 196trong protein 2C, những motif này có chức năng nhưenzym helicase Motif GxxGxGK(S/T) cũng xuất hiệntrong protein 2A2 (GksGsGKS; axit amin thứ 6-13).Trong motif DDLxQ ở protein 2C, Leucin được thaythế bởi Phenyalanin
Trong hệ gen DHV-1, vùng gen được quan tâmnghiên cứu nhiều nhất là vùng gen mã hoá cho proteinVP1 hay còn gọi là protein 1D, dài khoảng 714nucleotide Vùng VP1 gây ảnh hưởng đáng kể đến sựbiến đổi về gen; về đặc điểm hình thái và thích hợp choquá trình phân tích sự phát sinh loài của virus (Liu và
cs, 2008; Wang và cs, 2008) Vùng gen mã hoá proteinVP1 được chứng minh là vùng gen kháng nguyên,quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực củavirus viêm gan vịt Những đột biến trong vùng genVP1 dễ dẫn đến thay đổi thành phần axit amin và đặctính gây bệnh của virus, từ đó có thể hình thành ra biếnchủng mới Với sự trợ giúp của phương pháp sinh họcphân tử, vùng gen mã hoá cho VP1 được chọn làmđích để phân tích, so sánh, chẩn đoán các chủng viruscường độc viêm gan vịt, để giúp tìm ra những vùnghay thay đổi và những
18
Trang 33vùng không thay đổi, tìm hiểu những vùng gen tạo ra các axit amin có vai trò miễndịch và độc lực, và là đích để khảo sát đặc tính sinh học phân tử của một giống vắcxin hay cường độc gây bệnh Vùng gen VP1 có thể được coi là chỉ thị phân tử cógiá trị trong việc đánh giá chủng giống (Kim và cs, 2007; Liu và cs, 2008) Trên cơ
sở các dữ liệu cùng với các phương pháp hiện đại, có thể thay đổi vùng gen khôngmong muốn của virus, để tạo ra loại vắc xin thế hệ mới tốt nhất, tạo điều kiện chocông tác phòng bệnh đạt được kết quả cao
Hiện nay, đã có tài liệu công bố về sinh học phân tử gen và hệ gen của virusgây bệnh viêm gan vịt ở Việt Nam Những nghiên cứu mới nhất của Viện Côngnghệ sinh học là cơ sở thu nhận những dữ liệu gen/hệ gen của virus viêm gan vịttại nước ta, trước hết là gen kháng nguyên VP1
- Đánh giá đặc tính của một giống virus, trước hết phải xem xét tính thíchứng trên môi trường nuôi cấy, cụ thể trên động vật cảm thụ, trên phôi gia cầm vàtrên môi trường tế bào tổ chức Không phải giống virus nào cũng thích ứng trên tất
cả 3 loại môi trường đó, do vậy, tuỳ mỗi một loại giống mà bố trí môi trường thíchhợp để nuôi cấy và khảo sát đặc tính sinh học Đặc tính sinh học trên môi trườngnuôi cấy biểu hiện ở khả năng gây bệnh, mức độ gây nhiễm, triệu chứng lầm sàng,bệnh tích đặc trưng, hàm lượng virus, khả năng gây bệnh (độc lực), tính ổn địnhkháng nguyên, độc lực, miễn dịch Tất cả các biểu hiện này (phenotype) đều do hệgen quyết định hay nói cách khác, đó chính là biểu hiện genotype của giống
Việc xác định đặc tính giống thông qua khảo sát phenotype và genotype (hệgen) giúp chúng ta hiểu biết sâu sắc về giống vi sinh vật Trước đây, khi phươngpháp sinh học phân tử chưa phát triển, xác định đặc tính giống hầu hết dựa vàobiểu hiện của mối tương quan giữa virus và đối tượng cảm nhiễm Ngày nay, khicông nghệ gen đã được ứng dụng rộng rãi, phương tiện và dụng cụ thực hiện dễdàng, thì việc khảo sát hệ gen bên trong cho phép chúng ta xác định được đặc tínhphân tử của giống ngay cả khi chưa cần thực nghiệm
Trong thời gian qua, việc thu thập các chủng viêm gan vịt để nghiên cứu vàxây dựng ngân hàng gen đã được nhiều đơn vị nghiên cứu trong nước quan tâm.Các chủng của Việt Nam và thế giới được so sánh thành phần gen và mối quan hệnguồn gốc phả hệ, đây là nên tảng cho việc thiết lập tạo nguồn gen chuẩn quốc gia(Bảng 2.1)
Trang 34Bảng 2.1 Các chủng viêm gan vịt của Việt Nam và thế giới cung cấp chỉ thị gen để phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ
ST
Tên chủng T
Trang 352.2.7 Sức đề kháng của virus viêm gan vịt
Virus có sức đề kháng cao với các yếu tố vật lý, hóa học Virus có thể tồntại trong thức ăn, chất độn chuồng, nước uống 15-40 ngày Ở 370C, chúng vẫnsống sót sau 21 ngày, ở 600C tồn tại được 30 phút Virus thích nghi với nhiệt độthấp: Ở 40C virus tồn tại được 2 năm, ở âm 140C virus có thể sống được 4 năm,
âm 200C có thể tồn tại được 9 năm
Các chất sát trùng dễ dàng tiêu diệt virus nhanh chóng: NaOH 5% giết chếtvirus trong vòng 6 giờ, focmol 1% diệt virus ít nhất trong vòng 3 giờ (NguyễnVĩnh Phước, 1978)
Virus viêm gan vịt tương đối ổn định ở nhiệt độ dưới 40 - 450C nhưng bị vôhoạt một cách nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn Các dung dịch muối NaCl,
Na2SO4, MgCl2, MgSO4 có thể bảo quản virus chống lại sự tác động của nhiệt độ
ở 500C Virus cũng có thể sống ở pH từ 3 - 9 trong vòng 48 giờ
2.2.8 Chẩn đoán
Chẩn đoán bệnh viêm gan do virus ở vịt con có một số khó khăn vì bệnhxuất hiện đột ngột và chấm dứt nhanh nên bệnh thường bị giải thích sai lầm là dothức ăn và do chuồng trại vệ sinh kém Trong bệnh viêm gan vịt thường quan sát
có vi trùng gây bệnh phó thương hàn và trực khuẩn E.coli và người ta cho nó lànguyên nhân gây chết khi chẩn đoán bệnh viêm gan vịt do virus cần chú ý đếnnhững điểm sau:
+ Bệnh xuất hiện đột ngột và diễn ra cấp tính
+ Chỉ gây tổn thương cho vịt con trước 2 tháng tuổi
+ Gan có nhiều điểm xuất huyết
2.2.8.1 Chẩn đoán phân biệt
Để chẩn đoán phân biệt với các bệnh khác cần dựa vào các đặc điểm: dịch tễ,triệu chứng, bệnh tích và kiểm tra virus
Bệnh phó thương hàn vịt (Patatyphus aratum): có thể chữa khỏi bằng khánghuyết thanh hoặc kháng sinh Trái lại bệnh viêm gan vịt do virus thì không có kếtquả
Bệnh dịch tả vịt: hiện tượng xuất huyết không chỉ thấy ở gan mà còn ở các tổchức khác: da, bao tim màng ngực, niêm mạc dạ dày, ruột… bệnh còn xảy ra ở mọilứa tuổi
Trang 36Bệnh ngộ độc Aflatoxin: có triệu chứng gần giống với bệnh viêm gan vịtnhưng kiểm tra tổ chức học thấy tế bào gan bị phá huỷ rất nghiêm trọng.
2.2.8.2 Chẩn đoán virus học
Đây là phương pháp hữu hiệu nhất, lấy bệnh phẩm là gan, lách, não nghiềnthành huyễn dịch 10 - 20% rồi tiêm cho phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi, phôi gà 8 - 10ngày tuổi hoặc có thể dùng huyễn dịch tiêm cho vịt 1 - 7 ngày tuổi, mỗi bệnh phẩmtiêm từ 6 - 10 vịt, mỗi con 0,2 ml, tiêm dưới da hoặc nhỏ mũi
Sau thời gian nung bệnh ngắn vịt sẽ phát bệnh với triệu chứng, bệnh tíchgiống như bệnh trong tự nhiên Mổ khám vịt sẽ thấy có điểm xuất huyết đặc trưng
ở gan
2.2.8.3 Chẩn đoán huyết thanh học
Trong chẩn đoán huyết thanh học có nhiều phương pháp: phương pháp làmphản ứng trung hoà, phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng kết tủa khuyếch tán trongthạch Nhưng trong chẩn đoán bệnh viêm gan vịt người ta thường sử dụng phảnứng trung hoà Nguyên tắc của phản ứng trung hoà dựa trên nguyên tắc chung của
sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, phản ứng trung hoà có thểthực hiện trên phôi gà hoặc phôi vịt hay trên vịt con
Lấy huyết thanh nghi bệnh từ máu của vịt con đã bị bệnh điển hình hoặc
ở những vịt con sống sót sau khi đàn vịt khỏi bệnh 2 tuần Phản ứng thực hiệntrên phôi vịt hoặc phôi gà với chủng virus đã được làm thích nghi trong phòng thínghiệm Tuy nhiên, nếu phản ứng làm trên phôi vịt, thì việc xác định liều ELD50
thường dễ dàng hơn so với phôi gà, nhưng phôi gà có ưu điểm là đảm bảo chắcchắn không có mặt của virus cũng như kháng thể của bệnh tự nhiên
2.2.9 Vắc xin và chế phẩm sinh học phòng bệnh
2.2.9.1 Vắc xin phòng bệnh
Nguyên lý của việc tiêm phòng bằng vacxin là gây ra trong cơ thể sống m tộđáp ứng chủ động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tếbào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gâybệnh và nhờ đó làm mất khả năng này Biện pháp tiêm phòng bằng vắc xin đãmang lại cho y học, thú y học những thành tựu lớn trong phòng bệnh do virus và vikhuẩn gây ra
Trang 37Gần đây, do sự hiểu biết về lý thuyết miễn dịch, sự không ngừng cải tiếntrong kỹ thuật chẩn đoán, sự phát triển liên tục của những sản phẩm mới vàphương thức sử dụng vacxin mới đã làm cho việc phòng bệnh bằng vắc xin đượcgiải quyết một cách hoàn thiện.
Vắc xin phòng bệnh viêm gan vịt có 2 loại: vắc xin nhược độc và vắc xin vôhoạt
- Vắc xin nhược độc: Virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh
học: tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virusgiảm đi Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gâybệnh nên được dùng để làm vắc xin Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng virusviêm gan vịt cường độc sau khi đã cấy truyền qua phôi gà không còn khả năng gâybệnh cho vịt con nhưng virus vẫn nhân lên trong tế bào các mô, so với chủng virusviêm gan vịt cường độc thì mức độ nhân lên của virus này là thấp hơn (Hwang,1965)
Bằng phương pháp giảm độc trên phôi đã tạo ra nhiều chủng virus viêm ganvịt nhược độc Hiện nay, vắc xin viêm gan vịt nhược độc dùng chủ yếu ở Châu Âu
là loại đã được giảm độc sau 53 - 55 lần tiếp truyền qua phôi gà 8 -10 ngày tuổi; ở
Mỹ là loại giảm độc sau 84 - 89 lần cấy truyền Vắc xin được bảo quản ở nhiệt độ
âm 700C trong vài năm
- Vắc xin vô hoạt: Ngoài vắc xin nhược độc còn có vắc xin vô hoạt Vắc xin
viêm gan vịt vô hoạt được sản xuất từ virus viêm gan vịt bằng cách nuôi cấy virustrên phôi gà, thu hoạch dịch phôi, vô hoạt virus bằng BEI (Binary Ethylenimine),dùng bổ trợ dạng nhũ dầu (ES - STA (Lipid Emulsion System - Salmonellatyphimurium) và có lympho B phân bào (Woolcok, 1991) Bảo quản
ở 40C trong thời gian 20 tháng vẫn giữ được hiệu lực của vắc xin
Nghiên cứu hiệu lực của vắc xin viêm gan vịt vô hoạt, các tác giả đều chobiết vắc xin có khả năng tạo miễn dịch cao cho đàn vịt (Gough, 1981) Sử dụng 3lần vắc xin vô hoạt nhũ dầu cho đàn vịt giống sẽ tạo được miễn dịch thụ động chođàn vịt con Hiện nay, trên thế giới mới có vắc xin viêm gan vịt nhược độc và vôhoạt serotype 1
Trên thị trường Việt Nam đang sử dụng rộng rãi nhiều loại vắc xin nhược độcviêm gan vịt do các công ty Vetvaco, Navetco, Marphavet và RTD sản xuất đangdần dần thay thế vắc xin ngoại trong việc phòng chống bệnh
Trang 38Qua khảo sát sinh học phân tử hệ gen bước đầu cho thấy, chủng virus được
sử dụng làm vắc xin có nguồn gốc từ Hàn Quốc, Ai Cập, Mỹ, Trung Quốc
Ngoài ra, một chủng virus vắc xin nhược độc khác của Học viện Nông nghiệp ViệtNam cũng đã được nghiên cứu đầy đủ về đặc tính sinh học (Nguyễn Phục Hưng,2004; Nguyễn Bá Hiên, 2007), Quy trình sản xuất (Bùi Thanh Khiết, 2007;Nguyễn Bá Hiên, 2007), đặc tính phân tử và đã bước đầu được ứng dụng vào thực
tế Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy các loại vắc xin sử dụng tạiViệt Nam đều thuộc genotype 1
2.2.9.2 Chế phẩm sinh học phòng bệnh
Kháng thể phòng chống virus viêm gan vịt chiết xuất từ lòng đỏ trứng gà vớicông nghệ tinh chế cao, hiệu lực mạnh, phổ kháng virus rộng và thời gian bảo vệkéo dài
Sử dụng công nghệ tinh chế tiên tiến, loại bỏ phần lớn Lecithin, chất béo,protein thô, những chất này chiếm thể tích lớn mà không có tác dụng điều trị, cóthể gây stress và các phản ứng dị ứng Protein kháng thể chiết xuất hoàn toàn làmcho kháng thể được hấp thu nhanh chóng sau khi tiêm, nhanh chóng phát huy tácdụng Nếu sử dụng ngay từ giai đoạn đầu và giữa của bệnh, sản phẩm có thể pháthuy tác dụng ngay lập tức và chỉ cần dùng một lần Sản phẩm không chỉ dùng chocác chủng thông thường mà còn được dùng cho các chủng vịt nhiễm virus nặng ởcác khu vực dịch nặng
Khoảng thời gian bảo vệ kéo dài, kháng thể tồn tại được 14 ngày trong máusau khi tiêm và thời gian kháng virus hiệu quả cao hơn 10 ngày, vì vậy 1 lần tiêm
có thể bảo vệ vịt khỏi bệnh trong 14 ngày, tỷ lệ phòng bệnh hiệu quả là 100% và tỷ
lệ chữa khỏi bệnh hơn 95%
Sản phẩm an toàn, không độc, không tồn dư, không gây ô nhiễm và khôngảnh hưởng đến chất lượng thịt
Trang 39PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.1.1 Đối tượng nghiên cứu
- Giống virus Viêm gan vịt cường độc
3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu
- Vắc xin viêm gan vịt
- Trứng vịt có tinh
- Trứng gà Leghorn có phôi đã ấp được 9 ngày
- Vịt xiêm 1 - 3 ngày tuổi đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy tế bào Eagle MEM
- Trypsin, Phenol red, NaHCO3, Na2HPO4,
Các chất dùng để tách ARN của virus:
- Nito lỏng
- Trizol (Life Technologies): 1ml
- Men sao chép ngược: Reverse Transcriptase
- SDS 0,5%
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp
- Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp
- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA hãng Fermentas cung cấp
Trang 40- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Fermentas cung cấp.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR/RT-PCR do hãng QIAGEN và BIOONER cung cấp
- Bộ kit dùng để tách DNA từ thạch agarose ”MinElute Gel Extraction Kit”
do hãng QIAGEN cung cấp
- Bộ kit tách dòng “TA-cloning kit” do hãng Invitrogen cung cấp
- Kháng sinh kanamycin, ampicilin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối
- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãngQIAGEN cung cấp
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
- Các dung dịch sử dụng trong tách dòng
- Các dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose
Các chất tham gia phản ứng PCR có trong bộ Kit của Hãng Qiagen:
và các phần mềm sinh - tin học