Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và biến đổi bệnh lý của gà mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tại vùng phụ cận hà nội

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Võ Văn Hiểu Tên Luận văn: ” Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và biến đổi bệnh lý của gà mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tại vùng phụ cận Hà Nội”.. Tê

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các số liệu thu thập và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ c\ho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Văn Hiểu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình vàquan tâm của PGS.TS Nguyễn Bá Hiên Đồng thời tôi cũng nhận được những đónggóp vô cùng quý báu của các thầy, cô giáo trong Bộ môn Vi Sinh Vật – Truyền nhiễm,

Bộ môn Bệnh lý thú y, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, KhoaThú Y, Ban Đào tạo Đại học, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Tôi xin được bày tỏ

sự biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến những sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo của công ty DABACO và công tyRTD đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn ở bên độngviên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để giúp đỡ tôi hoàn thành quá trình học tập vànghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Văn Hiểu

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract ix

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học 2

1.4 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà 3

2.1.1 Đặc điểm địa dư bệnh 3

2.1.2 Đặc điểm dịch tễ học 4

2.1.3 Phương pháp phòng và điều trị bệnh 9

2.2 Virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà (IBV) 11

2.2.1 Đặc điểm căn bệnh 11

2.3 Một số phương pháp chẩn đoán gà nhiễm IBV 21

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán dựa vào đặc điểm lâm sàng 21

2.3.2 Chẩn đoán virus học 21

2.3.3 Phản ứng huyết thanh học 21

2.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng để chẩn đoán IBV 22

Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 27

3.1 Nội dung nghiên cứu 27

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

3.3 Nguyên liệu 27

3.4 Phương pháp nghiên cứu 28

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 28

3.4.2 Phương pháp mổ khám gà chết 28

3.4.3 Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR 30

3.4.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 32

3.4.5 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 33

3.4.6 Phương pháp xác định tỷ lệ mắc Viêm phế quản truyền nhiễm thông qua triệu chứng lâm sàng, dịch tễ và mổ khám bệnh tích 33

3.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 34

Phần 4 Kết quả và thảo luận 35

4.1 Một số đặc điểm dịch tễ học gà mắc bệnh IB tại vùng phụ cận Hà Nội 35

4.1.1 Tình hình gà mắc bệnh IB theo phương thức chăn nuôi 35

4.1.2 Tình hình gà mắc bệnh IB theo lứa tuổi trên địa bàn nghiên cứu 36

4.1.3 Tình hình gà mắc bệnh IB theo mùa trên địa bàn nghiên cứu 39

4.2 Một số biến đổi bệnh lý của gà mắc IB 41

4.2.1 Một số triệu chứng lâm sàng điển hình của gà mắc bệnh IB 41

4.2.2 Một số biến đổi bệnh lý đại thể của gà mặc bệnh IB 43

4.2.3 Một số biến đổi bệnh lý vi thể của gà mặc bệnh IB 47

Phần 5 Kết luận và đề nghị 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 52

Tài liệu tham khảo 54

DANH MỤC VIẾT TẮT

ARN Acid Ribo Nucleic

IB Infectious bronchitis

IBV Infectious bronchitis virus

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

HI Hemagglutinin inhibition

CPE Cytopathic effect

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent AssayVNT Viral neutralization test

SPF Specific pathogen free

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Sự lưu hành của các chủng huyết thanh khác nhau trên thế giới của IBV 12

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 31

Bảng 3.3 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt trong phản ứng RT-PCR 31

Bảng 4.1 Tỷ lệ mắc bệnh IB ở gà chăn nuôi theo phương thức công nghiệp ở một số trại của công ty DABACO tại Bắc Ninh 35

Bảng 4.2 Tỷ lệ mắc bệnh IB ở gà chăn nuôi theo phương thức thả đồi ở một xã tại huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang 36

Bảng 4.3 Tỷ lệ gà mắc bệnh IB theo lứa tuổi nuôi tại một số trại công nghiệp của công ty DABACO Bắc Ninh 37

Bảng 4.4 Tỷ lệ gà mắc bệnh IB theo lứa tuổi nuôi thả đồi tại Yên Thế, Bắc Giang 37

Bảng 4.5 Tỷ lệ gà mắc bệnh IB theo mùa với phương thức chăn nuôi công nghiệp tại công ty DABACO 39

Bảng 4.6 Tỷ lệ gà mắc bệnh IB theo mùa với phương thức chăn nuôi thả đồi tại Yên Thế, Bắc Giang 39

Bảng 4.7 Một số triệu chứng lâm sàng đặc trưng của gà mắc bệnh IB 41

Bảng 4.8 Một số bệnh lý đại thể đặc trưng của gà mắc bệnh IB 43

Bảng 4.9 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chấn đoán gà mắc bệnh IB tại 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc bộ gen của IBV 14

Hình 2.2 Mô hình cấu trúc protein của IBV 15

Hình 2.3 Sự nhân lên của IBV trong tế bào vật chủ 19

Hình 4.1 Tỉ lệ gà nghi mắc bệnh IB theo lứa tuổi 38

Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ gà nghi mắc bệnh IB theo mùa 40

Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện triệu chứng lâm sàng đặc trưng của gà mắc bệnh IB 42

Hình 4.4 Đầu phù thũng 42

Hình 4.5 Viêm kết mạc mắt 42

Hình 4.6 Gà bị báng bụng, có dáng đứng của chim cánh cụt 43

Hình 4.7 Gà tiêu chảy phân loãng và nhiều nước 43

Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện một số bệnh lý đại thể đặc trưng của gà mắc bệnh IB 45

Hình 4.9 Khí quản xuất huyết 46

Hình 4.10 Xoang mũi chưa nhiều dịch 46

Hình 4.11 Buồng trứng biến dạng 46

Hình 4.12 Báng nước xoang bụng 46

Hình 4.13 Thận sưng, chứa Urate 47

Hình 4.14 Vỏ trứng nhạt màu, hình dạng trứng giống trái xoài 47

Hình 4.15 Phổi xuất huyết, hồng cầu tràn ngập trong các phế nang (10X) 47

Hình 4.16 Thấm nước phù ở hạ niêm mạc khí quản (10X) 47

Hình 4.17 Xuất huyết kẽ thận (14X) 48

Hình 4.18 Tế bào ống thận thoái hóa không bào (40X) 48

Hình 4.19 Kết quả xác định IBV bằng xét nghiệm RT-PCR 50

Hình 4.20 Kết quả phản ứng RT-PCR xác định sự có mặt của IBV trong mẫu bệnh phẩm bằng cặp mồi đặc hiệu (P: đối chứng dương IBV; M: thang DNA chuẩn 1kb (Fermentas)) 51

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Võ Văn Hiểu

Tên Luận văn: ” Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và biến đổi bệnh lý của gà mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tại vùng phụ cận Hà Nội”.

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt

Nam Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu được đặc điểm dịch tễ học và bệnh lý học của gà mắc bệnh IBcùng với việc ứng dụng phản ứng RT-PCR trong chẩn đoán cung cấp thông tin và làm

cơ sở cho việc chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh do IBV gây ra trên thực địa từ đó

đề xuất được các biện pháp phòng bệnh có hiệu quả

Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng lấy mẫu là gà ISA Brown nuôi hướng trứng nghi mắc IB ở mọi lứatuổi chăn nuôi theo hướng tập trung trên địa bàn tỉnh Bắc Ninh của công ty DABACO

và nuôi thả đồi ở Yên Thế, Bắc Giang Mẫu bệnh phẩm gà nghi mắc IB được lấy dựatrên TCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT Mổ khám gà theo TCVN…

Trizol (Roche diagnostics GmbH, Mannheim, Đức) đã được dụng để tách chiết RNA tổng số trong mẫu bệnh phẩm theo quy trình của nhà sản xuất cDNA được phiên

mã ngược sử dụng bộ Kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific) cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR sử dụng kit GoTaq® Green Master Mix (Promega, Mỹ) Kit này chứa DNA Taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA Mồi (primer) được sử dụng trong

nghiên cứu này là các cặp mồi đã được công bố trước đây (Feng et al, 2012).

Sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả, dịch tễ học thống kê, điều tra hồicứu:lập biểu đồ thống kê, điều tra theo phương pháp điều tra ngẫu nhiên

Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mềmMinitab 14.0 Phép thử Khi bình phương được sử dụng để so sánh sự sai khác giữa các

tỷ lệ phần trăm Giá trị P < 0,05 đã được sử dụng để chỉ các số liệu sai khác có ý nghĩa

về mặt thống kê

Kết quả chính và kết luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong ở gà đẻ do bệnh IB theo phương thức chăn nuôi công nghiệp cao hơn so với chăn nuôi thả đồi Trong đó: tỷ lệ gà mắc IB theo phương thức chăn nuôi công nghiệp và thả đồi tương ứng là 15,46% và

10,40%; tỷ lệ tử vong do bệnh IB là 14,72% và 9,71% tương ứng với phương thứcchăn nuôi công nghiệp và chăn nuôi thả đồi.

Gà đẻ mắc bệnh IB tỷ lệ cao nhất vào các tháng 10-12 và 1-3 trong năm Hầuhết các lứa tuổi của gà đẻ đều mắc bệnh IB nhưng gà từ 19-23 tuần tuổi có tỷ lệ mắc

và tỷ lệ chết cao nhất

Tỷ lệ mẫu dương tính với cặp mồi đặc hiệu của IBV được xác định bằng phảnứng RT-PCR trung bình là 41,30% (60/145 mẫu)

Một số đặc điểm triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh IB gồm gồm: sốt, ủ rũ và

ăn kém; hô hấp khó khăn; sưng đầu; viêm kết mạc; báng nước xoang bụng và tiêuchảy phân nhiều nước

Một số đặc điểm bệnh lý đại thể và vi thể quan sát được của gà mắc bệnh IBgồm phổ biến là thận sưng, tiếp đến là các bệnh tích ghi nhận trên đường hô hấp nhưxuất huyết khí quản, phổi tụ huyết hoặc xuất huyết và viêm túi khí và viêm xoang mũi.Phổi xuất huyết, hồng cầu tràn ngập trong các phế nang, thấm nước phù ở hạ niêmmạc khí quản, xuất huyết kẽ thận và tế bào ống thận thoái hóa không bào là các bệnhtích vi thể phổ biến quan sát được ở gà mắc bệnh IB

THESIS ABSTRACT

Author: Vo Van Hieu

Thesis title: "Studying some epidemiological aspects of infectious bronchitis and pathological changes of diseased chickens raised in neighbour provinces of Hanoi”.

Major: Veterinary medicine Code: 60 64 01 01

Name of institution: Vietnam National University of

Agriculture Objectives

This study has multipurposes of investigating epidemiological indexes ofInfectious bronchitis (IB), some main pathological changes of diseased chickens.Additionally, this study also aimed at application of RT-PCR in order to rapid andaccurate diagnose of IB in chickens

Methods

In this study, the epidemiology of IB was investigated on hens of ISA Brown

breed, which raised at either (i) intensive chicken farms of Bac Ninh province or (ii)

back yard chicken farms of Bac Giang province Samples were collected according tostandard protocol (TCVN 01 - 83: 2011/BNNPTNT)

Total RNA was extracted by Trizol reagent (Roche diagnostics GmbH,Mannheim, Germany) Step of cDNA synthesis was done RevertAid First StrandcDNA Synthesis kit (Thermo Scientific) PCR detection of IBV was done by GoTaq®Green Master Mix (Promega, USA), which used specific primers developed in theprevious study (Feng et al , 2012)

Several methods such as descriptive- and statistical- epidemiology wereapplied to design experiment and to collect data Raw data was analysed by biologicalstatistic method which is implemented in Minitab 14.0 Differences were consider to

be significant at p < 0.05

Results and conclusion

The studying result showed that the morbility of IBV infected hens were higher

in the intensifying farms (15.46%) than in the back yard farms (10.40%) Similarly,the mortarlity of hens which kept under intensive conditions (14.72%) were higherthan that of hens which kept under free- range conditions (9.71%)

By RT-PCR method, the infections were determined in 60/145 tested samples(41.30%) Chickens of all ages were infected by IBV, however the highest infected

rate was observed at 19-23 weeks of age The highest percentage of diseased henswere observed on two different periods: from October to December and from January

to March

Several clinical changes of diseased chickens were: fever, listless, lossappatite; difficult breathing; swollen head; 'penguin-like' posture and watery diarrhea.Main pathological changes of IBV infected chickens (from the most frequent to less)were: swollen kidneys, haemorrhagic of trachea, congested lungs, airsaculitis,sinusitis Microscopic lesions in IB were diffuse alveolar haemorrhage, massinfiltration of lymphocytes in the trachea, haemorrhage of tubules in the kidney, etcwere among the most frequent lesions observed by light microscope

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) đang là mộttrong những vấn đề rất được quan tâm do thiệt hại kinh tế lớn trong chăn nuôi gàcông nghiệp Đây là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tốc độ lây lan cao, tỷ lệ mắc cao

thức ăn, tăng chi phí thú y, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng (Gorgyo et al.,

1984) Một số nghiên cứu khác báo cáo các trường hợp gà mắc bệnh có biểu hiện

triệu chứng về hô hấp và thận (Shahata, 1988; Shihata et al., 2003) Gà con cũng

có thể cảm nhiễm với virus gây phá hủy ống dẫn trứng và dẫn tới hậu quả khôngphục hồi tới giai đoạn gà đẻ Virus phá hủy ống dẫn trứng của gà đẻ, hậu quả làmgiảm sản lượng trứng và chất lượng của trứng IBV gây bệnh có có rất nhiềuserotype, biến đổi liên tục và một số serotype không tạo miễn dịch chéo với nhau

gây khó khăn cho công tác chẩn đoán cũng như kiểm soát bệnh (Roussan et al.,

2008)

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về IB, IBV và ảnh hưởng của bệnh này tới gà

đẻ còn rất hạn chế Nguyễn Phước Ninh và cs (2008) báo cáo rằng, gà đẻ mắc IBkhông những làm giảm sản lượng trứng mà còn tạo điều kiện cho các bệnh khácphát triển Tỷ lệ đẻ có thể giảm tới 50% và sau đó khả năng phục hồi không hoàntoàn, chỉ đạt 70-80% so với ban đầu Vì vậy cần tìm hiểu về các dấu hiệu sớm củabệnh cũng như chẩn đoán phát hiện nhanh giúp ngăn ngừa dịch bệnh và giảm thiệthại cho người chăn nuôi, đồng thời nghiên cứu được thực hiện sẽ góp phần xâydựng quy trình chẩn đoán nhanh bệnh để có biện pháp can thiệp kịp thời trong đàn.Các kết quả đạt được sẽ góp phần tìm hiểu sâu hơn về IBV, cho phép các nghiêncứu tiếp sau phân lập các chủng IBV gây bệnh trên đàn gà Kỹ thuật RT-PCR chophép chẩn đoán nhanh, chính xác các gà mắc bệnh gây ra do IBV, đồng thời gópphần xây dựng chiến lược kiểm soát dịch bệnh trên đàn gà ở Việt

Nam hiện nay Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và biến đổi bệnh lý của gà mắc bệnh viêm phế quản truyền nhiễm tại vùng phụ cận Hà Nội”.

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Nghiên cứu được đặc điểm dịch tễ học và bệnh lý học của gà mắc bệnh IBcùng với việc ứng dụng phản ứng RT-PCR trong chẩn đoán cung cấp thông tin vàlàm cơ sở cho việc chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh do IBV gây ra trên thực địa

từ đó đề xuất được các biện pháp phòng bệnh có hiệu quả

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) là một bệnh

truyền nhiễm cấp tính gây ra bởi một Coronavirus Bệnh dễ lây lan qua đường tiếp

xúc với những triệu chứng đặc trưng ở đường hô hấp như là ho, hắt hơi và có tiếngran khí quản Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế bởi nó làm giảm tăng trọng, giảmhiệu quả của thức ăn, gây viêm túi khí, đồng thời còn làm giảm sản lượng trứng vàchất lượng trứng Bệnh lây lan nhanh trong tự nhiên, diễn biến phức tạp với nhiềuserotyp của virus IB (Infectious Bronchitis Virus - IBV), khiến cho công tác phòngchống bệnh gặp nhiều khó khăn Tuy nhiên, bệnh này không gây ảnh hưởng đáng

kể đến sức khỏe cộng đồng

Mặc dù tỷ lệ chết cũng gây thiệt hại kinh tế đáng kể trong chăn nuôi gàcông nghiệp nhưng thiệt hại của bệnh do giảm hiệu quả trong sản xuất thườngđược chú ý hơn là sự thiệt hại do gà chết Gà broiler khi bị bệnh thường chết tậptrung vào 2 tuần cuối của đời gà, tức là khoảng tuần tuổi thứ 5 - 6 Gà chết thường

là do tác động của vi khuẩn kế phát tấn công vào hệ hô hấp đã bị tổn thương bởivirus Một số chủng IBV gây tổn thương thận với tỷ lệ chết trên 30% ở gia cầmnon (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2013)

Virus gây bệnh cũng có thể nhân lên trong ống dẫn trứng ở gia cầm trưởngthành, làm giảm 10 - 50% sản lượng trứng, đồng thời làm tăng tỷ lệ trứng dị hìnhhoặc ảnh hưởng đến màu sắc của vỏ trứng Sản lượng trứng thường không trở lạiđược như mức bình thường Khi gà bị nhiễm virus, đôi khi cũng dẫn đến hậu quảống dẫn trứng không phát triển hoàn thiện

2.1.1 Đặc điểm địa dư bệnh

IB được Schalk và Hawn báo cáo lần đầu tiên ở Bắc Dakota, Mỹ năm 1930(Schalk and Hawn, 1931) Bệnh ảnh hưởng tới gà con 2-3 tuần tuổi và gây ra cácbệnh lý đường hô hấp với tỷ lệ chết khá cao Những nghiên cứu sau này bổ sungrằng bệnh còn phổ biến ở gà đẻ với các triệu chứng báng bụng nước, teo buồngtrứng và ống dẫn trứng, mất khả năng đẻ trứng của đàn gà cùng với các triệuchứng đường hô hấp Beaudette and Hudson (1936) đã phân lập, nuôi cấy và làmthay đổi độc lực của virus bằng cách tiếp truyền nhiều đời qua phôi trứng

Tới năm 1950, phương pháp chẩn đoán bệnh gây ra do IBV đầu tiên được xác lậpdựa trên phản ứng trung hòa virus trên phôi gà là cơ sở cho phương pháp sàng lọc

dương tính huyết thanh học đầu tiên đối với bệnh gây ra do IBV (Van Roeckel et al, 1950) Năm 1956, theo báo cáo của Jungherr và cộng sự thì hai chủng virus

Connecticut được phân lập vào năm 1951 và chủng Massachusentts được phân lậpnăm 1941 gây bệnh tương tự nhau nhưng không gây miễn dịch chéo hoặc không

có khả năng bảo hộ chéo cho nhau

IB phân bố ở nhiều quốc gia trên thế giới Ở Mỹ, ngoài type Massachusetts(Mass) lần đầu tiên được phân lập vào những năm 1950, một số serotyp cũng đượcphát hiện Những năm 1940, typ Mass cũng được phân lập ở châu Âu Một sốserotype khác được phân lập ở Bắc Mỹ, châu Phi, châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ,Nhật, Hàn Quốc), Úc và châu Âu Bệnh thường xuyên xảy ra ở những đàn gà mặc

dù đã sử dụng vacxin phòng bệnh Virus phân lập từ những vụ dịch đó thườngkhác với typ virus vacxin

Ở Việt Nam, IB còn rất ít được quan tâm nghiên cứu Trần Thanh Vân(1996) khi nghiên cứu đàn gà bố mẹ giống thịt Hubbard High - Yield tại trại Ando

và Bắc Sơn đã cho thấy sự hiện diện của hai biến chủng IBV 4/91 và CR

88 Cả hai biến chủng này của IBV đều gây ra hậu quả làm gà giảm đẻ và ảnhhưởng tới chất lượng trứng gà Năm 1999, tác giả Bùi Trần Anh Đào đã khảo sát

sự cảm nhiễm virus gây bệnh Newcastle, Gumboro và IB trên đàn gà thịt tại khuvực thành phố Hồ Chí Minh và đã đưa ra được chương trình tiêm vacxin phòng babệnh trên Gà đẻ trứng mắc IBV biểu hiện giảm sản lượng trứng cũng như chấtlượng trứng sẽ giảm Tỷ lệ đẻ giảm có thể lên tới 50% và sau đó khả năng phục hồikhông hoàn toàn chỉ đạt 70 - 80% so với ban đầu (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2008).Việt Nam cũng được ghi nhận sự có mặt của IBV serotype 793B dòng 4/91 vàserotype Mass dòng H120 trên gà thịt tỉnh Lâm Đồng qua phương pháp tiêmxoang niệu mô (Võ Thị Trà An, 2012)

2.1.2 Đặc điểm dịch tễ học

2.1.2.1 Loài vật mắc bệnh

Gà được coi là vật chủ tự nhiên duy nhất của bệnh, tuy nhiên tính mẫn cảm đối với bệnh thay đổi phụ thuộc vào giống hoặc nòi gà

Coronavirus được phân lập từ chim trĩ mắc bệnh đường hô hấp và/hoặc bệnh

ở thận, có kết quả giải trình tự gen rất tương đồng với IBV Ở chim cút, có

hiện tượng khí quản khò khè nhưng không phân lập được virus, cũng như khôngxác định được nguy cơ phơi nhiễm với virus.

Gây bệnh thực nghiệm IBV cho gà tây bằng cách phun sương không biểuhiện triệu chứng lâm sàng, nhưng nếu đưa qua đường tĩnh mạch có thể có triệuchứng sau khi gây nhiễm 48 giờ Tương tự như vậy, những gà gây bệnh bằng

chủng Coronavirus phân lập từ gà tây thì thấy có sự nhân lên của virus trong nhu

mô ruột nhưng không có triệu chứng lâm sàng

Con vật mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, nhưng gà con mẫn cảm nhất và có tỷ lệchết cao Khi tuổi càng tăng, gà trở nên đề kháng tốt hơn với những biến đổi bệnh

lý ở thận, ống dẫn trứng và tỷ lệ chết giảm

2.1.2.2 Phương thức truyền lây

IBV lây truyền nhanh chóng giữa các cá thể gà trong đàn Các loài chim mẫncảm khi nuôi cùng chuồng với gà bệnh thường triệu chứng xuất hiện trong vòng 48giờ Bệnh lây chủ yếu qua đường hô hấp

Virus phân lập từ khí quản, phổi, thận và túi Fabricius của gà sau 24 giờ vàđến 7 ngày sau khi gây nhiễm, nhưng có thể phân lập IBV từ hạch manh tràng vàphân sau khi gây nhiễm 14 tuần và 20 tuần Tần xuất phân lập được virus giảm dầntheo thời gian và thay đổi tùy thuộc vào chủng virus nhiễm phải Có thể phân lậpđược virus từ các mẫu thu thập được từ khí quản hoặc dịch ngoáy trực tràng ở gà

19 tuần tuổi

Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, một số chủng virus vacxin có thể tồntại trong các cơ quan của gà trên 163 ngày hoặc dài hơn Trong suốt giai đoạn này,virus có thể định kỳ bài thải ra ngoài môi trường qua dịch mũi và phân, khiến chobệnh lây từ đàn này sang đàn khác thông qua người chăn nuôi và dụng cụ chănnuôi

Mặc dù có nhiều báo cáo cho biết đã phân lập được virus từ trứng gà sau khikhỏi bệnh trên 43 ngày nhưng lại không phân lập được IBV từ những con gà nở rakhi đem ấp

2.1.2.3 Cơ chế sinh bệnh

Cơ chế sinh bệnh của IBV tới nay được cho là tùy thuộc vào chủng virus.Virus được cho là xâm nhập đầu tiên vào tế bào biểu mô của gà gồm đường hôhấp, thận, ống tiêu hóa và cơ quan sinh dục (Cavanagh, 2003) Dù xâm nhập vào

cơ thể bằng đường nào, virus cũng đến ký sinh và sinh sản trong các tế bào biểu

mô hô hấp, ở đây virus đã làm các tế bào này bị thoái hóa và chết Virus phá hoạithành huyết quản làm tăng tiết dịch thẩm xuất và thâm nhiễm các tế bào lymphovào các xoang hô hấp Khi triệu chứng bệnh thể hiện rõ, bằng phương pháp khángthể huỳng quang có thể thấy virus gây bệnh trong nguyên sinh chất và nhân tế bàothượng bì niêm mạc mũi, phế quản, phế nang, túi hơi và cả trong phủ tạng như gan

và lách Kết quả của những biến đổi sâu sắc của mô bào sẽ làm con vật chết trongthể cấp tính Virus gây phá hủy ống dẫn trứng của gà đẻ, hậu quả làm giảm sảnlượng trứng và chất lượng của trứng Gà có biểu hiện phá hủy ở thận khi nhiễmnhững chủng IBV gây ra bệnh lý thận Virus xâm nhập vào các mảng biểu mô củaống thận và nhân lên Các chủng virus này thường gặp ở gà hướng thịt giai đoạngần xuất truồng và có thể gây ra tỷ lệ chết khá cao cũng như làm cho gà giảm tăng

trọng (Ambali and Jones, 1987; Casais et al., 2003) Các IBV chủng Connecticut

có khả năng nhân lên trong giới hạn cơ quan hô hấp Hiệu giá virus cao nhất đượcxác định trong ba ngày đầu sau khi nhiễm sau đó giảm dần vào các ngày kế tiếp.Virus gây viêm phổi khí quản, gây viêm đục và làm thành túi khí dày lên(Cavanagh, 2003)

Khi thể bệnh kéo dài, ngoài tế bào niêm mạc hô hấp, virus còn tác động vào

tế bào cơ quan sinh dục làm biến đổi tổ chức của khí quan này Vì vậy, sau khi đãkhỏi bệnh, con vât vẫn còn mang một số di chứng

2.1.2.4 Triệu chứng lâm sàng

Những dấu hiệu đặc trưng ở đường hô hấp của gà bị nhiễm IBV là ho, thởkhò khè, tiếng ran khí quản và chảy nước mũi Có thể quan sát thấy mắt ướt và đặcbiệt gà con có thể bị sưng phồng các xoang Gà con ủ rũ, yếu ớt, đứng co cụm lạixung quanh nguồn nhiệt, gà kém ăn, giảm trọng lượng Ở những gà trên 6 tuần tuổi

và những gà lớn có những dấu hiệu giống như gà con nhưng ít quan sát thấy dấuhiệu chảy nước mũi Ở những đàn gà lớn nhiều khi không quan sát thấy những dấuhiệu của bệnh IB, trừ khi chúng ta quan sát thật cẩn thận bằng cách cầm từng con

gà và nghe chúng vào ban đêm khi cả đàn gà ở trạng thái yên tĩnh Một vài chủngcường độc tự nhiên được phát hiện ở Mỹ và ở Anh vào đầu những năm 1990 gâybệnh một cách khác thường và tạo ra phù đầu nghiêm trọng, có những túi khí nhỏ

và tỷ lệ chết thay đổi ở gà mái tơ và gà mái trưởng thành

Gà con mắc bệnh IB có triệu chứng hô hấp rất đặc trưng như thở khó, thởkhò khè ngắt quãng, ho, hắt hơi, chảy nước mũi, chảy nước mắt, xoang bị sưng

to, viêm hầu - họng làm cho con vật khó thở Gà mệt mỏi, thường nằm tụm lạidưới nguồn nhiệt Gà giảm ăn và tăng trọng giảm rõ rệt Giai đoạn sau, viêm lansâu vào phần dưới đường hô hấp, dịch thẩm xuất tích tụ nhiều ở niêm mạc khí -phế quản làm cho con vật càng khó thở Bệnh kéo dài đến 2 tuần, con vật chết dongạt thở.

Gà trên 6 tuần tuồi và chim trưởng thành cũng có các triệu chứng tương tựnhư trên, nhưng hiện tượng chảy nước mũi không phải là triệu chứng thường gặp.Một số chủng phân lập được từ gà mắc IB tại Mỹ và Anh những năm 1990 chothấy chúng có tính gây bệnh khác thường, gây hiện tượng sưng mặt, viêm túi khí,

tỷ lệ chết khác nhau ở gà hậu bị và gà trưởng thành

Với gà thịt thương phẩm, khi mắc phải một trong những chủng virus gâybệnh ở thận, có thể qua khỏi giai đoạn bệnh ở đường hô hấp, nhưng sau đó trở nênyếu ớt, mệt mỏi, lông xù, phân ướt, uống nước nhiều Nếu đàn gà đẻ bị lắng đọngurat ở thận sẽ khiến cho tỷ lệ chết tăng mặc dù bề ngoài gà vẫn biểu hiện khỏemạnh

Ở những đàn gà đẻ, ngoài những dấu hiệu đường hô hấp, chúng còn bịgiảm nghiêm trọng số lượng và chất lượng trứng Những đàn gà giống và nhữngđàn gà đẻ có dấu hiệu giảm nhẹ sản lượng trứng hoặc trứng bị biến dạng khi chưa

có dấu hiệu về đường hô hấp vẫn phân lập được IBV từ những mẫu bệnh phẩm lấy

từ dịch ngoáy mũi và hạch màng treo ruột Sự giảm mạnh mẽ sản lượng trứng cóthể khác nhau trong mỗi giai đoạn đẻ và tuỳ theo từng chủng virus Sau 6 - 8 tuầnnhiễm bệnh, sản lượng trứng có thể hồi phục lại mức sản xuất như trước khi nhiễmbệnh, nhưng hầu hết các trường hợp đều không đạt được như vậy Ngoài ra, trứng

đẻ ra không đạt tiêu chuẩn để ấp, trứng bị mỏng vỏ, biến dạng, vỏ trứng xù xì.Ngoài việc giảm số lượng, chất lượng trứng cũng bị giảm mạnh ở những đàn gà bịnhiễm bệnh Lòng trắng trứng có thể mỏng và loãng như nước không có sự xácđịnh ranh giới giữa bề dầy và mỏng của lòng trắng trứng như trứng của những đàn

gà sạch bình thường

Nếu gây nhiễm IBV cho gà 1 ngày tuổi, virus sẽ tấn công và phá huỷ đườngsinh dục của gà Hậu quả sẽ gây nên hiện tượng gà đẻ giả Tất cả gà ở trong đànđều bị nhiễm bệnh, nhưng tỷ lệ chết có khác nhau giữa các đàn phụ thuộc vào độclực của serotype gây nhiễm, lứa tuổi, tình trạng miễn dịch và các yếu tố stress nhưlạnh hoặc kế phát vi khuẩn Một số chủng virus gây bệnh đường hô hấp và thậnnhư chủng Delaware 72 và chủng Australian T gây tỷ lệ

chết tương đối cao Ngoài ra những nhân tố như giống, giới tính, dinh dưỡng tạo ra

sự khốc liệt của các ca bệnh về thận Tỷ lệ chết có thể tới 25% hoặc cao hơn ởnhững gà dưới 6 tuần tuổi và chết không đáng kể ở những gà lớn hơn lứa tuổi đó

Tỷ lệ chết trong trường hợp sỏi đường tiết niệu từ 0,1 – 1% trong vòng một tuần

Tại Trung Quốc, trong chăn nuôi gà thịt thương phẩm có thể bị mắc IB “thể

dạ dày tuyến” (proventricular - typ) với triệu chứng đặc trưng là gà ủ rũ, mắt sưng

to, chảy nước mắt, tiêu chảy kèm với triệu chứng đường hô hấp, tỷ lệ mắc 100%,

tỷ lệ chết là 15 - 80% Virus phân lập được từ các ổ dịch được gọi tên là QX IBV

Bệnh do Coronavirus gây ra ở chim trĩ có triệu chứng hô hấp kèm theo

bệnh ở thận Ở chim trĩ đẻ, bệnh sẽ làm cho tỷ lệ ấp nở thấp, trứng có kích thướcnhỏ, chuyển màu từ nâu xanh olive đậm sang màu vàng nhạt hoặc màu nâu xanh lácây) Đã có thông báo về một ổ dịch cho thấy chim chết rất nhanh, tỷ lệ chết 15%với triệu chứng hắt hơi, sổ mũi Sản lượng trứng cũng như tỷ lệ ấp nở giảm nhưngchất lượng trứng lại không bị ảnh hưởng Chim trĩ con bị bệnh tuy không có triệuchứng hô hấp nhưng đến 10 tuần tuổi, tỷ lệ chết lên đến 45% Chim bị bệnh lưng

bị cong, cánh sã

2.1.2.5 Đặc điểm bệnh tích của gà mắc bệnh IB

Bệnh tích đại thể: Gà bị nhiễm bệnh thường bị viêm, tích nước hoặc tiết

dịch thẩm xuất trong khí quản, chảy qua mũi và viêm rò Các túi khí chứa đầy dịchthẩm xuất đục hoặc màu vàng Dịch thẩm xuất có thể tìm thấy ở vùng thấp của khíquản hoặc phế quản của gà chết Những vùng viêm phổi nhỏ có thể quan sát được

ở xung quanh những phế quản lớn Dịch noãn hoàng được tìm thấy trong xoangbụng của gà trong giai đoạn đẻ trứng, nhưng trường hợp này cũng thấy ở nhữngbệnh khác mà gây giảm sản lượng trứng Chiều dài và trọng lượng của ống dẫntrứng giảm một cách rõ rệt và kéo dài đến 21 ngày mới trở lại bình thường và thờigian trở lại bình thường nhanh hơn bằng cách tác động làm giảm các tác nhânstress như chế độ ăn uống Ở gà 2 tuần tuổi bị phá hủy ống dẫn trứng do nhiễmIBV, hậu quả là đến giai đoạn đẻ sẽ không đẻ được hoặc gây giảm sản lượng trứng

(Broadffoot et al., 1956; Sevoian and Levine, 1957) IBV cũng có khả năng mẫn

cảm ở gà Lowghor trắng một ngày tuổi với biểu hiện bệnh tích một phần ba ốngdẫn trứng phía dưới chứa đầy phân, làm cho phần ruột già tích thức ăn và cuộn lạigây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến gà Gà mắc IBV

chủng T có biểu hiện thận căng phồng và nhạt màu Bên trong thận, các ống nhỏ

và niệu quản căng phồng và chứa đầy urat - dạng tinh thể axit uric (Cumming,1963; Crinion, 1971; Julian and Willis, 1969)

Bệnh tích vi thể: Màng nhầy khí quản của gà bị nhiễm IBV thường bị phù.

Bề mặt bị mất lông mao, những tế bào biểu mô co tròn đóng vẩy và thâm nhiễmmột lượng không đáng kể các tế bào lymphô và tế bào dị hình sau 18 giờ nhiễmbệnh Sự tái tạo lại biểu mô bắt đầu sau 48 giờ nhiễm bệnh 7 ngày sau khi nhiễmbệnh, có sự tăng sinh các tế bào lympho và các tế bào mầm Các xoang khí bị phù,các tế bào biểu mô bong ra và chứa đầy dịch tiết có lẫn tơ huyết trong vòng 24 giờnhiễm bệnh Gia tăng các tế bào dị hình sau khi xuất hiện các u lympho, tăng sinhnguyên bào sợi và tái tạo lại những tế bào biểu mô Bệnh tích vi thể ở thận đối với

gà khi bị nhiễm IB chủ yếu là viêm thận kẽ Virus gây ra thoái hóa hạt, hình thànhcác hốc nhỏ và bong tróc những tế bào biểu mô hình ống và thẩm xuất số lượnglớn các tế bào dị hình trong kẽ thận trong những ca bệnh cấp tính Bệnh tích ởnhững ống thận dễ nhận thấy ở vùng tủy Các vùng hoại tử ở trung tâm có thể nhìn

rõ cho thấy sự cố gắng tái sinh của các tế bào biểu mô hình ống Trong quá trìnhhồi phục, quần thể các tế bào viêm thay đổi như lymphocyte, plasma Trong mộtvài trường hợp, sự thoái hóa làm teo một vùng hay toàn bộ thận Trong trường hợpviêm thận, các niệu quản kết hợp với sự teo thận làm căng phồng các ống chứa đầycác urate và thường dẫn đến các viên sỏi thận lớn có thành phần chính là các kếttinh của axit uric Bằng thực nghiệm, gây bệnh cho gà mái hậu bị cho thấy cáctriệu chứng và bệnh tích như giảm trọng lượng, mất lông rung khí quản từ những

tế bào biểu mô, giãn nở các tuyến hình ống, thấm xuất tế bào đơn nhân, tế bàolympho, tế bào plasma, tế bào dị hình, phù (Riddell, 1987; Siller, 1981)

2.1.3 Phương pháp phòng và điều trị bệnh

2.1.3.1 Vệ sinh phòng bệnh

Việc tạo ra đàn gà sạch bệnh bằng các phương pháp quản lý khoa học đối với

gà từ lúc 1 ngày tuổi cùng với công tác vệ sinh, sát trùng chuồng nuôi có thể giúphạn chế bệnh Với tình hình chăn nuôi hiện nay, trong một trại hoặc trong mộtchuồng cùng một lúc nuôi gà nhiều lứa tuổi, mật độ chuồng nuôi cao khiến chocông tác phòng chống bệnh gặp nhiều khó khăn Vì vậy, biện pháp quan trọng là

sử dụng vacxin phòng bệnh

2.1.3.2 Phòng bệnh bằng vacxin

Hiện nay, vacxin phòng bệnh IB phổ biến là hai loại vacxin nhược độc vàvacxin vô hoạt

Vacxin nhược độc được sử dụng phòng bệnh cho gà broiler từ lúc 1 ngày tuổi

và dùng cho lần đầu tiên để phòng IB đối với đàn gà giống và gà đẻ Vacxin có thểnhỏ mắt, nhỏ mũi hoặc nhỏ vào khí quản Với số lượng gà lớn, có thể sử dụngphương pháp phun sương hoặc cho uống

Vacxin vô hoạt có bổ trợ dầu sử dụng phòng bệnh cho gà đẻ Vacxin được sửdụng để tiêm cho những đàn gà đã được miễn dịch cơ sở với vacxin nhược độc,tiêm trước khi đẻ vài tuần và có thể sử dụng kết hợp với một số loại vacxin vô hoạtkhác

IBV serotyp Massachusetts được sử dụng phổ biến để sản xuất vacxin Vìvậy, nếu serotyp này được phân lập từ gà có biểu hiện triệu chứng hô hấp thì có thể

là virus vacxin, cần tiếp tục xác định serotyp khác có thể là căn nguyên gây bệnh.Chủng virus vacxin này cũng có thể cường độc trở lại và gây ra những phản ứng

do sử dụng vacxin

Trên thị trường Việt Nam có một số loại vacxin phòng bệnh IB như sau:Nobilis MA 5, Nobilis IB+G+ND, Nobilis IB+ND, Nobilis MA5+Clone 30,Nobilis IB+ND+EDS, Nobilis IB H 120, Nobilis IB 4/91, Nobilis RT+IBmulti+G+ND, Nobilis IB D 1466, Bio-Sola Bron MM (Intervet); BursalDisease Newcastle Brochitis Reovirus vaccine (Lohmann Animal Health Int);Cevac ND - IB K, Cevac ND IB EDS K, Cevac ND IB IBD EDS K, Cevac ND-IB-IBD (Cevasante Animale); NBLH-VAC, NBBH-VAC, IB-VAC (Choong AngVaccine Laboratory); Medivac ND-IB, Medivac IB H-120, Medivac IB H-52,Medivac ND-EDS-IB Emulsion, Medivac ND-IB-IBD Emulsion (P.T Medion);Newcastle Lasota+Bron Mass, Newcastle B1+Bron Conn, Bursal Disease-Newcastle Disease-Bronchitis Vaccine (Provac-3), Bursal Disease-NewcastleDisease-Bronchitis-Reovirus vaccine (Provac-4), Poulvac EDS New BronzVaccine (Fort Dodge Animal Health); Gumpeskal+IB+EDS, Pestikal+EDS+IB,Gumpeskal+IB, Bronhikal® SPF (Pfizer); Polybron-B1, Polybron-N63, Bipestos(Shering-Plough Animal Health Corporation); Aviffa RTI, Gallimune 302ND+IB+EDS, Bioral H120, Gallimune 407 ND+ IB+ EDS+ ART (Merial)

2.1.3.3 Điều trị gà mắc IB

Vì là bệnh do virus nên không có thuốc điều trị đặc hiệu Áp dụng một sốgiải pháp như sử dụng thiết bị sưởi để hạn chế nhiễm lạnh cho đàn gà, giảm mật độchuồng nuôi, đảm bảo khẩu phần ăn sẽ giúp hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra Sửdụng một số loại kháng sinh nhằm chống nhiễm trùng kế phát, đồng thời cho gàuống đủ nước pha chất điện giải

2.2 VIRUS GÂY BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ (IBV)

Virus Infectious bronchitis (IBV) là là tác nhân gây bệnh viêm phế quảntruyền nhiễm và gây thiệt hại kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm côngnghiệp trên toàn thế thế giới Bệnh do virus IB được mô tả lần đầu tiên năm 1931

tại Mỹ Virus IB gây bệnh là do Coronavirrus (ARN virus) - đây là bệnh xảy ra

quanh năm và trên mọi lứa tuổi gà, với tỷ lệ mắc cao 50 – 100%, gây chết đến25% Bệnh đặc biệt nguy hiểm với gà con dưới một tháng tuổi và gây thiệt hạikinh tế nghiêm trọng cho gà nuôi lấy trứng giống và trứng thương phẩm

2.2.1 Đặc điểm căn bệnh

Virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis virus,

IBV) thuộc bộ Nidovirales, họ Coronaviridae, giống Gammacoronavirus (Gonzalez et al., 2003) Virus có cấu tạo sợi đơn dương ARN và có vỏ bọc với kích cỡ bộ genome dài khoảng 27,6 kb (Mo et al., 2012).

2.2.1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại IBV

IBV có hình dạng tương đối tròn, đường kính xấp xỉ 120 nm, có vỏ, trên bềmặt có những gai hình chuỳ (Spike) có chiều dài khoảng 20 nm Những gai này

không xếp khít nhau như những gai hình roi của Paramyxovirus Cấu trúc lõi

(ribonucleoprotein) được giải phóng ra từ những phân tử bị phá vỡ tự nhiên có thểquan sát bóng, nhưng được thông qua độ không bắt màu Trong hầu hết các trườnghợp, ribonucleoprotein được quan sát như một sợi tơ có đường kính khoảng 1 - 2

nm, nhưng khi ở dạng cấu trúc cuộn có thể quan sát được đường kính từ 10 - 15nm

Trước năm 1956, theo thông báo của các nhà khoa học cho rằng nguyênnhân gây nên bệnh IB là do chủng gây bệnh Massachusetts và chủng Baeudettekhông gây bệnh cho gà nhưng gây chết phôi Tuy nhiên, kể từ đó đến nay số lượngcác chủng được phân lập từ các ổ dịch gà ngày càng tăng và có tính kháng nguyênkhác hoàn toàn so với type Massachusetts ban đầu IBV có khả năng biến

đổi nhanh chóng, điều này dẫn đến virus IB ở trang trại có thể có những biến thểmới hoặc type huyết thanh mới Do sự phổ biến của các biến thể của bệnh viêmphế quản truyền nhiễm (IB) vì vậy việc đầu tiên cần phải xác định trước khi sửdụng một loại vacxin IB trong một thời gian dài Vì vậy sự cần thiết để có đượcnhững thông tin về những biến thể và những huyết thanh mới là rất quan trọng.Thế giới đã có không ít những biến chủng vủa IBv Dưới đây là những biến chủng

đã được công bố (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Sự lưu hành của các chủng huyết thanh khác nhau trên

thế giới của IBV Chủng huyết thanh

Phân loại các chủng IBV dựa vào phản ứng trung hoà virus, kháng thể trunghoà virus, các điểm quyết định kháng nguyên trung hoà đều nằm trên protein S.Tuy nhiên, trong những năm gần đây, người ta hay sử dụng các kháng thể đơndòng kháng protein S và phân tích trình tự gen để phân loại virus IB Đã có bằngchứng cho thấy có sự tái tổ hợp virus khi nhiễm nhiều chủng cùng một lúc

(Cavanagh et al., 1992).

Phân loại dựa vào sự phân tích kháng thể trong huyết thanh: Việc phân loại

các chủng IBV bằng phản ứng HI cũng đã được tiến hành Các kháng thể ngăn trởngưng kết hồng cầu sinh ra rất sớm, ngay từ lần gây nhiễm đầu tiên và có sự đặchiệu chủng rất cao Sự đặc hiệu của miễn dịch sớm và ít phản ứng chéo là cơ sởcho việc phân lập virus bằng phản ứng HI (King and Hopkins, 1984) Cook và cs(1987) đã so sánh phản ứng HI và phản ứng trung hòa trong môi trường nuôi cấy

tổ chức khí quản gà và đã đưa ra kết kuận rằng phản ứng HI được tiến hành chonhững chủng có đặc tính nhiễm chéo cao, dễ biến chủng và là phản ứng cho kếtquả rõ hơn so với phản ứng trung hòa virus

Phân loại các chủng IBV dựa vào phân tích kháng thể đơn dòng: Các kháng

thể đơn dòng đã được tạo ra kháng lại một số chủng có nguồn gốc Bắc Mỹ nhưMassachusetts, Connecticut 46, Arkansas 99, Iowa 97, Gray, một số chủng đượcphân lập ở Châu Âu như nhóm D274, nhóm D1466 và những chủng được phân lập

ở Úc Các kháng thể đơn dòng đặc hiệu chủng được sử dụng để nhận biết cácchủng mới phân lập Rất nhiều kháng thể đơn dòng kháng D274 có độ đặc hiệu vớinhững chủng có trình tự hệ gen S1 giống nhau và đã được sử dụng để xác định cácchủng IBV từ những ổ dịch ở Hà Lan Những chủng cường độc phân lập ở Úcđược xác định bằng kháng thể đơn dòng chính xác hơn so với việc xác định bằngphân tích kháng thể trong huyết thanh

Phân loại chủng IBV bằng việc phân tích trình tự axit nucleic: Hơn 20

chủng IBV đã xác định được trình tự hệ gen của protein S1 Bằng việc xác địnhtrình tự các axit amin của protein S1 cho thấy giữa các chủng có sự khác nhau từ

20 - 25% Dựa vào sự phân tích trình tự hệ gen protein S1 đã phân loại các chủngIBV được chính xác hơn Theo Hopkins (1974) đã phân loại chủng Arkansas 99 vàConnecticut 46 là cùng nhóm, nhưng khi xác định trình tự hệ gen protein S1,Johnson và Marquardt, 1975 đã xác định được chúng khác nhau tới 29% Hoặcbằng phản ứng VN cho thấy chủng Connecticut 46 và Massachusetts là nhữngchủng khác nhau, nhưng hệ gen S1 của chúng chỉ khác nhau có 7,6% về trình tựaxit amin và 4,6% trình tự Nucleotid

Do vậy, việc xác định trình tự các axit nucleic ngày càng hữu ích trong việcphân loại các chủng IBV trong tương lai.

2.2.1.2 Cấu trúc của IBV

Virion của IBV là một ARN sợi đơn, thẳng có 3 protein đặc hiệu chính gồmprotein gai (Spike - S), protein màng (Membrain - M) và protein nhân(Nucleocapsid - N) Ngoài ra, trong cấu tạo của virus còn có loại protein thứ tư(hay còn gọi là protein màng nhỏ - sM) được xác định là protein liên kết với lớp vỏ

virion (Pasternak et al., 2006) Các chủng IBV khác nhau về tỷ trọng (gradient)

đường Tỷ trọng đường của các chủng thường từ 1,15 - 1,18 g/ml Malcolm andHeather (1980) dựa vào đặc điểm trên mà chia virus thành hai loại gồm loại thứnhất là những virus có tỷ trọng đường cao ~ 1,18 g/ml, ở những loại này thường cócấu trúc polypeptid và có bộ gen hoàn chỉnh đồng thời có hình thái điển hình củacoronavirus Loại thứ hai là những virus có tỷ trọng đường thấp hơn 1,13 g/ml,

những loại virus này cũng có hình thái của Coronavirus nhưng không điển hình,

trong cấu trúc phân tử thiếu polypeptit ribonucleoprotein và hệ gen (van Roeckel

et al., 1942; Gonzalez et al., 2003; Mo et al., 2012) (Hình 2.1).

Hình 2.1 Cấu trúc bộ gen của IBV

Protein S: Protein có hai hoặc 3 bản sao, mỗi loại có 2 chuỗi

glycopolypeptid là S1 và S2 (xấp xỉ 520 - 625 axít amin) Hầu hết kháng thể trunghoà virus và kháng thể gây ngăn trở ngưng kết hồng cầu đều nằm trên protein S1.Protein S2 rất khó phát hiện và một vài protein N có thể bị mất hoặc bị thoái hoá(Hình 2.2)

Hình 2.2 Mô hình cấu trúc protein của IBV

(Hougeand Machamer, 2008) (S: spike; M: Membrane; E: Envelop; N:

Nucleoprotein; ssRNA: Single stranded RNA)Protein M được cấu tạo bởi 225 axít amin và chủ yếu nằm ẩn bên trongmàng virus hoặc mặt trong bề mặt màng, chỉ có khoảng 10% lộ ra bên ngoài màng.Protein màng có vai trò trong sắp xếp và kết dính hạt virus bằng các tương tác giữacác protein cấu trúc khác (Hogue and Machamer, 2008)

Protein N: Protein bao quanh vật liệu di truyền của virus được cấu tạo bởi

409 amino axit Protein có nhiều chức năng như hình thành lõi virus và dẫn truyền

và điều chỉnh tín hiệu ở tế bảo vật chủ mang virus (You et al., 2007).

Các chủng IBV khác nhau về tỷ trọng (gradient) đường Tỷ trọng đườngcủa các chủng thường từ 1,15 - 1,18 g/ml Dựa vào đặc điểm này, Malcolm andHeather (1980) đã chia IBV làm hai loại

Loại thứ nhất gồm những virus có tỷ trọng đường cao1,18 g/ml, ở nhữngloại này thường có cấu trúc polypeptid và có bộ gen hoàn chỉnh đồng thời có hìnhthái điển hình của coronavirus

Loại thứ hai gồm những virus có tỷ trọng đường thấp hơn 1,13 g/ml, ởnhững loại virus này cũng có hình thái của coronavirus nhưng không điển hình,trong cấu trúc phân tử thiếu polypeptit ribonucleoprotein và hệ gen

2.2.1.3 Đặc tính nuôi cấy của IBV

IBV thích ứng khi nuôi cấy trên phôi trứng, trên tế bào và trên môi trườngnuôi cấy tổ chức khí quản Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy IBV trên tế bào và trên

phôi gà đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất vacxin IB từ virus nhược độc có chất lượng cao, an toàn và thuần khiết.

+ Nuôi cấy virus trên phôi gà: IBV phát triển tốt trong phôi gà đang phát

triển Nếu gây nhiễm những chủng cường độc tự nhiên vào phôi gà 10-11 ngàytuổi, ở lần gây nhiễm đầu tiên phôi phát triển còi cọc và sống đến 90% cho dù nuôicấy đến ngày thứ 19 Nhưng nếu tiếp tục cấy chuyển liên tiếp trên phôi gà đangphát triển thì tỷ lệ chết phôi và còi cọc phôi càng gia tăng và cấy chuyển liên tiếpđến đời thứ 10 thì hầu như các phôi bị còi cọc và có đến 80% phôi bị chết nếu nuôi

cấy tiếp đến ngày thứ 20 (Yachida et al., 1979).

Sự thay đổi các đặc tính của phôi thể hiện rõ nhất khi gây nhiễm virus sauvài ngày Sự biến đổi nhẹ của những phôi còi cọc có thể quan sát được trong quátrình soi trứng Nếu bộc lộ trứng đã gây nhiễm có thể quan sát sự co quắp của thaigiống như một hình cầu với chân bị biến dạng ép chặt vào đầu thai và dính đầy cácmàng ối xung quanh thai Túi lòng đỏ bị teo lại và lớp màng dễ bị phá vỡ Có sựgia tăng dung dịch nước xoang niệu nang một cách rõ ràng Những phôi bị nhiễmIBV có một bệnh tích chắc chắn xảy ra là sự lắng đọng urat ở trung thận Bệnh tíchnày kết hợp với sự còi cọc của phôi là đặc trưng của sự gây nhiễm IBV trên trứng

gà có phôi Một bệnh tích khác cũng được phát hiện ở những trứng có phôi đượcgây nhiễm từ những chủng IBV phân lập không gây chết phôi là màng ối dầy vàcùng với những lớp màng xoang niệu nang liền kề bao bọc chặt lấy thai bị còi cọc.Bệnh tích này thường có thể phát hiện ở ngày thứ ba sau khi gây nhiễm Nhữngbệnh tích trên cũng quan sát được trong trường hợp gây nhiễm virus Newcastlechủng Lentogenic trên trứng gà có phôi

Phôi gà sau khi gây nhiễm biểu hiện xung huyết xung quanh các mạch máu

và một vài điểm hoại tử ở gan vào ngày thứ 6 sau khi gây nhiễm Tất cả phổi bịviêm với đặc trưng là xung huyết, thâm nhiễm tế bào và thấm dịch đầy xoangcuống phổi Ở thận, bị viêm thận kẽ với biểu hiện phù và căng phồng những ốngnhỏ ở phần đầu Tiểu cầu thận không biến đổi Màng đệm túi niệu (CAM) và màng

ối bị phù (Loomis et al., 1950) Jordan and Nassar (1973) đã nghiên cứu gây

nhiễm IBV chủng Beaudette vào xoang niệu nang của trứng gà có phôi và đã xácđịnh được thời điểm gây nhiễm, nhiệt độ ấp sau khi gây nhiễm, thời gian nuôi cấy

có ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu giá virus Theo tác giả, nếu gây nhiễm virus vớiliều 1x107 EID50 vào xoang niệu nang của phôi trứng gà ấp 10 - 11 ngày tuổi hiệugiá của virus có sự thay đổi Hiệu giá virus đạt tối đa ở 12

giờ nếu ấp ở 37oC, 24 giờ nếu ấp ở 32oC Hiệu giá virus trên màng đệm túi niệucao hơn so với dung dịch nước niệu nang Phôi bị chết được quan sát đầu tiên ở 24giờ nếu ấp ở 37oC, 48 giờ nếu ấp ở 32oC Ở 42oC phôi sẽ chết sớm hơn và hiệu giávirus cũng thấp hơn Những chủng virus được tiếp đời qua phôi gà 20 - 30 lần đạtđược hiệu giá virus tối đa sau 24 - 30 giờ ở 37oC Nhìn chung, với liều gây nhiễm1x103 EID50 sẽ cho hiệu giá virus đạt gần tối đa sau 36 - 40 giờ khi ấp

ở nhiệt độ 37oC

+ Nuôi cấy virus IB trên môi trường tế bào: Môi trường nuôi cấy tế bào

một lớp đã được sử dụng để nghiên cứu IBV, trong đó tế bào thận phôi gà (CEK:chick embryo kidney) và tế bào thận gà (CK: chick kidney) được sử dụng thànhcông nhất

Gillette (1973) đã cấy chuyển thành công IBV trên môi trường tế bào CEK

và kết luận rằng việc cấy chuyển IBV trên môi trường CEK một số lần nhất địnhthì virus mới tạo ra bệnh lý tế bào điển hình (CPE) cho dù những plaque được pháthiện bằng cách nhuộm màu có thể nhìn thấy ngay trong lần cấy chuyển đầu tiên vàhiệu giá IBV trên CEK có sự khác nhau giữa các chủng Sự cấy chuyển của mộtvài chủng trên CEK thích hợp hơn cấy chuyển trên phôi Kích cỡ và hình thái củacác plaque biến đổi theo các chủng và nhiệt độ nuôi cấy, thường các plaque nếunuôi cấy ở 40oC sẽ lớn hơn so với nuôi cấy ở 37oC

Khi nuôi cấy IBV trên CEK và CK hiệu giá virus đạt tối đa ở 14 - 36 giờsau khi gây nhiễm, tùy thuộc vào nhiều nhân tố gây nhiễm Nếu gây nhiễm trên tếbào gan phôi gà (CEL: chick embryo liver) hiệu giá virus cũng đạt giống như khinuôi cấy trên tế bào CEK Hiệu giá virus trên phôi gà cao hơn so với CEK và CK

từ 10 đến 100 lần, nhưng ngược lại CEK và CK lại mẫn cảm hơn CEL

Những chủng IBV đã được cấy chuyển trên phôi gà và nhiều lần trên tế bào

CK có thể nhân lên được trong môi trường tế bào xơ phôi gà, nhưng có hiệu giáthấp hơn vài log10 so với tế bào CK Nếu trong môi trường nuôi cấy tế bào cótrypsin thì sự hình hình thành các plaque sẽ rõ hơn (Otsuki and Tsubokura, 1981).IBV chủng Beaudette có thể phát triển trên tế bào thận nguyên thuỷ và tế bào thậnphôi của nhiều loài gà và động vật có vú khác nhưng rất kém (Coria, 1969) IBVchủng Beaudette, chủng M41 và chủng Iowa 97 có thể cấy chuyển qua dòng tế bàoVERO của động vật có vú (Cunningham, 1970) Trong số 10 chủng đã kiểm tra, cóhai chủng nhân lên trong BHK-21 (Baby hamster kidney - 21) và không có chủng

nào nhân lên trong tế bào HeLa (Otsuki et al., 1988) Gây

nhiễm IBV chủng Beaudette trên tế bào thận gà, sau 6 giờ gây nhiễm bắt đầu hìnhthành bệnh lý tế bào, sau 18 – 24 giờ, bệnh lý tế bào biểu hiện rõ nhất.

+Nuôi cấy IBV trên tổ chức khí quản: IBV lần đầu tiên được gây nhiễm thành công vào tổ chức khí quản năm 1978 (Darbyshire et al., 1978) Tác giả đã sử

dụng tổ chức khí quản của phôi gà ấp 20 ngày tuổi, nuôi cấy trong các ống lăn, sau

đó gây nhiễm IBV, bệnh lý lông rung dễ dàng quan sát bằng kính hiển vi sau 3 – 4ngày Việc nuôi cấy virus vào tổ chức khí quản đã phục vụ cho việc phân lập virus,chuẩn độ xác định hiệu giá và xác định type virus được chính xác hơn (Cook,1984)

2.2.1.4 Sức đề kháng

- Sức đề kháng của virus với nhiệt độ: hầu hết các chủng IBV đều bị vôhoạt sau 15 phút ở 56oC và 45oC/90 phút Virus có thể tồn tại trong dịch niệu mônhiều năm ở điều kiện nhiệt độ -30oC Có thể sử dụng dung dịch glycerol 50% đểbảo quản tốt mô bệnh phẩm vận chuyển tới phòng thí nghiệm mà không cần bảoquản lạnh Ở ngoài môi trường, virus có thể sống trên 12 ngày vào mùa xuân và 56ngày vào mùa đông

- Sức đề kháng của virus với điều kiện khô lạnh: trong dịch niệu mô đượclàm khô lạnh, đóng nút trong môi trường chân không và bảo quản trong tủ lạnh,virus có thể tồn tại ít nhất 30 năm Môi trường có 10% glucose sẽ tạo ra sự ổn địnhcủa virus ở sự khô lạnh hay sự đông băng

- Sức đề kháng của virus với điều kiện pH: Virus thích ứng với môi trường

có pH từ 6 - 6,5, tối ưu là 7 - 8 Ở độ pH 3 các chủng IBV có thể bị thay đổi về cấutrúc

- Sức đề kháng của virus với các yếu tố hóa học: Virus bị phá hủy bởi cáchóa chất tiêu độc thong thường như Ether, Chloroform trong 10 phút,

Betapropiolactone 0,05 - 0,1% (BPL) và Formalin 0,1% Cá biệt một số chủng có thể sống 18 giờ trong Ether 20% ở 4oC

2.2.1.5 Sự nhân lên của IBV

Sự nhân lên của IBV trong tế bào vật chủ cũng tương tự như cácCoronavirus khác Protein S gắn với các thụ thể của các loại tế bào tương ứng vớicác chủng IBV khác nhau, cơ chế gắn đặc hiệu của virus với các thụ thể cho tớinay vẫn chưa được sáng tỏ sợi đơn dương RNA của virus sau đó được sử dụngnhư một khuôn để trực tiếp tổng hợp RNA trong tế bào vật chủ Protein N sau đó

gắn với sợ RNA mới được tổng hợp, cùng với đó là sự hợp nhất protein M vàprotein E ở bên trong màng nguyên sinh chất của tế bào vật chủ Sau khi protein Ngắn với RNA mới được tổng hợp, cấu trúc này xoắn lại và xuyên qua cấu chúc hợpnhất giữa protein M và E và được bao bọc bởi lớp màng Hạt virus mới được hìnhthành sau đó sẽ di chuyển ra bề mặt tế bào thông bao hệ Golgi và được giải phóngkhỏi thế bào thông qua cơ chế xuất bào (exocytosis) (Hình 2.3) (Casler and Cook,1999).

Hình 2.3 Sự nhân lên của IBV trong tế bào vật chủ (Lai, 1987)

2.2.1.6 Serotype và genotype của IBV

IBV có rất nhiều serotype gây bệnh đã được xác định và báo cáo bởi nhiềunhà khoa học, trong đó phải kể tới như các serotype Connecticut (Conn),Massachusetts (Mass), Australian T, 793B, D274, H120, Italy-02, Baudette,California … Việc chẩn đoán các serotype dựa trên các nhóm quyết định kháng

nguyên (epitope) của IBV (Sjaak de Wit et al., 2011) Chính vì vậy mà việc sử

dụng các test chẩn đoán huyết thanh trở nên khó khăn hơn khi có quá nhiều

serotype gây bệnh Trong tương lai, việc phát triển một kit chẩn đoán để sàng lọc

gà dương tính huyết thanh học với IBV phải dựa trên cơ sở chẩn đoán cùng lúcnhiều serotype bằng cách ứng công nghệ sinh học tiên tiến

Định typ virus dựa vào những trình tự cớ sự biến động lớn của gen S1 cóthể được phát hiện bằng phản ứng nhân gen ngược ngược (Reverse PolymeraseChain Reaction) và phương pháp giải trình tự gen Các phương pháp sinh học phân

tử hiện đại được ứng dụng để chẩn đoán chính xác các genotyp của các chủng IBVkhác nhau (De Wit, 2000)

2.2.1.7 Đáp ứng miễn dịch gà nhiễm IBV

Đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào đều có vai trò quantrọng trong cơ chế phòng ngự và bảo vệ của cơ thể gà mắc IBV

Đáp ứng miễn dịch dịch thể: Gà đáp ứng lại với virus thông qua việc sản

sinh kháng thể dịch thể đặc hiệu IgM là kháng thể được sinh ra đầu tiên và đượcxác định trong huyết thanh sau quá trình nhiễm virus, kháng thể tăng tới đỉnh trongkhoảng giao động 8 ngày sau khi nhiễm và giảm dần ở các ngày nhiễm virus tiếptheo IgM có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán sớm gà nhiễm IBV Khángthể được sinh ra tiếp theo là IgG, được phát hiện nhiều sau khoảng từ 10 – 14 ngàynhiễm Kháng thể này được phát hiện bởi hầu hết các phương pháp chẩn đoán như

ELISA, HI và VNT (Da Silva Martins et al., 1991) Tuy nhiên hàm lượng kháng

thể sinh ra trong huyết thanh thì không cung cấp đủ miễn dịch bảo hộ đối với gà.Các nghiên cứu sau này góp phần khẳng định vai trò của các kháng thể tại chỗđược sinh ra và có giá trị bảo hộ đối với cơ quan hô hấp Các báo cáo sau đó đãtrích ly được tế bào plasma và kháng thể trong dịch rửa tuyến lệ, mũi và khí quản

(Raj et al., 1997).

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (Cell mediated immunity – CMI):

CMI đã được chứng minh là có liên quan với vai trò của các protein S1, N và Mtrong thành phần cấu trúc của virus Tế bào T được xác định ở khí quản của gànhiễm IBV cho thấy đáp ứng miễn dịch ở khí quản có vai trò của quần thể tế bào Tmang dấu ấn CD4+ và CD8+ Các nghiên cứu sau này cũng xác định được sự cómặt của các yếu tố cản nhiễm Interferon type 1 (INF-1) khá cao ở khí quản vàphổi, chỉ số này thấp hơn ở các cơ quan khác gồm plasma, thận, gan và lách INF-1

có vai trò quan trọng trong việc trì hoãn quá trình phát bệnh cấp tính ở gà nhiễmIBV Mặt khác sự tăng tiết tại chỗ của INF-1 và Interleukin-1 beta kích thích tạo ramột tín hiệu kháng virus và kích hoạt và

dịch chuyển các tế bào T tới các mô và tạo ra các đáp ứng miễn dịch kịp thời

(Cavanagh, 2007; Guo et al., 2008).

2.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN GÀ NHIỄM IBV

2.3.1 Phương pháp chẩn đoán dựa vào đặc điểm lâm sàng

Cần chẩn đoán phân biệt với một số bệnh đường hô hấp ở gà nhưNewcastle, viêm thanh khí quản truyền nhiễm, sổ mũi truyền nhiễm ở gà và hộichứng giảm đẻ

- Bệnh Newcastle: bệnh thường xảy ra trầm trọng hơn IB, triệu chứng thầnkinh rõ ràng khi mắc chủng có độc lực cao, tỷ lệ đẻ bị giảm ít hơn IB Bằng phảnứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu có thể phân biệt hai bệnh một cách dễ dàng

- Bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm: lây lan trong đàn chậm hơn,biểu hiện triệu chứng đường hô hấp trầm trọng hơn IB Bệnh tích điển hình là xuấthuyết và tích dịch thẩm xuất có fibrin ở thanh - khí quản Ở phế quản, phổi và túikhí không có bệnh tích

- Bệnh sổ mũi truyền nhiễm gà (infectious coryza - IC): mặt bị sưng to rất đặc trưng trong bệnh IC nhưng ít gặp trong bệnh IB

- Hội chứng giảm đẻ: sản lượng và chất lượng trứng của đàn gà đẻ bị ảnhhưởng tương tự như bệnh IB, nhưng chất lượng bên trong quả trứng không bị ảnhhưởng

2.3.3 Phản ứng huyết thanh học

Sử dụng dịch nuôi cấy virus trên gây bệnh bằng cách tiêm vào khí quản cho

gà Nếu trong bệnh phẩm có IBV, sau 18 - 36 giờ gà có biểu hiện triệu chứng

hô hấp Sau 4 tuần có thể lấy huyết thanh, làm phản ứng trung hòa để xác địnhserotyp của chủng virus đã phân lập được.

Sự có mặt của IBV trong bệnh phẩm có thể chẩn đoán khẳng định bằngkháng thể đặc hiệu Sử dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch enzymvới kháng thể chuẩn kháng IBV đơn dòng hoặc đa dòng Gà mắc IBV với rất nhiềuserotyp và genotyp khác nhau như Mass, Conn, 4/91, D274, Italy-02 … Tới nay,

có rất nhiều phương pháp đã được phát triển nhằm chẩn đoán và xác định serotypcũng như chẩn đoán chính xác IBV Những phương pháp đã được phát triển gồmphương pháp phân lập virus từ bệnh phẩm của gà mắc bệnh, phản ứng huyết thanhhọc ngăn trở ngưng kết hồng cầu (haemagglutination inhibition - HI), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), immunoperoxidase assay (IPA), phản ứngtrung hòa virus (virus neutralization test - VNT), phản ứng miễn dịch huỳnh quang(immunofluorescence assay (IFA), agar gel precipitation test (AGPT)

2.3.4 Kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng để chẩn đoán IBV

Phản ứng RT-PCR và phản ứng định lượng virus real-time RT-PCR (de Wit,2000) Các phương pháp này đều có ưu điểm và nhược điểm riêng về độ nhạy, độđặc hiệu, thời gian kiểm tra và giá thành của sản phẩm Phương pháp định lượngrealtime RT-PCR được phát triển và ứng dụng chẩn đoán và được áp dụng chonhiều loại mầm bệnh gây bệnh trong thú y Phương pháp này cho phép định lượngvirus gây bệnh với độ nhạy rất cao; tuy nhiên, phương pháp này đôi khi cũng cónhững mặt giới hạn khi các chủng IBV thay đổi hình thành các chủng virus mới

(Callison et al., 2006) Phương pháp nhân gen (RT-PCR) không thích hợp để xác

định typ virus gây bệnh, việc định typ gây bệnh thường dựa trên cơ sở so sánhtrình tự các Nucleotit của gen S trong cấu trúc của IBV

2.3.4.1 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase - PCR)

Virus, khi được phân loại theo bản chất di truyền thường được phân thành 2loại chính là virus có cấu trúc di truyền là DNA (DNA virus) và virus có cấu trúc

di truyền là RNA (RNA virus) Dựa trên cấu trúc này mà người ta phát triển các kỹthuật PCR khác nhau để tập trung phát hiện từng loại virus dựa trên cấu trúc ditruyền đích là DNA hay RNA Để phát hiện và nghiên cứu virus có cấu trúc ditruyền là RNA (IBV là một RNA virus), người ta đã phát triển một kỹ thuật có tên

là RT-PCR hay PCR phiên mã ngược (Reverse transcriptase - PCR)

Phản ứng RT-PCR cho khuếch đại DNA từ RNA Như vậy RT-PCR gồm có

2 giai đoạn: Ban đầu là RT (phiên mã ngược), dưới tác dụng của RNA