TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Màng sinh học biofilm là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinh vật, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn của một hoặc một số loài phát triển tr
NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Tụ cầu khuẩn Staphylococcus spp phân lập được ở đường hô hấp của gà nuôi tại huyện Gia Lâm – Hà Nội và một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đề ra, chúng tôi đã thực hiện một số nội dung sau:
Phân lập và thuần khiết vi khuẩn;
Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn; Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn;
Nghiên cứu biến động của quá trình sản sinh màng sinh học theo thời gian;
Nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học.
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 4/2015 đến tháng 3/2016.
Nguyên liệu
- Thạch thường của hãng Merck.
- Môi trường lỏng: tryptone water, tryptic soy broth, peptone water của hãng Merck.
- Yeast extract của hãng Oxoid.
- Giấy tẩm kháng sinh, kháng sinh bột.
- Đĩa nhựa 96 giếng vô trùng (SPL Life Sciences).
- Hóa chất dùng trong định lượng màng sinh học: methanol, đệm PBS 1x, dung dịch 1% tím kết tinh (crystal violet), dung dịch cồn 80% có bổ sung 5% sodium dodecyl sulfate.
- Máy đọc ELISA (Biotek, ELx808).
Phương pháp nghiên cứu
Dịch hầu họng được lấy ngẫu nhiên từ một số đàn gà nuôi tại huyện Gia Lâm, Hà Nội và một số tỉnh lân cận như Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Hải Dương Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch hầu họng, xoang mũi của gà Các mẫu tăm bông được bảo quản trong đệm trypton và bảo quản ở 4 o C trong suốt quá trình vận chuyển mẫu.
3.6.2 Phương pháp phân lập, thuần khiết vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí được phân lập và thuần khiết theo quy trình thường quy của bộ môn Vi sinh vật- Truyền nhiễm, Khoa Thú y Các bước được tóm tắt như sau: (i) ria cấy tăm bông thấm dịch swab trên đĩa thạch thường và nuôi cấy trong tủ ấm 37 o C/24h (ii) Lựa chọn những khuẩn lạc màu trắng hoặc vàng, dạng S, có kích thước to hoặc nhỏ để thuần khiết (iii) Nhuộm Gram, chọn mẫu có tụ cầu khuẩn cho các nội dung nghiên cứu tiếp theo.
3.6.3 Phương pháp xác định khả năng sản sinh màng biofilm Định lượng khả năng sản sinh màng sinh học được thực hiện trên đĩa 96 giếng (Stepanovic, 2007) Các bước được tóm tắt như sau: Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn bằng môi trường lỏng
- Chuyển 1 ml huyễn dịch vi khuẩn (pha trong TSB+Y) vào 9 ml dung dịch
TSB+Y vô trùng Nuôi tĩnh ở 37 o C trong vòng 12 giờ Huyễn dịch vi khuẩn là nước rửa mặt thạch chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết.
Bước 2: Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn 1/10
- Chuyển 1 ml vi khuẩn sau nuôi cấy 12 giờ trong môi trường TSB+Y vào ống nghiệm chứa 9 ml môi trường TSB+Y mới, vô trùng Trộn đều.
- Chuyển 100 àl huyễn dịch vi khuẩn (1/10) vào mỗi giếng của đĩa nhựa vụ trựng 96 giếng (đó cú sẵn 100 àl mụi trường TSB+Y) Nuụi tĩnh ở 37 o C/24 giờ.
Bước 4: Rửa trôi vi khuẩn không bám vào thành/ đáy đĩa
- Loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn không nằm trong màng sinh học bằng cỏch rửa mỗi giếng bằng 200 àl PBS 1x; lặp lại 3 lần Thấm khụ giếng. Bước 5: Cố định màng sinh học
- Cố định vi khuẩn bỏm vào thành/ đỏy đĩa bằng 200 àl methanol;
- Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
- Loại bỏ hoàn toàn methanol trong giếng bằng cách thấm khô. Bước 6: Nhuộm màng sinh học
- Bổ sung vào mỗi giếng 200 àl dung dịch tớm kết tinh 1%;
- Giữ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút;
- Loại bỏ hoàn toàn dung dịch tím kết tinh;
- Loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm thừa (không thấm vào lớp màng sinh học) bằng cỏch rửa mỗi giếng bằng 200 àl PBS 1x; lặp lại ớt nhất 3 lần cho đến khi không còn màu của thuốc nhuộm sau khi thấm khô giếng.
Bước 7: Đo mật độ quang
- Hòa tan thuốc nhuộm tím kết tinh thấm vào màng sinh học bằng cỏch bổ sung vào mỗi giếng 200 àl dung dịch ethanol 95%;
- Giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
- Đo giá trị OD ở bước sóng 595 nm.
Bước 8: Phân tích kết quả Đánh giá mức sản sinh màng sinh học được thực hiện theo tác giả Stepanovic (2000) Tính toán kết quả theo công thức sau: ODc = ODđc +3SD Trong đó: (ODđc là giá trị OD trung bình của các mẫu đối chứng âm, SD là độ lệch chuẩn của giá trị OD của các mẫu đối chứng âm) Mẫu dương tính (sản sinh màng sinh học) là mẫu có giá trị ODmẫu > ODc Mức tạo màng sinh học được đánh giá như sau:
ODmẫu ≤ ODc ODc < ODmẫu ≤ 2ODc 2ODc < ODmẫu ≤ 4ODc 4ODc < ODmẫu
3.6.4 Phương pháp nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian Để nghiên cứu biến động của sự sản sinh màng sinh học theo thời gian, chúng tôi nuôi vi khuẩn vào các giếng của đĩa 96 giếng Nuôi tĩnh ở 37 o C, loại bỏ dung dịch trong giếng, cố định lớp biofilm hình thành (nếu có) sau mỗi 4 giờ Các bước định lượng lớp biofilm tại mỗi thời điểm được thực hiện theo phương pháp trình bày ở mục 3.6.3 Các bước thực hiện được tóm tắt ở hình 3.1
Hình 3.1 Các bước nghiên cứu biến động biofilm theo thời gian
3.6.5 Phương pháp xác định khả năng đề kháng kháng sinh
Khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành biofilm được thực hiện tóm tắt như sau: (i) xác định loại kháng sinh mà vi khuẩn phân lập mẫn cảm, (ii) xác định nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, (iii) nuôi cấy tĩnh vi khuẩn ở đĩa 96 giếng, trong vòng 20 giờ để hình thành biofilm,
(iv) loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn không nằm trong lớp biofilm, giữ lại biofilm, (v) thêm kháng sinh ở nồng độ cao hơn MIC và lưu trong vòng 12 giờ hoặc 24 giờ,
(vi) loại bỏ kháng sinh, bổ sung môi trường và nuôi thêm trong vòng 24 giờ ở
37 o C, (vii) thu huyễn dịch vi khuẩn ở các giếng, đo giá trị OD 630 và xác định tỷ lệ số vi khuẩn ở các nồng độ kháng sinh khác nhau so với giếng đối chứng vi khuẩn (không bổ sung kháng sinh) Các bước thực hiện kể trên được chúng tôi trình bày tóm tắt ở hình 3.2.
Hình 3.2 Tóm tắt các bước nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn
Hình 4.1 trình bày tóm tắt kết quả phân lập vi khuẩn hiếu khí trực tiếp từ mẫu swab trên môi trường thạch thường.
Hình 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu swab
Từ các mẫu swab, chúng tôi phân lập được nhiều loại vi khuẩn hiếu khí có khuẩn lạc dạng S, với đường kính khuẩn lạc to/ nhỏ khác nhau Với mục tiêu phân lập được tụ cầu khuẩn, chúng tôi lựa chọn những khuẩn lạc có màu vàng (ở các sắc độ khác nhau: vàng rơm, vàng chanh, không màu) để thuần khiết. Hình 4.2 minh họa kết quả thuần khiết vi khuẩn Staphylococcus spp.
Hình 4.2 Kết quả thuần khiết tụ cầu khuẩn từ mẫu swab.
Các mẫu có màu vàng rơm, vàng chanh và không màu lần lượt được sắp xếp ở hàng trên cùng, hàng thứ hai và hàng dưới cùng
Sau 2 lần thuần khiết liên tiếp, chúng tôi đã thu được những thạch trong đó chỉ quan sát được một loại khuẩn lạc (giống nhau về dạng khuẩn lạc, màu sắc) Các loại khuẩn lạc thuần có màu phổ biến là vàng rơm, vàng chanh hoặc không màu (hình 4.2) Hình 4.3 là kết quả nhuộmGram để khẳng định chắc chắn sự thuần khiết của khuẩn lạc.
Hình 4.3 Hình thái của chủng tụ cầu khuẩn thuần khiết.
Hình ảnh vi khuẩn ở độ phòng đại 1000 lần (ảnh nhỏ), vi khuẩn xếp cạnh nhau có dạng chùm nho (mũi tên, ảnh lớn)
Kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) có thể quan sát thấy rõ hình thái đặc trưng của tụ cầu khuẩn: bắt màu Gram dương (màu tím xanh), vi khuẩn thường tập trung thành đám có dạng như chùm nho (hình 4.3) Trên các vi trường, chỉ quan sát được hình thái của một loại vi khuẩn Các kết quả kể trên cho biết đã thuần khiết thành công các chủng tụ cầu khuẩn Tổng hợp kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả phân lập và thuần khiết vi khuẩn Địa điểm lấy mẫu Bắc Giang Vĩnh Phúc Hải Dương
Như vậy, trong 63 mẫu dịch thu được ở đường hô hấp trên của gà, chúng tôi đã thuần khiết được 88 chủng phân lập là vi khuẩn Gram dương thuần khiết Trong đó, đã thuần khiết được 31 chủng tụ cầu khuẩn để thực hiện các nội dung nghiên cứu tiếp theo.
Nghiên cứu hệ vi sinh vật đường hô hấp của gia cầm, nhóm tác giả Poorniya và Upadhey đã phân lập được 64 loại vi khuẩn (Poornima and Upadhye, 1995) Trong số này, chiếm ưu thế của nhóm vi khuẩn Gram dương là Staphylococus epidemidis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Bacillus megaterium, Corynebacterium xerosis và Micrococcus spp.; chiếm ưu thế của nhóm vi khuẩn Gram âm là Escherichia coli, Citrobacter freundii và Enterobacter aerogenes (Poornima and Upadhye, 1995) Ở một nghiên cứu khác, Byrum và Slemons cho thấy sự đa dạng hệ vi sinh vật ở đường hô hấp trên của gia cầm, bao gồm các nhóm vi khuẩn Gram âm (Flavobacterium spp., Vibrio alginolyticus) và Gram dương (Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermis và Staphylococcus sciuri) (Byrum and Slemons, 1995) Ởhai nghiên cứu kể trên, có thể thấy tụ cầu khuẩn là loại vi khuẩn thường gặp nhất ở đường hô hấp của gia cầm Do đó, kết quả phân lập được tụ cầu khuẩn với tỷ lệ tương đối cao (49,21%) trong nghiên cứu này là hoàn toàn phù hợp Tuy nhiên, do phạm vi của đề tài, chúng tôi chưa có điều kiện đi sâu vào định loài các chủng tụ cầu khuẩn phân lập được.
Kết quả nghiên cứu khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
môi trường tăng sinh và nghiên cứu sự hình thành biofilm của các chủng tụ cầu khuẩn Một trong những yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sản sinh màng sinh học của vi khuẩn là loại môi trường tăng sinh Để loại trừ sai số do sử dụng môi trường không phù hợp, trước khi định lượng mức sản sinh màng sinh học, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phát triển của 31 chủng tụ cầu khuẩn. Kết quả theo dõi sự sinh trưởng theo thời gian được trình bày hình 4.4.
Pha tiềm phát (lag phase)
Hình 4.4 Đường cong sinh trưởng của tụ cầu khuẩn ở môi trường TSB-Y.
Ký hiệu là giá trị OD trung bình tại mỗi thời điểm thu mẫu Đường giới hạn cận trên và cận dưới tại mỗi thời điểm là độ lệch chuẩn giá trị OD của 31 mẫu
Số lượng vi khuẩn nhân lên trong môi trường TSB-Y có xu hướng tăng dần theo thời gian (giá trị OD 630 ở thời điểm sau lớn hơn ở thời điểm trước) Dễ nhận thấy đường cong sinh trưởng của 31 chủng tụ cầu khuẩn được chia thành 3 giai đoạn rõ rệt: (i) pha tiềm phát (trong khoảng 3 giờ đầu), (ii) pha lũy thừa (từ 3 - 9 giờ sau nuôi) với mức tăng cao nhất so với thời điểm 0 giờ là 2,5 lần, (iii) pha cân bằng (từ 15 - 30 giờ sau nuôi) Trong nghiên cứu này, chúng tôi dừng thí nghiệm tại thời điểm 30 giờ nên không quan sát được pha suy vong (death phase) của vi khuẩn Với đường cong sinh trưởng kể trên, có thể khẳng định TSB-Y là môi trường phù hợp để thực hiện các nội dung nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả định lượng khả năng sản sinh màng sinh học
Chúng tôi đã nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học của 31 chủng tụ cầu khuẩn, với các kết quả định lượng khả năng sản sinh biofilm được trình bày ở hình 4.5.
Hình 4.5 Kết quả kiểm tra khả năng tạo màng sinh học.
Mỗi chủng tụ cầu được nuôi trên 4 giếng (theo cột) Các giếng đối chứng âm (Đ.c) được đóng khung Mẫu có khả năng sinh biofilm mạnh (M), trung bình (TB), yếu (Y) và không sản sinh biofilm (-)
Có thể nhận thấy ở 8 giếng đối chứng âm (chỉ có môi trường TSB-Y,không có vi khuẩn) không có hiện tượng giữ màu của thuốc nhuộm Ở các mẫu nuôi vi khuẩn có hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh ở các mức độ khác nhau (hình 4.5) Trong hình minh họa này, một số mẫu có màu giống đối chứng âm và được đánh giá âm tính (không hình thành biofilm).Một số mẫu được ký hiệu bằng các chữ cái là Y, TB và M là các mẫu có hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm và được đánh giá dương tính ở các mức khác nhau Hình ảnh lớp biofilm hình thành được chúng tôi minh họa ở hình 4.6.
Hình 4.6 Màng sinh học nhuộm bằng tím kết tinh 1% (200X).
Sự hình thành biofilm được đánh giá ở mức mạnh (A), trung bình (B) và yếu (C) so với đối chứng (D) không hình thành biofilm
Hình 4.6 cho thấy giếng đối chứng âm (hình 4.6D) không có sự phát triển của vi khuẩn và không có hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh Ở giếng nuôi cấy vi khuẩn đều quan sát được sự hình thành các mảng biofilm ở mức độ mạnh
(hình 4.6A), trung bình (hình 4.6B) và yếu (hình 4.6C), và có hiện tượng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh trong lớp biofilm Giếng có biofilm hình thành ởmức mạnh có thể thấy rõ một lớp vi khuẩn bám rất sát nhau trên bề mặt giếng Ngược lại, ở giếng có biofilm hình thành ở mức yếu sẽ có ít các lớp vi khuẩn trên bề mặt giếng. Để làm rõ mức độ hình thành màng sinh học, chúng tôi đo mật độ quang của thuốc nhuộm giữ lại trong giếng, so sánh với giá trị
ODc, 2ODc, 4ODc của đối chứng âm để xác định mẫu hình thành/ không hình thành biofilm cũng như mức độ sản sinh biofilm.
3M 5 8 1M 5 8 4 M 5 6 2 M 5 6 5 M 5 4 3M 5 4 3M 5 3 1M 5 3 5 M 5 2 9 M 5 1 M 5 1 7 5 M 5 0 2 M 4 9 M 49 1 3M 4 7 1M 4 7 4 M 39 2 M 39 4 M 2 4 3M 2 4 2 M 2 4 1M 2 4 M 20 M 19 M 18 M 17 M 16 M 15 M 14 M 1 3 M 12 (+ ) M ạn h (+ ) T ru n g b ìn h (+ ) Y ếu  m tí n h
Hình 4.7 Mức tạo màng sinh học của tụ cầu khuẩn.
Kết quả tính giá trị ngưỡng của đối chứng âm cho giá trị ODc = 0,350 Kết quả ở hình 4.7 cho thấy có 16/31 mẫu (chiếm 51,61%) có khả năng hình thành màng sinh học ở 3 mức: mạnh, trung bình và yếu Có 15/31 mẫu được đánh giá là không sản sinh màng sinh học Tụ cầu khuẩn là loại vi khuẩn thường gặp ở ngoài môi trường, trên cơ thể động vật khỏe mạnh hoặc động vật mắc bệnh Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy có từ 37,5% đến 57% số chủng tụ cầu khuẩn (phân lập được từ nhiều loại mẫu khác nhau) có khả năng sản sinh biofilm (Mirani, 2013, Oliveira,
2006) Với các kết quả nghiên cứu thu được, có thể thấy rằng khả năng sản sinh màng sinh học là phổ biến của các chủng tụ cầu khuẩn
4.4 BIẾN ĐỘNG CỦA QUÁ TRÌNH SẢN SINH MÀNG SINH HỌC
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu về khả năng hình thành màng sinh học, chúng tôi đã chọn 7 chủng vi khuẩn (sản sinh biofilm ở các mức khác nhau) để nghiên cứu đặc điểm của quá trình hình thành màng sinh học theo thời gian Hình 4.8 trình bày kết quả phân tích biến động lớp biofilm hình thành theo thời gian (từ 4 giờ - đến 40 giờ).
Hình 4.8 Biến động về lượng biofilm sản sinh theo thời gian.
Chiều cao của các cột tại mỗi thời điểm tương ứng với giá trị OD 595 Để dễ quan sát, mẫu hình thành biofilm được biểu thị bằng màu hồng, mẫu không hình thành biofilm được biểu thị bằng màu xanh Các đường nét đứt mô phỏng sự biến động (tăng- giảm) của lớp biofilm theo thời gian Đối với mẫu M12 (đã được xác định không hình thành biofilm, trình bày ở hình 4.7), tại tất cả các thời điểm thu mẫu (từ 4 giờ đến 40 giờ) giá trị OD của thuốc nhuộm tím gentian giữ lại trong giếng đều thấp hơn giá trị ngưỡng ODc, và không có sự biến động trong suốt thời gian theo dõi (hình 4.8) Nói cách khác, ở mẫu này không có sự hình thành lớp biofilm của vi khuẩn theo thời gian Đối với mẫu M49.1 và M24.2 (đã được xác định sản sinh biofilm ở mức yếu, trình bày ở hình 4.7), chúng tôi thấy giá trị OD của thuốc nhuộm giữ lại trong giếng rất ít có sự biến động theo thời gian (hình 4.8) Ngược lại, với các mẫu được xác định hình thành biofilm ở mức trung bình và mạnh (M47.1, M54.3 và M49.2) các giá trị OD này có xu hướng tăng dần trong khoảng 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm (từ 24 giờ đến 40 giờ) Minh họa sự biến động của lượng biofilm theo thời gian (thông qua màu thuốc nhuộm tím gentian giữ lại trong giếng) được trình bày ở hình 4.9. Đ.c
Hình 4.9 Biến động màu thuốc nhuộm giữ lại bởi lớp biofilm.
Trình bày ở hình 4.9 là ảnh chụp đĩa nhuộm biofilm theo thời gian của các chủng vi khuẩn sản sinh biofilm ở các mức yếu, trung bình và mạnh Ở giếng đối chứng (Đ.c) và mẫu M12 hầu như không giữ màu thuốc nhuộm trong các giếng tại các thời điểm rút mẫu (4 giờ đến 40 giờ) Ngược lại, mẫu M49.2 (hình thành biofilm mạnh) có thể thấy rất rõ sự tăng dần về màu tím gentian trong khoảng 4 giờ đến 20 giờ, sau đó giảm từ 24 giờ đến 40 giờ.
Như vậy, với kết quả trình bày ở hình 4.8 và hình 4.9 cho thấy sự hình thành biofilm là một quá trình động và phụ thuộc vào thời gian Cũng dễ dàng nhận thấy rằng, lượng biofilm sản sinh không luôn tương quan tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy tĩnh vi khuẩn (lượng biofilm đạt cực đại sau đó giảm xuống) Kết quả này là do (i) sự giảm theo thời gian các chất dinh dưỡng có trong giếng nuôi vi khuẩn và do (ii) song song với quá trình tạo màng sinh học luôn có hiện tượng phá vỡ một phần cấu trúc biofilm để giải phóng vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu công bố năm 2006 (Holá, 2006), về ảnh hưởng của thời gian, chất dinh dưỡng và nhiệt độ đến sự hình thành biofilm cho thấy: ở điều kiện nuôi cấy là 25 o C vi khuẩn Staphylococcus epidermidis hình thành màng sinh học rất chậm theo thời gian Ngược lại, ở 37 o C, vi khuẩn hình thành màng sinh học một cách nhanh chóng (sau nuôi cấy khoảng 2-4 giờ), lớp màng sinh học này hoàn chỉnh sau nuôi cấy từ 12- 14 giờ, sau đó giảm dần nếu tiếp tục duy trì từ 34-42 giờ Như vậy, kết quả của chúng tôi là tương đồng khi cũng chỉ ra sự biến động của lớp biofilm được hình thành theo thời gian.
Kết quả nghiên cứu sự biến động của biofilm theo thời gian còn cho thấy sự cần thiết phải tìm hiểu được đặc điểm của sự hình thành biofilm của các chủng tụ cầu khuẩn trước khi thực hiện các nghiên cứu như định lượng biofilm, thử khả năng đề kháng kháng sinh của lớp biofilm, v.v vì lớp biofilm hình thành mạnh
-yếu tại các thời điểm khác nhau Ở khía cạnh này, nhận xét này của chúng tôi là phù hợp với khuyến cáo trước đây về thời gian nuôi vi khuẩn để nghiên cứu sự sản sinh biofilm (Stepanovic, 2007).
4.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN HÌNH THÀNH MÀNG SINH HỌC Để nghiên cứu ảnh hưởng của biofilm tới khả năng đề kháng kháng sinh, trước hết cần phải tìm được loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm. Tham khảo cơ sở dữ liệu của EUCAST về các loại kháng sinh mà tụ cầu khuẩn mẫn cảm (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), chúng tôi đã tiến hành thử tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh Kết quả được trình bày tóm tắt ở hình 4.10.
Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh.
31 chủng tụ cầu khuẩn được thử tính mẫn cảm với 8 loại kháng sinh gồm: Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin (Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và
Trimethprime/sulfamethoxazol (Bt) Trục Ox biểu thị đường kính vòng vô khuẩn (mm), trục Oy biểu thị số lượng chủng thử kháng sinh đồ Với mỗi loại kháng sinh, đường nét đứt màu đỏ giới hạn mức kháng (phía bên trái) và mẫn cảm (phía bên phải)
Kết quả nghiên cứu khả năng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn hình thành màng sinh học
Để nghiên cứu ảnh hưởng của biofilm tới khả năng đề kháng kháng sinh, trước hết cần phải tìm được loại kháng sinh mà vi khuẩn mẫn cảm. Tham khảo cơ sở dữ liệu của EUCAST về các loại kháng sinh mà tụ cầu khuẩn mẫn cảm (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, 2017), chúng tôi đã tiến hành thử tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh Kết quả được trình bày tóm tắt ở hình 4.10.
Hình 4.10 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh.
31 chủng tụ cầu khuẩn được thử tính mẫn cảm với 8 loại kháng sinh gồm: Neomicin (Ne), Doxycycline (Dx), Penicillin (Pn), Tetracycline (Te), Kanamycin (Kn), Gentamicin (Ge), Norfloxacin (Nr) và
Trimethprime/sulfamethoxazol (Bt) Trục Ox biểu thị đường kính vòng vô khuẩn (mm), trục Oy biểu thị số lượng chủng thử kháng sinh đồ Với mỗi loại kháng sinh, đường nét đứt màu đỏ giới hạn mức kháng (phía bên trái) và mẫn cảm (phía bên phải)
Kết quả hình 4.10 cho biết 31/31 chủng đều kháng penicillin (đường kính vòng vô khuẩn < 26 mm, theo tiêu chuẩn của EUCAST) Kết quả này phù hợp với đặc điểm của các chủng tụ cầu khuẩn đều sản sinh enzyme penicillinase.Ngoài ra, 31/31 chủng tụ cầu khuẩn này còn kháng tetracycline Đối với 6 loại kháng sinh còn lại, các chủng tụ cầu khuẩn có tính mẫn cảm và kháng không giống nhau với mỗi loại kháng sinh Tổng hợp kết quả, chúng tôi thấy đa số các chủng tụ cầu khuẩn (22/31 chủng) mẫn cảm với norfloxacin.
Với kết quả kể trên, chúng tôi chọn (i) norfloxacin để chứng minh khả năng đề kháng kháng sinh và (ii) dùng nồng độ cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) để tác động lên vi khuẩn nằm trong lớp màng sinh học trong vòng 12 giờ Sau thời gian tác động của kháng sinh, bổ sung môi trường duy trì TSB-Y và tiếp tục nuôi trong vòng 24 giờ. Bảng 4.2 trình bày kết quả xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn nằm trong màng sinh học sau khi chịu tác động của kháng sinh.
Bảng 4.2 Kết quả xác định khả năng đề kháng kháng sinh
Mẫu thử nghiệm M24.1 M24.2 M39.2 M47.1 M49.1 M49.2 Trung bình
Có thể nhận thấy các mẫu đối chứng (không có vi khuẩn, cột 6, bảng 4.2), môi trường nuôi không có hiện tượng vẩn đục, với giá trị OD 630 từ 0,032 đến 0,044 Ngược lại, ở các mẫu nuôi vi khuẩn nằm trong lớp biofilm (sau thời gian tác động của kháng sinh) có hiện tượng vẩn đục, với giá trị OD 630 tăng tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh Ở nồng độ kháng sinh 100x, 10x và 1x, đậm độ vi khuẩn giảm xấp xỉ 7,4 lần (1,640/0,223), 6,2 lần (1,640/0,264) và 3,4 lần (1,640/0,485) so với đậm độ vi khuẩn ở giếng không có kháng sinh (0x) Kết quả ở bảng 4.2 chứng tỏ còn vi khuẩn sống sót trong lớp màng sinh học sau thời gian tác động của kháng sinh Nói cách khác, vi khuẩn nằm trong màng sinh học đề kháng với nồng độ kháng sinh cao gấp 10 lần và 100 lần nồng độ MIC.
Trong một công bố về khả năng đề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus, tác giả Urish đã rút ra kết luận: sự có mặt của kháng sinh (cefazolin) ở các nồng độ cao gấp 2, 20 và 200 lần chỉ làm giảm lượng biofilm sản sinh ra mà không thể loại bỏ được hoàn toàn lớp biofilm (Urish, 2016) Đáng chú ý, tỷ lệ vi khuẩn nằm trong lớp biofilm sống sót dao động từ 2,0% đến 57,9% sau khi chịu tác động của 3 loại kháng sinh là cefazolin, gentamicin và vancomycin ở nồng độ gấp 10 lần nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (Urish, 2016) So sánh với kết quả nghiên cứu kể trên, kết quả của chúng tôi thu được là phù hợp khi chứng minh được khả năng đề kháng kháng sinh rất cao của vi khuẩn sản sinh biofilm
Các kết quả thu được trong nghiên cứu này đã cho thấy các chủng tụ cầu khuẩn phân lập được có khả năng sản sinh biofilm ở mức độ mạnh – yếu khác nhau Chính lớp biofilm này đã giúp cho vi khuẩn đề kháng với nồng độ kháng sinh cao gấp 100 lần nồng độ MIC Do giới hạn của đề tài, chúng tôi chưa có điều kiện khảo sát giới hạn đề kháng với nồng độ kháng sinh lớn nhất với của vi khuẩn nằm trong lớp biofilm.