Bước đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn clotridium cố định nitơ trong đất trồng ngô ở xã hưng lợi hưng nguyên

Ngoài tác dụng trực tiếp là tăng năng suất, phân bón có tác dụng rấtlớn đến việc tạo ra nền đất thâm canh mà lâu nay ngời sử dụng ít chú ý tới.Những khiếm khuyết về chế độ dinh dỡng đất

Bộ giáo dục và đào tạo Trờng đại học vinh

Khoa Sinh học - -

Lê thị thu lan

Đề tài:

Bớc đầu nghiên cứu một số đặc điểm của vi khuẩn

hng lợi - hng nguyên - nghệ an

Luận văn tốt nghiệp

Chuyên ngành di truyền - vi sinh

Giáo viên hớng dẫn - GVC:Nguyễn Dơng Tuệ

Vinh - 2007

lời cảm ơn

Luận văn đợc thực hiện và đạt kết quả là nhờ vào phần nỗ lực, cố gắng, mệtmài, nghiêm túc trong công tác nghiên cứu khoa học của bản thân Cũng trong suốtquá trình thực hiện, tôi còn nhận đợc sự giúp đỡ của thầy cô giáo, của ngời thân vàbạn bè

Trớc hết tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ đãtận tình, chu đáo giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, phòngthí nghiệm Di truyền – Vi sinh – Phơng pháp, phòng thí nghiệm Hoá sinh trờng

Đại Học Vinh cùng tất cả bạn bè, ngời thân luôn giúp đỡ, động viên và tạo mọi điềukiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện

Đặc biệt, qua đây tôi xin chân thành cảm ơn nhân dân, cán bộ xóm 6- xã HngLợi đã tận tình giúp đỡ tôi để luận văn này đợc hoàn thành

Tuy có nhiều cố gắng, song bản thân đề tài này không thể tránh khỏi nhữngthiéu sót Tôi rất mong nhận đợc sự đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên: Lê Thị Thu Lan

Lớp:43E1 Sinh

mục lục

Mở Đầu……… 1

Đặt vấn đề ……… 1

Mục tiêu đề tài ……… … 3

Phần I: Tổng quan tài liệu ……… 4

I Định nghĩa phân bón ……… …… ……… … 4

II Phân bón vi sinh vật ………… ……… 5

III Tình hình nghiên cứu trong nớc ……… … 5

3.1 Tình hình nghiên cứu phân vi sinh ……… 6

3.2 ứng dụng thực tiễn của phân bón vi sinh học ở Việt Nam … 6 3.3 Tình hình nghiên cứu Clostridium pasteurianum ………… 7

IV Đặc điểm chung của vi khuẩn Clostridium pasteurianum …… 8

V Đặc điểm bào tử ……… 9

VI Vòng tuân hoàn nitơ trong t nhiên……… 9

VII Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử……… 11

Phần II: Đối tợng, nội dung, phơng pháp, địa điểm và thời gian nghiên cứu………15

I Đối tợng nghiên cứu ……… 15

II Thời gian nghiên cứu ……… 15

III Địa điểm và phơng pháp thu mẫu ……… 15

IV Phơng pháp nghiên cứu ……… 16

4.1 Phơng pháp phân tích một số chỉ tiêu nông hoá- thổ nhỡng……… 16

4.2 Phơng pháp nuôi cấy vi sinh vật ……… 17

4.3 Phơng pháp xác định vi sinh vật ……… 18

4.4 Phơng pháp phân lập ……… 18

4.5 Phơng pháp theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát

triển……… 19

4.6 Phơng pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Clostridium ……… 20

4.7 Một số phơng pháp khác ………20

4.8 Một số phơng pháp kiểm tra enzim……….21 4.9 phơng pháp xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng

chủng………22

4.10 phơng pháp xử lý số liệu………22

V Nghiên cứu các yếu tố ảnh hởng đến khả năng đồng hoá nitơ……… … 23

5.1 ảnh hởng của pH……… …… 23

5.2 ảnh hởng của nhiệt độ……… 23

5.3 ảnh hởng của độ ẩm……… 23

5.4 ảnh hởng của thời gian……… … 23

Phần III: Kết quả nghiên cứu ……… 25

I Một số đặc điểm của khu vực nghiên cứu ……… 25

II Kết qủa phân tích một số chỉ tiêu nông hoá ………… 25

II.1 Kết quả xác định pH ……… 25

II.2 Kết quả phân tích NH4+trong đất……… 27

III Kết quả định lợng vi khuẩn Clostridium trong mẫu đất……

IV Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Clostridium ………… … 29

V Đặc điểm khuẩn lạc ……… … 31

VI Kết quả khẳng định vi khuẩn Clostridium……… … .32

6.1 Kết quả khi nuôi ống thạch sâu……… 32

6.2 Thử nghiệm trong môi trờng lỏng ……… … 33

6.3 Thử hoạt tính của catalaza ……… 33

VII Sinh trởng của các chủng đã chọn……….33

VIII Khả năng cố định nitơ phân tử của các chủng …………35

IX Xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng chủng…… 36

X Các yếu tố ảnh hởng đến sự cố định nitơ phân tử …….37

X.1 ảnh hởng của pH ……… ……… 38

X.2 ảnh hởng của nhiệt độ ……… 39

X.3 ảnh hởng của độ ẩm ……… ……… .41

X.4 ảnh hởng của thời gian ……… ……… 42

XI Số lợng vi khuẩn cần sử dụng ……… … 44 - 45 kết luận và kiến nghị I Kết luận ……… 46

II Kiến nghị ……… 48

Tài liệu tham khảo……… ….49 - 50

Phần I: Tổng quan tài liệu

I Định nghĩa phân bón:

Các chất đa vào đất có tác dụng trực tiếp cải thiện dinh dỡng của thựcvật và cải thiện tính chất của đất- gọi là phân bón Phân bón đợc chia làmhai nhóm:

- Nhóm phân khoáng không chứa chất hữu cơ, bao gồm: phân nitơ,phôtphat, Kali, Magiê, phân hỗn hợp, phân Bo, phân Molipđen

- Phân hữu cơ gồm: phân chuồng, phân than bùn, phân xanh, phânrác

Ngoài ra còn có phân vi sinh đã bớc đầu đợc sử dụng để tăng cờng cácquá trình sinh học trong đất và góp phần bảo vệ môi trờng

Ngoài tác dụng trực tiếp là tăng năng suất, phân bón có tác dụng rấtlớn đến việc tạo ra nền đất thâm canh mà lâu nay ngời sử dụng ít chú ý tới.Những khiếm khuyết về chế độ dinh dỡng đất không thể bổ cứu đợc nếu chỉbiết đầu t lao động mà còn phải đầu t vật chất thông qua bón phân để nângcao dự trữ dinh dỡng và mức dễ tiêu của các nguyên tố

Nhiều nghiên cứu đã khẳng định: Năng suất cây trồng càng cao, lợngdinh dỡng cây lấy đi càng nhiều và nhu cầu phân bón càng lớn

Tuy nhiên, việc sử dụng phân bón hoá học gây nguy cơ ô nhiễm môitrờng, làm giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịchbệnh, ảnh hởng không tốt đến chất lợng nông sản và cũng là nguyên nhântất yếu dẫn đến thoái hoá đất canh tác Tồn d của các sản phẩm hoá họcnàyđã và đang tích luỹ trong hệ sinh thái và trở thành mối đe doạ nghiêmtrọng đối với sức khoẻ con ngời và môi sinh

Chẳng hạn nh: phân chuồng và phân bắc không hợp vệ sinh gây ranhiều bệnh về đờng hô hấp, tiêu hoá,…ảnh hởng đến sức khoẻ cộng đồng Phân vô cơ thuộc nhóm chua sinh lý: K2SO4, (NH4)2SO4, Supe lân còntồn d axit đã làm chua hoá đất, dẫn đến làm nghèo kiệt các ion bazơ và làmxuất hiện nhiều chất độc mà chủ yếu là: Al3+, Fe2+, Mn2+ di động có hại chocây, làm giảm hoạt tính sinh lý của đất

Ngoài ra bón nhiều đạm và bón muộn phân đạm cho rau quả cũnglàm tăng đáng kể hàm lợng NO3- trong cây cũng nh sẽ hại đến sức khoẻ conngời

Do đó việc sử dụng phân bón vi sinh vật có tác dụng nâng cao năngsuất và chất lợng nông sản, giảm chi phí, tiết kiệm phân bón vô cơ và gópphần quan trọng trong bảo vệ môi trờng, xây dựng nền nông nghiệp sạchbền vững [2].

II Phân bón vi sinh vật:

Phân bón vi sinh vật là phân bón chứa một hoặc nhiều chủng vi sinhvật sống, hữu hiệu đã đợc tuyển chọn mà hoạt động của chúng có tác dụngtạo ra trong đất trồng các chất dinh dỡng hoặc các chất sinh học có tác dụngnâng cao năng suất cây trồng, chất lợng nông sản hoặc cải tạo đất Phân bón

vi sinh vật này không gây ra ảnh hởng xấu đến con ngời, vật nuôi và môi ờng sinh thái [17]

Các loại phân bón vi sinh có thể kể đến là phân vi sinh vật cố địnhnitơ- đạm sinh học Và trong đề tài này hớng tới khả năng ứng dụng phân

bón vi sinh cố định nitơ phân tử đơn chủng với loài vi khuẩn Clostridium

pasteurianum.

III Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nớc:

3.1 Tình hình nghiên cứu phân vi sinh:

Năm 1895-1900 tại Anh, Mỹ, Balan và Nga bắt đầu sản xuất chếphẩm vi sinh vật cố định nitơ phân tử [17]

Năm 1964 vấn đề cố định nitơ phân tử đợc coi là một trong hai vấn đềquan trọng của chơng trình sinh học quốc tế [17]

Hiện nay vấn đề nghiên cứu tạo các chế phẩm vi sinh đơn chủng và

đa chủng (tổng hợp) đang đợc xã hội đặc biệt quan tâm đối với các nhànông nghiệp, nhà vi sinh

ở Việt Nam, phân vi sinh cố định đạm đã đợc nghiên cứu từ nhữngbớc đầu năm 60 Nhng phải gần 30 năm sau, nghĩa là tới năm 1987 thì mới

có quy trình sản xuất hoàn thiện

Từ năm 1991, mời đơn vị trong toàn quốc đã tập trung phân vi sinhvật cố định đạm cho các loại cây trồng khác nhau

Hai đơn vị đi đầu trong công tác nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinhvật là: Viện công nghệ sinh học(Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệquốc gia) và Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam- Bộ nôngnghiệp và phát triển nông thôn [16]

3.2 ứng dụng thực tiễn của phân bón vi sinh học ở Việt Nam:

Nớc ta là nớc nông nghiệp, do đó nhu cầu phân bón là rất lớn, cùngvới việc sử dụng phân bón hoá học thì phân bón sinh học cũng đã bớc đầu

đợc đa vào ứng dụng trong nền nông nghiệp nớc ta Phân bón vi sinh khôngnhững góp phần tăng năng suất cây trồng mà còn góp phần bảo vệ môi tr-ờng

Năm 1980 trờng đại học Cần Thơ đã thử nghiệm và sản xuất thànhcông chế phẩm Vidana cho cây bộ đậu Viện khoa học kỹ thuật Việt Nam

và trờng đại học Nông Nghiệp I cũng đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩmNitragin cho cây đậu tơng và cây lạc tại một số tỉnh miền Bắc và đồng bằngsông Hồng thu đợc kết quả tốt.[16]

Quá trình sản xuất phân vi sinh cố định nitơ trên nền chất mangkhông khử trùng đã đợc ứng dụng(1999) do xí nghiệp phân vi sinh Sơn Tây-Công ty phân bón Pháp Vân- Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn sảnxuất, đã làm tăng năng suất lúa 12,02%-19,5%; ngô tăng 10,2%-1097%;chè tăng 26,7%; lạc tăng 23,7%; …đồng thời có thể giảm bớt 30% phânNPK đối với chè, 20% phân NPK đối với lúa, 50% lân đối với lạc vẫn đảmbảo năng suất.[16]

Chế phẩm Vidafo dùng nhiễm khuẩn cho lạc của Viện khoa học kỹthuật Nông Nghiệp miền Nam và đồng bằng sông Cửu Long đã làm tăngnăng suất lạc 13,8%- 17,5% ở miền Bắc và miền Trung; tăng 22% ở miềnNam.[16]

Và với chế phẩm đơn chủng, đặc biệt với Clostridium pasteurianum

hiện nay vẫn đang là một con đờng mở cho các nhà nghiên cứu khoa họcsinh học, những nhà nông nghiệp

3.3 Tình hình nghiên cứu Clostridium pasteurianum:

Năm 1893 lần đầu tiên X.N Vinogradxki phát hiện đợc một loài vikhuẩn kỵ khí sống tự do có khả năng cố định nitơ phân tử Đó là loài

Clostridium pasteurianum.[7].

Hiện nay ngoài loài Clostridium pasteurianum ngời ta còn phân lập thấy có nhiều loài Clostridium khác cũng có khả năng cố định nitơ phân tử.

Đó là các loài: C.butyrium, C.butylicum, C.beiferinkia, C.aceticum, …

Đã có rất nhiều chế phẩm thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium

pasteurianum để bón cho cây trồng Trong một số đã thu đợc những hiệu

quả dơng tính khá rõ rệt Tuy nhiên, hiệu quả nay không ổn định và cho đến

nay ngời ta vẫn cha giải thích đợc một cách dứt khoát là trong các trờng hợp

có tác dụng dơng tính thì chủ yếu là do sự cố định nitơ hoặc là do sự tíchluỹ các chất có hoạt tính sinh học.[7]

IV Đặc điểm chung của vi khuẩn Clostridium pasteurianum:

Vi khuẩn Clostridium pasteurianum là vi khuẩn gram dơng hình que,

kỵ khí, sinh bào tử

Tế bào của Clostridium pasteurianum có kích thớc khoảng 2,5 - 7,5 x

0,7 - 1,3àm Có thể đứng riêng rẽ, xếp thành đôi hay xếp thành chuỗi ngắn.Khi còn non có tế bào chất đồng đều, có khả năng di động Khi già, tế bàochất có cấu tạo hạt, tế bào mất khả năng di động Bào tử thờng có hình bầudục hay hình kéo dài nằm ở giữa hay gần một đầu của tế bào Bào tử có kíchthớc lớn hơn bề rộng của tế bào dinh dỡng do đó khi mang bào tử tế bào th-ờng có hình thoi Kích thớc bào tử ≈1,3- 1,6àm

Vi khuẩn này có thể phát triển trong phạm vi pH khá rộng: pH =4,7 - 8,5 pH thích hợp nhất đối với sự phát triển của nó là: 5,9 - 8,3 hoặc6,9 - 7,3 Nói chung mỗi (g) đất trồng trên miền Bắc nớc ta, số lợng vikhuẩn này có từ hàng vạn đến hàng triệu tế bào Số lợng của chúng ở trongvùng rễ cây trồng bao giờ cũng nhiều hơn ngoài vùng rễ Thờng tập trungnhiều trong lớp đất cày nhng ngay ở độ sâu 75cm vẫn có thể thấy có hàngnghìn tế bào trong mỗi gam đất

Bào tử của vi khuẩn Clostridium pasteurianum có sức đề kháng cao

đối với nhiệt độ cao và sự khô hạn Bào tử của loài vi khuẩn này có thể sống

đợc 5 giờ ở nhiệt độ 75 C và 1 giờ ở nhiệt độ 80 C [7].°C và 1 giờ ở nhiệt độ 80°C [7] °C và 1 giờ ở nhiệt độ 80°C [7]

Clostridium pasteurianum phát triển thích hợp trong những mặt đất

có độ ẩm vào ≈ 60 - 80% so với độ ẩm tuyệt đối Chúng phát triển nhiềutrong lớp đất cày ở đó có các chất hữu cơ phong phú Chúng phát triển tốtnhất ở nhiệt độ: 25 C - 30 C [3].°C và 1 giờ ở nhiệt độ 80°C [7] °C và 1 giờ ở nhiệt độ 80°C [7]

V Đặc điểm bào tử:

Bào tử (nội bào tử) vi khuẩn không làm chức năng sinh sôi nảy nở nhbào tử của nấm mà đó là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, bào tử có thểchống chịu cao hơn nhiều so với tế bào dinh dỡng đối với các điều kiện bất

lợi về nhiệt độ, độ ẩm, pH, thiếu thức ăn, hoặc đối với sự có mặt của các hoáchất độc, các bức xạ,…

Bào tử có nhiều lớp màng khác nhau bao bọc Màng bào tử có tácdụng làm tăng cờng khả năng bảo vệ của bào tử đối với các điều kiện vật lýbất lợi và sự phá huỷ của enzim

Tác giả Kraxinhicôp (1958) cho rằng: Việc hình thành bào tử là mộthình thức nhằm đổi mới tế bào và nâng cao sức sống của tế bào vi khuẩn.Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tếbào mới Quá trình này kéo dài vài tiếng nhng có khi chỉ khoảng 40 - 50phút [3]

VI Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên:

Nitơ là nguyên tố dinh dỡng quan trọng đối với sinh vật trên mặt đất

Dự trữ của nitơ trong tự nhiên rất lớn Nitơ phân tử chiếm 78,16% thể tíchcủa không khí Trong bầu không khí bao quanh trái đất có tới ≈ 4.1015 tấnnitơ Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng có khoảng 10 - 25.109

tấn Trong các vật trầm tích có khoảng 4.1015 tỷ tấn nitơ [4]

Cây không đồng hoá đợc trực tiếp nitơ hữu cơ Nhờ quá trình phângiải của vi sinh vật, từ các hợp chất cha nitơ giải phóng ra NH3, một nguồnthức ăn rất tốt đối với thực vật Quá trình phân giải này đợc gọi là quá trìnhamôn hoá

Nếu trong đất có đầy đủ oxi thì NH3 sinh ra tiếp tục đợc vi sinh vậtchuyển hoá thành nitrat (qua giai đoạn nitrit trung gian) Quá trình này đợcgọi là quá trình nitrat hoá Nitrat là loại hợp chất nitơ đợc thực vật hấp thụrất dễ dàng nhng cũng rất dễ bị rửa trôi xuống các lớp đất sâu hơn

Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phản nitrat do vi sinh vậtgây nên, nhng cũng có quá trình nitrat hoá thuần tuý là các phản ứng hoáhọc Sau quá trình này nitrat sẽ chuyển thành nitơ phân tử bay vào khôngkhí [3]

Và vì sao lợng phân đạm hoá học sản xuất ra trên toàn thế giới chỉ

đáp ứng đủ khoảng 30 - 40% nhu cầu về đạm mà vẫn có mùa màng tơi tốt

và đất vẫn giữ đợc độ phì nhiêu suốt từ đời này qua đời khác? Phải chăng,

đó là do cây trồng đã lấy đợc nitơ từ các chất dự trữ trong đất? Không thể

nh vậy đợc vì qua hàng năm canh tác không có loại đất nào còn có dự trữnitơ nếu không đợc bổ sung hàng năm.[6]

Các nhà khoa học cho biết ngoài việc bổ sung nitơ thông qua phân hoá học và phân hữu cơ còn có một lợng nitơ rất lớn hàng năm đợc đa vào

đất nhờ hoạt động cố định nitơ của các nhóm vi sinh vật sống cộng sinh và sống tự do trong đất.[6]

Và quá trình cố định nitơ này đã bù đắp lại sự mất mát nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên Đó chính là vai trò của vi sinh vật trong chu trình chuyển hoá nitơ tự nhiên:

Protêin

Vi sinh vật

Prôtêin

Động vật

Prôtêin Thực vật

NH

3

Nitơ phân

tử

(N

2)

NO

3

Nh vậy vi sinh vật tham gia trong tất cả các quá trình amôn hoá, nitrathoá, phản nitrat hoá, tạo nên chu trình chuyển hoá nitơ trong tự nhiên

VII Cơ chế của quá trình cố định nitơ phân tử:

Quá trình sinh học của cố định nitơ là phức tạp và tiêu thụ một lợnglớn các phân tử ATP bởi vì các enzim liên quan đến nó phải khắc phục sựcản trở năng lợng hoạt hoá to lớn, cái mà đối phó với sự tổng hợp amoniac

Ngay từ năm 1934 Viện sĩ Liên Xô A.N.Bakhơ đã viết: “chúng ta hivọng rằng bằng con đờng nghiên cứu về lý thuyết của tác dụng của các chấtxúc tác oxi hoá khử sinh học đã gây nên sự liên kết nitơ trong không khínhờ vi sinh vật mà chúng ta có thể biết rõ đợc những điều kiện thích hợpnhất cần thiết để tổng hợp ra amoniac công nghiệp” [7]

Hai enzim tham gia vào quá trình này là nitrogenaza vànitrogenredutaza Nitrogenaza là một phức hệ enzim có hai thành phần mẫmcảm với oxi, đó là hai prôtêin có phân tử nhỏ Một thành phần gọi là prôtêinsắt, hay còn gọi là nitrogenaza khử hay thành phần II, một thành phần khácgọi là prôtêin kim loại có sắt- molibđen còn gọi là thành phần I Thành phần

hai đợc nghiên cứu ở Clostridium pasteurianum gồm hai tiểu

phần(subunits) đồng nhất, mỗi tiểu phần có khối lợng phân tử là 29000dalton(Da) ở giữa có một trung tâm chứa 4 nguyên tử sắt và 4 nguyên tử lu

huỳnh không ổn định với axit Thành phần I(Mo- Fe prôtêin) ở Clostridium

pasteurianum phức tạp hơn, có khối lợng phân tử chung là 220000 Da gồm

2 nguyên tử Mo, khoảng 30 nguyên tử sắt và nhiều nguyên tử S không ổn

định với axit Chúng cấu tạo bởi 4 tiểu phần, gồm 2 loại, một loại có khối ợng phân tử là 50000 Da và một loại có khối lợng phân tử là 60000 Da Mỗiloại gồm 2 tiểu phần [7]

l-Nitrogennaza xúc tác để chuyển N2 thành NH3 đòi hỏi sự tổng hợpcủa thành phần I, thành phần II, hợp chất Mg và ATP đợc thể hiện qua phảnứng sau:

Nitrogenaza

NO

2

N2 + 8H+ + 8e- + 16Mg ATP NH3 + N2↑ + 16Mg ATP+ 16Pi

Nitrogenaza ở 0 C dễ mất hoạt tính hơn so với nhiệt độ th°C và 1 giờ ở nhiệt độ 80°C [7] ờng Nhng

ở điều kiện kỵ khí(trong điều kiện lạnh sâu) thì nitrogenaza lại có thể giữ

Sự ngng kết nitrogenaza là có tính khử cao trong tự nhiên và quá trình

bị kiềm hãm bởi oxi vì cả dinitrogenaza và đặc biệt sự khử dinitrogenaza bịlàm mất hoạt tính nhanh chóng và không thuận nghịch bởi O2 [3]

Và sở dĩ trong điều kiện yếm khí mà sự cố định nitơ vẫn đợc thựchiện là nhờ các vi khuẩn khử nitrat(NO3-) nh Clostridium pasteurianum theo

Hydrogenaza Feredoxin Nitrogenaza

(khử) (khử)

Nitrogenaza Hydrogenaza Feredoxin Nitrogenaza ( hoạt động)

(oxi hoá) (oxi hoá) N 2

NH3

Và quá trình đó đợc lấy năng lợng từ axetylphotphat( CH3 – COO ~ CP) trong các phản ứng phân giải hợp chất hữu cơ

Phần II: Đối tợng, nội dung, phơng pháp, địa

Điểm và thời gian nghiên cứu:

I Đối tợng nghiên cứu:

Đối tợng nghiên cứu của đề tài này là vi khuẩn Clostridium có trong

đất trồng ngô thuộc xã Hng Lợi - Hng Nguyên - Nghệ An

II Thời gian nghiên cứu:

- Thời gian thu mẫu: Chúng tôi đã thu mẫu hai đợt vào ngày10/09/2006 và 10/10/2006

- Thời gian thu thập số liệu: Từ tháng 9/2006 đến tháng 12/2006

- Thời gian xử lý số liệu và hoàn thành báo cáo: Từ tháng 01/2007

đến tháng 04/2007

III Địa điểm và phơng pháp thu mẫu:

Địa điểm nghiên cứu của đề tài là vùng đất trồng ngô ven Sông Lamthuộc xóm 6 – xã Hng Lợi – Hng Nguyên – Nghệ An

Căn cứ vào kết quả thực địa, chúng tôi đã xác định thu mẫu tại 2 vùng

đất khác nhau(2 chân ruộng) của nhà ông: Ngô văn Chín Mỗi vùng lấy tại 5

Mỗi điểm lấy khoảng 100(g) đất: Dùng dao đã khử trùng qua cồn và

đựng trong các túi polyetylen sạch, ghi nhãn ở từng vùng.[18]

Đa về phòng thí nghiệm, trộn đều cả 5 điểm / ở 1 vùng trong khay,phơi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Sau đó dùng để phân tích

IV Phơng pháp nghiên cứu:

4.1 Phơng pháp phân tích một số chỉ tiêu nông hoá - thổ nhỡng:

4.1.1 Thành phần cơ giới của đất:

Thành phần cơ giới của dất đợc xác định bằng phơng pháp vê tay và sosánh theo tài liệu của viện nông hoá thổ nhỡng(1976).[23]

4.1.2 pH: Đo bằng máy pH meter:

Phơng pháp: Cần 10(g) đất (đã trộn đều qua rây 1mm) cho vào bìnhtam giác 250 ml sau đó thêm vào 25 ml KCl 1N, lắc trong 15 phút trên máylắc Để lắng 2h, lắc 2 – 3 lần rồi đo pH ngay trong dung dịch huyền phù.

Đo mẫu: Trong bình thuỷ tinh chứa dung dịch huyền phù (250ml) cho

điện cực ngập trong dung dịch huyền phù, cho đến giá trị ổn định, ghi giá trịhiển thị pH trên máy.[15]

4.1.3 Xác định Nitơamôn bằng phơng pháp đo màu quang phổ trên máy

đo màu quang phổ (Mỹ) theo Kjeldahl – Nessler cải tiến: [15]

Cơ sở của phơng pháp: Trong môi trờng kiềm amôn phản ứng vớithuốc thử Nessler có ion kép Na-K-Tactrat không gây Kết tủa mà tạo phứcidomecuramon có màu đỏ gạch:

Cân 10g đất cho vào trong 5 bình tam giác 250ml ( 1bình/ 10g đất).Phân tích theo trình tự trên từ ngày đầu đến ngày thứ năm tơng tự với từngbình

K: Hệ số chuyển đất tơi sang đất khô kiệt(hệ số đất khô kiệt)

4.2 Phơng pháp nuôi cấy vi sinh vật:

Vi sinh vất đợc nuôi trong môi trờng Vinograxki I.[6], gồm:

(NH4)2SO4 : 2(g) MgSO4 : 0.5(g)

NaCl : 2(g) Agar : 20(g)

K2HPO4 : 1(g) H2O : 1 lit

FeSO4 : 0.1(g) thanh trùng ở 1 atm, trong 30 phút

Vi sinh vật đợc nuôi trong môi trờng thạch với thành phần nh trên và

để sinh trởng – phát triển tốt, đem phân lập

Dùng trong thuỷ tinh dàn đều huyền phù Vi sinh vật trên mặt thạch saukhi môi trờng thạch đã đợc đổ vào các đĩa Petri Sau đó đặt vào tủ ấm ở

300C trong 3 – 7 ngày khuẩn lạc xuất hiện

4.3 Phơng pháp xác định số lợng vi sinh vật ( theo phơng pháp CFU):

Làm môi trờng thạch đĩa Petri:

Số lợng tế bào sống đợc xác định bằng phơng pháp thông dụng là cấy

Vi sinh vật trên đĩa petri và phơng pháp pha loãng [16]

Từ dung dịch huyền phù đợc pha loãng thập phân 10-1 10-2, 10-3, 10-4,

10-5 Cấy ở nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 vào môi trờng thạch đĩa vô trùng pH = 7.Nuôi đến lúc hình thành khuẩn lạc 4 – 7 ngày ở 300C trong t ấm.Kết quả:

- Đếm các khuẩn lạc ( máy đếm hoặc bằng mắt)

ni: Số lợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích dịch mẫu (1 ml) cấy vào trong mỗi đĩa

fi: Độ pha loãng tơng ứng

4.4 Phơng pháp phân lập:

Dựa vào đặc điểm của Clostridium pasteurianum có bào tử, dịch huyền

phù của mẫu phân lập đợc xử lý nhiệt ở 60 -700C trong thời gian 30 phút,sau đó nuôi cấy trên môi trờng thạch

Thí nghiệm đợc lập lại hai lần liên tiếp Để khẳng định chúng là

clostridium pasteurianum, quan sáy bào tử bằng phơng pháp nhộm bào tử

theo phơng pháp Zichl(hoặc do Muller cải tiến).[12]

Chọn các khuẩn lạc có đặc điểm hình thái khác nhau, đứng riêng rẽ,cùng thời gian mọc Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc đó cấy vào ốngthạch nghiêng(đã khử trùng) Nuôi ở nhiệt đọ phòng(20 – 300C)

Sau thời gian nuôi cần kiểm tra lại độ thuần chủng của giống đã mọctrong từng ống nghiệm bằng cách dùng phơng pháp cấy ria nh sau: Que cấyvô trùng chạm nhẹ một lần trên môi trờng thạch nghiêng hoặc môi trờnglỏng Cấy ricrac vuông góc lên mặt thạch của hộp petri Sau đó chọn khuẩnlạc mọc tốt nhất đem cấy vào ống nghiệm chứa môi trờng lỏng.[13]

4.5 Phơng pháp theo dõi các chỉ tiêu sinh trởng và phát triển:

4.5.1 Thời gian xuất hiện:

Sau khi cấy huyền phù vi sinh vật vào các đĩa thạch petri(cấy ở nồng

độ: 10-3, 10-4, 10-5, mỗi nồng độ 2 đĩa) Theo dõi thời gian xuất hiện của cáckhuẩn lạc trên đĩa thạch

4.5.2 Theo dõi sự sinh trởng:

Để nguyên petri, đo kích thớc (mm) khuẩn lạc bằng Micromet hiệnsố(thớc palme) Từ đó tính sinh trởng theo Blachmem(1981):

4.5.3 Tìm hiểu đặc điểm của khuẩn lạc:

Khi các khuẩn lạc xuất hiện tìm hiểu các đặc điểm của khuẩn lạc về:màu sắc, hình dáng, bề mặt, cấu trúc, bờ khuẩn lạc

4.6 Phơng pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn Clostridium:

Những khuẩn lạc có cùng đặc điểm mô tả, cùng thời gian xuất hiệnchúng ta có thể phân biệt trên đĩa thạch đợc xem là một chủng Và lựa chọnmột khuẩn lạc điển hình cấy ria sang đĩa môi trờng mới

Tiếp tục lựa chọn khuẩn lạc có đặc điểm mô tả giống ban đầu để cấyvào môi trờng lỏng Vinograxki I – ống nghiệm đợc nuôi 5 ngày trong điềukiện thờng ở nhiệt độ phòng để cho vi sinh vật sinh trởng và phát triển tối đa

và môi trờng cạn hết dinh dỡng Trong điều kiện khó khăn, nếu là

Clostridium pasteuanum thì chúng sẽ sinh bào tử Để khẳng định chúng là Clostridium pasteurianum quan sát bào tử bằng phơng pháp nhuộm bào tử.

Sau đó dùng que cấy lên một ít dịch nuôi cây, cấy ria lên đĩa thạch.Lựa chọn khuẩn lạc có đặc điểm giống với mô tả ban đầu, tiếp tục cấy ria 1– 2 lần để làm sạch, đồng thời quan sát bào tử dới kính hiển vi với khuẩnlạc đã mọc đợc 4 – 5 ngày

Chủng Clostridium pasteurianum đó đợc xem là sạch(thuần khiết) nêu

nh đặc điểm của các khuẩn lạc giống nhau, hình thái tế bào giống nhau và

đại đa số đều có bào tử sau 4 – 5 ngày hình thái khuẩn lạc Giống

Clostridium pasteurianum đợc bảo quản trên ống thạch nghiêng ở 4 – 50Ctrong tủ lạnh

4.7 Một số phơng pháp khác để khẳng định là vi khuẩn kỵ khí:

4.7.1 Dùng môi trờng thạch sâu (thạch đứng):

Sau khi đã tách đợc các chủng thuần khiết (sạch), cấy các chủng đóvào các ống thạch sâu

Dùng que cấy nhọn, đâm sâu vào giữa ống thạch cho đến gần đáy rồirút nhanh ra, ống để đứng

Rồi quan sát sự phát triển của vi khuẩn Clostridium pasteurianum theo

vết cấy đâm sâu.[20]

4.7.2 Phơng pháp cấy vào môi trờng lỏng:

Các chủng thuần khiết đợc cấy vào môi trờng lỏng đã đợc đổ vào cácống nghiệm và khử trùng Nếu chủng nào mà phát triển dới đáy ốngnghiệm thì đó là vi khuẩn kỵ khí Còn nếu phát triển trên bề mặt môi trờnglỏng thì sẽ bị loại bỏ (đó là loại hiếu khí)

4.8 Một số phơng pháp kiểm tra enzim để khẳng định:

Dựa trên nguyên lý 1 gen – 1 men(enzim) ở đây cần phảI kiểm tracác enzim bằng các phơng pháp sau:

4.8.1 Phơng pháp thử hoạt tính phản ứng Catalaza.[11]:

+ Nếu phản ứng dơng tính sủi bọt thì đó là loài hiếu khí.

+ Nếu phản ứng âm tính không sủi bọt thì đó là loài kỵ khí

Chủng xuất hiện màu vàng cam là chủng có khả năng cố định nitơ

4.9 Phơng pháp xác định khả năng đồng hoá nitơ của từng chủng:

Nuôi các chủng trong môi trờng lỏng Lấy 5ml môi trờng lỏng đã đợckhử trùng vào mỗi ống nghiệm + 4ml H2O cất + 1ml Nessler Cho vàoCuvet để đo màu Theo dõi liên tục từ 3 – 7 ngày, đo phổ ở bớc sóng λ =

Xi: Giá trị thứ i của dãy biến số

N: Số lần xuất hiện dãy biến số

Độ lệch chuẩn:

n

X x

n i i



Với:

n: Số lần thực hiện

X