Sốt xuất huyết là bệnh truyền nhiễm cấp tính, do muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus truyền virus dengue gây ra. Bài viết trình bày việc tìm ra hợp chất tự nhiên gắn kết tốt từ đó có thể ức chế NS5 MTase của virus dengue.
Trang 1KHÁM PHÁ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN ỨC CHẾ NS5 METHYLTRANSFERASE
CỦA VIRUS DENGUE DỰA TRÊN TIẾP CẬN IN SILICO
Nguyễn Lê Trà Giang 1 , Cù Thái Phương Nga 1 , Phạm Thị Mỹ Duyên 1 ,
Trương Bách Thịnh 1 , Nguyễn Thụy Việt Phương 1
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Sốt xuất huyết là bệnh truyền nhiễm cấp tính, do muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus
truyền virus dengue gây ra Trên thế giới có khoảng 400 triệu người nhiễm sốt xuất huyết mỗi năm với khoảng 22.000 người chết trong trường hợp nặng Tuy nhiên, hiện nay chưa có thuốc điều trị bệnh sốt xuất huyết Do
đó, việc tìm ra hợp chất tiềm năng gắn tốt với NS5 methyltransferase (MTase), dẫn đến ức chế protein này là một
trong những cách tiếp cận của việc nghiên cứu thuốc để điều trị bệnh sốt xuất huyết
Mục tiêu: Tìm ra hợp chất tự nhiên gắn kết tốt từ đó có thể ức chế NS5 MTase của virus dengue
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phương pháp in silico sử dụng là gắn kết phân tử (molecular
docking) thực hiện trên 100 chất tự nhiên từ 10 loại dược liệu trên NS5 MTase của virus dengue (PDB ID: 4R8S) với phần mềm AutoDock Vina
Kết quả: 100 chất khảo sát gắn kết thành công vào khoang gắn của NS5 MTase Hai khung cấu trúc có khả
năng gắn kết tốt là khung steroid và khung flavonoid với hai đại diện lần lượt là ligand A25 (ecliptalbin) và A29 (myricetin) Trong đó, ecliptalbin là chất tiềm năng nhất trên NS5 MTase với ái lực gắn kết là -10,3 kcal.mol -1
Kết luận: Nghiên cứu cho thấy tiềm năng ức chế của ecliptalbin trên NS5 MTase của virus dengue
Từ khóa: virus dengue, NS5 methyltransferase, in silico, gắn kết phân tử, hợp chất tự nhiên
ABSTRACT
DISCOVERY OF NATURAL COMPOUNDS AS NS5 METHYLTRANSFERASE INHIBITORS
OF DENGUE VIRUS THROUGH IN SILICO APPROACH
Nguyen Le Tra Giang, Cu Thai Phuong Nga, Pham Thi My Duyen,
Truong Bach Thinh, Nguyen Thuy Viet Phuong
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No 2 - 2021: 32 - 39
Background - Objectives: Dengue fever is an acute infectious disease caused by the transmission of dengue
virus through the bite of mosquitoes, Aedes aegypti and Aedes albopictus, respectively There are about 400 million infected people every year resulted in 22,000 deaths from severe cases However, there is currently no effective drugs for the treatment of dengue virus Therefore, finding potential binding compound into NS5 RNA MTase leading to inhibit this protein is one of approaches for antidengue drug discovery This reseach aimed to discover potential binding natural compounds as NS5 MTase inhibitors of dengue virus
Methods: Molecular docking as in silico approach was carried out for 100 natural compounds on NS5 RNA
MTase (PDB ID: 4R8S) of dengue virus using AutoDock Vina program
Results: The results showed that 100 natural compounds were successfully fitted well into the binding site of
NS5 MTase The two scaffolds had good binding affinities were steroid and flavonoid groups with two top hit compounds A25 (ecliptalbine) and A29 (myricetine), respectively Of which, A25 (ecliptalbine) was the best binding ligand with its binding affinity of -10.3 kcal.mol -1
1 Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Thụy Việt Phương ĐT: 0919520708 Email: ntvphuong@ump.edu.vn
Trang 2Conclusion: Through molecular docking, ecliptalbine was identified as the potential inhibitor of the NS5
MTase of dengue virus
Keywords: dengue virus, NS5 methyltransferase, in silico, molecular docking, natural compounds
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay có khoảng 400 triệu người nhiễm
sốt xuất huyết mỗi năm với khoảng 22.000 người
chết trong những trường hợp nặng(1) Theo báo
cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) vào năm
2019, Việt Nam là nước đứng thứ 2 Châu Á, sau
Phillippines về số lượng người mắc bệnh với
tổng cộng 320.000 ca sốt xuất huyết(2) Cho đến
nay vẫn chưa có thuốc hiệu quả để điều trị bệnh
sốt xuất huyết do virus dengue gây ra Do đó
việc nghiên cứu các hợp chất tiềm năng có thể
phát triển thành thuốc, đặc biệt là các thuốc cho
tác động trên cấu trúc của virus và một số
protein liên quan tới quá trình phát triển, nhân
đôi của virus như NS5 methyltransferase, NS5
ARN polymerase phụ thuộc ARN (NS5 RNA
dependent RNA-polymerase) là cần thiết
Cấu trúc của virus dengue dưới kính hiển vi
có dạng hình cầu, với đường kính khoảng 35-50
nm, gồm có: phần vỏ bản chất là lipoprotein,
protein màng, nắp capsid đối xứng hình khối, và
vật liệu di truyền là ARN dạng sợi dương NS5
là protein lớn nhất trong vùng không cấu trúc
với khoảng 900 acid amin có khối lượng phân tử
khoảng 104 kDa NS5 chứa methyltransferase
(MTase), guanylyltransferase (GTase) ở đầu N
và ARN polymerase phụ thuộc ARN ở đầu C(3)
Trong đó, NS5 MTase đóng vai trò quan trọng
trong quá trình nhân đôi và dịch mã của virus(3)
Do đó ức chế protein này sẽ dẫn đến ức chế quá
trình phát triển của virus
Trên thế giới, một số nghiên cứu đã được
thực hiện để tìm ra hợp chất tiềm năng có thể
gắn kết và ức chế enzym NS5 MTase Tiêu biểu
như Lata V Ganji và cộng sự (2019) đã nhận
thấy rằng việc sử dụng các hợp chất có khung
flavonoid như avicularin, rutin, quercetin cho
hiệu quả tác động tốt trên NS5 MTase với IC50
dao động từ 1,7 – 3,6 µM(4) Một nghiên cứu
khác, Fatiha Benmansour và cộng sự (2016) đã
sử dụng kỹ thuật in silico để tìm ra hợp chất có
tác dụng ức chế NS5 MTase và kết quả là thu được hợp chất ức chế non-nucleosid mới là N-phenyl-[(phenylcarbamoyl)amino]benzene-1-sulfonamid và một hợp chất dẫn xuất khác
là [(phenylcarbamoyl)amino]benzen-1-sulfonat cho kết quả ức chế mạnh NS5 MTase từ 10 đến 100 lần(5) Ngoài ra vào năm 2009, Michael Podvinec và cộng sự đã sử dụng phương pháp gắn kết phân tử để sàng lọc hơn
5 triệu chất và chọn ra 263 chất để tiến hành thực nghiệm thì nhận thấy rằng có 10 chất ức chế cho kết quả IC50 < 100µM và trong đó có
4 chất cho kết quả IC50 < 10µM(6)
Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này là tìm
ra được các hợp chất tự nhiên có khả năng gắn kết tốt với NS5 MTase, từ đó dẫn đến ức chế protein này để có thể phát triển thành thuốc chống virus dengue Quá trình được
thực hiện dựa trên tiếp cận in silico (với sự hỗ
trợ của máy tính) thông qua khảo sát khả năng gắn kết phân tử (molecular docking) của các hợp chất tự nhiên trên protein mục tiêu NS5 MTase để chọn lựa chất tiềm năng gắn kết tốt trên NS5 MTase
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đích tác động
NS5 MTase của virus dengue chủng dengue 3 với mã PDB ID: 4R8S tải về từ ngân hàng dữ liệu Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)
Ligand
100 hợp chất tự nhiên (ký hiệu từ A1 đến A100) là thành phần hóa học của 10 cây thuốc có tác dụng kháng virus gồm có: 13 hợp chất từ tỏi,
14 hợp chất từ cỏ mực, 23 hợp chất từ đu đủ,
4 hợp chất từ xuyên tâm liên, 1 hợp chất từ keo giậu, 6 hợp chất từ sầu đâu, 2 hợp chất từ rau diếp cá, 28 hợp chất từ nga truật, 7 hợp chất từ
cỏ sữa lá lớn và 2 hợp chất từ nghệ
Trang 3Phương pháp nghiên cứu
Quá trình re-docking
Quá trình re-docking thực hiện cho ligand
đồng kết tinh vào protein NS5 MTase với mã cấu
trúc là 4R8S nhằm tái tạo dữ liệu thực nghiệm và
đánh giá sự phù hợp của phần mềm AutoDock
Vina(7) Quá trình docking được thực hiện trên
khoang gắn kết của protein với các thông số tọa
độ như sau: center_x = -2,835 Å, center_y = 0,171 Å,
center_z = 41,373 Å và kích thước hộp thoại gắn
kết: size_x _y, _z : 22 x 22 x 22 (Å)3 Kết quả
re-docking được đánh giá dựa trên sự so
sánh 3 yếu tố: ái lực gắn kết hay điểm số gắn kết
(kcal.mol-1), cấu dạng và vị trí ligand trong
khoang sau khi gắn kết, sự chênh lệch của cấu
dạng ligand trước và sau docking qua giá trị
RMSD (root mean square deviation, Å) hay căn
bậc hai của độ lệch bình phương trung bình,; tương tác giữa protein với ligand đồng kết tinh trước và sau khi docking
Gắn kết phân tử (molecular docking)
Quá trình docking được thực hiện trên khoang gắn kết của protein NS5 MTase (PDB ID: 4R8S) với các thông số tọa độ như quá trình re-docking Kết quả docking được đánh giá thông qua cấu dạng gắn kết của ligand, ái lực gắn kết (kcal.mol-1), các tương tác
có thể xảy ra giữa ligand với các acid amin quan trọng của protein Năng lượng gắn kết càng thấp, cho thấy khả năng gắn kết của phân
tử vào protein đích càng cao
Các giai đoạn nghiên cứu được thực hiện
như Hình 1
Hình 1 Các giai đoạn thực hiện trong nghiên cứu
KếT QUả
Kết quả re-docking
Kết quả re-docking ligand đồng kết tinh SFG
(sinefungin) vào khoang gắn kết của protein NS5
MTase (PDB ID: 4R8S) cho điểm số gắn kết
tốt -9,0 kcal.mol-1 (Hình 2 A, 2 B) Bên cạnh đó,
cấu dạng và vị trí ligand khi được tái gắn kết
không có nhiều thay đổi so với cấu trúc thực
nghiệm, thể hiện qua giá trị RMSD = 0,82 Å < 2 Å
(Hình 2 C) Phân tích tương tác giữa ligand SFG
với protein trước và sau khi re-docking (Hình 2 D)
cho thấy cấu dạng tái tạo được liên kết hydro với các acid amin Ser56, Gly86, Lys105, His110, Asp131, Val132 và liên kết kỵ nước với His110
như trước khi re-docking (Hình 2) Điều này
chứng minh độ tin cậy về khả năng tái tạo dữ liệu thực nghiệm của phần mềm sử dụng, do
đó có thể sử dụng phương pháp và các thông
số cho các thử nghiệm gắn kết phân tử trong quá trình sàng lọc
Trang 4Hình 2 Kết quả re-docking ligand SFG (sinefungin) vào protein (PBD ID: 4R8S)
(A) và (B) Vị trí ligand đồng kết tinh trong khoang gắn kết, (C) Ligand SFG trước (màu đỏ) và sau (màu hồng) docking trong khoang gắn kết, (D) Tương tác protein-ligand trước và sau re-docking (màu xanh là liên kết hydro,
màu hồng là liên kết kỵ nước)
Dựa trên đặc điểm cấu trúc và các tương tác
giữa ligand đồng kết tinh (sinefungin) và protein,
có thể dự đoán các ligand có cấu trúc lớn, đa dị
vòng thơm và có các điểm cho nhận điện tử
tương tự như ligand đồng kết tinh sẽ phù hợp với
khoang gắn kết và cho điểm số tốt (Hình 3)
Hình 3 Cấu trúc ligand đồng kết tinh
(sinefungin) có đa dị vòng (màu xanh) và các điểm
cho nhận điện tử (màu đỏ)
Kết quả gắn kết phân tử (molecular docking)
Sau quá trình gắn kết, tất cả 100 ligand khảo sát đều gắn thành công vào khoang gắn kết cho điểm số gắn dao động từ -3,9 đến -10,3 kcal.mol-1 Trong đó, 6 hợp chất tiềm năng có điểm số gắn kết tốt nhất từ -8,3 đến -10,3 kcal.mol-1 điển hình là hợp chất A25, 51 hợp chất cho điểm số gắn kết nhỏ hơn -8,0 kcal.mol-1, 43 hợp chất lớn hơn -8,0 kcal.mol-1 Mối liên quan về cấu trúc và điểm số gắn kết cho thấy sự phù hợp so với kết quả dự đoán dựa trên sự tương đồng về mặt cấu trúc với
sinefungin (ligand đồng kết tinh) (Hình 4)
Hình 4 Kết quả gắn kết của một số khung cấu trúc trên NS5 MTase (PDB ID: 4R8S)
Trang 5Cụ thể, các khung cấu trúc có cả dị vòng
thơm và các nhóm thế nhận điện tử sẽ cho khả
năng gắn kết tốt nhất với protein, điển hình
flavonoid với hợp chất A29 (Hình 4 C) và steroid
với hợp chất A25 (Hình 4 B) Trong khi đó, các
khung cấu trúc lớn có nhóm nhận điện tử nhưng
chỉ chứa vòng thơm đơn giản (furan, phenol)
cho điểm số gắn trung bình (Hình 4 D), còn các
cấu trúc không vòng thơm hoặc không có nhóm
nhận điện tử có điểm số gắn kết thấp (Hình 4 A)
20 hợp chất có khả năng gắn kết tốt với ái lực
gắn < -8.0 kcal.mol-1 trên protein NS5 MTase
được minh họa ở Hình 5
Liên quan cấu trúc và ái lực gắn hay điểm số
gắn kết
Mối liên quan giữa cấu trúc và điểm số gắn
kết được đánh giá trên hai khung cấu trúc có khả
năng gắn kết tốt nhất là steroid và flavonoid
(Hình 6 và 7) Nhìn chung, hai khung cấu trúc
này đều lớn, cồng kềnh giống với cấu trúc của
ligand đồng kết tinh, giúp các hợp chất thuộc hai
khung này có thể len sâu và lắp đầy vào khoang
gắn tạo tương tác tốt với các acid amin của NS5
MTase
Khung steroid
Ba hợp chất A22, A23 và A25 thuộc khung steroid Trong đó, hợp chất A22 và A23 có nhiều điểm tương đồng về mặt cấu trúc, tuy nhiên hợp chất A23 (-9,0 kcal.mol-1) cho điểm số gắn kết tốt hơn A22 (-8,5 kcal.mol-1) do nhóm đường tại vị trí R1 có nhiều nhóm hydroxyl (-OH) hình thành được nhiều liên kết hydro nhưng kém bền Khi thay nhóm thế nhóm carbonyl tại vị trí R2 của A22 và A23 bằng vòng pyridin (A25) giúp hợp chất gắn kết tốt hơn nhờ các tương tác kỵ nước giữa vòng pyridin và nhóm carbonyl của acid amin Ile147, nhóm phenyl của acid amin His110
và carbonyl của acid amin Lys105 (Hình 6) Hợp
chất A25 thể hiện tiềm năng gắn kết tốt nhất trong tất cả các ligand khảo sát do có điểm số tốt
và hình thành nhiều liên kết tương tự như ligand đồng kết tinh với các acid amin Lys105, His110, Val132 và Ile147, đặc biệt là tương tác kỵ nước giữa vòng phenyl của ligand với nhóm phenyl của acid amin His110, giữa nhóm hydroxyl của ligand và nhóm carbonyl của acid amin Gly58
(Hình 8)
Hình 5 Các hợp chất gắn kết tốt trên protein NS5 MTase (PDB ID: 4R8S)
Trang 6Hình 6 Khung steroid và các hợp chất thuộc khung steroid
Khung flavonoid
Trong các hợp chất tự nhiên thuộc nhóm
flavonoid được khảo sát, các chất thuộc phân
nhóm flavon và flavonol cho điểm số gắn kết
tốt do có dị vòng benzopyron và các nhóm OH
giúp hình thành các liên kết hydro và liên kết
kỵ nước, tăng khả năng gắn kết Ba hợp chất
A18 (-9,8 kcal.mol-1), A59 (-9,9 kcal.mol-1) và
A60 (-10,3 kcal.mol-1) do có nhiều nhóm OH,
đặc biệt là các nhóm OH trong phân tử đường
tại vị trí R hình thành các liên kết hydro với
acid amin quan trọng trong khoang gắn kết
như Glu111, Asp146, Val132 và cho điểm số
gắn kết cao nhất trong tất cả ligand khảo sát(8)
Các hợp chất A17, A28, A29, A30, A41 cho
điểm số gắn kết tốt (nhỏ hơn -9,0 kcal.mol-1), nhưng không có phân tử đường trong cấu trúc Phân tích mối liên quan về mặt cấu trúc
và điểm số gắn kết, nhóm thế OH (nhóm thế R) trong phân nhóm flavonol (A30) cho khả năng gắn kết tốt hơn phân nhóm flavon (A17),
và sự gia tăng các nhóm thế hydroxyl cũng làm tăng ái lực gắn kết, điển hình là A29 (-9,4 kcal.mol-1, Hình 7)
Như vậy, khung steroid là khung cấu trúc
tiềm năng và hợp chất A25 (ecliptalbin) chiết
xuất từ cây Cỏ Mực (Eclipta prostrata -
Asteraceae) là hợp chất mới gắn kết tốt nhất cho tiềm năng kháng enzym NS5 MTase của virus dengue
Hình 7 Khung flavonoid và các hợp chất thuộc khung flavonoid
Trang 7
Hình 8 So sánh tương tác 2D giữa ligand đồng kết tinh (A) (màu tím) và ligand A25 (B) (màu xanh nhạt)
với enzym NS5 MTase của virus dengue
BÀN LUẬN
Nhìn chung các hợp chất thuộc khung
steroid và flavonoid cho kết quả gắn kết tốt nhất
so với các khung khác Điều này có thể giải thích
là hai khung cấu trúc này cồng kềnh, tương thích
tốt với hình dạng của khoang gắn giúp chúng
len sâu, tiếp xúc hoàn toàn với các bề mặt của
khoang gắn kết, đồng thời có nhiều nhóm thế
OH nên khả năng hình thành nhiều liên kết
hydro, do đó điểm số gắn kết tốt hơn
Hợp chất A25 (ecliptalbin) trong cây Cỏ Mực
(Eclipta prostrata - Asteraceae) cho tiềm năng ức
chế NS5 MTase của virus dengue do có nhiều
điểm tương đồng về mặt cấu trúc với ligand
đồng kết tinh cũng như hình thành liên kết với
acid amin quan trọng (Ile147) trong khoang gắn
kết (Hình 8)
Ecliptalbin là một trong 8 loại alkaloid được
tìm thấy trong lá và hạt của cây Cỏ Mực Một số
nghiên cứu chỉ ra rằng hợp chất này cho tác
dụng giảm lipid máu và có tác dụng chống oxy
hóa (Hình 9)(9) Ngoài ra, dịch chiết cây Cỏ Mực
còn được chứng minh là có tác dụng chống lại
virus dengue trong một số bài thuốc từ dược liệu
nhưng chưa có nghiên cứu nào đưa ra được hợp
chất cụ thể có tác dụng trên virus dengue(10) Do
đó, thông qua quá trình docking trên NS5 MTase, ecliptalbin được nhận dạng là một hợp chất tiềm năng Tuy nhiên, kết quả thu được chỉ
là nghiên cứu in silico, và kết quả điểm số
docking vẫn chưa phản ánh được giá trị hoạt tính sinh học, do đó cần được kiểm chứng qua
các thử nghiệm in vitro và in vivo để nghiên cứu
tác dụng kháng virus dengue của hợp chất này
Hình 9 Một số công dụng của ecliptalbin
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thực hiện quá trình gắn kết phân tử cho 100 hợp chất từ 10 cây thuốc trên protein mục tiêu NS5 MTase Kết quả cho thấy hai khung cấu trúc tiềm năng là flavonoid và steroid, trong đó hợp chất A25 (ecliptalbin) chiết xuất từ cây Cỏ Mực là chất
Trang 8gắn kết tốt nhất có tiềm năng cho tác dụng
kháng virus dengue
TÀI LIỆU THAM KHảO
1 Centers for Disease control and prevention About dengue: what
https://www.cdc.gov/dengue/about/index.html (access on
10/12/2020)
2 World Health Organization (2020) Dengue and severe dengue
https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (access on 10/12/2020)
3 Norazharuddin H, Lai NS (2018) Roles and prospects of dengue
virus non-structural proteins as antiviral targets: an easy digest
The Malaysian Journal of Medical Sciences, 25(5):6-15
4 Ganji LV, Kanyalkar MA (2019) Non-structural proteases as a
target of dengue virus Journal of Antivirals and Antiretrovirals,
11(4):1-15
5 Benmansour F, Trist I, Coutard B, Decroly E, Querat G, Brancale
A, and Barral K (2017) Discovery of novel dengue virus ns5
methyltransferase non-nucleoside inhibitors by fragment-based
drug design European Journal of Medicinal Chemistry, 125:865-880
6 Podvinec M, Lim SP, Schmidt T, Scarsi M, Wen D, Sonntag LS,
Sanschagrin P, Shenkin PS, Schwede T (2010) Novel inhibitors
of dengue virus methyltransferase: Discovery by in vitro-driven
virtual screening on a desktop computer grid Journal of
Medicinal Chemistry, 53 (4):1483-1495
7 Trott O, Olson AJ (2010) AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient
optimization, and multithreading Journal of Computational Chemistry, 31(2):455-461
8 Stephanie F, Saragih M, Alkaff AH, Nasution MAF, Tambunan USF (2019) Screening of potential Northern African natural product compounds as dengue virus NS5 methyltransferase
inhibitor: An in silico approach In: 2019 IEEE 19th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE),
215-220
9 Abdel-Kader MS, Bahler BD, Malone S, Werkhoven MC, Troon
F van, Wisse JH, Bursuker I, Neddermann KM, Mamber SW, Kingston DG (1998) DNA-damaging steroidal alkaloids from
Eclipta alba from the suriname rainforest Journal of Natural Products, 61(10):1202-1208
10 Govindarajan M, Karuppannan P (2011) Mosquito larvicidal
and ovicidal properties of Eclipta alba (L.) Hassk (Asteraceae) against chikungunya vector, Aedes aegypti (Linn.) (Diptera: Culicidae) Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 4(1):24-28
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 27/12/2020