LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR

ictaluri được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1.. Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen wzz bằng phươn

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)

- Máy gel doc (Biorad)

- Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max

- Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)

- Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)

- Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad)

- Máy đo quang phổ

2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid

- Bộ kít tách chiết plasmid của Qiagen

2.1.2.2 Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR

- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen

2.1.2.3 Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose

- Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen

2.1.2.4 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn

Các enzyme cắt giới hạn được cung cấp bởi Biolab: SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, BglII Các thành phần của phản ứng cắt được sử dụng theo

hướng dẫn của nhà sản xuất

2.1.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi

Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X Thành

phần phản ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1

2.1.2.6 Hóa chất dùng cho điện di DNA

Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol

blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck)

(a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA 1 kb; (c): Thang DNA 1 kb plus

2.1.2.8 Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phương pháp hóa

2.1.4 Chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi Trung

tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm:

- Chủng Edwardseilla ictaluri hoang dại S7

- Chủng Escherichia coli: E.coli DH5α; E coli DH5α λpir; E coli SM10

λpir

2.1.5 plasmid

2.1.5.1 Plasmid pKD4

- Kích thước 3267 bp

- Mang trình tự khởi đầu sao chép ori6K gamma

- Mang gen kháng ampicillin và gen kháng kanamycin nằm giữa hai trình

tự FRT

- Được sử dụng để tạo cassette 1 STEP

Hình 2.2 Plasmid pKD4 2.1.5.2 Plasmid pCAMBIA 1300

- Kích thước 8958 bp

- Mang gen kháng kanamycin

- Được sử dụng làm bản mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin dùng trong thiết kế cassette

Hình 2.3 Plasmid pCAMBIA 1300

2.1.5.3 Plasmid pGEM-T Easy

- Kích thước 3015 bp

- Có gắn thêm T ở vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu quả nối

- Mang gen kháng ampicillin và trình tự khởi đầu sao chép f1 ori

- Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α của β galactosidase giúp chọn

lọc những khuẩn lạc có gen chèn dựa trên sự chọn lọc màu sắc trắng/ xanh của khuẩn lạc

- Plasmid pGEM-T Easy được sử dụng để nhân dòng

Hình 2.4 Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4 Plasmid pJET1.2/blunt

- Plasmid đầu bằng cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu bằng

- Plasmid pJET1.2/blunt được sử dụng để nhân dòng

Hình 2.5 Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5 Plasmid pKD46

- Kích thước 6329 bp

- Mang gen kháng kanamycin

- Mang hai trình tự khởi đầu sao chép repA101ts và oriR101 Sự khởi đầu sao chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, do đó plasmid không nhân lên được ở 37oC – 42oC

- Mang các gen exo, bet và gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red

được điều khiển bởi promoter ParaB Promoter ParaB tăng cường sản xuất

λ Red khi có arabinose

- Mang gen kháng ampicillin

- Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E ictaluri để tận dụng hệ thống

tái tổ hợp λ Red

Hình 2.6 Plasmid pKD46

2.1.5.6 Plasmid pGP704

- Kích thước 3705 bp

- Mang trình tự khởi đầu sao chép oriR6K, cần phải có protein π do gen

pir mã hóa mới nhân lên được Do đó, plasmid chỉ được duy trì trong những chủng có gen pir như E coli DH5α λpir; E coli SM10 λ pir

- Mang gen kháng ampicillin

Hình 2.7 Plasmid pGP704

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo dòng E coli DH5α mang đoạn gen wzz của E ictaluri

2.2.1.2 Khuếch đại và thu nhận đoạn gen wzz của E ictaluri

Ly trích DNA bộ gen E ictaluri theo quy trình sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E ictaluri vào 5 ml môi trường BHI colistin, nuôi cấy lắc

- Thu dịch nổi, bảo quản - 20oC

DNA bộ gen E ictaluri được sử dụng làm bản mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen wzz bằng cặp mồi WF1/WR1 Sản phẩm PCR được tinh sạch

qua cột để dòng hóa

2.2.1.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn

gen wzz (pGEMT::wzz)

Taq DNA polymerase có hoạt tính terminal transferase, thêm

deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ của sản phẩm PCR Hệ thống vector pGEM-T Easy được thiết kế mang một thymidine (T) ở đầu 3’của cả hai bên T nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình nối bằng cách ngăn chặn việc tự đóng vòng của vector

và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR Nhờ vậy, phản

ứng nối xảy ra dễ dàng Thành phần phản ứng nối như sau:

Phản ứng nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ

2.2.1.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α bằng phương pháp hóa

biến nạp

Các tế bào E coli được phát triển ở pha log Tế bào thu được bằng cách li

tâm và huyền phù tế bào trong dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả năng kết dính DNA (khả nạp) Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo ra phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào và đi vào tế bào chất nhờ hiện tượng thực bào Các tế bào phát triển trên môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau đó được nuôi trên môi trường chứa kháng sinh cho phép xác định các khuẩn lạc chứa plasmid

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp được tiến hành như sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E coli vào 5 ml môi trường LB lỏng Nuôi cấy qua đêm ở

- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh Ngâm trong nước đá 5 - 10

phút

Tất cả các bước tiếp theo phải thực hiện trong đá lạnh

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 3000 vòng/phút, 7 phút, 4oC Bỏ dịch nổi

- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh Ly tâm

2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC Bỏ dịch nổi

- Huyền phù sinh khối tế bào trong 10 ml dung dịch CaCl2 0,1 M lạnh Để trên

đá trong 30 phút Ly tâm 2700 vòng/phút, 5 phút, 4oC Bỏ dịch nổi

- Huyền phù sinh khối trong 2 ml dung dịch CaCl2 0,1 M Bổ sung 2 ml

glycerol lạnh 50% để đạt nồng độ glycerol cuối cùng là 10%

- Chia lượng nhỏ 100 µl vào tube 1,5 ml và làm lạnh nhanh trong ethanol 100o

ở - 80oC

2.2.1.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGEM-T::wzz vào E coli DH5α

- Trộn đều, nhẹ nhàng 10 l phản ứng nối (ở bước 2.2.1.3) vào 100 µl tế bào

E coli khả nạp Giữ trong bể đá 10 phút

- Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 42oC trong 2 phút

- Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào bể đá trong 1 – 2 phút

- Cho vào 250 µl môi trường LB Nuôi cấy lắc ở 37oC, 1 giờ

- Lấy 100 µl trãi trên môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) và X – gal

(40 µg/ml)

- Ủ ở 37oC, qua đêm

2.2.1.6 Kiểm tra dòng biến nạp bằng PCR khuẩn lạc

Vector pGEM-T Easy chứa gen lacZα mã hóa cho tiểu phẩn α của enzyme galactosidase Vùng MCS nằm trong gen lacZα giúp chọn lọc vector có gen chèn dựa vào màu sắc trắng/xanh của khuẩn lạc Các tế bào E coli biến nạp được sàng

β-lọc trên môi trường LB – amp – Xgal Khuẩn lạc chứa vector có gen chèn có màu trắng Khuẩn lạc chứa vector không có gen chèn có màu xanh

Lựa chọn các khuẩn lạc có màu trắng để kiểm tra sự hiện diện của đoạn gen

wzz bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi M13F/M13R Cặp mồi

M13F/M13R nằm hai bên MCS của vector pGEM-T Easy cho phép xác định đoạn

gen wzz có được chèn vào hay không Cặp mồi có trình tự như sau:

M13F: 5’- GTTTTCCCAGTCACGAC - 3’

M13R: 5’ – AACAGCTATGACCATG - 3’

2.2.1.7 Kiểm tra dòng biến nạp bằng phản ứng cắt giới hạn

Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính sẽ được nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn

- Plasmid được tách chiết sử dụng bộ kit của Qiagen

- Phản ứng cắt giới hạn với SalI và EcoRI để kiểm tra sự hiện diện của gen wzz

trong plasmid tái tổ hợp có thành phần như sau:

2.2.2 Tạo chủng E ictaluri mang plasmid pKD46

2.2.2.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp E ictaluri bằng phương pháp điện biến nạp

Sử dụng điện trường mạnh trong một thời gian ngắn sẽ làm tạm thời mất tính

ổn định của màng tế bào Khi đó, màng tế bào có khả năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trường xung quanh Nhờ vậy mà DNA hoặc RNA có

thể được chuyển vào tế bào

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp E ictaluri được tiến hành như sau:

- Cấy 1 khuẩn lạc E ictaluri vào 5 ml môi trường BHI lỏng Nuôi cấy qua

đêm ở điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC

- Cấy chuyền 1 ml dịch nuôi cấy vào 100 ml môi trường BHI lỏng Nuôi cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC cho đến khi OD600 đạt khoảng 0,8 – 1.0

- Chuyển dịch nuôi cấy vào các falcon 50 ml lạnh Ngâm trong nước đá 10

phút

Các thao thác tiếp theo được thực hiện trong đá lạnh

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 vòng/phút, 15 phút, 2oC Bỏ dịch nổi

- Huyền phù sinh khối tế bào trong trong 50 ml nước lạnh Ly tâm 4000

vòng/phút, 15 phút, 2oC Bỏ dịch nổi

- Huyền phù sinh khối trong 50 ml glycerol lạnh 10% Ly tâm 4000 vòng/phút,

15 phút, 2oC Bỏ dịch nổi (bước này được lặp lại 2 lần)

- Huyền phù sinh khối trong 2 ml glycerol lạnh 10% Sau đó, chia 100 µl dịch

tế bào vào mỗi tube 1,5 ml Sử dụng để biến nạp ngay hoặc làm lạnh nhanh trong ethanol 100o và bảo quản ở - 80 oC

2.2.2.2 Biến nạp plasmid pKD46 vào E ictaluri

- Trộn 100 ng plasmid pKD46 vào 100 µl tế bào E ictaluri khả nạp Khuấy

nhẹ bằng đầu tip Ủ trên đá 20 phút

- Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹ để các tế bào lắng xuống dưới đáy

- Đặt cuvette vào máy điện biến nạp.Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V Nhấn nút start và giữ 5 ms

- Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch

tế bào sang 1 tube mới

Các khuẩn lạc mọc trên môi trường BHI – ampcillin – colistin được nuôi cấy

để tách plamid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn với EcoRI

Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong 3 giờ

2.2.2.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp E ictaluri mang plasmid pKD46 bằng

phương pháp điện biến nạp

Plasmid pKD46 sản xuất enzyme tái tổ hợp λ Red Quá trình sản xuất λ Red được tăng cường khi có L – arabinose Do đó, trong quá trình chuẩn bị tế bào khả

nạp E ictaluri::pKD46, L – arabinose được bổ sung để tăng cường sự sản xuất

enzyme tái tổ hợp

Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp giống như trong mục 2.2.2.1 Tuy nhiên,

trong quá trình nuôi cấy thu sinh khối có bổ sung L – arabinose đến nồng độ cuối là

10 mM Tế bào khả nạp được sử dụng liền để không mất hoạt tính của enyme tái tổ

hợp λ red

2.2.3 Knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP

Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 1 STEP được tiến hành như trong

Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 1 STEP

2.2.3.1 Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự plasmid pKD4 (AY048743.1) và trình tự 2 bên đoạn gen

wzz của E ictaluri trên ngân hàng gen NCBI, chúng tôi thiết kế cặp mồi F1/R1 để

tạo cassette 1 STEP chứa gen kháng kamamycin ở giữa với hai đầu là 2 trình tự

tương đồng trên E ictaluri Mồi F1 bao gồm đoạn P1 là priming site 1 của pKD4 và đoạn H1 (50 bp) nằm bên trái gen wzz Mồi R1 bao gồm đoạn P2 là priming site 2

của pKD4 và đoạn H2 (50 bp) nằm bên phải gen wzz Cặp mồi F1/R1 có trình tự

2.2.3.2 Phản ứng PCR tạo cassette 1 STEP

Thực hiện phản ứng PCR trên bản mẫu là pKD4 với cặp mồi F1/R1để tạo cassette 1 STEP Sản phẩm PCR có kích thước 1595 bp được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch qua cột và sử dụng để biến

nạp vào E ictaluri::pKD46

2.2.3.3 Biến nạp cassette 1 STEP vào E ictaluri mang pKD46

- Trộn 100 ng sản phẩm PCR vào 100 µl tế bào E ictaluri::pKD46 khả nạp

vừa mới chuẩn bị Khuấy nhẹ bằng đầu tip Ủ trên đá 20 phút

- Chuyển toàn bộ dịch tế bào vào cuvette lạnh, lắc nhẹ để các tế bào lắng xuống dưới đáy

- Đặt cuvette vào máy điện biến nạp Chỉnh máy điện biến nạp ở mức 2500V Nhấn nút start và giữ 5 ms

- Sau đó cho ngay 1ml môi trường BHI vào cuvette, trộn đều và chuyển dịch

tế bào sang 1 tube mới

- Nuôi cấy lắc ở 100 vòng/phút, 28oC, 45 phút

- Trãi dịch tế bào lên môi trường BHI chứa colistin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) Ủ ở 28oC trong 36 – 48 giờ

2.2.4 Knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP

Độ dài trình tự tương đồng cần thiết để xảy ra tái tổ hợp là khác nhau ở mỗi

loài vi khuẩn Đối với E coli, Shigella, Yersinia …chỉ cần trình tự 50 nucleotide

tương đồng là đủ để xảy ra sự tái tổ hợp Tuy nhiên, nhiều loài vi khuẩn khác như

Y.pseudomonas, Vibrio cholerae… đòi hỏi phải có trình tự đoạn tương đồng dài hơn

mới có thể xảy ra tái tổ hợp tương đồng Do đó, bên cạnh cassette 1 STEP có đoạn tương đồng 50 nucleotide, chúng tôi thiết kế cassette 2 STEP với trình tự tương đồng dài hơn (400 nucleotide) Sử dụng phương pháp 2 STEP PCR để tạo cassette 2 STEP

Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp 2 STEP được tiến hành như

trong Sơ đồ 2.2

Sơ đồ 2.2 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp 2 STEP

2.2.4.1 Thiết kế mồi

Dựa vào trình tự gen wzz trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi WF1/WR2 để khuếch đại đoạn đầu của gen wzz (W1, kích thước 388 bp) và cặp mồi WF2/WR1 để khuếch đại đoạn cuối của gen wzz (W2, kích thước 405 bp)

WF2 và WR2 được thiết kế gắn thêm trình tự FRT 34 nucleotide giúp loại bỏ gen kháng kanamycin ở những bước tiếp theo của đề tài Cặp mồi có trình tự như sau:

WF2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGG CACAGGCGATCTATCAGC-3’

WR2: 5’GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGTGC ACTCCCCTCTTTATGACG-3’

Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin của pKD4 trên ngân hàng gen, chúng tôi thiết kế cặp mồi KF/KR để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin KF và KR cũng được gắn thêm trình tự FRT như trên Sản phẩm PCR (Km) có kích thước 863

bp Cặp mồi có trình tự như sau:

KF: 5’-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATGATTG AACAAGATGGATTGC-3’

KR: 5’- GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCTCAGAA GAACTCGTCAAGAAGG-3’

2.2.4.2 Phản ứng PCR tạo cassette 2 STEP

Để tạo cassette 2 STEP, chúng tôi tiến hành 2 bước phản ứng PCR (2 step PCR) Đầu tiên chúng tôi tiến hành 3 phản ứng PCR để thu các đoạn W1, W2 và

Km

- Phản ứng PCR sử dụng DNA E ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi

WF1/WR2 để khuếch đại đoạn W1

- Phản ứng PCR sử dụng DNA E ictaluri làm bản mẫu với cặp mồi

WF2/WR1 để khuếch đại đoạn W2

- Phản ứng PCR sử dụng pKD4 làm bản mẫu với cặp mồi KF, KR để khuếch đại đoạn Km

Sau khi thu được các sản phẩm PCR lần 1, tiến hành đo nồng độ và trộn chung 3 đoạn (0,3 pmol mỗi đoạn) để làm bản mẫu cho phản ứng PCR lần 2 Phản ứng PCR lần 2 sử dụng cặp mồi WF1/WR1 cho sản phẩm 2 STEP kích thước 1668

bp

2.2.4.3 Biến nạp cassette 2 STEP vào E ictaluri mang pKD46

Các bước biến nạp cassette 2 STEP được thực hiện như đối với cassette 1 STEP

trong mục 2.2.3.3

2.2.5 Knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704

Các bước knockout gen wzz bằng phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704

được tiến hành như trong Sơ đồ 2.3

Sơ đồ 2.3 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz bằng phương pháp sử dụng

suicide plasmid pGP704