Luận văn khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây hồ đằng rễ mành (cissus verticillata (l ) nicolson c e jarvis)

Mọi người chỉ biết nó dùng để làm cảnh mà ít ai biết được, nó cũng đem lại rất nhiều công dụng trị bệnh như: Tăng huyết áp, đái tháo đường,…Đề tài này sẽ góp phần tìm hiểu thêm về giá tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG

(Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis)

LỚP: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Từ xưa đến nay, không có sự thành công nào mà không gắn liền với sự hỗ trợ, giúp đỡ

dù ít hay nhiều từ mọi người Trong thời gian 5 năm học tập, gắn bó với giảng đường đại học, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè

Với sự biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả thầy cô ở khoa Dược – Điều dưỡng đã cùng với tri thức, tâm huyết của mình để truyền đạt tất cả vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường Thầy cô không những chỉ dạy cho chúng em tri thức mà còn chỉ dạy cho chúng em cách làm người để chúng em có đủ hành trang khi bước vào đời Đó là những điều vô cùng quý báu mà không có bất cứ thứ gì có thể so sánh được

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy Trần Công Luận và cô Trì Kim Ngọc, người đã tận tình hướng dẫn để em có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp Do kiến thức còn hạn chế nên cũng không thể tránh khỏi những sai sót trong quá trình làm luận văn và báo cáo, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô để em có thể học hỏi được nhiều hơn và hoàn thiện bài báo cáo khóa luận tốt hơn

Sau cùng, em xin kính chúc thầy cô của khoa Dược – Điều dưỡng cũng như toàn bộ thầy cô giáo của trường Đại học Tây Đô thật nhiều sức khỏe và niềm tin để tiếp tực thực hiện hiện sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai sau

Trân trọng

LỜI CAM ĐOAN

Em cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em

Các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong luận văn là trung thực và chính xác

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Lý Thảo

TÓM TẮT

Đặt vấn đề

Hồ đằng rễ mành là một loại cây còn khá mới ở Việt Nam, nó được di thực từ châu

Mỹ Mọi người chỉ biết nó dùng để làm cảnh mà ít ai biết được, nó cũng đem lại rất nhiều công dụng trị bệnh như: Tăng huyết áp, đái tháo đường,…Đề tài này sẽ góp phần tìm hiểu thêm về giá trị mà cây thuốc đem lại với các nội dung: Mô tả định danh, khảo sát vi học, định tính sơ bộ thành phần hóa học và khảo sát tác dụng sinh học chống oxy hóa của cây

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Dược liệu là cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis) thu

hái vào tháng 10 năm 2016 tại tỉnh Bạc Liêu Sau khi phơi khô, sử dụng bột dược liệu

để mô tả định danh, khảo sát vi học, định tính sơ bộ thành phần hóa học Từ 3 kg dược liệu HĐRM, sử dụng 1,6 lít cồn 96 % để làm ẩm dược liệu và 33 lít cồn 96 % chiết ngấm kiệt với tốc độ xả 10 – 15 giọt/ phút

Sau đó, đem toàn bộ dịch chiết thu được lắc phân bố lần lượt với các dung môi hữu cơ:

PE, EtOAc để được các cao phân đoạn Thử hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng SKLM và quang phổ UV – Vis

Kết quả và kết luận

Định danh chính xác tên khoa học của mẫu thực vật thu hái được dùng trong nghiên

cứu là Cissus verticilla (L.) Nicolson & C.E.Jarvis, họ Nho (Vitaceae)

Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa học, xác định trong cây có flavonoid và một số thành phần hóa học khác: Carotenoid, tinh dầu, tannin, saponin, chất khử và hợp chất polyuronid

Chiết được cao tổng

Tiến hành lắc phân bố lần lượt thu được các cao với khối lượng như sau: 47,15 g cao PE; 19,43 g cao EtOAc; 27,53 g cao cồn nước còn lại

Kết quả thử nghiệm tác dụng chống oxy hóa bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy các cao đều có tác dụng chống oxy hóa và có thể sơ bộ kết luận cao EtOAc cho kết quả rõ nhất

Tiến hành thăm dò khả năng chống oxy hóa của các cao bằng phương pháp đo quang trên máy quang phổ UV – Vis cũng giúp khẳng định cao EtOAc chống oxy hóa mạnh nhất trong các cao

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Thực vật học 2

2.1.1 Vị trí phân loại 2

2.1.2 Đặc điểm họ Nho (Vitaceae) 3

2.1.3 Sơ lược về chi Cissus 3

2.1.4 Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis 4

2.1.4.1 Mô tả hình thái 4

2.1.4.2 Phân bố, sinh thái 4

2.1.4.3 Cách trồng 4

2.1.4.4 Thu hái, chế biến 5

2.2 Thành phần hóa học 5

2.3 Một số tác dụng dược lý của HĐRM 5

2.3.1 Tác dụng hạ đường huyết 5

2.3.2 Tác dụng chống dị ứng và chống viêm 6

2.4 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa 6

2.4.1 Khái niệm về gốc tự do 6

2.4.2 Chất chống oxy hóa 7

2.4.3 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể 7

2.4.3.1 Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường 8

2.4.3.2 Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên 8

2.4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình thành gốc tự do 9

2.4.4.1 Ảnh hưởng của các xenobiotic 9

2.4.4.2 Ảnh hưởng của các tác nhân viêm và hoại tử gan 9

2.4.4.3 Ảnh hưởng của tác nhân tiêu máu và bầm huyết 10

2.4.4.4 Ảnh hưởng của điều kiện sống 10

2.4.5 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do 11

2.4.5.1 Hệ thống phòng vệ các gốc tự do trong cơ thể 11

2.4.5.2 Hệ thống enzym chống oxy hóa ở gan 11

2.4.6 Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 13

2.4.6.1 Phương pháp ức chế gốc tự do DPPH 13

2.4.6.2 Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd O2- (Superoxyd scavenging) 13

2.4.6.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA 14

2.4.6.4 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II 14

2.4.6.5 Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2 14

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.1 Nguyên liệu 16

3.1.2 Dung môi, hóa chất 16

3.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Mô tả định danh 16

2.2.1.1 Hình thái 16

2.2.1.2 Vi học 16

3.2.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học 18

3.2.3 Chiết xuất dược liệu 19

3.2.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghệm DPPH 20

3.2.4.1 Chuẩn bị thuốc thử và mẫu thử 20

3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao trên SKLM với TT DPPH20 3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng cách đo độ hấp thu quang phổ UV – Vis 21

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

4.1 Mô tả định danh 22

4.1.1 Hình thái 22

4.1.2 Vi học 23

4.1.2.1 Vi phẫu 23

4.1.2.2 Soi bột 32

4.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học 36

4.3 Chiết xuất dược liệu 39

4.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng thử nghệm DPPH 39

4.4.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao trên SKLM với TT DPPH 39

4.4.2 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các cao bằng cách đo độ hấp thu quang phổ UV – Vis 40

4.5 Bàn luận 43

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.1.1 Thực vật học 44

5.1.2 Hóa học 44

5.1.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học 6

Bảng 3.1 Phản ứng thử nghiệm DPPH 21

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học 37

Bảng 4.2 Kết quả xác định độ ẩm 39

Bảng 4.3 Kết quả thăm dò khả năng chống oxy hóa của 3 cao ở nồng độ 1 mg/ml 40

Bảng 4.4 Kết quả đo độ hấp thu của cao EtOAc ở 5 nồng độ 40

Bảng 4.5 Kết quả đo độ hấp thu của chất đối chứng vitamin C ở 5 nồng độ 41

Bảng 4.6 Kết quả xác định giá trị IC50 của các mẫu 42

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Sơ đồ vị trí phân loại thực vật của HĐRM 2

Hình 2.2 Cây Hồ đằng rễ mành 4

Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết 18

Hình 3.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất dược liệu HĐRM 19

Hình 4.1 Các bộ phận của cây HĐRM 22

Hình 4.2 Vi phẫu phiến lá HĐRM và sơ đồ kèm theo 23

Hình 4.3 Chi tiết các bộ phận trong phiến lá 24

Hình 4.4 Vi phẫu cuống lá HĐRM và sơ đồ kèm theo 25

Hình 4.5 Chi tiết các bộ phận trong cuống lá 26

Hình 4.6 Vi phẫu thân già HĐRM và sơ đồ kèm theo 27

Hình 4.7 Chi tiết các bộ phận trong thân già 28

Hình 4.8 Vi phẫu thân non HĐRM và sơ đồ kèm theo 29

Hình 4.9 Chi tiết các bộ phận trong thân non 29

Hình 4.10 Vi phẫu rễ già bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo 30

Hình 4.11 Chi tiết các bộ phận trong rễ già bất định HĐRM 31

Hình 4.12 Vi phẫu rễ non bất định HĐRM và sơ đồ kèm theo 32

Hình 4.13 Chi tiết các bộ phận trong rễ non 32

Hình 4.14 Bột lá 33

Hình 4.15 Các cấu tử trong bột lá HĐRM 33

Hình 4.16 Bột thân 34

Hình 4.17 Các cấu tử trong bột thân HĐRM 34

Hình 4.18 Bột rễ 35

Hình 4.19 Các cấu tử trong bột rễ HĐRM 35

Hình 4.20 SKLM thăm dò hoạt tính chống oxy hóa 39

Hình 4.21 Biểu đồ đường chuẩn của cao EtOAc 41

Hình 4.22 Biểu đồ đường chuẩn của vitamin C 41

Hình 4.23 Biểu đồ so sánh giá trị IC50 của các mẫu 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid deoxyribonucleic

DMSO : Dimethyl sulfoxyd

DPPH : 1,1 – diphenyl – 2 - picrylhydrazyl EtOAc : Ethyl acetat

HĐRM : Hồ đằng rễ mành

HTCO : Hoạt tính chống oxy hóa

IC50 : Inhibitory concentration half maximal GSH : Glutathion

GSH – Px : Glutathion peroxidase

LDL :Low density lipoprotein

MDA : Malonyl dialdehyd

MeOH : Methanol

NBT : Nitroblue tetrazolium

RNS : Reactive oxygen species

ROS : Reactive nitrogen species

PE : Petroleum ether (ether dầu hỏa)

SOD : Superoxyd dismutase

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

TT : Thuốc thử

UV – Vis : Ultra violet – visible

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một trong những đất nước có điều kiện tốt khí hậu tốt để thực vật phát triển và tạo ra nguồn nguyên liệu dồi dào cho việc nghiên cứu tạo ra các sản phẩm có giá trị trị bệnh cho con người Chính vì vậy, từ ngàn xưa, ông cha ta đã khám phá sức mạnh của thiên nhiên và biết sử dụng nhiều loại thực vật nhằm mục đích chữa bệnh, đồng thời tránh được một số tác nhân có hại cho sức khỏe con người và được đặt lên hàng đầu

Xã hội ngày càng phát triển thì con người càng phải đối đầu với những loại bệnh mới, nguy hiểm hơn rất nhiều như: Đái tháo đường, tăng huyết áp, ung thư,…Từ nguyên nhân trên, nhu cầu về các loại thuốc cũng tăng cao Do đó, việc nghiên cứu các chất mang hoạt tính sinh học cao có trong các loài cây, cỏ có tác dụng thiết thực trong đời sống hàng ngày là vấn đề quan tâm của toàn xã hội

Gần đây, có một loại cây di thực từ châu Mỹ du nhập vào Việt Nam và được sử dụng

như một loại cây cảnh đẹp và lạ, đó là cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.)

Nicolson & C.E.Jarvis) Cây này có thể bắt gặp ở quán cà phê, nơi bán cây cảnh, nhà hàng,… Tuy nhiên, bên cạnh việc dùng để làm cảnh, cây còn đem lại một số tác dụng

chữa bệnh: Đái tháo đường, hạ đường huyết (Almeida E.R., et al (2007); Pepato M.T.,

et al (2003); Viana G.S.B., et al (2004)), chống viêm và chống dị ứng (Quilez A.M.,

et al (2004)) Về hóa thực vật, trong cây có sự hiện diện của: Flavonoid, saponin,

coumarin, steroid Do cây mới xuất hiện ở Việt Nam trong khoảng thời gian gần đây nên việc theo dõi sự phát triển của cây với sinh thái, thổ nhưỡng cần được quan tam nhiều hơn

Để góp phần tìm hiểu thêm về giá trị mà cây thuốc đem lại, đề tài “Khảo sát hoạt tính

chống oxy hóa của cây Hồ đằng rễ mành (Cissus verticillata (L.) Nicolson &

C.E.Jarvis) được tiến hành với các nội dung sau:

- Mô tả định danh, khảo sát vi học các bộ phận của cây HĐRM

- Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật của cây HĐRM

- Khảo sát tác dụng sinh học: Thử hoạt tính chống oxy hóa của cây HĐRM

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Thực vật học

2.1.1 Vị trí phân loại

Tên gọi: Hồ đằng rễ mành

Tên gọi khác: Liêm hồ đằng, Mành mành

Tên nước ngoài: Princess vine (tiếng Anh)

Tên khoa học: Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis

Đồng danh: Cissus sicyoides L

2.1.2 Đặc điểm họ Nho (Vitaceae) (Trương Thị Đẹp, 2007)

Thân: Cây bụi leo hay dây leo thân gỗ bằng vòi cuốn mọc đối diện với lá

Lá: Đơn, mọc cách, có khía răng hoặc có thùy hình chân vịt hoặc lá kép hình chân vịt với 3 – 5 lá chét Lá kèm nhỏ, dễ rụng

Cụm hoa: Xim, tán, ngù, chùm, đôi khi chùm kép ở nách lá hay đối diện với lá (do sự phát triển cộng trụ của thân)

Hoa: Nhỏ, đều, lưỡng tính hay đơn tính vì trụy, mẫu 4 hay 5, 4 vòng

Bao hoa: 4 – 5 lá đài, 4 – 5 cánh hoa, tiền khai van; cánh hoa có thể rời hay dính nhau

ở chóp như một cái nón

Bộ nhị: Số nhị bằng số cánh hoa, rời và mọc trước cánh hoa Đĩa mật dày nằm ở phía trong vòng nhị

Bộ nhụy: 2 lá noãn dính nhau thành bầu trên 2 ô, mỗi ô 2 noãn

Quả: Mọng, chứa 2 – 4 hạt, hạt có nội nhũ

2.1.3 Sơ lược về chi Cissus

Cây bụi leo, có tua cuốn đối diện với lá Lá đơn, thường có răng, có khi chia thùy; lá kèm 2, nhỏ Cụm hoa có cuống, thành tán hay ngù, đối diện với lá; hoa có cuống Đài hình đấu Cánh hoa 4, xếp van, tách ra ở đỉnh khi hoa nở Nhị 4, đối diện với cánh hoa, đính xung quanh đĩa; bao phấn hướng trong Đĩa mật nguyên, lượn sóng hay chia thùy Bầu dính suốt chiều cao với đĩa mật; 2 ô, 2 noãn cong; vòi dạng cột; đầu nhụy ít rõ Quả mọng hơi nạc; hạt độc nhất, có 2 hố nhỏ ở gốc (Võ Văn Chi, 2004; Phạm Hoàng Hộ, 2000)

Gồm tới 350 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới và vùng nóng Ở nước ta có một số loài được sử dụng (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2000):

- Cissus adnata Roxb Dây nôi

- Cissus annamica Gagn Hồ đằng trung bộ

- Cissus assamica (Laws.) Craib Hồ đằng assam

- Cissus astrotricha Gagn Hồ đằng lông sao

- Cissus bachmaensis Gagn Hồ đằng bạch mã

- Cissus evrardii Gagn Hồ đằng evrad

- Cissus hastata Pl Hồ đằng mũi giáo

- Cissus hexangularis Thor ex Gagn Hồ đằng 6 cạnh

- Cissus javana DC Hồ đằng Java, Hồ đằng hai màu

- Cissus modeccoides Pl Chìa vôi

- Cissus quadrangulus L Hồ đằng 4 cánh

- Cissus repens Lamk Hồ đằng bò

- Cissus rosea Royle Hồ đằng hường

2.1.4 Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis

2.1.4.1 Mô tả hình thái

- HĐRM là cây leo tua cuốn, cao 5 – 7 m hoặc hơn, phân nhiều cành mảnh, nhẵn,

có hệ thống rễ bất định mọc ở các nách lá chạy dọc suốt thân cành Những rễ này buông thòng mềm mại, màu hồng thắm khi còn non rồi chuyển qua màu vàng xám khi già dần

- Lá mọc đơn so le, phiến lá hình tim hẹp, dài 6 – 10 cm, rộng 4 – 6 cm, cuống lá dài 2 – 3 cm, đậm màu, tua cuốn mảnh đối diện với cuốn lá

- Cụm hoa là một xim ngắn dạng tán đứng đối diện với lá, mang nhiều hoa nhỏ lưỡng tính với 4 cánh hoa màu vàng lục, 4 nhị đứng đối diện cánh hoa, bầu trên

- Quả mọng, gần hình cầu, đường kính 8 – 10 cm, chứa 1 – 4 hạt, khi chín màu đen (Nguồn dẫn: Http://blogcaycanh.vn;http://chohoaonline.com)

2.1.4.2 Phân bố, sinh thái

- HĐRM là cây di thực phân bố tự nhiên ở nhiều vùng của châu Mỹ, từ Bắc Mỹ cho đến Trung và Nam Mỹ

- Ở nước ta, cây được trồng làm cảnh ở nhiều nơi

2.1.4.3 Cách trồng

- Cây rất dễ trồng, chọn phần thân bánh tẻ, bỏ lá, chỉ chừa một phần cuống, cắt thành từng đoạn có từ hai đến ba mắt lá để làm hom giâm, cắm trong những túi bầu (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn; http://trongraulamvuon.com)

Hình 2.2 Cây Hồ đằng rễ mành

- Che nắng và theo dõi để tưới nước bổ sung sao cho vừa đủ ấm Sau một thời gian, các chồi nách phát triển thành cành mới thì đem túi bầu đi trồng (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn; http://trongraulamvuon.com; http://chohoaonline.com) 2.1.4.4 Thu hái, chế biến

- Lá tươi, thân hay rễ rửa sạch, đun với nước để ngâm chân (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn)

- Thân, lá, rễ giã lấy nước giữ luôn bã để đắp lên vết bỏng hay vết ngứa, ngoài ra

có thể phơi khô để nguyên hoặc nghiền thành bột (Nguồn dẫn: Http://caycanhsanvuon.vn)

2.2 Thành phần hóa học

Các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây HĐRM không nhiều

Theo Barbosa W.L.R et al (2002); Beltrame F.L et al (2001), trong cây HĐRM có flavonoid với 2 cấu trúc chính là: Kaemferol – 3 – O – rhamnosid và quercetin – 3 – O

– rhamnosid Luteolin, kaempferol, luteonin – 3 – sulfat được chiết từ dung dịch nước sau khi thủy phân

2.3 Một số tác dụng dược lý của HĐRM

2.3.1 Tác dụng hạ đường huyết

Theo Almeida E.R., et al (2007), dịch chiết lá tươi của cây HĐRM làm giảm đáng kể

lượng đường trong máu ở chuột mắc bệnh tiểu đường

Theo Pepato M.T., et al (2003), việc sử dụng lâu dài dịch của lá cây HĐRM ảnh

hưởng đến các biến đổi sinh lý và trao đổi chất của carbohydrat, lipid, protein của chuột bị bệnh tiểu đường

Kaempferol – 3 – O – rhamnosid

CTPT: C21H20O10

Quercetin – 3 – O – rhamnosid

CTPT: C21H21O11

Theo Viana G.S.B., et al (2004), chỉ ra lợi ích tiềm năng của dịch chiết nước từ cây

HĐRM trong việc làm giảm đường huyết trong máu trên chuột bị bệnh tiểu đường type 2

2.3.2 Tác dụng chống dị ứng và chống viêm

Theo Quilez A.M., et al (2004), cho thấy tác dụng chống dị ứng và chống viêm thông

qua thử nghiệm in vitro phóng thích histamin từ tế bào mast của dịch chiết methanol trong cây HĐRM

2.4 Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa

2.4.1 Khái niệm về gốc tự do

Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (ROS và RNS), là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử Chúng được chia thành hai nhóm lớn là các gốc tự do và các dẫn xuất không phải gốc tự do

Bảng 2.1 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học

O2•– Gốc superoxyd 1O2 Oxy đơn

OH• Gốc hydroxyl NO• Oxyd nitrid ROO• Gốc peroxyd ONOO- Peroxynitrid

H2O2 Hydrogenperoxyd HOCl Acid hypochlorique

Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử độc thân Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyd, nitroperoxyd là tiền chất của các gốc tự do Các ROS và RNS phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh nó do

đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như

ADN, protein, lipid (Proctor P.H., 1989; Favier A., 2003; Pincemail J., et al, 1998)

Các ROS và RNS được tạo ra một cách tất yếu trong quá trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ thể Ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: Điều hòa phân ly tế bào, kích hoạt các yếu

tố phiên mã cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm và điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzym chống oxy hóa Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: Đột biến ở ADN, biến tính protein, oxy hóa

lipid (Favier A., 2003; Pincemail J., et al, 1998)

Sự phá hủy các đại phân tử sinh học bởi ROS và RNS là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm Sự oxy hóa của các LDL dẫn đến sự hình thành các vạch lipid trên thành mạch máu, giai đoạn đầu tiên của bệnh tăng huyết áp và nhiều bệnh tim mạch Các ROS và RNS tấn công phospholipid màng tế bào làm thay đổi tính mềm dẻo của màng, thay đổi chức năng của nhiều thụ thể trên màng do đó ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của màng cũng như việc trao đổi thông tin giữa tế bào và môi trường Sự oxy hóa

các ADN bởi các ROS và RNS gây nên biến dị di truyền là một trong những nguy cơ phát triển ung thư Nhiều enzym và protein vận chuyển cũng bị oxy hóa và vô hoạt bởi

ROS và RNS (Favier A., 2003; Gardès – Albert M., et al, 2003; Pincemail J., et al,

1998) Sự tích lũy các sản phẩm của sự oxy hóa các cấu tử tế bào gây nên hiện tượng lão hóa sớm Các ROS và RNS cũng tham gia vào quá trình gây các bệnh suy giảm hệ thần kinh như Alzheimer, trong đó hiện tượng chết của các tế bào thần kinh gắn liền với hiện tương phân ly tế bào gây nên bởi các ROS và RNS (Gardès – Albert M.,

et al, 2003)

Để bảo vệ cơ thể khỏi tác động xấu của các ROS và RNS, tế bào được trang bị một hệ thống bảo vệ gồm các chất chống oxy hóa

2.4.2 Chất chống oxy hóa

Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo

ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic S.V., et al 2000; Lachman J., et al, 2000; Singh N., et al, 2004)

Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: Các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo thành gốc tự do như đồng, sắt; vô hoạt oxy đơn)

Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người được cung cấp bởi hai nguồn: Bên trong và bên ngoài Các chất chống oxy hóa bên trong bao gồm các protein (ferritin, transferrin, albumin, protein sốc nhiệt) và các enzym chống oxy hóa (superoxyd dismutase, glutathion peroxidase, catalase) Các chống oxy hóa bên ngoài là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồm vitamin E, vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki E., et al, 1995; Lachman J., et al, 2000; Pincemail J., et al, 1998; Vansant G., et al, 2004) Các chất này có nhiều trong rau và

quả Chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự nhiên Việc sử dụng nhiều rau quả

là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa

2.4.3 Sự hình thành các gốc tự do của oxy trong cơ thể

Trong tế bào, gốc tự do được sinh ra do các phản ứng chuyển nhường điện tử Những phản ứng này có thể được thực hiện bởi enzym hoặc không enzym, thông qua sự oxy hóa khử của các ion kim loại chuyển tiếp (Viện Dược liệu, 2006)

2.4.3.1 Sự hình thành gốc tự do trong trao đổi bình thường

Trong sinh học, nguồn quan trọng sinh ra gốc tự do là sự cung cấp điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào trong ty lạp thể cho oxy Trong ty lạp thể có một hệ thống enzym và các chất trung gian làm nhiệm vụ vận chuyển hydro và điện tử từ cơ chất tới oxy Những hợp chất này tạo ra một loại các phản ứng dây chuyền nối tiếp nhau gọi là chuỗi hô hấp tế bào (Viện Dược liệu, 2006)

Quá trình oxy nhận điện tử ở chuỗi hô hấp tế bào thực tế phải xảy ra qua nhiều giai đoạn Mỗi giai đoạn oxy chỉ nhận được một điện tử Oxy nhận điện tử đầu tiên tạo ra gốc superoxyd (O2•–) Oxy nhận điện tử chủ yếu ở màng ty lạp thể Khoảng 80 % lượng O2•– hình thành chuyển vào trong ty lạp thể, còn 20 % thoát ra bào tương O2•–

có các chức năng như sau: Là nguồn sinh ra H2O2; cùng với NO2 và các chất phóng thải từ tế bào thành tham gia chi phối trạng thái tĩnh hay hoạt động của tiểu cầu, quyết định sự bám dính hay kết tụ của tiểu cầu vào thành mạch (Viện Dược liệu, 2006) Các gốc O2•– hình thành nhanh chóng được enzym SOD chuyển thành H2O2 theo cơ chế tự oxy hóa khử:

H2O2 là tác nhân oxy hóa và dễ dàng bị phân hủy theo phản ứng:

Như vậy, ở cơ thể bình thường, oxy qua các chuyển hóa trong cơ thể tạo ra O2•–, H2O2

để thực hiện các chức năng sinh lý Chúng chỉ tồn tại với một nồng độ vô cùng thấp,

dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể (Viện Dược liệu, 2006)

2.4.3.2 Sự hình thành gốc tự do ngẫu nhiên

Rất có thể do chuyển động nhiệt hoàn toàn ngẫu nhiên mà các gốc O2•– và H2O2 va đập với nhau, không có men đặc hiệu xúc tác tạo ra một số phản ứng phụ sau (Viện Dược liệu, 2006):

 Sự hình thành gốc tự do không có enzym SOD xúc tác

Các gốc O2•– có khả năng phản ứng với nhau trong điều kiện không có enzym SOD xúc tác theo phản ứng sau:

O2•– + O2•– + 2H+ → H2O2 + O2

Cơ chất

Oxy đơn bội (1O2) có tính oxy hóa rất mạnh Nó có thể phản ứng với bất kỳ một chất hữu cơ nào khi nó gặp tạo ra các peroxyd

 Sự hình thành gốc tự do từ các ion kim loại chuyển tiếp

Ion kim loại chuyển tiếp (Fe2+, Cu2+) dễ dàng phân tách H2O2 thành gốc OH•

H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH• + OH

-Bình thường phản ứng này trong sinh học ít xảy ra, vì H2O2 ở nồng độ thấp còn Fe2+,

Cu2+ thường bị khóa ở dạng phức, ít ở trạng thái tự do

Các ion kim loại chuyển tiếp có thể phản ứng với oxy tạo ra gốc O2•– Phản ứng này đặc biệt quan trọng vì nó khơi mào cho các phản ứng gốc tự do xảy ra

Fe2+ + O2 → Fe3+ + O2•–

Cu+1 + O2 → Cu2+ + O2•–

Như vậy, từ 4 tiểu phân O2•–, H2O2, O2 và kim loại chuyển tiếp cùng hợp biến sinh ra gốc OH• và 1O2 những tác nhân có khả năng phản ứng mạnh Gốc OH• phản ứng mạnh với hầu hết các phân tử sinh học ở tốc độ khuếch tán, có khả năng gây tổn thương lớn trong phạm vi bán kính nhỏ mà nó sinh ra

2.4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại sinh đến sự hình thành gốc tự do

2.4.4.1 Ảnh hưởng của các xenobiotic

Đây là các chất hóa học, cơ thể không tổng hợp sẵn ra được, ví dụ như các thuốc trừ sâu, diệt cỏ, các hợp chất nitro hữu cơ, các phẩm nhuộm Khi xâm nhập vào cơ thể, các hóa chất này có giai đoạn trung gian tạo ra các gốc tự do (Viện Dược liệu, 2006) 2.4.4.2 Ảnh hưởng của các tác nhân viêm và hoại tử gan

Các hợp chất halogen hữu cơ, điển hình là CCl4 là chất gây viêm hoại tử gan Khi vào gan được chuyển hóa như sau:

2.4.4.3 Ảnh hưởng của tác nhân tiêu máu và bầm huyết

Điển hình là các diazonaphtol, diphenylhydrazin…, các chất này phản ứng với oxyhemoglobin tạo ra methemoglobin và gốc phenylhydrazin Gốc này nhường điện tử cho oxy tạo ra O2•– (Viện Dược liệu, 2006)

2.4.4.4 Ảnh hưởng của điều kiện sống

 Ảnh hưởng của sự ô nhiễm môi trường

Khí thải của các động cơ dùng xăng, dầu có nhiều chất độc như: CO, NO, carbuahydro tetraethyl chì Những chất này phân hủy tạo gốc tự do như sau (Viện Dược liệu, 2006):

 Ảnh hưởng của stress

Cơ thể hoạt động một cách bình thường là do cân bằng nội môi đã được thiết lập Nếu

có một yếu tố nào phá vỡ cân bằng nội môi thì được gọi là tác động của stress Khi cơ thể bị các stress như sự di chuyển và thay đổi môi trường sống, sự thay đổi nhiệt độ quá nóng hay quá lạnh, môi trường quá ồn hay bị ô nhiễm, áp lực và sự căng thẳng –

lo lắng trong công việc,…thì hàm lượng gốc tự do của oxy thường cao hơn 1,5 đến 2 lần so với đối chứng Thông qua các dây thần kinh hướng tâm và vùng dưới đồi, cơ thể

có những đáp ứng với các stress Sự giải phóng ra adrenalin và noradrenalin, khi cơ thể bị stress tác động sẽ dẫn tới khả năng chuyển hóa tương tác với oxy tạo ra các gốc

O2• Đồng thời nhiều acid béo chưa no được giải phóng ra từ các lipid Những yếu tố

đó (gốc O2• tăng, acid béo chưa no tăng,…) thúc đẩy quá trình peroxy hóa tăng khi bị stress (Viện Dược liệu, 2006)

 Ảnh hưởng của khu vực địa lý

Các bức xạ mặt trời, bức xạ nền ở một miền nào đó có phát ra những tia ảnh hưởng tới

sự hình thành các gốc tự do của oxy theo cơ chế như sau:

và là nguyên nhân của nhiều bệnh tật (Viện Dược liệu, 2006)

2.4.5 Sự phòng vệ của cơ thể chống lại gốc tự do

Khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc bao gồm hiệu lực vận chuyển điện tử của oxy và

sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, đặc biệt với các protein như: Transferrin, lactoferin, ferritin

 Phòng vệ loại bỏ các gốc đã sinh ra

Ở trong tế bào quan trọng nhất là enzym SOD và hệ thống glutathion Ở tổ chức màng

thì quan trọng nhất là các chất kiểu vitamin E, ubiquinon, β – caroten loại bỏ các gốc

LOO•, LO• theo phản ứng mỗi phân tử vitamin E này loại bỏ hai gốc LOO• Ở pha nước có vai trò của vitamin C và một số chất như acid uric

Việc sửa chữa loại bỏ các phân tử sinh học đã bị tổn thương trước khi chúng tích tụ lại hoặc trước khi chúng đủ mức gây ra những biến đổi chuyển hóa và định hướng đến sự sống của tế bào

Ví dụ: Các protein đã bị oxy hóa sẽ bị proteinase phân hủy; các lipid màng sẽ bị các lipase phân hủy, acyl transferase tác động

2.4.5.2 Hệ thống enzym chống oxy hóa ở gan

Gan là cơ quan có nhiều enzym trong đó có những enzym đóng vai trò quan trọng trong nhiều việc chống oxy hóa là: Các chất chống peroxyd, enzym SOD, phân hủy các gốc tự do khác, những ion khóa kim loại chuyển tiếp…, trong đó các chất chống

peroxyd chiếm thành phần chủ yếu ở gan (Viện Dược liệu, 2006)

 Các chất chống peroxyd

Đó là các chất glutathion (GSH), enzym glutathion peroxidase (GSH – Px) xúc tác phân hủy các peroxyd với hằng số tốc độ phản ứng k = 108 mol/giây theo phản ứng sau:

Như vậy, hàm lượng GSH, hoạt tính enzym GSH – Px liên quan đến việc phân hủy các peroxyd Khẩu phần ăn đủ protein và hàm lượng selen liên quan chặt chẽ với GSH và hoạt tính enzym GSH – Px Nếu hàm lượng selen không đủ thì GSH giảm, hoạt độ enzym GSH – Px thấp Ngoài ra, peroxysom còn có catalase phân hủy H2O2 nồng độ cao theo phản ứng sau:

 Enzym superoxyd dismutase (SOD)

Enzym này có khả năng phân hủy đặc hiệu các gốc O2•- với hằng số tốc độ rất lớn (k =

Vitamin E (α – tocopherol) là chất chống oxy hóa quan trọng ở các tổ chức màng Mỗi

phân tử vitamin E có khả năng loại bỏ bớt hai gốc LOO• theo phản ứng sau:

Ngoài phản ứng trực tiếp với gốc tự do vitamin E có khả năng loại bỏ oxy đơn bội theo phản ứng sau:

(vitE•: dạng oxy hóa (dạng kích thích))

Trong tế bào có nhiều chất có cấu trúc tương tự vitamin E như ubiquinon (coenzym

Q10) cũng có tính chất này

Các gốc kiểu semiquinon là những gốc bền, có nồng độ khá lớn (10-8 M) so với các gốc tự do của oxy là những gốc không bền Vì thế những gốc này có thể phản ứng với nhau tạo ra các sản phẩm không phải là gốc

Vitamin C là những chất có khả năng loại bỏ các gốc tự do ở pha nước của tế bào Ngoài ra, vitamin C còn có khả năng tái tạo vitamin E dạng oxy hóa trở về dạng khử

Những chất như acid uric huyết tương, GSH ở dịch tế bào cũng có tính chất loại bỏ các gốc tự do

Phân tử β – caroten cũng có tính chất chống oxy hóa theo cơ chế nhận năng lượng kích thích của oxy đơn bội, biến oxy đơn bội thành oxy thường và bản thân β – caroten trở

thành dạng kích thích, sau đó có thể trở về trạng thái bình thường hoàn toàn bằng hiện tượng vật lý là năng lượng kích thích truyền cho các liên kết nội tạng dưới dạng nhiệt

2.4.6 Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxy hóa

sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước

+ AH

Chất kháng oxy hóa

+ A•

sóng λ = 550 nm Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm

giảm sự hình thành phức màu tím (Lee S.M., et al, 2003)

2.4.6.3 Phương pháp xác định hàm lượng MDA

MDA (Malonyl dialdehyd) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng

tế bào nên được áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào (Viện Dược liệu, 2006)

Nguyên tắc:

- MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào Khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng thực hiện ở môi trường pH bằng 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 OC, thời gian 10 – 15 phút Dựa trên sự giảm cường độ hấp thu của phức, ta tính được khả năng kháng oxy hóa của hoạt chất (Viện Dược liệu, 2006)

- Việc ngăn chặn tạo thành phức có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin thể

hiện hoạt tính chống oxy hóa của hoạt chất (Lapenna D., et al, 2002)

2.4.6.5 Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2

Nguyên tắc:

Hai tiểu phân O2- và H2O2 sinh ra từ chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng độ

cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra 1O2, OH• là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ

đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa

H2O2 và đỏ phenol (màu đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2

trong sự hiện diện của enzym peroxydase từ cải gia vị (horseradish)) (Hosoea H., et al,

2002)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Nguyên liệu

Dược liệu: Toàn cây HĐRM (Cissus verticillata (L.) Nicolson & C.E.Jarvis), thu hái

vào tháng 10 năm 2016, tại địa bàn tỉnh Bạc Liêu Dược liệu được cắt nhỏ, sấy ở

50 – 60 OC đến khô, xay thành bột thô

Định danh dược liệu bằng cách so sánh hình thái thực vật, vi phẫu và soi bột với các thông tin trên tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành

3.1.2 Dung môi, hóa chất

- Dung môi: Cồn 96%, ethyl acetat, PE

- Hóa chất: DPPH (Hungari), vitamin C (Ấn Độ), bản mỏng silica gel 60 F254

(Merck), một số hóa chất, thuốc thử thường quy dùng trong phòng thí nghiệm

3.1.3 Trang thiết bị nghiên cứu

 Vi phẫu (Trần Hùng, et al, 2010)

- Chọn mẫu thích hợp

- Tiến hành cắt vi phẫu

- Nhuộm vi phẫu theo các bước:

 Ngâm lát cắt vào nước Javel 15 – 20 phút cho đến khi lát cắt trắng, rửa nhiều lần với nước cất

 Ngâm tiếp lát cắt vào dung dịch acid acetic 3 – 5 phút, rửa nhiều lần với nước cất

 Nhuộm lát cắt bằng dung dịch son phèn lục iod 2 phút, rửa nhiều lần với nước cất

 Ngâm lát cắt vừa nhuộm trong nước cất

- Tiến hành soi trên kính hiển vi

- Dùng ngón tay gì nhẹ trên lamelle cho bột phân tán đều

- Dùng giấy lọc thấm nhanh nước thừa ở mép lamelle

- Soi trên kính hiển vi lần lượt với các vật kính 10x, 40x để quan sát các đặc điểm của bột dược liệu

3.2.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học

Quy trình chiết và định tính các nhóm hợp chất từ dược liệu bằng phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa học Ciulei

Ethanol / hồi lưu

Dịch chiết cồn thủy phân

Chiết lại bằng ether

Dịch chiết nước thủy phân

Hình 3.1 Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết