Một ưu điểm khác khi biểu hiện protein mục tiêu trong chu chất là số lượng và chủng loại protein của tế bào chủ hiện diện không nhiều trong chu chất khoảng 100 loại so với tế bào chất tr
Trang 1Trang
I Báo cáo kết quả thực hiện đề tài 2
1.1 Đặt vấn đề 2
1.2 Nội dung thực hiện 4
1.3 Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp 4
1.4 Kết quả, biện luận 9
1.5 Kết luận, đề nghị 21
II Phụ lục
Tài liệu tham khảo
Trang 2I BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1.1 Mục tiêu của việc thực hiện đề tài [1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 14]
Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường glucose trong máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, cơ thể bị nhiễm độc keto axit, kèm theo triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh… Bệnh xảy
ra do hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hoặc insulin đủ nhưng hoạt động kém hiệu quả ĐTĐ có thể gây biến chứng cấp như nhiễm trùng, nhiễm toan, hôn mê, tăng thẩm thấu hoặc biến chứng mãn tính như tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim, mù lòa, suy thận, rối loạn tiêu hóa, niệu sinh dục, loét bàn chân, bị cắt cụt tứ chi…
Trong sản xuất protein tái tổ hợp, mục tiêu hàng đầu là tạo ra số lượng lớn nhưng đồng thời protein mục tiêu phải tồn tại ở cấu hình có hoạt tính tức phải có sự
gấp cuộn chính xác Vi khuẩn Gram âm E coli là một trong những ưu tiên chọn lựa
làm tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp do khả năng sinh sản nhanh, đạt mật
độ cao trong những môi trường nuôi cấy rẻ tiền đồng thời bộ gen của E coli đơn giản và đã được giải trình tự Thông thường, khi sử dụng E coli làm tế bào chủ để
sản xuất protein tái tổ hợp thì những protein này được định vị trong tế bào chất Đây
là môi trường khử nên những protein mục tiêu biểu hiện vượt mức thường có xu hướng kết tụ, hình thành một dạng không tan (thể vùi) và protein không có hoạt tính
do cấu hình không chính xác Để phục hồi hoạt tính mong muốn của protein mục tiêu, đầu tiên thể vùi (protein mục tiêu) phải được tách chiết từ tế bào chất, hòa tan thể vùi và phải được tái gấp cuộn để có cấu hình chính xác Tuy nhiên, hiệu suất của quá trình tái gấp cuộn còn tùy thuộc rất nhiều yếu tố, một trong những yếu tố quan trọng nhất chính là protein mục tiêu Nếu phân tử protein mục tiêu ở dạng tự nhiên càng có nhiều cầu nối disulfide, thì quá trình tái gấp cuộn càng có hiệu quả thấp Trong phân tử insulin tự nhiên có 3 cầu nối disulfit, trong đó hai cầu nối disulfide tại vị trí amino acid A7-B7, A20-B19 hình thành ở vùng A và B, một cầu nối
Trang 3disulfide giữa amino acid A6-A11 bên trong chuỗi A Sự hiện diện của 3 cầu nối này làm cho hiệu suất tái gấp cuộn MPI không cao khi biểu hiện vượt mức trong tế
bào chất của E coli
Trong khi đó, vùng chu chất của E coli là một môi trường có tính oxi hóa và
chứa nhiều nhân tố xúc tác hình thành cầu nối disulfide như họ protein Dsb (disulfide bond) nên thuận lợi cho tái gấp cuộn cho protein mục tiêu Một ưu điểm khác khi biểu hiện protein mục tiêu trong chu chất là số lượng và chủng loại protein của tế bào chủ hiện diện không nhiều trong chu chất (khoảng 100 loại) so với tế bào chất (trên 3000 loại) nên quá trình tinh chế protein mục tiêu sẽ thuận lợi hơn và hiệu quả hơn khi protein mục tiêu được biểu hiện trong tế bào chất
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng Ecotin, protein ức chế trypsin
ở E coli được tổng hợp và tiết vào chu chất nhờ một trình tự tiết nằm ở đầu N của
Ecotin Bằng cách dung hợp trình tự tiết và trình tự mã hóa Ecotin vào đầu N của proinsulin thì proinsulin sẽ được chuyển vào chu chất và sự tái gấp cuộn của proinsulin có hiệu quả cao so với việc dung hợp với các peptide tín hiệu của các gen
pelB, dsbA, hay ompT Trong nghiên cứu này, trình tự tiết và trình tự mã hóa Ecotinđược sử dụng để dung hợp với đầu N của MPI để cấu trúc dòng vi khuẩn E colicó khả năng biểu hiện Ecotin-miniproinsulin dạng tan trong chu chất có cấu
hình gấp cuộn tự nhiên Dòng tái tổ hợp này sẽ sử dụng như là nguồn giống để tạo insulin tái tổ hợp có hoạt tính dùng trong sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ
1.1.2 Sự cần thiết của nghiên cứu đề tài [6, 7, 8, 9]
Số lượng bệnh nhân TĐ ngày càng gia tăng tạo ra nhu cầu rất lớn về insulin Quy trình sản xuất insulin thương phẩm dùng trong điều trị TĐ được bắt đầu bằng việc chiết xuất insulin từ tụy của bò và heo Tuy nhiên, nguồn insulin ly trích từ động vật không đủ, có nhiều rủi ro và giá thành cao Năm 1955, Frederick Sanger
đã tìm ra chuỗi axit amin của insulin người, tạo cơ sở cho các nhà khoa học tổng hợp được gen mã hóa cho insulin người và dùng công nghệ gen để sản xuất số lượng lớn insulin người tái tổ hợp với hiệu quả cao và giá thành rẻ hơn nhiều lần
Trang 4[9] Vào năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu hiện trong E coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản xuất insulin người
tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food
& Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành Đến năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra một cơ hội lớn cho các nước đang phát triển tiếp cận và sản xuất loại thuốc này
Con số điều tra không đầy đủ nhưng đã cho thấy rằng Việt Nam cũng nằm trong những nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường ở mức cao, vì vậy nhu cầu insulin là rất lớn Tuy nhiên, việc phụ thuộc lâu dài vào nguồn insulin ở nước ngoài với giá thành cao rõ ràng không phải là con đường tối ưu nền kinh tế Việt Nam Trước tình hình như trên và với điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng như về nhân lực của PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ trong điều trị bệnh tiểu đường với giá thành phù hợp với mức chi tiêu của người dân là một định hướng nghiên cứu thiết thực và cần thiết Mục tiêu và nội dung của đề tài này cũng nằm trong định hướng nghiên cứu trên và cũng là hướng nghiên cứu mới
1.2 NỘI DUNG THỰC HIỆN
Khuếch đại đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa ecotin từ
bộ gen E coli W3110 bằng phản ứng PCR và phân lập; cấu trúc plasmid dòng hóa
pGEM-T Easy mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa Ecotin; cấu trúc plasmid biểu hiện pET-43a mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa Ecotin dung hợp với gen mã hóa miniproinsulin (MPI) người; biến
nạp plasmid này vào chủng vi khuẩn biểu hiện E coli B834(DE3); khẳng định tính
chính xác của protein tái tổ hợp ecotin-miniproinsulin (EMPI) bằng phương pháp Western-blot; khảo sát nồng độ cảm ứng của IPTG và chất hỗ trợ (ethanol) để tối ưu
Trang 5sự biểu hiện EMPI dạng tan trong chu chất; tối ưu hóa điều kiện chiết tách phân
đoạn chu chất
1.3 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
1.3.1 Chủng vi sinh vật
- Chủng chủ E coli DH5[F - , 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17 (r k - ,
m k + ), phoA, supE44, - , thi-1, gyrA96, relA1] được dùng để dòng hóa các gen và tạo
lượng lớn các plasmid tái tổ hợp
- Chủngchủ E coli B834(DE3) [F - ompT hsdS B (r B - m B - ) gal dcm met (DE3)]
được dùng để nghiên cứu sự biểu hiện gen trong plasmid pET43EMPI
- Chủng chủ E coli W3110 [F - λ - rph-1 INV(rrnD, rrnE)] dùng để tách bộ
gen
- Chủng chủ E coli DH5/pET43Ins mang plasmid chứa gen mã hóa cho mini-proinsulin
1.3.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng là môi trường LB (Luria-Bertani) có thành phần trong 1 lít như sau: Bacto-Tryptone 10g, cao nấm men 5g và 10g NaCl
Nhằm biểu hiện MPI ở dạng tan trong chu chất của E coli, chúng tôi chọn
phương án dung hợp trình tự mã hóa MPI với trình tự mã hóa ecotin và thẻ 6xHis ở đầu N Trình tự tín hiệu (ss) và gen mã hóa ecotin giúp cho MPI được biểu hiện
Trang 6trong chu chất E coli Thẻ 6xHis giúp cho bước tinh chế bằng phương pháp sắc kí
ái lực với cột Ni-NTA (GS)6 (trình tự lặp lại 6 lần của Gly-Ser) giúp tạo ecotin ở dạng dimer đồng hóa trị Ngoài ra, một vị trí cắt của TEV protease (ENLYFQG) đã được chèn vào cấu trúc này giữa ecotin và 6xHis có vai trò giúp loại bỏ ecotin ra khỏi protein dung hợp 6xHis-MPI Một gốc methionine (R) được chèn giữa thẻ 6xHis và MPI giúp việc loại bỏ thẻ 6xHis khỏi MPI bằng CNBr Do đó, chỉ bằng một bước tinh chế bằng phương pháp sắc kí ái lực với cột Ni-NTA và xử lý bằng cặp enzyme trypsin/ carboxypeptidease B, chúng tôi dự kiến có thể thu nhận được insulin hoàn chỉnh giống với cấu trúc tự nhiên Cấu trúc gen để biểu hiện MPI dung
hợp với ecotin và 6xHis trong chu chất E coli để thu nhận insulin được minh họa ở Hình 1 Cấu trúc này được tạo thành bằng cách: (i) Nhân bản gen mã hóa ecotin
cùng với trình tự peptide tín hiệu bằng phản ứng PCR dùng khuôn DNA bộ gen của
E coli và tạo dòng trong plasmid pGEM thành plasmid pGEco; (ii) Tổng hợp trình
tự linker chứa đoạn (GS)6 và trình tự nhận biết của TEV protease (ENLYFQG) bằng phản ứng PCR tái tổ hợp; nối trình tự linker này vào đầu C của ecotin trong plasmid pGEco tạo thành plasmid pGEcolin chứa gen mã hóa ecotin và trình tự linker; (iii) Thu nhận gen mã hóa ecotin và trình tự linker từ plasmid pGEcolin và nối vào trình tự mã hóa 6xHis-MPI trong plasmid pET43-Ins tại vị trí tương ứng với đầu N của 6xHis-MPI để có được plasmid pET43EMPI biểu hiện MPI ở dạng dung
hợp với ecotin (Hình 1)
Hình 1 Sơ đồ mô tả cấu trúc trình tự mã hóa protein dung hợp ecotin-MPI
được dòng hóa trong pET43EMPI Đoạn gen mã hóa ecotin gồm trình tự tín hiệu (ss) và gen cấu trúc được dung hợp ở đầu N của MPI Đoạn linker gồm trình tự lặp lại của 6 Gly-Ser và một vị trí cắt của TEV protease Thẻ 6His và gốc methionine (R) giúp loại bỏ thẻ 6His và MPI bằng CNBr Vị trí cắt protease được chỉ bằng mũi tên.
Trang 71.3.4.2 Cảm ứng biểu hiện ecotin-MPI trong các chủng E coli
a Cảm ứng biểu hiện ecotin-MPI
Cấy một khuẩn lạc của dòng E coli/ pET43EMPIvào bình nuôi cấy chứa
5ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml Nuôi cấy qua đêm, 37oC Hút dịch huyền phù tế bào chuyển vào bình nuôi cấy mới chứa 10ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml Nuôi cấy lắc ở 37oC đến khi OD600 của dịch nuôi cấy đạt đến 0,8 Bổ sung IPTG sao cho nồng độ cuối đạt 0,5mM và tiếp tục nuôi cấy lắc ở 25o
C, trong 24 giờ Ly tâm thu sinh khối ở thời điểm OD600 = 2,5 với tốc độ 10.000 vòng/phút, 5phút, nhiệt độ phòng Rửa sinh khối tế bào 2 lần với nước cất.Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ hết phần dịch.Hòa sinh khối trong 100µl dH2O
Bổ sung tiếp 25µl dung dịch nạp mẫu điện di protein 5X Vortex đều, đun sôi
100oC, trong 10 phút.Ủ ngay vào đá lạnh trong 15 phút để biến tính protein Ly tâm thu dịch nổi 10.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC và phân tích bằng điện di SDS-PAGE
b Tạo shock thẩm thấu và kiểm tra khả năng tiết của ecotin-MPI trong chu chất
Thu 1,5ml dịch nuôi cấy đã cảm ứng bằng IPTG vào eppendorf.Ly tâm 10.000 vòng, 5 phút.Sinh khối được huyền phù trong 200µl dung dịch chứa sucrose 25%, Tris-HCl 0,3M, MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, pH 8.Để eppendorf ở nhiệt độ phòng 30 phút.Ly tâm 13.000 vòng, 5 phút, 4oC Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 100µl dung dịch đã làm lạnh chứa MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, Tris-HCl 10mM, pH 8, để trong đá 30 phút Ly tâm 13.000 vòng, 15 phút, 4o
C Dịch nổi (phân đoạn chu chất) được thu nhận Cặn tủa (phân đoạn tế bào chất) được huyền phù trong nước Phân tích sự hiện diện của ecotin-MPI trong chu chất và trong tế bào chất bằng điện di SDS-PAGE
c Phân tích sự biểu hiện ecotin-MPI bằng điện di SDS-PAGE
Nạp mẫu vào mỗi giếng của gel gom trong bản gel polyacrylamide 12,5% Điện di với điện thế 160V, 2mA/giếng cho đến khi phẩm màu xanh tiếp cận đầu dưới của gel Dừng điện di và nhuộm gel trong dung dịch nhuộm khoảng 1 giờ Giải nhuộm cho đến khi nền gel trong suốt không màu
Trang 8d Xác nhận protein dung hợp ecotin-MPI bằng Western blot
* Chuyển màng
- Điện di SDS-PAGE các mẫu và thang phân tử lượng protein đã nhuộm sẵn Sau khi điện di cắt bỏ gel gom, đánh dấu gel phân tích Ngâm và lắc gel trong dung dịch chuyển màng (Towbin) 10 phút
- Chuẩn bị một màng lai nitrocellulose, hai tấm giấy thấm có kích thước phù hợp với kích thước của gel Ngâm trong dung dịch chuyển màng ít nhất 10 phút
- Điện chuyển thẩm: làm ướt tất cả các miếng xốp bằng dung dịch chuyển màng, sau đó xếp theo thứ tự cực âm, miếng xốp, giấy lọc, gel, màng lai, giấy lọc, miếng xốp, cực dương Khóa bộ điện chuyển màng lại, thêm dung dịch chuyển màng ngập các miếng xốp
- Lắp vào bồn điện di, chuyển với dòng điện 25V, 350mA trong 1 giờ
- Lấy màng lai ra, đánh dấu mặt trên
* Khóa màng
- Chuyển màng lai vào hộp chứa dung dịch khóa màng
- Lắc nhẹ trong 1 giờ, ở nhiệt độ phòng
* Phát hiện protein bắt đặc hiệu với kháng thể
- Rửa màng lai 3 lần, với 15ml - 20ml PBST/lần, 5 phút/lần
- Bổ sung 15ml dung dịch chứa kháng thể kháng HUI-18 Lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ
- Rửa màng lai 5 lần, 15ml - 20ml PBST/lần, 5 phút/lần
* Hiện phim
- Đặt màng lai lên bìa nylon kiếng, phủ khắp bề mặt của màng bằng 1ml hỗn hợp reagent 1 và 2 (bộ Kit HyperfilmTM
ECL) Đậy màng lai lại bằng nylon
- Chuyển vào phòng tối, áp sát mặt phim lên phía trên, đúng với vị trí của
màng lai, giữ cố định 5-10 phút
- Nhúng phim vào dung dịch developer đến khi vạch protein xuất hiện
- Nhanh chóng chuyển phim sang dung dịch fixer, rửa đến khi nền phim
trong suốt
Trang 9- Rửa phim lại bằng nước, mang ra khỏi phòng tối, phơi khô
1.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và cảm ứng đến biểu
hiện ecotin-MPI trong chu chất
a Ảnh hưởng của nồng độ IPTG
Chủng được nuôi cấy ở 250C và cảm ứng trong 24 giờ bằng các nồng độ IPTG khác nhau là 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM và 1,0mM để phân tích mức độ biểu hiện ecotin-MPI trong chu chất
Ứng với mỗi điều kiện, thu sinh khối từ 1,5ml dịch nuôi cấy và thu nhận phân đoạn chu chất để kiểm tra mức độ hiện diện của ecotin-MPI trong chu chất bằng điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12,5%
b Ảnh hưởng của ethanol
Chủng được nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung 1%, 2%, 3%, 4% hoặc 5% ethanol với các điều kiện nuôi cấy, cảm ứng và phân tích tương tự như mục a
1.3.6 Các phương pháp ly trích EMPI dạng tan từ chu chất [3, 5, 13]
1 3.6.1 Ly trích EMPI bằng phương pháp shock thẩm thấu [1]
Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, 5 phút Sinh khối được huyền phù trong 500ul dung dịch chứa 25% sucrose, 0.3M Tris–HCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, pH 8.0, để ở nhiệt độ phòng 30 phút sau đó ly tâm 13000 vòng, 5 phút, 4o
C Dịch nổi được loại bỏ và cặn được làm tan trong 500ul dung dịch đã làm lạnh chứa 0.5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0, để trong đá 30 phút Ly tâm 13000 vòng, 15 phút, 4oC Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI
1.3.6.2 Ly trích EMPI bằng phương pháp shock thẩm thấu [2]
Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 13000 vòng, 2 phút, 4oC Rửa bằng dung dịch PBS lạnh (8g NaCl, 0.2g KCl; 1.15g Na2HPO4.7H2O; 0.2g KH2PO4 trong 1 lít nước cất), pH 7.3, vortex kỹ, lặp lại hai lần Huyền phù sinh khối bằng dung dịch 20% sucrose (20g sucrose trong 100ml dung dịch Tris-HCl 10mM pH 7.5; giữ lạnh 4oC), vortex, thêm 0,5M EDTA, pH 8.0 Để yên trong đá 10 phút, ly tâm 13.000 vòng, 5
Trang 10phút, lấy phần tủa Thêm nước cất lạnh, vortex, để yên trong đá trong 10 phút, ly tâm 13.000 vòng, 5 phút Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI
1 3.6.3 Ly trích EMPI bằng phương pháp shock thẩm thấu [3]
Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, 5 phút Sinh khối được rửa 2 lần trong dung dịch chứa 10mM Tris-HCl, pH 8, 30mM NaCl Cặn được tái huyền phù trong dung dịch sucrose 20% (20g sucrose trong 100ml dung dịch Tris-HCl 30mM), 1mM EDTA, pH 8 Để yên trong đá 10 phút, ly tâm 13000 vòng, 5 phút Tái huyền phù cặn trong nước cất Để yên trong đá 10 phút ly tâm 13.000 vòng, 5 phút Dịch nổi chính là phân đoạn chu chất được thu nhận chứa EMPI
1.4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
1.4.1 Tạo plasmid pET43EMPI biểu hiện ecotin-miniproinsulin trong chu
chất E coli
1.4.1.1 Thu nhận gen mã hóa cho ecotin
Đoạn gen ecotin mang trình tự tín hiệu tiết và vùng mã hóa ecotin được thu nhận bằng phương pháp PCR từ DNA bộ gen của E coli W3110 với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR và Pfu DNA polymerase Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 500bp khi phân tích trên gel agarose 1% đúng như dự đoán (Hình 2) Sản
phẩm này được tinh chế và dòng hóa vào plasmid pGEM
Trang 11
Như vậy, gen ecotin đã được khuếch đại thành công bằng phương pháp PCR
và có mang vị trí cắt giới hạn của hai enzyme NdeI và EcoRI ở hai đầu.Sản phẩm PCR sau đó được xử lý bằng hai enzyme NdeI/EcoRI và tinh chế để chuẩn bị cho
bước tạo dòng hóa vào plasmid pGEM
1.4.1.2 Tạo dòng gen mã hóa ecotin vào plasmid pGEM
a Tạo plasmid pGEM mang gen ecotin (pGEco)
Plasmid pGEM được tách chiết bằng phương pháp SDS kiềm xử lý bằng hai
enzyme NdeI/EcoRI và tinh chế Gen ecotin đã được xử lý bằng NdeI/EcoRI được
nối với plasmid pGEM bằng T4 ligase Sản phẩm nối được biến nạp vào vi khuẩn
E coli DH5 và trải trên môi trường LB-Amp có bổ sung X-gal Chúng tôi thu được các khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng (kết quả không trình bày) Các khuẩn lạc trắng được chọn làm các dòng dự tuyển cho các bước sàng lọc phía sau
bp
100
Hình 2 Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen ecotin từ E coli W3110
bằng cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR; 1, DNA bộ gen; 2, Thang DNA 100 bp; 3, Sản phẩm PCR.
Trang 12b Sàng lọc thể biến nạp (E coli DH5) chứa plasmid pGEco
Thể biến nạp E coli DH5 mang plasmid pGEco được tuyển chọn và kiểm
chứng từ các khuẩn lạc trắng bằng phương pháp cắt giới hạn với enzyme NdeI và EcoRI.Sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương ứng với kích thước của plasmid pGEM) và 500bp (tương ứng với kích thước của gen ecotin) (Hình 3, giếng 2) Như vậy chúng tôi đã tạo dòng thành công gen ecotin vào
plasmid pGEM
Plasmid pGEco thu được đã được giải trình tự với cặp mồi T7/ SP6 để thu
nhận thông tin của trình tự gen ecotin chèn vào Kết quả so sánh mức độ tương đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin chính xác 100% (Hình 4)
Plasmid pGEco này được dùng làm nguồn gen ecotin cho các bước tiếp theo
Hình 3 Kết quả kiểm tra E coli DH5/ pGEco bằng phương pháp cắt giới hạn 1, Thang DNA 1kb; 2, pGEM/EcoRI; 3, pGEco/EcoRI; 4, pGEco/NdeI- EcoRI; 5, Thang DNA 100bp
Trang 131.4.1.3 Tạo dòng gen mã hóa ecotin dung hợp với trình tự nhận biết bởi
TEV protease
Trình tự linker mã hóa đoạn peptide gồm vùng 6 lần lặp lại của dipeptide
Gly-Ser (GS)6 và trình tự nhận biết của TEV protease (ENLYFQG) được tổng hợp
bằng phương pháp PCR tái tổ hợp với cặp mồi A1F/A2R và Pfu DNA polymerase
Sản phẩm PCR có kích thước 81bp khi được phân tích trên gel agarose 1% đúng
như dự đoán trên lý thuyết (Hình 5giếng 2) Sản phẩm PCR này được tinh chế và
dòng hóa vào plasmid pGEco
Trình tự linker thu nhận ở trên được xử lý với cặp enzyme EcoRI-NcoI và
được nối vào plasmid pGEco đã được mở vòng cũng bằng hai enzyme trên để tạo plasmid tái tổ hợp được đặt tên là pGEcolin Tiếp theo, sản phẩm nối được hóa biến
nạp vào chủng E coli DH5 Thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp được sàng lọc dựa vào khả năng kháng ampicillin Trên đĩa môi trường LB-Agar-Amp, chỉ những
tế bào mang plasmid mới có khả năng sống sót và hình thành khuẩn lạc đơn Đây là
các khuẩn lạc E coli DH5/pGEcolin dự tuyển
Hình 4 Kết quả giải trình tự pGEco và kiểm tra trình tự gen ecotin
