Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt cây neem (azadirachta indica a juss)

Nhƣng tại Việt Nam các nghiên cứu đi vào ứng dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem chủ yếu về lĩnh vực bảo vệ thực vật và bắt đầu có những nghiên cứu sử dụng các hoạt chất này trong bả

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC SƠ ĐỒ

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chương 1MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Mục đích 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu về cây Neem 3

2.1.1 Mô tả cây và giá trị của cây Neem 4

2.1.2 Dược tính 7

2.1.3 Các hợp chất limonoid trong cây Neem 8

2.2 Các phương pháp trích ly limonoid từ hạt Neem 14

2.2.1 Phương pháp sử dụng dung môi 14

2.2.2 Phương pháp hiện đại, trích ly bằng CO2 siêu tới hạn 16

2.3 Tính chất vật lý của họ Limonoid 17

2.4 Tính chất hóa học của limonoid 18

2.5 Các phương pháp xác định limonoid 18

2.5.1 Phương pháp sắc kí khí – khối phổ (GC – MS) 18

2.5.2 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC 19

Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 20

2.6 Tổng quan các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến việc trích ly hợp chất limonoid từ cây Neem 21

2.6.1 Tổng quan các công trình nghiên cứu tại Việt Nam 21

2.6.2 Tổng quan các công trình nghiên cứu trên thế giới 23

3.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị 25

3.3.1 Dụng cụ 25

3.3.2 Hóa chất 25

3.3.3 Thiết bị 25

3.4 Nội dung nghiên cứu 26

3.5 Phương pháp nghiên cứu 26

3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 26

3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 29

3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem 31

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 33

4.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 33

4.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 36

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của việc hỗ trợ xử lý nguyên liệu bằng vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt Neem 38

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41

5.1 Kết luận 41

5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Th.S Kha Chấn Tuyền, Th.S Đoàn Thị Tuyết Lê Người đã luôn động viên, tận tình hướng dẫn, quan tâm

và giúp đỡ em rất nhiều về kiến thức cũng như truyền đạt kinh nghiệm cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học & Môi Trường, cũng như tất cả các thầy cô của trường đại học Lạc Hồng đã truyền đạt kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập

Em xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện khoa học và ứng dụng Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm việc tại viện

Em xin cảm ơn các anh chị trong phòng phân tích, cùng các anh chị làm việc tại Viện

Con vô cùng biết ơn ba mẹ và anh chị đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện cho con hoàn thành chương trình đại học trong suốt thời gian vừa qua

Xin cảm ơn sự góp ý và giúp đỡ của tất cả các bạn trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Sinh viên

Phạm Hồng Thắng

Nguyễn Thành Trung

tỉnh Ninh Thuận 3

Hình 2.3 Lá và trái Neem trồng tại Ninh Thuận 5

Hình 2.3 Nhân hạt Neem tại Ninh Thuận 7

Hình 2.4 Cấu trúc Limonoid 9

Hình 2.6 Các hoạt chất chính trong lá và hạt Neem 14

Hình 3.1 Thiết bị trích ly dầu Neem 27

Hình 3.2 Máy cô quay chân không 29

Hình 3.3 Máy sắc kí cột cao áp (HPLC) 30

Hình 3.4 Thiết bị trích ly có hỗ trợ vi sóng 32

Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện khối lƣợng cao thu đƣợc từ 3 loại dung môi 34

Hình 4.2 Cao Neem sau khi trích ly 35

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào loại dung môi 35

Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng cao phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi 37

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn hàm lƣợng limonoid phụ thuộc vào thời gian trích ly và tỉ lệ giữa nguyên liệu và dung môi 38

Hình 4.5 Biểu đồ thể hiện lƣợng cao thu đƣợc khi xử lý nguyên liệu ở các khoảng thời gian và công suất khác nhau 39

Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện lƣợng Limonoid khi xử lý nguyên liệu ở các công suất và khoảng thời gian khác nhau 40

Bảng 2.2 Hàm lượng Azadirachtin trong nhân, cành, lá, rễ và thân cây Neem 12

Bảng 2.3 Hàm lượng Azadirachtin trong nhân hạt nem ở các nước 13

Bảng 2.4 So sánh phương pháp trích ly bằng dung môi có hỗ trợ vi sóng 16

Bảng 4.1 Kết quả lượng cao Neem thu được bằng 3 loại dung môi khác nhau 33

Bảng 4.2 Kết quả lượng limonoid thu được bằng 3 loại dung môi khác nhau 34

Bảng 4.3 Mã hóa yếu tố thí nghiệm 36

Bảng 4.4 Kết quả lượng cao thu được khi khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 36

Bảng 4.5 Kết quả lượng limonoid thu được khi khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian đến hiệu suất thu hồi limonoid từ hạt Neem 37

Bảng 4.6 Kết quả lượng cao thu được khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng 38

Bảng 4.7 Kết quả lượng limonoid thu được khi xử lý nguyên liệu bằng vi sóng 39

Sơ đồ 3.1 Quy trình trích ly hoạt chất limonoid từ hạt cây Neem 28

DANH MỤC VIẾT TẮT

SCFs : Lưu chất siêu tới hạn

GC – MS: Phương pháp sắc kí khí - khối phổ (gas chromatography- Mass

Spechrmetry)

HPLC: Sắc kí lỏng cao áp (High performance liquid chromatography)

Các hoạt chất sinh học trong cây Neem hay cây Xoan chịu hạn tên khoa học

Azadirachta indica A Juss, thuộc họ xoan (Meliaceae) trên thế giới đã nghiên cứu

đƣợc ứng dụng nhƣ chất chống viêm trong y học, chống nấm mốc, kháng khuẩn, diệt côn trùng gây hại, … trong bảo vệ thực vật và bảo quản nông sản cho đến các sản phẩm thực phẩm chức năng chống oxy hóa Nhƣng tại Việt Nam các nghiên cứu

đi vào ứng dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem chủ yếu về lĩnh vực bảo vệ thực vật và bắt đầu có những nghiên cứu sử dụng các hoạt chất này trong bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm nhƣ việc sử dụng dầu Neem với nồng độ 200 ppm

có tác dụng xua đuổi sự ký sinh của bọ hà (Cylas Formicarius F.) [7] Điều chế

thuốc với hoạt chất từ lá Neem Ninh Thuận để phòng trừ mối mọt trong bảo quản ngũ cốc…

Theo kết quả điều tra mới nhất của Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn tỉnh Đồng Nai về tổn thất sau thu hoạch đối với 8 loại nông sản chính (lúa, bắp, cà phê, điều, tiêu, rau ăn lá, rau ăn quả và trái cây) thì trái cây đứng hàng đầu với tỷ lệ tổn thất trung bình gần 19% Còn rau ăn lá và rau ăn quả tổn thất từ 12 - 13,6%, với lúa là trên 12%, cà phê trên 7%, bắp trên 6% Trong đó, tổn thất nặng nề nhất là ở các khâu thu hoạch, vận chuyển và bảo quản sơ chế

Do đó, để góp phần vào việc giảm tổn thất sau thu hoạch ở khâu bảo quản nông sản đồng thời nâng cao giá trị sử dụng các hoạt chất sinh học từ cây Neem,

chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu

hồi limonoid từ hạt cây Neem (Azadirachta indica A Juss)” Từ đó làm tiền đề

ứng dụng tác dụng các hoạt chất sinh học từ hạt Neem trong ngành bảo quản nông sản và chế biến thực phẩm

1.2 Mục tiêu

- Xác định được loại dung môi cho hiệu suất thu hồi limonoid cao

- Xác định tỉ lệ dung môi và nguyên liệu, thời gian thích hợp của phương pháp trích ly các hoạt chất limonoid từ hạt Neem cho hiệu suất cao và có hiệu quả

- Khảo sát và xác định đươc sự ảnh hưởng của vi sóng đến hiệu suất trích ly limonoid từ hạt cây Neem

1.3 Mục đích

Góp phần xây dựng quy trình trích ly các hợp chất có hoạt tính sinh học từ hạt cây Neem với hiệu suất cao

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về cây Neem

Cây Neem (Xoan chịu hạn) tên khoa học Azadirachta indica A Juss, thuộc

họ Xoan (Meliaceae), có nguồn gốc từ Ấn Độ và chính tại đây cây Neem được sử

dụng rộng rãi nhất Là loài cây chịu hạn và thích nghi rất tốt với các điều kiện khác nhau của môi trường, do vậy cây Neem được trồng từ cực nam Karaia của dãy Hymalya, từ vùng nhiệt đới tới vùng cận nhiệt đới, vùng khô cằn tới vùng nhiệt đới,

từ vùng gần mặt nước biển đến vùng có độ cao 700 m so với mặt nước biển

Cây Neem được du nhập vào Việt Nam từ năm 1981 trồng thử nghiệm bước đầu thành công ở tỉnh Thuận Hải (cũ), ngày nay thuộc tỉnh Ninh Thuận với diện tích nhỏ, nhưng thực sự phát triển nhanh ở Ninh Thuận kể từ năm 1998 bắt đầu từ

mô hình nghiên cứu khoa học trồng thử nghiệm 5 ha cây Neem trồng xen với cây Keo lá tràm tại hộ ông Nguyễn Văn Phóng, xã Phước Dinh, huyện Ninh Phước

Hình 2.1 Khu vực vườn giống cây Neem tại xã Phược Dinh, huyện Ninh Phước,

tỉnh Ninh Thuận Sau đó, cây Neem được trồng nhiều ở vùng khô hạn Ninh Thuận, diện tích hiện nay trên 6.000 ha và triển vọng sẽ trở thành cây quan trọng trong chiến lược

phát triển của tỉnh trong tương lai, do đặc điểm sinh học thích hợp với điều kiện khí hậu và đất đai của vùng khô hạn Ninh Thuận và những tiềm năng ứng dụng của nó Ngoài các lợi ích trong việc cải tạo môi trường sinh thái cho vùng bán khô hạn của Ninh Thuận như: phủ xanh đất cát ven biển và đồi núi trọc, chống xói mòn, cây Neem còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau trong nông nghiệp như chế biến thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản nông sản có nguồn gốc thảo mộc, phân bón, dược phẩm, mỹ phẩm cho đến thực phẩm chức năng phục vụ đời sống Khi diện tích Neem phát triển thì việc thu hoạch, bảo quản và chế biến các sản phẩm từ

lá, trái, gỗ cây Neem trong theo hướng công nghiệp cần được nghiên cứu để tăng hiệu suất sử dụng, mở thêm ngành sản xuất mới, tạo công ăn việc làm cho người dân

Theo Báo Tuổi trẻ Online, ngày 3/7/2011 Ban quản lý rừng phòng hộ ven biển Ninh Phước đã bán 4 tấn lá Neem tươi và hơn 10 tấn lá Neem khô cho Công ty quốc tế Phi Long (Hà Nội) với mức giá 2.000 đồng/kg lá tươi và 6.000 đồng/kg lá khô Công ty sẽ xuất khẩu số hàng này sang Nhật Bản làm dược liệu (kem đánh răng, thuốc chữa đau bụng )

2.1.1 Mô tả cây và giá trị của cây Neem

Cây Neem là loại cây gỗ trung bình, đường kính 40-50 cm cao từ 12-15 mét, chịu hạn tốt Nó là loại cây có lá xanh quanh năm, phát triển tốt ngay cả trên đất cát bạc màu, đất nghèo dinh dưỡng với khí hậu khô cằn Cây có nhánh rộng, tán lá hình oval hay hình tròn đường kính khoảng 1 – 1,5m Cây từ 8 tuổi trở đi bắt đầu cho gỗ tốt, dùng cho công nghiệp đồ mộc, làm trụ trồng thanh long, làm giàn nho cành nhỏ làm củi đốt

Lá Neem thuộc loại lá kép lông chim một lần, dạng mác, bìa lá có khía hình răng cưa, cuống lá ngắn Cây ra lá non và khoảng tháng 2 – 4 và bộ lá thường xanh tốt quanh năm, không có thời kỳ rụng lá Một cây Neem cao 7,5 – 8m cho trung bình hàng năm khoảng 350 kg lá tươi (tương đương khoảng 50 kg lá khô) Lá Neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như: Nimbin, Nimbinene, Nimbandiol, Nimbolide, Quercetin có nhiều tác dụng trong việc chữa trị các vết thương lở loét,

vết thương làm độc, các bệnh về mắt, có thể dùng làm rau ăn vừa bổ sung khoáng chất vừa có tác dụng phòng ngừa giun sán hoặc viêm nhiễm đường ruột

Hình 2.3 Lá và trái Neem trồng tại Ninh Thuận

Trái Neem có hình bầu dục, trơn láng và dài khoảng 2cm Trái hình thành, phát triển và chín trong khoảng 1-2 tháng Thông thường trái chín từ tháng 6 – 8, trái Neem khi chín có vị ngọt, có thể ăn được, phần thịt bên trong có chứa hạt màu sáng, chiều dài khoảng 1,5 cm, chứa 1-2 nhân hạt màu nâu bên trong Thời điểm thu hoạch tốt nhất là lúc trái vừa chuyển sang màu xanh vàng và nên thu hoạch khi trái còn ở trên cây Cây Neem trưởng thành mỗi năm có thể cho 30 – 50 kg trái tươi Trái Neem được dùng làm thuốc tẩy giun, thuốc giảm đau và thuốc trị bệnh đường tiết niệu, bệnh trĩ Nước thịt quả khi phun lên cây có thể xua đuổi côn trùng, diệt các

ổ bệnh như dịch tả, sốt xuất huyết …

Theo nghiên cứu của Phân viện cơ điện nông nghiệp và công nghệ sinh học năm 2002, để bảo quản hạt Neem sau thu hoạch không bị mất các hàm lượng có chứa các hoạt chất sinh học thì việc thu hoạch và sơ chế hạt phải thực hiện theo các bước sau:

- Thu hoạch: Trái Neem được hái khi chín, trái có màu vàng nhạt, không được hái trái xanh vì tỷ lệ nảy mầm và hàm lượng dầu thấp Khi chín trái dài khoảng 2cm, có hình oval Phần thịt bên trong có chứa hạt màu sáng, chiều dài

khoảng 1,5 cm, chứa 1-2 nhân hạt màu nâu bên trong Cường độ hô hấp trái Neem rất cao trong giai đoạn chín (400 ml CO2/kg/giờ), chứng tỏ hoạt động sinh lý của trái Neem diễn ra rất mạnh, thoát nước rất nhiều và cần nhiều oxy, vì vậy không nên

sử dụng các loại bao bì PE, PP đựng trái và hạt, phải sử dụng loại bao đay, bao vải Sau khi hái trái phải được trải mỏng 2-3 cm ra nền thấm nước tốt để thoát nước, tránh hư hỏng trái

- Sơ chế: Sau khi thu hoạch cần phải nhanh chóng bóc phần thịt quả càng nhanh càng tốt Ngâm trong nước lạnh trong vài giờ làm cho phần thịt quả rời ra Trái sau đó cọ xát mạnh bằng nước sạch và ngâm trong nước để tách hạt khỏi phần thịt quả Hạt sau khi tách ra được trải mỏng ra, phơi nắng từ 3-4 ngày trên sàn hoặc sân phơi thấm nước Quá trình hong khô phải được tiến hành cẩn thận vì những hạt

chưa khô dễ bị nhiễm mốc, chủ yếu là Aspergillus sp gây ra Sau khi hong khô đạt

ẩm độ khoảng 12% đựng hạt trong các bao vải, bao đay, bao bố tránh đựng hạt trong các túi nylong làm ảnh hưởng đến sự hô hấp của hạt và làm giảm phẩm chất tinh dầu cũng như các hoạt chất sinh học Không dùng các hạt có nhân màu đen để đem gieo hoặc ép tinh dầu

Nhân hạt Neem chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học như azadirachtin, salanin, meliantriol … Dầu chiết từ nhân hạt Neem được dùng để sản xuất thuốc giảm đau, thuốc sát trùng … Ngoài ra, dầu hạt Neem còn được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng và nhiều ngành công nghiệp khác

Hình 2.3 Nhân hạt Neem tại Ninh Thuận

2.1.2 Dược tính

Hợp chất nimbidol được trích từ hạt Neem có tính hạ sốt và trị sốt rét Các công trình của Obaseki cho thấy dịch trích trong quả của loài cây này nếu cho uống thì có hiệu quả trên chuột nhắt đã nhiễm ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoelli-nigeriensis [21]

Theo Abatan, dịch trích metanol của lá Neem có tác dụng trên ký sinh trùng

ở chuột nhắt đã nhiễm Plasmodium berghei với liều lượng 500 mg/kg trong 4 ngày [8]

Hợp chất nimbidin được trích từ hạt Neem có tác dụng chống viêm loét bao

tử, trị phong thấp Nimbidin có ức chế nấm da, tóc Tinea rubrum Dung dịch nimbidin còn ức chế vi trùng lao

Hợp chất mahmoodin, trích từ dầu Neem được thử nghiệm tính kháng khuẩn trên các vi khuẩn gram dương và gram âm

Hợp chất natri nimbidinat và natri nimbinat là dẫn xuất của nimbidin và nimdin có tính diệt côn trùng

Omkar Parshad và cộng sự đã nghiên cứu về dịch chiết nước và dịch sterol của lá Neem tác động đến khả năng thụ thai của chuột Các tác giả cho rằng, trong dịch chiết sterol có chứa azadirachtin và những limonoid có tác dụng ngăn chặn sự sản sinh hormon tạo hoàn thể [22]

Parshad và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng an thần đối với chuột của dịch chiết sterol thô của lá Neem Dịch chiết sterol thô của lá Neem được đưa vào chuột với liều 100 mg/kg trọng lượng chuột, 2 lần trong một tuần, liên tục trong 6 tuần, nhận thấy có tác dụng làm giảm hoạt động của thần kinh tự phát ở chuột, do đó dịch chiết này có tác dụng an thần ở chuột Các tác giả cho rằng, đó là do dung dịch chiết của lá Neem có tác động đến thần kinh trung ương hoặc lực của cơ vận động và không ảnh hưởng đến thần kinh ngoại biên [22]

Năm 1873, Alfre Petelot và Broughton đã cô lập từ các bộ phận của cây Neem một chất nhựa rất đắng có tên azadin, có chứa D-glucosamin, arabinoz, galactoz, dùng trong nghề nhuộm Theo Alfre Petelot, còn cho biết lá có hoạt tính diệt côn trùng, khi cháy cho khói có mùi khó chịu và giết được côn trùng [9]

Khảo cứu dược lý học của Luscombe cho thấy lá cây Neem có tác dụng kháng virus Tác dụng của cây này trên hệ thống tim mạch đã được thử nghiệm, với dịch trích nước của lá thì làm nhịp tim ở thỏ giảm đi trong khi ở chuột lang thì trở nên mất cảm ứng với dược liệu này [26]

Theo Shimizu Masaki, tính chất chống khối u được ghi nhận với dịch trích nước của rễ và lá trên chuột do Polysacharid gọi là N9G1 [20] Ngoài ra, dịch trích của Neem có ảnh hưởng lớn đối với côn trùng như gây ngán ăn, chất xua đuổi hay

ức chế tăng trưởng của côn trùng

2.1.3 Các hợp chất limonoid trong cây Neem

Các hoạt chất sinh học từ cây Neem được chia thành hai nhóm chính là Isoprenoid và các chất không phải là Isoprenoid như các hợp chất polyphenolic (Flavonoid, Flavonoglycoside, Dihydrochalcone, Tanin, Coumarin), các hợp chất Cacbonhydrate, protein và các hợp chất sulfua dễ bay hơi Các hoạt chất sinh học

thuộc nhóm Isoprenoid gồm 24 chất thuộc diterpenoid, triterpenoid (hay còn gọi là limonoid) được chia thành 8 nhóm nhỏ: protomeliacin, limonoid với chuỗi bên xác định, azadirone và dẫn xuất, gedunin và dẫn xuất, valasinin và 3 nhóm C-seco-meliacin là nimbin, salanin và azadirachtin (Theo bảng 2.1)

Về mặt cấu trúc, limonoid là một dẫn xuất của triterpenoid có khung cơ bản

là 4, 4, 8-trimethyl-17-furamyl-steroid với 5 vòng A, B, C, D, và E theo hình 2.5

Trừ vòng furan E rất ít bị thay đổi, 4 vòng A, B, C, D có thể bị oxy hóa ở nhiều mức độ khác nhau, dựa vào tính chất oxy hóa của các vòng, người ta có thể xếp các hợp chất limonoid vào nhiều nhóm khác nhau

E O

1 2

11

12

13 14

15 19

30

18

17 16 22

23 21

Hình 2.4 Cấu trúc Limonoid

Bảng 2.1 Các hợp chất limonoid trong cây Neem

Tên hoạt chất Công thức

phân tử

Phân tử lượng

Điểm nóng chảy

Nguồn cô lập

17-β-hydroxy-

azadiradione

7-Desacetyl gedunin C26H32O6 440 259-62 Quả, vỏ cây 7-Desacetyl-7-benzoyl

Nimbidinin C26H36O6 442 282,2 Dầu hạt 1,3-Diacetyl vilasinin C30H40O7 512 157-8 Dầu hạt

Các hợp chất C-secomeliacin với chuỗi bên γ-hydroxybutenolide

Bảng 2.2 Hàm lƣợng Azadirachtin trong nhân, cành, lá, rễ và thân cây Neem

Bộ phận từ cây Neem Độ ẩm (% m/m) Hàm lƣợng Azadirachtin (mg/

100g tính luôn ẩm độ)

azadirachitin cao nhất 6,10 ± 0,70 mg/g và thấp nhất là tại Mali với hàm lượng 2,05

mg/g Theo Bảng 2.3

Bảng 2.3 Hàm lượng Azadirachtin trong nhân hạt nem ở các nước

Quốc gia Hàm lượng Azadirachtin (mg/g ± SE)

2,05

3.03 ±0,63 3,4 ±0,67 5,14±1,8 3,40±0,34 6,10±0,70 5,20±1,10

4,90

Các hợp chất limonoid chính trong lá Neem gồm Nimbin, Nimbidin, Nimbidol, sodium nimbinate, geduin, và các hợp chất limonoid chính trong lá Neem khô tại tỉnh Ninh Thuận gồm azadirachtolid A, azadirachtolid B, 6-Desacetylnimbin

và azadirachtolid [3] và các hợp chất limonoid chính trong nhân hạt Neem là Nimbin, 6-Desacetylnimbin, Salanin và Azadirachtin [3]

H

H3CO

1 2

8 9 10

11 12

14 13

22 23

6 29

31

C

H OH

C

H

O O

H3CO

O

O H H

H

H3CO

1 2

8 9 10

11 12

14 13

O

O

OC

OCH3O

1 2 3

4 5

10

6 7

8 9 11

12

13

14

15 1617

O

HHO

OC

H

C

CH3O

H

1 2 3

4 5

10

6 78 9

19 11

12

13

14 1516 17 18

20 21

22 23

1' 2' 3' 4'

5'

6' 33

31 30

Hình 2.6 Các hoạt chất chính trong lá và hạt Neem

2.2 Các phương pháp trích ly limonoid từ hạt Neem

2.2.1 Phương pháp sử dụng dung môi

Để trích ly limonoid trong hạt Neem, hạt Neem phải được thu hoạch và bảo quản theo đúng quy trình, độ ẩm khoảng 13% Hạt đem đi tách nhân, ép được dầu

từ nhân hạt Neem và bã ép Dầu ép được và bã ép làm nguyên liệu đầu vào cho quá trình trích ly limonoid theo quy trình sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình trích ly tổng quát đối với nguyên liệu hạt Neem [2]

Để trích ly các hoạt chất sinh học trong hạt Neem có thể sử dụng các dung môi chiết xuất có tính phân cực khác nhau như nước, methanol, ethanol, methylene chloride, chloroform, hexane, methylethylketone, butanol, petroleum benzene, ether, acetone, methyl tertbutyl ether, diethylcarbonate, [19]

Theo nghiên cứu của Trần Kim Quy và Trần Lê Quan, 2007 thì hàm lượng limonoid trích ly với dung môi ethanol thu được trong lá Neem (ẩm độ 12%) là 0,28% [6] Hàm lượng limonoid trong hạt Neem (ẩm độ 10%) khoảng 0,35 – 0,4% [17]

Ngoài ra để giảm thời gian trích ly và tăng hiệu suất trích ly [13] Nguyên liệu được xử lý vi sóng ở tần số 2450MHz, 300W trước khi đem trích ly bằng dung môi (methanol và Dichloromethan) Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng vi sóng thời gian trích ly giảm khoảng 450 lần so với phương pháp sử dụng dung môi thông thường nhưng hàm lượng azadirachtin trích ly là tương đương nhau

Tác

h

Ép

Bảng 2.4 So sánh phương pháp trích ly bằng dung môi có hỗ trợ vi sóng

Phương pháp trích ly Điều kiện trích ly Hàm lượng Azadirachtin

trích ly (%)

Trích ly có hỗ trợ vi sóng 4,5 phút, 650C, 150W 15,34 ± 085

2.2.2 Phương pháp hiện đại, trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn

Lưu chất siêu tới hạn (SCFs) đang ngày càng thay thế các dung môi hữu cơ được sử dụng trong công nghiệp và hoạt động tinh chế, trích ly các chất Việc ứng dụng các quy trình dựa trên SCF đã giúp loại bỏ việc sử dụng hexane và methylene chloride làm dung môi và loại bỏ dư lượng dung môi còn tồn dư không mong muốn trong sản xuất Một hệ thống trích ly siêu tới hạn cơ bản gồm một bình lưu chất (CO2, ), một bơm cao áp nhằm nén khí lên trạng thái siêu tới hạn, một bình trích có khả năng hiệu chỉnh được nhiệt độ và một bình thu hồi sản phẩm

Để thực hiện trích ly đầu tiên khí được bơm nén lên tới áp suất trích (lớn hơn

áp suất tới hạn) rồi được hiệu chỉnh ở nhiệt độ thích hợp (lớn hơn nhiệt độ tới hạn) Khí lúc này ở trạng thái thái siêu tới hạn Trong điều kiện trạng thái siêu tới hạn, khí siêu tới hạn chỉ tồn tại ở một pha duy nhất, được xem là trạng thái trung gian giữa hai khí và pha lỏng Tính chất hòa tan các chất trong mẫu có hiệu quả như trong chất lỏng đồng thời khí siêu tới hạn có khả năng chuyển động xuyên suốt trong khối vật liệu giống tính chất của bình thu hồi Tại bình thu hồi nhiệt độ và áp suất giảm trở lại làm cho trạng thái khí siêu tới hạn trở lại trạng thái khí, tách rời hoàn toàn khỏi các chất hòa tan đã trích ra

Sử dụng phương pháp trích ly siêu tới hạn với dung môi chiết suất CO2 để trích ly hoạt chất azadirachtin trong nhân hạt Neem Ấn độ ở quy mô thí điểm với điều kiện nhiệt độ khảo sát 20-400

C, tốc độ bơm lưu chất khảo sát ở mức 20 – 100 kg/giờ, áp suất bình trích ly ở điều kiện 300 bar Kết quả ở tỷ lệ giữa lưu chất CO2

và nguyên liệu 119, với nhiệt độ 400C thu được 2291 mg/kg azadirachtin trong nhân hạt Neem [23]

2.3 Tính chất vật lý của họ Limonoid

Limonoid là hợp chất có vị đắng đặc biệt, thường tồn tại ở dạng este rất kém bền [14] Khi chiết, limonoid rất dễ bị biến đổi do nhiệt độ cao, ánh sáng, pH của môi trường hay sự có mặt của các chất oxi hóa khử, vì vậy việc phân lập chúng rất

khó khăn Các limonoid thường có tính chất như:

- Kết tinh được trong MeOH, MeOH-H2O, EtOH, EtOAc

- Điểm tan chảy thường cao( > 2000C ) và kèm theo sự phân hủy

- Không tan trong nước, khó tan trong heptan, hexan, tan trong ete etylic, MeOH, EtOH, rất dễ tan trong CHCl3, CH2Cl2, EtOAc

- Trên phổ IR, ngoài các pic vùng 1750 – 1700 cm-1 của nhóm cacbonyl ( este, ceton) còn có các pic khác khá chuyên biệt của vòng furan tại 3150 cm-1, 1500

cm-1 870 cm-1 [24]

- Trên phổ 1H – NMR, vòng furan thế β sẽ có 3 tín hiệu dặc trưng (1 tín hiệu vùng δH bằng 6,5 ppm và 2 tín hiệu vùng 7,4 ppm) [10, 11] Nếu có số nhóm cetofuran thì δH của proton ở vị trí α trong vòng furan sẽ dời khoảng 0,7 ppm về phía trường thấp (δH >8ppm) Hằng số ghép đôi (J) của các tín hiệu này thường < 2Hz Nếu các vòng lacton α-β chưa bão hào thì các proton -CH=CH- này sẽ có tín hiệu đặc trưng của hệ thống AB tại vùng trường cấp δH = 5-6 ppm) Các proton thuộc nhóm metyl đính ở khung của limonoid thường cho các tín hiệu mạnh tại vùng 1 – 5 ppm

- Trên phổ 13C – NMR cũng cho tín hiệu vùng δC = 200 ppm Đăc biệt vòng furan thế cho 4 tín hiệu chuyên biệt (2 tín hiệu ở vùng δC = 140 ppm, 1 ở vùng δC =

120 ppm và 1 ở vùng δC = 110 ppm ) Đây cũng là một số gợi ý trong việc định hướng cấu trúc [14, 16, 25, 27]

- Trên các khối (MS), sự phân mảnh rất phức tạp tùy theo cấu trúc của từng nhóm khung limonoid [4], của từng chất cụ thể đưa đến nhiều khó khăn trong việc xác định cấu trúc limonoid

2.4 Tính chất hóa học của limonoid

Nói chung, limonoid là các dẫn xuất của triterpennoid giàu oxi Do xuất phát

từ triterpen, khi sắp xếp lại cấu trúc thì đa số các trường hợp, mạch nhánh sẽ bị cắt 4 cacbon (C-24, C-25, C-26, C-27) nên nhóm limonoid còn được gọi là tetranortriterpenoid để phân biệt với các “ proto -limonoid” còn đủ 30 cacbon

Các limonoid có cấu trúc kém bền do cấu trúc có vòng epoxy, lacton hay nhóm chức este Với sự có mặt của các axit / kiềm hay tác nhân oxi hóa khử sẽ xảy

ra sự sắp xếp lại cấu trúc limonoid Do vậy việc chiết xuất chúng phải thực hiện trong điều kiện nhẹ nhàng

Một số thuốc thử dùng để phát hiện limonoid trên sắc kí lớp mỏng:

- Ce(SO4)3 trong H2SO4 rồi sấy bản mỏng [25]

- Vananilin trong trongH2SO4 [25]

- Thuốc thử Erhlich ( p-dimethylamio benzaldehid 5% trong EtOH rồi hơ hơi HCl) Thường chỉ soi UV 254 nm hoặc phun H2SO4 rồi sấy bản mỏng

2.5 Các phương pháp xác định limonoid

2.5.1 Phương pháp sắc kí khí – khối phổ (GC – MS)

Phương pháp sắc kí khí - khối phổ GC - MS (gas chromatography- Mass Spechrmetry) dựa trên cơ sở ghép máy sắc kí khí với một máy khối phổ, người ta sử dụng khối phổ để phân tích những phân đoạn sắc kí khí, xác định cấu tử nào đó trong hỗn hợp cần phân tích Với những ưu điểm như: việc phân tích định tính các cấu tử của hỗn hợp được tách trong cột có thể tiến hành liên tục không cần tách các chất ra khỏi cột, và ngay cả lượng chất nhận được khi phân tích trên cột mao quản cũng hoàn toàn đủ để phân tích khối phổ, như vậy máy khối phổ có thể thực hiện chức năng của một detector Đây là phương pháp nhanh và hiệu quả trong việc xác định thành phần các chất tổng hợp

Phương pháp khối phổ nghiên cứu bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất

đó Chất nghiên cứu trước tiên được chuyển thành dạng hơi, sau đó chuyển thành các ion, các ion tạo thành được đưa vào máy khối phổ Qúa trình biến các phân tử trung hòa thành các ion gọi là ion hóa

Các ion có khối lượng m và điện tích e Tỷ số m/e được gọi là số khối z Khi tách các ion có số khối khác nhau và xác định xác suất có mặt của chúng, người ta vẽ đồ thị mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay còn gọi là cường độ I) và số khối z Đồ thị đó gọi là phổ khối lượng Để đánh giá chất lượng của khối phổ kế, người ta dùng khái niệm “độ phân giải R”

R= m/ m

Trong đó:

m: Khối lượng ion

m: hiệu số khối lượng 2 ion có thể tách ra khỏi nhau

Phương pháp tìm các chất theo khối phổ của chúng là, chuyển liên tục hỗn hợp khí

đi ra khỏi cột sắc kí vào nguồn ion của máy khối phổ Máy khối phổ được điều hưởng theo một khối lượng nhất định Bộ tự ghi của máy khối phổ ghi sắc khối phổ đồng thời với bộ tự ghi của máy sắc kí Sự xác thực dựa vào việc xác định chỉ số của sắc phổ cơ bản với cường độ của các vạch được đo theo khối phổ Khi đó, độ nhạy của máy khối phổ đối với một chất có khối lượng M có thể dùng để đặc trưng cho một chất nếu trong phổ chỉ có một vạch ứng với khối lượng M

2.5.2 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC

Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi băng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học trên bề mặt

Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: định tính, sắc ký điều chế, định lượng và xác định giới hạn tạp chất

Quá trình phân tách trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau Khi pha động di