TỔNG QUAN
Sản phẩm nectar quả hỗn hợp
Sản phẩm được tạo ra bằng cách kết hợp purée quả với nước đường theo tỉ lệ nhất định, thường chứa từ 35-70% purée quả tùy thuộc vào nguyên liệu và loại sản phẩm Để nâng cao hương vị và duy trì màu sắc tự nhiên, acid citric hoặc acid ascorbic thường được thêm vào.
Puree quả trong sản xuất nectar là sản phẩm chưa bị lên men nhưng có thể lên men thu được bằng biện pháp thích hợp
Trong rau quả, dịch quả chứa nhiều chất dinh dưỡng quý giá như đường, acid hữu cơ và vitamin, mang lại hương vị thơm ngon và hấp dẫn Sự cân đối của các chất này là yếu tố chính tạo nên giá trị dinh dưỡng cao của rau quả.
1.1.1 Quy trình sản xuất nectar rau quả
Phối chế Đồng hóa Đóng nắp
Xơ Đường, acid citric, vitamin C
1.1.2 Tình hình phát triển rau quả ở Việt Nam
Việt Nam sở hữu điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi cho việc trồng trọt rau, hoa, quả (RHQ), phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu Diện tích trồng RHQ trên cả nước khoảng 780 nghìn ha, với giá trị đạt 650 nghìn tỷ đồng, chiếm 9% GDP ngành nông nghiệp Kim ngạch xuất khẩu RHQ tuy có xu hướng tăng nhưng còn chậm, từ 230 triệu USD năm 2005 lên 431 triệu USD năm 2009 Nhiều mô hình phát triển sản xuất và xuất khẩu RHQ hiệu quả đã xuất hiện, với giá trị sản xuất trên 1 ha đạt 400 – 500 triệu đồng/năm, và một số trang trại đặc biệt đạt hơn 1 tỷ đồng, trong khi một số doanh nghiệp xuất khẩu hàng chục triệu USD mỗi năm.
Ngành sản xuất RHQ xuất khẩu tại Việt Nam có khả năng tạo ra thu nhập cao và thể hiện tiềm năng lớn trong lĩnh vực nông nghiệp.
Ngành hàng rau, hoa Việt Nam đang đối mặt với những vấn đề hạn chế xuất khẩu chiến lược, bao gồm thiếu hệ thống tiếp thị hợp tác và cơ sở hạ tầng hỗ trợ như kho vận lạnh và giao thông nội vùng Sự thiếu hụt người sản xuất có năng lực xuất khẩu cùng với chất lượng hoa không đồng đều cũng là những yếu tố cản trở Đặc biệt, giống cây trồng là yếu tố quan trọng, khi phần lớn giống rau, hoa hiện nay chủ yếu nhập khẩu, dẫn đến khó khăn trong kinh doanh xuất khẩu Việt Nam cũng phải chi tới 200 triệu USD mỗi năm để nhập khẩu hạt giống, ảnh hưởng tiêu cực đến sản xuất nông nghiệp.
TIÊU CHUẨN CHO NGUYÊN LIỆU
Yêu cầu nguyên liệu
Để chế biến nectar chất lượng, nguyên liệu cần có hàm lượng cao các chất khô hòa tan, đường, acid hữu cơ, tannin, và các hợp chất thơm, màu sắc hấp dẫn Các chỉ tiêu quan trọng nhất bao gồm khối lượng riêng, hàm lượng chất khô và độ acid của dịch quả Quả tươi tốt và đạt độ chín thích hợp là yếu tố quyết định; nếu quả chưa chín, màng tế bào sẽ cứng, dịch bào ít, dẫn đến nhiều phế liệu và dịch quả có hàm lượng đường thấp, acid cao, cùng màu sắc và hương vị không hấp dẫn.
Nguyên liệu chế biến nectar thường là các loại quả khó tách dịch bào như chuối, mơ, mận ổi, và mãng cầu Ngoài ra, nectar cũng có thể được làm từ một số loại rau củ như cà chua, cà rốt, hoặc từ hỗn hợp nhiều loại quả khác nhau.
Yêu cầu kỹ thuật
2.2.1 Giới hạn kim loại nặng trong sản phẩm
- Bảng 2.1 Giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong sản phẩm
Chì (Pb) 0,3 mg/kg 1) Đồng (Cu) 5 mg/kg
Tổng hàm lượng đồng, kẽm và sắt 20g/kg
2.2.2 Giới hạn độc tố vi nấm Đối với độc tố vi nấm theo tiêu chuẩn chỉ cần xác định về hàm lượng Patulin không quá 50 mg/l
- Hàm lượng etanola không được vượt quá 3 g/kg.
2.2.3 Giới hạn các chất phụ gia được phép sử dụng
- Bảng 2.2 Giới hạn các chất phụ gia trong sản phẩm
Phụ gia Mức tối đa
Axit xitirc Giới hạn bởi GMP *
Axit malic Giới hạn bởi GMP
Axit L-Ascocbic 400 mg/kg trong thành phẩm
Cacbon dioxit Giới hạn bởi GMP
2.2.4 Giới hạn vi sinh vật có trong sản phẩm
- Bảng 2.3 Giới hạn vi sinh vật trong sản phẩm
Chỉ tiêu Giới hạn tối đa
Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/ml sản phẩm
E coli, CFU/ml Không được có
Streptococci faecal, CFU/ml Không được có
Pseudomonas aeruginosa, CFU/ml Không được có
Staphylococcus aureus, CFU/ml Không được có
Clostridium perfringens, CFU/ml Không được có
Tổng số nấm men và nấm mốc, CFU/ml 10
2.2.5 Yêu cầu nước sử dụng để chế biến
Nước dùng để chế biến đồ uống không cồn cần tuân thủ các tiêu chuẩn chất lượng theo QCVN 01:2009/BYT, được quy định trong Thông tư số 04/2009/TT-BYT ngày 17/6/2009 của Bộ Y tế.
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU CỦA NGUYÊN LIỆU 13 3.1 Xác định chì, cadimi, kẽm, đồng và sắt theo TCVN 8126:2009
Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này hướng dẫn phương pháp xác định kẽm, đồng và sắt trong thực phẩm thông qua quang phổ hấp thụ ngọn lửa (FAAS), đồng thời xác định hàm lượng cadimi và chì bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò graphit (GFAAS) sau khi thực phẩm được phân hủy bằng vi sóng.
Tiêu chuẩn này không áp dụng cho các loại thực phẩm có hàm lượng chất béo lớn hơn hoặc bằng 40 % và không áp dụng cho sữa bột.
Nguyên tắc
Sản phẩm được phân hủy bằng axit nitric và hydro peroxit dưới áp suất cao trong lò vi sóng, sau đó dung dịch thủy phân được pha loãng bằng nước Chì và cadimi được xác định qua phương pháp GFAAS, trong khi kẽm, đồng và sắt được xác định bằng FAAS.
Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã loại ion, có điện trở ≥ 18 M.cm.
Cách tiến hành
Dùng cân phân tích, cân từ 0,2 đến 0,5 gam mẫu dạng khô, chính xác đến 0,1 mg cho vào bình phân hủy Teflon.
Thêm 5 ml axit nitric và 2 ml hydro peroxit vào bình phân hủy Đậy nắp, đặt bình vào giá đỡ rồi đưa vào lò vi sóng rồi đóng cửa lò Đặt chương trình của lò theo các thông số trong Bảng sau và bắt đầu phân hủy.
Các thông số chương trình đối với lò vi sóng
Chương trình vận hành của lò chỉ có hiệu lực khi 12 bình được phân hủy đồng thời Nếu chỉ có một số bình được phân hủy, các bình còn lại cần được làm đầy với thuốc thử trắng Khi sử dụng lò vi sóng khác với chương trình và thông số khác, có thể cần điều chỉnh chương trình thời gian/công suất cho phù hợp.
Sau khi lấy các bình phân hủy ra khỏi lò vi sóng, hãy để chúng nguội hoàn toàn trước khi mở Khi mở bình, cần tráng nắp và thành bình bên trong Tiếp theo, chuyển dung dịch sang bình chất dẻo và xử lý mẫu trắng tương tự như mẫu thử Đối với mỗi mẻ, cần thực hiện một phép thử trắng.
Nếu dung dịch thử có nồng độ kim loại cao và cần pha loãng, hãy sử dụng axit nitric 3M để duy trì nồng độ axit thấp trước khi xác định kim loại bằng máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Nồng độ axit cao không phù hợp với môi trường và có thể làm suy giảm tín hiệu phân tích Để giảm nồng độ axit, cần pha loãng một nửa dung dịch thử với axit nitric 0,1 M và một nửa dung dịch chuẩn với axit nitric 3 M, giúp hai dung dịch có cùng nồng độ axit Việc duy trì nồng độ axit thích hợp là rất quan trọng khi sử dụng đường hiệu chuẩn.
3.1.4.3 Đo quang phổ hấp thụ nguyên tử
Để xác định hàm lượng kim loại, nên sử dụng kỹ thuật đo FAAS vì nó ít bị nhiễu hơn so với GFAAS Các thông số như chương trình nhiệt độ hỗn hợp khí, bước sóng và các thông số thiết bị khác cần được tham khảo từ sổ tay đi kèm với thiết bị Đừng quên hiệu chỉnh nền để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.
Khi sử dụng phương pháp thêm chuẩn, các phép đo cần nằm trong dải tuyến tính với đường chuẩn gồm ít nhất ba điểm, trong đó có hai điểm chuẩn Nồng độ chất chuẩn cao nhất phải gấp 3 đến 5 lần nồng độ dung dịch thử, trong khi nồng độ chất chuẩn thấp hơn nên ở khoảng một nửa nồng độ chất chuẩn cao nhất Phương pháp thêm chuẩn được đơn giản hóa bằng cách sử dụng đường chuẩn phù hợp với chất nền, cho phép áp dụng cho các sản phẩm có cùng chất nền Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được trộn để tạo đường bổ sung chuẩn, với đường này được tạo song song từ gốc tọa độ và có cùng tỷ lệ pha loãng Do đó, đường chuẩn sẽ phù hợp với chất nền và dung dịch thử, đảm bảo cùng nồng độ chất nền Trong các thiết bị hiện đại, chức năng này thường được tích hợp sẵn trong phần mềm.
Nồng độ kẽm, đồng và sắt có thể được xác định hiệu quả bằng phương pháp FAAS Để đảm bảo độ chính xác, các dung dịch chuẩn và dung dịch thử cần có cùng nồng độ axit khi sử dụng đường hiệu chuẩn.
Sắt có thể bị ảnh hưởng đáng kể bởi chất nền, vì vậy việc sử dụng phương pháp thêm chuẩn hoặc các chuẩn tương thích với chất nền là cần thiết Nếu phát hiện có nhiễu mạnh, có thể thay thế bằng ngọn lửa oxi hóa axetylen nitơ oxit.
Kỹ thuật này thường được áp dụng để xác định nồng độ chì và cadimi trong thực phẩm, sử dụng cuvet nhiệt phân có đế Phương pháp này cho phép tạo ra dải pha loãng phân tích rộng, do đó cũng có thể được sử dụng để xác định đồng.
Nên sử dụng phương pháp thêm chuẩn phù hợp với chất nền, trừ khi sự khác biệt giữa độ dốc của đường hiệu chuẩn và đường bổ sung không đáng kể Khi áp dụng phương pháp này, các phép đo cần nằm trong dải tuyến tính Cần thiết lập chương trình cho bộ lấy mẫu tự động để phân phối thể tích tối ưu nhằm đạt độ hấp thụ lớn nhất trong dải tuyến tính, với độ hấp thụ nền không vượt quá 0,5 đơn vị Việc bơm nhiều có thể làm tăng độ hấp thụ ở nồng độ thấp Đánh giá mỗi chất nền mới thông qua đồ thị sử dụng tro hóa và nguyên tử hóa để tối ưu hóa các thông số của lò graphit.
Tính và biểu thị kết quả
Công thức tính nồng độ là C = (a−b)d f × 25 m (1), trong đó: a là nồng độ trong dung dịch thử (mg/l), b là nồng độ trung bình trong dung dịch trắng (mg/l), d f là hệ số pha loãng, và m là khối lượng mẫu thử (g).
Nếu giá trị (a - b) thấp hơn giới hạn phát hiện (DL) thì (a-b) được thay bằng DL để tính giới hạn phát hiện trong mẫu thử.
Nếu dung dịch thử đã được pha loãng, thì phải tính cả hệ số pha loãng (d f ).
Nếu mẫu thử được làm khô và kết quả được tính dựa trên khối lượng tươi, nồng độ kim loại trong mẫu thử, C FW, được biểu thị bằng (mg/kg) và tính theo công thức (2).
C là nồng độ của kim loại trong mẫu thử đã làm khô, tính bằng miligam trên kilôgam
(mg/kg), tính theo công thức (1);
W là hàm lượng nước của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm (%), tính theo công thức
W f là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
W d là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g).
Khi tiến hành phép thử lặp lại thì lấy kết quả trung bình đến 3 chữ số có nghĩa.
3.2 XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG N-METYLCARBAMAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHA RẮN
Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật N-methylcarbamate trong ngũ cốc, rau và quả bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Nguyên tắc
Mẫu được đồng hóa với axeton, diclometan và dầu nhẹ, sau đó ly tâm tạo ra hai lớp nổi phía trên Lớp nước phía trên được bay hơi đến khô, và dịch chiết có thể làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) với cột silica gắn aminopropyl Trong dung dịch chiết, M-metylcarbamat được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo có thủy phân sau cột Metylamin phản ứng với o-phthaldialdehyd và 2-mercaptoetanol, với các dẫn xuất được phát hiện bằng detector huỳnh quang.
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu trắng thuốc thử cùng với các mẫu trắng chất nền, sau đó thực hiện các phép thử thu hồi để đảm bảo tuân thủ các giới hạn dư lượng tối đa.
3.2.3.2 Cách chiết Đồng hóa 15 g (m) thử với 30 ml axeton 30 s trong ống ly tâm Thêm 30 ml diclometan và 30 ml dầu nhẹ và đồng hóa tiếp trong 30 s Ly tâm ống 5 min ở tốc độ
4000 min -1 Gạn lớp phía trên (hữu cơ) cho vào bình nón.
Chuyển từng phần 2 ml lớp này sang ống nghiệm và thêm 50 μl dung dịch hãm.Cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô.
Hút 1 ml diclometan cho qua cột SPE được gắn với thiết bị rửa giải thích hợp, rồi gạn bỏ dịch rửa giải Hòa tan phần cặn thu được trong 8.2 bằng 1 ml diclometan Cho dung dịch này vào ống SPE, dùng 0,5 ml diclometan để tráng và bắt đầu thu lấy dịch rửa giải cho vào ống nghiệm Tiếp tục rửa giải bằng 1 ml hỗn hợp rửa giải SPE, thu lấy dịch rửa giải này vào cùng ống nghiệm và cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô.
Đo HPLC
Hòa tan cặn thu được trong trong 1 ml dung dịch chuẩn nội trên thiết bị siêu âm
Lọc dung dịch qua màng lọc và bơm 100 μl vào hệ thống HPLC với cột bảo vệ và cột phân tích Áp dụng chương trình gradient ba yếu tố với tốc độ dòng 0,75 ml/phút.
75% pha động A và 25 % pha động B trong 5 min, sau đó áp dụng tuyến tính từ 0
% pha động C đến 100 % pha động C trong 20 min, cuối cùng 100 % pha động C trong 5 min.
Để thực hiện quá trình rửa giải từ cột phân tích HPLC qua cột phản ứng, cần sử dụng cột thủy phân và duy trì nhiệt độ của cột phản ứng ở 120°C Để rửa giải cột thủy phân, thêm thuốc thử OPA với tốc độ 0,1 ml/phút thông qua chi tiết chữ T có thể tích chết thấp.
Cho hỗn hợp đi qua detector huỳnh quang Các bước sóng kích thích và phát xạ được cài đặt tương ứng 340 nm và 455 nm.
Tính kết quả
Để xác định sự hiện diện của N-metylcarbamat, cần so sánh thời gian lưu của các pic thu được từ dung dịch mẫu thử với dung dịch gốc thuốc bảo vệ thực vật Để định lượng N-metylcarbamat, sử dụng các dung dịch chuẩn với nồng độ từ 0,005 μg/ml đến 0,05 μg/ml Trong sắc ký đồ, đo chiều cao hoặc diện tích pic của hợp chất và trimethacarb chuẩn, sau đó tính thương số giữa hai giá trị này Đánh dấu lượng hợp chất trong 1 ml dung dịch chuẩn trên trục hoành và thương số trên trục tung Đối với pic của hợp chất từ dung dịch mẫu thử, tính thương số và đọc khối lượng từ đường chuẩn Cuối cùng, tính phần khối lượng, w, bằng miligam trên kilogam mẫu thử theo công thức: w=x m.
X là khối lượng của hợp chất đọc được từ đường chuẩn, tính bằng microgam ( μg ); m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
Cần thực hiện các phép thử để xác nhận việc nhận dạng và định lượng dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, đặc biệt trong các trường hợp vượt quá mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL).
Phương pháp cặp đôi sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là công cụ tiêu chuẩn để xác định và định lượng N-metylcarbamat Đối với những hợp chất không thể phân tích bằng sắc ký khí, các kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng với detector chuỗi diot quang (LC-DAD) sẽ là sự lựa chọn phù hợp.
Xác định patulin theo TCVN 8161: 2009
Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp xác định hàm lượng patulin trong nước táo và puree táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp đã được kiểm nghiệm trên các mẫu bị nhiễm tự nhiên và các mẫu bổ sung với nồng độ patulin từ 26 g/l đến 128 g/l trong nước táo, từ 26 g/l đến 106 g/l trong nước táo đục, và từ 23 g/kg đến 121 g/kg trong puree táo.
Nước táo đục và puree táo được xử lý bằng enzym pectinaza để chiết xuất patulin Patulin được tách ra từ nước táo hoặc puree đã xử lý bằng dung dịch etyl axetat Dịch chiết này sau đó được làm sạch qua quá trình chiết pha lỏng-lỏng với dung dịch natri cacbonat Tiếp theo, dịch chiết bằng etyl axetat được làm khô bằng natri sulfat khan Cuối cùng, sau khi bay hơi etyl axetat, patulin được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại (UV).
- Không cần chuẩn bị mẫu
Chuyển 20 ml ± 0,1 ml nước táo đục vào ống ly tâm và thêm 150 µl dung dịch enzym Sau đó, vặn chặt nắp và lắc kỹ bình Để hỗn hợp qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc ủ trong 2 giờ ở 40°C, rồi tiến hành ly tâm trong 5 phút với gia tốc 4500 g.
- Cân 10 g mẫu thử puree, chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm (5.7), thêm 150
Trộn 10 ml nước với dung dịch enzym (4.10) và lắc đều bằng máy đồng hóa tùy thuộc vào mẫu Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc 2 giờ ở 40°C, sau đó ly tâm trong 5 phút với gia tốc 4500 g.
Sử dụng pipet để lấy 10 ml nước táo trong hoặc nước táo đục đã chuẩn bị, sau đó cho vào phễu chiết 100 ml Đối với puree táo, lấy 10 ml mẫu đã chuẩn bị, tương đương với 5 g puree, và cho vào phễu chiết 100 ml.
Để thực hiện quy trình chiết, đầu tiên cho 20 ml etyl axetat vào và lắc trong 1 phút, sau đó để yên cho tách lớp và tách riêng hai pha vào hai bình nón khác nhau Tiếp theo, chuyển phần nước vào phễu chiết và chiết lại với 20 ml etyl axetat, sau đó để yên để tách lớp và chuyển lớp nước vào bình nón rỗng, còn lớp etyl axetat thì cho vào bình nón đã chứa lớp etyl axetat từ lần chiết đầu tiên Lặp lại quy trình chiết một lần nữa, nhưng sau khi tách lớp, bỏ lớp nước phía dưới Cuối cùng, gộp ba phần dịch chiết etyl axetat vào phễu chiết và rửa bình nón bằng 5 ml etyl axetat mới, sau đó gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết.
Loại bỏ các hợp chất acid gây nhiễu
Cho 4 ml dung dịch natri cacbonat vào phễu chiết chứa dịch chiết etyl axetat, lắc trong 30 giây, sau đó đợi tách lớp và tháo lớp nước phía dưới vào bình nón Rót lớp phía trên vào bình cầu đáy tròn qua phễu chiết và giấy lọc có 15 g natri sulfat khan Chuyển phần nước trở lại phễu chiết, tráng bình nón bằng 10 ml etyl axetat, cho nước tráng vào phễu chiết và lắc 30 giây Để yên cho tách lớp, tháo bỏ lớp nước phía dưới và cho lớp phía trên qua natri sulfat sang bình cầu đáy tròn Tráng phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho qua natri sulfat vào bình cầu đáy tròn để chuẩn bị dung dịch mẫu thử.
Để thu được dung dịch cô đặc, cho bay hơi dung dịch đến thể tích nhỏ hơn 1 ml trong chân không, sử dụng nồi cách thủy ở 40 độ C Chuyển lượng còn lại sang lọ thủy tinh, chú ý tránh phía trong bình cầu đáy tròn bằng etyl axetat để đảm bảo chuyển hết patulin Tiếp tục bay hơi đến khô bằng dòng nitơ trên tấm gia nhiệt hoặc nồi cách thủy Hòa tan cặn bằng cách thêm 1 ml nước (hoặc 500 µl với mẫu puree) vào lọ, sau đó sử dụng máy trộn Vortex để hòa tan hoàn toàn Cuối cùng, chuyển dung dịch mẫu thử sang lọ nhỏ của HPLC và lọc qua bộ lọc xyranh dùng một lần nếu cần thiết.
Sử dụng pipet, lấy 10 ml nước táo không chứa patulin cho vào phễu chiết 100 ml Tiếp theo, dùng pipet lấy 50 μl dung dịch chuẩn hoặc lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 μl patulin tuyệt đối và cho vào nước táo Đậy nắp bình và lắc kỹ để trộn đều Thực hiện các bước như đã mô tả trong mục 3.2 đến 3.4.
Sử dụng pipet để lấy 10 ml nước táo đục cho vào ống ly tâm Tiếp theo, dùng pipet lấy 50 µl dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 µg patulin tuyệt đối và cho vào nước táo đục không chứa patulin Đậy nắp bình và lắc kỹ để trộn đều, sau đó tiến hành theo hướng dẫn trong mục 3.1.2.
Cân 10 g puree táo không chứa patulin với độ chính xác 0,1 g và cho vào ống ly tâm Sử dụng pipet để lấy 50 µl dung dịch chuẩn hoặc lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 µg patulin tuyệt đối, sau đó cho vào puree táo Lắc kỹ để trộn đều dung dịch và tiến hành theo hướng dẫn trong mục 3.1.3.
- Dựng đường chuẩn trong ngày phân tích.
Dung dịch hiệu chỉnh patulin dùng cho HPLC
Chuẩn bị năm dung dịch chuẩn HPLC trong các bình định mức 2 ml riêng biệt theo Bảng 1 Sử dụng pipet để chuyển dung dịch chuẩn patulin cho quá trình hiệu chuẩn (4.14) Tiến hành pha loãng từng dung dịch chuẩn đến 2 ml bằng nước có pH 4 (4.5).
Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn làm việc patulin
Nồng độ khối lượng (g/ml)
Các điều kiện vận hành HPLC
- Tốc độ dòng của pha động (cột): 1,0 ml/min;
- Bước sóng của detector UV: 276 nm;
Thể tích bơm là 50 l Đọc giá trị từ đường chuẩn khối lượng patulin trong dung dịch mẫu thử đã được bơm lên cột HPLC, tính phần khối lượng patulin, wPAT, bằng nanogam trên mililit (hoặc gam đối với puree) theo công thức: wPAT = ma x V1.
Trong đó: ma là khối lượng patulin trong dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằng nanogam (ng);
V2 là thể tích phần dung dịch thử (3.4) được bơm lên cột, tính bằng mililit (ml);
V1 là thể tích dung dịch mẫu thử (3.4), (V1 = 1,0 ml đối với nước táo, V1 = 0,5ml đối với puree) tính bằng mililit (ml);
Ms là thể tích mẫu được chiết, tính bằng mililit đối với nước táo (ms = 10 ml) hoặc gam đối với puree (ms = 5 g).
Kết quả cuối cùng có thể được biểu thị bằng microgam trên lit (hoặc kilogam đối với puree) và tương đương với nanogam trên mililit (hoặc gam).
Định lượng coliform theo TCVN 6848 : 2007
Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung về định lượng coliform Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:
thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm. bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc sau khi ủ ở 30 C hoặc 37 C.
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ này cần được thỏa thuận giữa các bên có liên quan Trong trường hợp đối với sữa và sản phẩm sữa, thì nhiệt độ ủ là 30 C.
Kỹ thuật này được khuyến cáo sử dụng khi số lượng khuẩn lạc cần tìm dự kiến lớn hơn
100 trên mililit hoặc trên gam mẫu thử.
Vi khuẩn ở nhiệt độ 30 C hoặc 37 C sẽ tạo ra các khuẩn lạc đặc trưng trên thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể Điều này cho thấy khả năng lên men lactoza có sinh khí theo các điều kiện thử nghiệm quy định trong tiêu chuẩn.
Chuẩn bị hai môi trường đặc chọn lọc và lấy mẫu thử theo quy định, cụ thể là nếu sản phẩm ban đầu là chất lỏng, cần lấy một lượng mẫu nhất định; nếu sản phẩm ở dạng huyền phù, cũng cần tuân theo quy định về lượng huyền phù ban đầu.
Chuẩn bị các cặp đĩa môi trường chọn lọc trong cùng một điều kiện Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng và, nếu cần thiết, xác định số khuẩn lạc bằng phương pháp lên men lactose.
Số coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu thử được tính từ số khuẩn lạc đặc trưng thu được trên các đĩa được chọn.
3.4.4 Môi trường đặc chọn lọc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL)
Dịch thủy phân mô động vật bằng enzyme 7 g
Muối mật (bile salts) 1,5 g Đỏ trung tính 0,03 g
Nước 1 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông của thạch
Tiến hành như sau để giữ được tính chọn lọc và đặc trưng của môi trường.
Trộn đều các thành phần khô với nước và để yên trong vài phút Điều chỉnh pH về mức 7,4 ± 0,2 ở nhiệt độ 25 C sau khi đun sôi Đun sôi hỗn hợp và khuấy đều thỉnh thoảng cho đến khi tất cả các thành phần tan hoàn toàn.
Giữ sôi trong 2 phút Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 44
Để tránh quá nhiệt, cần duy trì nhiệt độ từ 47°C trở xuống và không đun môi trường quá lâu hoặc đun lại Do đó, không nên khử trùng trong nồi áp lực và cần kiểm tra độ vô trùng của môi trường trước khi sử dụng.
Sử dụng môi trường trong vòng 4 h sau khi chuẩn bị.
3.4.5 Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng
Dịch thủy phân casein bằng emzym 10 g Lactoza (C12H22O11.H2O) 10 g
Hòa tan các thành phần khô trong nước bằng cách đun nóng nhẹ trên nồi cách thủy Điều chỉnh pH sao cho đạt 7,2 ± 0,2 ở 25 °C sau khi khử trùng, nếu cần thiết.
Chuyển 10 ml môi trường vào từng ống nghiệm (6.7) chứa các ống Durham (6.8) Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 C Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng.
3.4.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm vi và cụ thể sau:
Thiết bị thanh trùng có thể là tủ sấy cho phương pháp khô hoặc nồi hấp áp lực cho phương pháp ướt, theo tiêu chuẩn TCVN 6404 (ISO 7218) Đĩa Petri, được làm từ thủy tinh hoặc chất dẻo, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.
Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml.
Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có khả năng hoạt động từ 44 C đến 47 C hoặc ở 100 C.
Thiết bị đếm khuẩn lạc bao gồm một nguồn chiếu sáng cùng với dụng cụ đếm cơ học hoặc điện tử Ống nghiệm có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm, trong khi ống Durham có kích thước tương thích với ống nghiệm, cụ thể là 6.7 mm.
Bình hoặc chai, để đun sôi và bảo quản môi trường cấy. pH met, chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25 C.
Que cấy vòng, bằng platin-iridi hoặc niken-crom, đường kính khoảng 3 mm, hoặc loại vòng cấy dùng một lần.
Lấy mẫu sản phẩm cần tuân theo các tiêu chuẩn cụ thể phù hợp Trong trường hợp không có tiêu chuẩn sẵn có, các bên liên quan cần thỏa thuận để xác định phương pháp lấy mẫu.
Chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 6507 (ISO 6887), TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra Trong trường hợp không có tiêu chuẩn cụ thể, các bên liên quan cần thỏa thuận với nhau để thống nhất phương pháp kiểm tra.
3.4.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu theo TCVN 6507 (ISO 6887) cùng các dung dịch pha loãng tiếp theo theo quy định của TCVN 6263 (ISO).
8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.
Chuẩn bị hai đĩa cho sản phẩm dạng lỏng hoặc mỗi bộ pha loãng đã chọn Sử dụng pipet vô trùng để cho vào tâm mỗi đĩa 1 ml mẫu thử hoặc dung dịch pha loãng thích hợp Đảm bảo sử dụng một pipet vô trùng cho mỗi dung dịch pha loãng.
Để thực hiện thí nghiệm, hãy rót khoảng 15 ml môi trường VRBL (5.3) vào mỗi đĩa Petri ở nhiệt độ từ 44 C đến 47 C Thời gian từ khi hoàn thành việc chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch pha loãng 1/10 đối với sản phẩm lỏng) đến khi rót môi trường vào đĩa không được vượt quá quy định.
Trộn đều dịch cấy với môi trường và để hỗn hợp đông đặc trên đĩa Petri ở vị trí ngang và mát Đồng thời, chuẩn bị một đĩa kiểm tra chứa 15 ml môi trường để xác nhận độ vô trùng.
Sau khi đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4 ml môi trường VRBL (5.3) ở 44 C đến
47 C lên bề mặt của môi trường cấy Để cho đông lại như mô tả ở trên.
Lật ngược các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm (6.2) ở 30 C hoặc 37 C (như thỏa thuận) trong 24 h ± 2 h.
định lượng nấm men và nấm mốc theo TCVN 8275-1:2009
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc sống trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn 0,95, bao gồm các sản phẩm như trứng, thịt, sản phẩm sữa (trừ sữa bột), rau, quả, và các loại pate tươi Kỹ thuật được sử dụng là đếm khuẩn lạc ở nhiệt độ 25°C ± 1°C.
Tiêu chuẩn này không cho phép định lượng bào tử nấm mốc và không bao gồm việc nhận biết cũng như kiểm tra độc tố của hệ nấm trong thực phẩm Các phương pháp quy định không phù hợp để định lượng các loại nấm chịu nhiệt như Byssochlamys fulva hoặc Byssochlamys nivea, thường có trong rau và quả đóng hộp hoặc đóng chai.
Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy bề mặt bằng cách sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc theo quy định Tùy thuộc vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, cần xác định lượng mẫu thích hợp, bao gồm mẫu dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu, hoặc sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu/huyền phù.
Có thể chuẩn bị các đĩa bổ sung trong cùng điều kiện bằng cách sử dụng các dung dịch thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu Các đĩa đã cấy cần được ủ trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 25°C ± 1°C trong 5 ngày Nếu cần, các đĩa thạch có thể được để trong ánh sáng khuếch tán từ 1 đến 2 ngày Cuối cùng, tiến hành đếm các khuẩn lạc và khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờ bằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men.
Số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam hoặc mililit mẫu được xác định bằng cách đếm số khuẩn lạc, chồi hoặc mầm trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng khác nhau Nấm men và nấm mốc sẽ được đếm riêng biệt nếu cần thiết.
3.5.3 Dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy
Về thực hành trong phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6507 (ISO 6887) và TCVN 6263 (ISO 8261).
3.5.4.1 Thành phần của canh thang nước pepton 0,1 % (nồng độ khối lượng)
Dịch thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzym 1,0 g
3.5.4.2 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng)
Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 0 C, nếu cần.
3.5.5.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) [3],[4] Thành phần
Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme 5,0 g
Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,0 g
Nước cất hoặc nước đã loại ion 1 000 ml
Tùy vào sức đông của thạch.
3.5.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
Có thể thay thế dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần bằng dụng cụ sử dụng một lần nếu chúng đáp ứng các tiêu chuẩn kỹ thuật phù hợp.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN
6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:
Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 25 0 C ± 1 0 C.
Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 ml.
Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 440C đến 470C.
Máy đo pH, có độ chính xác 0,1 đơn vị pH ở 250C.
Chai, bình và ống nghiệm được sử dụng để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy cũng như pha loãng dung dịch Đĩa Petri vô trùng, làm từ thủy tinh hoặc chất dẻo, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.
Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độ khuếch đại từ 250 lần đến 1 000 lần).
Que dàn mẫu được làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, có đường kính nhỏ hơn 2 mm và chiều dài 80 mm Đường kính này không được vượt quá 2 mm nhằm giảm thiểu lượng mẫu dính vào que sau khi hoàn thành quá trình dàn mẫu.
3.5.7 Lấy mẫu Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản Mẫu phòng thử nghiệm không được làm đông lạnh.
Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này, vì vậy cần thực hiện theo tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Trong trường hợp không có tiêu chuẩn cụ thể, các bên liên quan sẽ cần thỏa thuận để xác định phương pháp lấy mẫu.
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần), TCVN 6404 (ISO
Các bên liên quan cần tuân thủ tiêu chuẩn TCVN 6263 (ISO 8261) và các tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm Trong trường hợp không có tiêu chuẩn cụ thể, các bên sẽ thỏa thuận để giải quyết vấn đề này.
3.5.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng
Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu, bao gồm dung dịch pha loãng ban đầu cùng với các dung dịch pha loãng theo tiêu chuẩn TCVN 6507 (tất cả các phần) và TCVN 6404 (ISO 7218).
6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm.
Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (5.1.3) làm dịch pha loãng, ngoại trừ việc chuẩn bị mẫu thử cụ thể Để đạt hiệu quả tốt nhất, nên sử dụng bộ kiểu nhu động để trộn mẫu hoặc máy lắc.
Để đảm bảo các bào tử không lắng xuống nhanh trong pipet, cần để pipet (6.2) ở tư thế nằm ngang thay vì đứng khi được làm đầy bằng huyền phù hoặc dung dịch pha loãng thích hợp.
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng để tránh các phần tử có chứa vi sinh vật lắng xuống.
Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu đối với sản phẩm ở dạng khác )cho vào một đĩa thạch DRBC
Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất
Để định lượng chính xác nấm men và nấm mốc, sử dụng 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10 -2 cho vào đĩa thạch DRBC thứ hai Đối với mẫu thử dạng lỏng, lấy 0,3 ml dung dịch pha loãng 10 -1 và dàn đều trên ba đĩa để thuận tiện cho việc phân tích.
Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng.
Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường.
Định lượng staphylococci theo TCVN 4830-1:2005
Tiêu chuẩn này mô tả phương pháp định lượng staphylococci dương tính với coagulase trong sản phẩm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Phương pháp này bao gồm việc đếm số khuẩn lạc trên môi trường Baird-Parker sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ từ 35 C đến 37 C.
3.6.2 Thuật ngữ và định nghĩa
3.6.2.1 Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (coagulase- positive staphylococci)
Vi khuẩn có khả năng hình thành khuẩn lạc điển hình hoặc không điển hình trên bề mặt môi trường cấy chọn lọc, đồng thời cho phản ứng coagulase dương tính khi thực hiện thử nghiệm theo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này.
3.6.2.2 Định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of the coagulase-positive staphylococci)
Việc xác định số lượng staphylococci dương tính với coagulase trong một mililit hoặc một gam mẫu là cần thiết khi thực hiện thử nghiệm theo tiêu chuẩn quy định.
Cấy mẫu lên bề mặt môi trường cấy đặc chọn lọc bằng cách sử dụng hai đĩa Đối với sản phẩm ở dạng lỏng, cần sử dụng một lượng mẫu thử quy định; trong khi đó, nếu sản phẩm ở dạng khác, cần dùng một lượng huyền phù ban đầu theo quy định.
Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu, sử dụng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng Sau đó, ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 35 C hoặc 37 C và tiến hành kiểm tra sau 24 giờ và 48 giờ.
Để xác định số lượng staphylococci dương tính với coagulase, cần tính toán số lượng khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa từ một mililit hoặc một gam mẫu Kết quả này phải có ý nghĩa và được xác nhận bằng thử nghiệm coagulase dương tính.
3.6.4 Dịch pha loãng và môi trường cấy
3.6.4.1 Yêu cầu chung Đối với thực hành trong phòng thí nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218).
Xem TCVN 6507 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra.
3.6.4.3 Môi trường thạch Baird-Parker 2)
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường bán sẵn, trong trường hợp này phải theo đúng các chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Pepton từ casein Cao nấm men Cao thịt
1) Phụ thuộc vào sức đông của thạch.
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,2 ± 0,2 ở 25 C, nếu cần.
Chuyển các lượng 100 ml môi trường vào các bình hoặc các lọ (6.5) có dung tích thích hợp.
Khử trùng môi trường 15 phút ở 121 C.
1) Chỉ sử dụng kali telurit sẵn có phù hợp đối với phép thử này
Hòa tan hoàn toàn kali telurit trong nước bằng cách đun nóng rất nhẹ.
Bột phải dễ tan Nếu có mặt chất không hòa tan màu trắng trong nước thì loại bỏ bột đó.
Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 àm để khử trựng.
Dung dịch có thể được bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 C ± 2 C.
Loại bỏ dung dịch, nếu có kết tủa màu trắng.
3.6.5.2 Dung dịch nhũ tương lòng đỏ trứng (nồng độ khoảng 20 % hoặc theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất).
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng dung dịch bán sẵn, nếu có.
Để đảm bảo an toàn thực phẩm, sử dụng trứng gà tươi còn nguyên vẹn Trước khi sử dụng, hãy rửa trứng bằng bàn chải trong dung dịch tẩy rửa, sau đó tráng sạch dưới nước chảy Tiếp theo, khử trùng vỏ trứng bằng cách ngâm trong etanol 70% trong 30 giây và để khô tự nhiên, hoặc phun cồn và tiệt trùng bằng ngọn lửa.
Trong điều kiện vô trùng, đập vỡ trứng và tách lòng đỏ khỏi lòng trắng bằng cách chuyển lòng đỏ giữa các vỏ trứng Sau đó, cho lòng đỏ vào bình vô trùng và thêm bốn phần nước vô trùng, trộn đều Đun nóng hỗn hợp trong nồi cách thủy ở 47 C trong 2 giờ, sau đó để ở nhiệt độ 3C ± 2 C từ 18 đến 24 giờ để tạo kết tủa Cuối cùng, thu phần chất lỏng nổi lên và bảo quản trong bình vô trùng để sử dụng.
Dịch nhũ tương này có thể bảo quản ở nhiệt độ + 3 C ± 2 C tối đa 72 h.
Dung dịch natri hydroxit, c (NaOH) 0,1 mol/l
Pha loãng bằng nước đến 100 ml.
Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 àm để khử trựng.
Dung dịch có thể bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ + 3 C ± 2 C.
Môi trường cơ bản (5.3.1) Dung dịch kali telurit (5.3.2.1) Nhũ tương lòng đỏ trứng (5.3.2.2)
Dung dịch sulfamezathin (5.3.2.1) (nếu cần)
Làm tan chảy môi trường cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy đến khoảng 47 C.
Dưới điều kiện vô trùng, tiến hành thêm hai dung dịch khác nhau vào mẫu thử Nếu có nghi ngờ về sự hiện diện của loài Proteus, cần bổ sung dung dịch sulfamezathin Mỗi dung dịch phải được làm ấm trước ở nhiệt độ 47 C trong nồi cách thủy và lắc kỹ sau khi thêm từng dung dịch.
3.6.7 Chuẩn bị các đĩa thạch Đổ một lượng thích hợp môi trường hoàn chỉnh vào đĩa Petri vô trùng để thu được môi trường thạch dày khoảng 4 mm và để cho đặc lại.
Trước khi tiến hành làm khô, các đĩa có thể được bảo quản trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ từ +3 C ± 2 C Lưu ý rằng đối với các đĩa sản xuất công nghiệp, cần tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về thời gian bảo quản.
Trước khi sử dụng, hãy làm khô các đĩa bằng cách mở nắp và úp bề mặt thạch xuống dưới Đặt chúng vào tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 C đến 50 C cho đến khi các giọt nước trên bề mặt môi trường hoàn toàn biến mất.
3.6.8 Môi trường canh thang não – tim (Brain-heart infusion broth)
Pepton từ mô tế bào động vật Bột não bê
Bột tim bò Glucoza Natri clorua Natri hydro phosphat, khan (Na2HPO4) Nước
Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.
Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,4 ± 0,2 ở 25 C.
Chuyển các lượng môi trường cấy từ 5 ml đến 10 ml vào ống hoặc lọ có dung tích thích hợp.
Khử trùng môi trường 15 phút ở 121 C.
Nếu không sẵn có huyết tương thỏ khô, thì pha loãng một thể tích của huyết tương thỏ vô trùng tươi với ba thể tích nước vô trùng.
Khi sử dụng kali xitrat hoặc natri xitrat làm chất chống đông vón huyết tương, cần thêm dung dịch EDTA để đạt được nồng độ 0,1% EDTA trong huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng.
Huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng phải được dùng ngay, trừ khi có quy định của nhà sản xuất.
Trước khi sử dụng, kiểm tra từ mẻ huyết tương với các chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase và staphylococci phản ứng âm tính với coagulase.
3.6.10.Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
Có thể sử dụng dụng cụ thủy tinh dùng một lần thay thế cho dụng cụ thủy tinh tái sử dụng nếu chúng đáp ứng các tiêu chuẩn cần thiết.
Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh vật thông thường [Xem TCVN
6404 (ISO 7218)] và cụ thể là:
Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)
Tủ ấm, để duy trì môi trường đã cấy, các đĩa và ống ở trong dải nhiệt độ 35 C ± 1
Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 C ± 1 C đến 50 C ± 1 C.
Nồi cách thủy hoặc thiết bị tương tự có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở mức 47 C ± 2 C, rất quan trọng cho quá trình nuôi cấy Để khử trùng và bảo quản môi trường cấy, cần sử dụng ống nghiệm, bình hoặc lọ có nắp vặn với dung tích phù hợp, đặc biệt là các ống đựng dung dịch hồng cầu vô trùng hoặc các lọ đáy tròn kích thước khoảng 10 mm x 75 mm Ngoài ra, đĩa Petri cũng cần phải được vô trùng và có thể làm từ thủy tinh hoặc chất dẻo.
Que cấy thẳng và pipet Pasteur.
Pipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng 0,1 ml, 0,1 ml và 0,5 ml.