MÔN SINH HÓA Chương 41 Các công cụ trong khoa học hóa sinh

Đây là một kỹ thuật phân tích bằng cách phân tách các hợp chất liên kết chặt chẽ với nhau khỏi hỗn hợp chung.. 1 Sắc ký phân vùng: Các phân tử của hỗn hợp được phân vùng giữa pha tĩnh và

Sách cơ bản về khoa học hóa sinh: Phần 7

Chương 41: Các công cụ trong khoa học hóa sinh

Hóa sinh là một loại khoa học thí nghiệm chứ không phải là mộtloại khoa học thực nghiệm Sự hiểu biết và phát triển các khái niệmtrong hóa sinh là kết quả của việc thí nghiệm liên tục và những bằngchứng thu được từ đó Sẽ là nói không ngoa khi cho rằng nền tảng chocác kiến thức hiện tại (và cả tương lai nữa!) về hóa sinh được dựa trêncác công cụ phòng thí nghiệm được sử dụng cho thí nghiệm hóa sinh

Do đó, sự phát triển của các kỹ thuật phân tích nhạy cảm và tinh vi này

đã góp phần rất lớn vào sự hiểu biết của chúng ta về hóa sinh

Một cuộc tranh luận chi tiết về các dụng cụ này sẽ là quá tầm với củacuốn sách này Các nguyên tắc sử dụng cơ bản của một số công sẽ được

mô tả trong chương này Tuy nhiên, người đọc phải tham khảo Chương

27, vì các kỹ thuật sau đây liên quan đến sinh học phân tử và công nghệDNA tái tổ hợp

● Tách chiết và tinh sạch axit nucleic

● Dấu vân tay DNA hoặc hồ sơ DNA

Sắc ký

Sắc ký là một trong những công cụ hữu ích và phổ biến nhất của

hóa sinh Đây là một kỹ thuật phân tích bằng cách phân tách các hợp

chất liên kết chặt chẽ với nhau khỏi hỗn hợp chung Các ví dụ bao

gồm protein, peptide, axit amin, lipid, carbohydrate, vitamin và một sốloại thuốc tây

Nguyên tắc và phân loại.

Sắc ký thường bao gồm pha động và pha tĩnh Pha động đề cập đếnhỗn hợp các chất (được tách ra), hòa tan trong chất lỏng hoặc khí Phatĩnh là một ma trận rắn xốp, qua đó mẫu chứa trong pha động di động

Sự tương tác các pha di động và tĩnh Pha động đề cập đến hỗn hợp cácchất (được tách ra), hòa tan trong chất lỏng hoặc khí Pha tĩnh là mộthỗn hợp rắn xốp, qua đó mẫu chứa trong pha động có thể chuyển động

Sự tương tác giữa các pha động và tĩnh dẫn đến việc tách các hợp chấtkhỏi hỗn hợp Những tương tác này bao gồm các nguyên tắc hóa lý như

hấp phụ, phân vùng, trao đổi ion, sàng phân tử và ái lực.

Hình 41.1: Các loại sắc ký quan trọng (HLPC-Sắc ký lỏng hiệu năngcao; TCL-Sắc ký lớp mỏng)

Sự tương tác giữa pha tĩnh và pha động thường được sử dụng đểphân loại sắc ký, ví dụ: phân vùng, hấp phụ, trao đổi ion Hơn nữa, việcphân loại sắc ký cũng dựa trên bản chất của pha tĩnh (giấy, giấy mỏng,cột) hoặc dựa trên bản chất của cả pha động và pha tĩnh (sắc ký khí-lỏng) Một bản tóm tắt về các phương pháp (các lớp) sắc ký khác nhau

được đưa ra trong Hình.41.1.

1) Sắc ký phân vùng: Các phân tử của hỗn hợp được phân vùng giữa

pha tĩnh và pha động tùy thuộc vào ái lực tương đối của chúng vớitừng pha

a) Sắc ký giấy: Kỹ thuật này thường được sử dụng để tách axit amin,

đường, dẫn xuất đường và peptide Trong sắc ký giấy, một vài giọtdung dịch chứa hỗn hợp các hợp chất cần tách được áp dụng (pháthiện) ở một đầu, thường là ~ 2 cm hoặc dài hơn, một dải giấy lọc(Whatman số 1 hoặc 3) Giấy được sấy khô và nhúng vào hỗn hợpdung môi gồm butanol, axit axetic và nước theo tỷ lệ 4: 1: 5 (đểtách axit amin) Thành phần nước của hệ dung môi liên kết vàogiấy và tạo thành một phân tĩnh Thành phần hữu cơ di chuyển trêngiấy là pha động Khi sự di chuyển của dung môi lên trên, nó đượcgọi là sắc ký tăng dần Trong sắc ký giảm dần, dung môi di chuyển

Phân vùng Hấp thụ Trao đổi ion

Cột TLC

Lọc gel Ái lực HPLC

Sắc ký giấy Một chiều Hai chiều Tằng dần

Giảm dần Sắc ký lớp mỏng Sắc ký khí-lỏng

Dải giấy

Pha động

xuống dưới (Hình.41.2) Khi dung môi chảy, nó sẽ mang theo cácchất chưa xác định Tốc độ di chuyển của các phân tử phụ thuộcvào độ hòa tan tương đối trong pha tĩnh (dung dịch nước) và pha

Sau khi di chuyển đủ mặt trước dung môi, giấy (sắc ký) được lấy

ra ngoài , sấy khô và rửa ảnh để xác định các điểm cụ thể

Ninhydrin, tạo thành phức màu tím với α-amino axit, thường

được sử dụng làm chất tạo màu Bản chất hóa học của các đốm cóthể được xác định bằng cách chạy các chất tiêu chuẩn đã biết với

Rf = Khoảngcách di chuyển của chất

Khoảngcách dichuyển bằng dung môi phíatrước Giá trị Rf của từng chất, đặctrưng của một hệ dung môi và giấy nhất định, thường giúp xác địnhnhững chất không xác định Đôi khi, rất khó để tách một hỗn hợp cácchất phức tạp bằng một lần chạy với một hệ dung môi Trong trường hợpnhư vậy, lần chạy thứ hai được thực hiện bởi một hệ dung môi khác,

theo hướng vuông góc với lần chạy đầu tiên Điều này được gọi là sắc

ký hai chiều giúp tăng cường sự phân tách hỗn hợp thành các thành

phần riêng lẻ

b) Sắc ký lớp mỏng (TLC): nguyên tắc của TLC cũng tương đồng

với sắc ký giấy (phân vùng) Thay cho một tờ giấy, một chất trơ,chẳng hạn như cellulose, được sử dụng làm chất hỗ trợ Celluloseđược lan truyền dưới dạng một lớp mỏng trên các tấm thủy tinhhoặc nhựa Sự phân tách sắc ký xảy ra tương đối nhanh trong TLC

Pha động

Trong trường hợp sắc ký hấp phụ lớp mỏng, các chất hấp phụ như

silica gel hoạt tính, alumina, kieselguhr được sử dụng

Hình 41.3: Biểu đồ biểu diễn sắc ký khí-lỏng (GLC)

c) Sắc ký khí-lỏng (GLC): Đây là phương pháp được lựa chọn để tách các chất dễ bay hơi hoặc các dẫn xuất dễ bay hơi của một số

chất không bay hơi Trong GLC, pha tĩnh là một vật liệu rắn trơ(đất diatomaceous hoặc powdered firebrick), được ngâm tẩm vớimột chất lỏng không bay hơi (silicon hoặc polyethylen glycol).Chúng được đóng gói trong một cột hẹp và duy trì ở nhiệt độ cao(khoảng 200°C) Một hỗn hợp vật liệu dễ bay hơi được bơm vàocột cùng với pha động, đó là một loại khí trơ (argon, heli hoặcnitơ) Việc tách hỗn hợp dễ bay hơi dựa trên phân vùng của cácthành phần giữa pha động (khí) và pha tĩnh (lỏng), do đó có tên làsắc ký khí-lỏng Các hợp chất riêng biệt có thể được xác định vàđịnh lượng bằng máy dò (Hình.41.3) Các máy dò này hoạt độngtrên các nguyên tắc ion hóa hoặc dẫn nhiệt Sắc ký khí-lỏng rấtnhạy, nhanh và đáng tin cậy Nó thường được sử dụng để ước tínhđịnh lượng các vật liệu sinh học như lipid, thuốc và vitamin

Hình 41.4: Biểu đồ biểu diễn sắc ký cột hấp phụ

2) Sắc ký cột hấp phụ: Các chất hấp phụ như silica gel, alumina, bột

than và canxi hydroxyapatite được đóng gói vào một cột trong ốngthủy tinh Cột đó sẽ làm pha tĩnh Hỗn hợp mẫu trong dung môi đượccho vào cột này Các thành phần riêng lẻ được hấp phụ khác nhau vàochất hấp phụ Quá trình rửa giải được thực hiện bởi một hệ thống hỗtrợ (pha động) Các hợp chất riêng lẻ ra khỏi cột với các tỷ lệ khácnhau có thể được thu thập và xác định riêng biệt (Hình.41.4) Ví dụ,axit amin có thể được xác định bằng phương pháp đo nhiệt lượngninhydrin Một bộ máy tự động lưu trữ dữ liệu phân đoạn cột thườngđược sử dụng trong khoảng thời gian gần đây

pha động (đệm)

Hỗn hợp

Pha tĩnh ) cột (

Rửa giải Chất đệm

Hình 41.5: Biểu đồ biểu diễn của máy phân tích axit amin.

Rửa ảnh màu Máy đo màu

Mẫu

Cột trao ionđổi ion

Phân tách axit amin Chất đệm

Ninhydrin

Máy ghi kết quả Dụng cụ bơm

3) Sắc ký trao đổi ion: Trao đổi ion liên quan đến việc tách các phân tử dựa vào điện tích Nhựa trao đổi ion-cation và anion được sử dụng

cho mục đích này Một bộ trao đổi anion (R+A-) trao đổi anion của nó(A-) với một anion khác (B-) trong hỗn hợp chất

độ pH Nguyên tắc này được sử dụng trong việc tách các phân tử

Một hỗn hợp các axit amin (protein hydrolysate) hoặc protein có thểđược phân tách một cách thuận tiện bằng sắc ký trao đổi ion Hỗn hợpamino axit (ở pH khoảng 3.0) được truyền qua bộ trao đổi cation vàcác axit amino riêng lẻ có thể được tách rửa bằng cách sử dụng cácchất đệm khác nhau Các phần tách rửa khác nhau, chứa các aminoaxit riêng lẻ, có thể phản ứng với thuốc thử ninhydrin để tạo các màuphức tạp Điều này được theo dõi liên tục và xác định định lượng

amino axit Máy phân tích axit amin, được phát triển đầu tiên bởi Moore và Stein, dựa trên nguyên tắc này (Hình.41.5).

Có khá nhiều bộ trao đổi ion trên thị trường hiện nay Bao gồm nhựapoly-styrene (nhựa trao đổi anion, Dowex 1; nhựa trao đổi cation,Dowex 50), diethyl aminoethyl cellulose (DEAE), Carboxy methyl(CM)

Hình 41.6: Nguyên lý của sắc ký lọc gel

4) Sắc ký lọc gel: Trong sắc ký lọc, các phân tử tách dựa trên kích

thước, hình dạng và trọng lượng phân tử của chúng Kỹ thuật này

cũng được gọi là sàng phân tử hoặc sắc ký phân tử Thiết bị bao

gồm cột được đóng gói với gel giống như bọt biển (thường là

polysacarit liên kết ngang) có chứa lỗ chân lông Các gel đóng vai tròsàng lọc ở mức phân tử để tách các phân tử nhỏ hơn và lớn hơn

(Hình.41.6).

Hỗn hợp dung dịch chứa các phân tử có kích thước khác nhau (ví dụnhư protein) được áp dụng cho cột và rửa giải bằng đệm Các phân tửlớn hơn không thể đi qua các lỗ của gel và do đó, di chuyển nhanhhơn Mặt khác, các phân tử nhỏ hơn xâm nhập vào các hạt gel, bị bỏlại phía sau và di chuyển chậm hơn Bằng cách chọn các hạt gel có độxốp khác nhau, các phân tử khác nhau có thể được tách ra Các loạigel có bán trên thị trường bao gồm Sephadex (G-10, G-25, G-100),Biogel (P-10, P-30, P-100) và sepharose (6B, 4B, 2B)

Sắc ký lọc gel có thể được sử dụng để xác định gần đúng trọng lượngphân tử Điều này được thực hiện bằng cách sử dụng cột hiệu chuẩnvới các chất có trọng lượng phân tử đã biết

5) Sắc ký ái lực: Nguyên tắc sắc ký ái lực dựa trên đặc tính liên kết đặc

hiệu và không cộng hóa trị của protein với các phân tử khác, được gọi

là phối tử Ví dụ, các enzyme sẽ liên kết đặc biệt với các phối tử như

Nguyên Hạt xốp

tử lớn Nguyên

tử nhỏ

Kỹ thuật này bao gồm việc sử dụng các phối tử liên kết cộng hóa trịvới một chất nền trơ và xốp trong một cột Các phối tử cố định đóng

vai trò như các lưỡi câu phân tử để chọn lọc protein ta cần trong khi

các protein còn lại vượt qua cột Khi protein đó đã bị bắt bởi phối tử,

có thể được rửa giải bằng các phân tử phối tử tự do Cách khác, một

số thuốc thử có thể phá vỡ tương tác phối tử protein có thể được sử

Sắc ký ái lực rất hữu ích cho việc tinh sạch enzyme, vitamin, axitnucleic, thuốc tây, thụ thể hoóc môn, kháng thể, v v

6) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Nếu nói thẳng ra, thì các kỹ

thuật sắc ký rất chậm và tốn thời gian Sự phân tách có thể được cảithiện đáng kể bằng cách tăng áp suất lên khoảng 5.000-10.000 psi, do

đó kỹ thuật này cũng được gọi (ít thường xuyên hơn) là sắc ký lỏng

áp lực HPLC yêu cầu sử dụng vật liệu nhựa không nén được và mộtcột kim loại mạnh Các chất rửa giải được phát hiện bằng các phươngpháp như hấp thụ tia cực tím và huỳnh quang

Điện di

Sự chuyển động của các hạt tích điện (ion) một điện trường dẫnđến việc chúng hướng về điện cực tích điện trái dấu được gọi là điện di.Các phân tử có điện tích dương (cation) di chuyển về phía cực âm trongkhi những phân tử có điện tích âm (anion) di chuyển về phía Điện cựcdương là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi để tách các phân

tử như protein plasma, lipoprotein và globulin miễn dịch

Tốc độ di chuyển của các ion trong điện trường phụ thuộc vào một

số yếu tố bao gồm hình dạng, kích thước, điện tích tổng và khả năng hòatan của các ion, độ nhớt của dung dịch và cường độ của dòng điện được

sử dụng

Hình 41.7: Biểu đồ biểu diễn điện di trên giấy.

Các loại điện di khác nhau.

Trong số các kỹ thuật điện di, điện di vùng (giấy, gel),điểm đẳng tậptrung đẳng điện và miễn dịch chọn lọc là những kỹ thuật quan trọng vàthường được sử dụng trong phòng thí nghiệm Kỹ thuật điện di biên giới

di động, phát triển bởi Tiselius (1933), ngày nay ít được sử dụng hơn.Trong kỹ thuật này, một ống chữ U chứa đầy dung dịch protein đượcphủ bởi một dung dịch đệm Khi các protein di chuyển trong dung dịchtrong quá trình điện di, chúng tạo thành các ranh giới có thể được xácđịnh bằng chỉ số khúc xạ

1) Điện di vùng: một loại điện di biên giới di động được chỉnh sửa và

đơn giản hóa là điện di vùng Một vật liệu hỗ trợ trơ như giấy hoặc

a) Điện di trên giấy: Trong kỹ thuật này, mẫu được áp dụng trên

một dải giấy lọc được làm ướt bằng dung dịch đệm mong muốn.Các đầu của dải được nhúng vào các bể chứa đệm trong đó cácđiện cực được đặt Dòng điện được áp dụng cho phép các phân

Giấy

Chất đệm

Ion điện âm

Điểm áp

tử di chuyển trong thời gian đủ Giấy được loại bỏ, sấy khô vànhuộm bằng thuốc nhuộm có màu đặc biệt để phát hiện cácchất Các điểm màu có thể được xác định bằng cách so sánhcùng với nhiều bộ kiểm tra theo tiêu chuẩn chạy cùng lúc.

Để tách huyết thanh giấy lọc Whatman số 1, đệm veronal hoặctris ở pH 8,6 và các vết màu amido đen hoặc xanh bromophenol

được sử dụng Huyết thanh được tách thành năm dải riêng

biệt - albumin, D1-, D2-, E- và J-globulin (Tham khảo

hình.9.1) Đối với kiểu điện di của lipoprotein, tham khảo hình14.34

b) Điện di trên gel: Kỹ thuật này liên quan đến việc tách các phân

tử dựa trên kích thước của chúng, tính cả điện tích Các phân tửlớn chuyển động chậm trong điện di gel (điều này trái ngược vớilọc gel) Độ phân giải cao hơn trong kỹ thuật này Do đó,protein huyết thanh có thể được tách thành khoảng 15 dải, thay

Các gel thường được sử dụng trong điện di gel là agarosepolyacrylamide, natri dodecyl (SDS) Polyacrylamide được sửdụng để xác định trọng lượng phân tử của protein trong kỹ thuậtđiện di phổ biến được gọi là SDS-PAGE

2) Tập trung đẳng điện: Kỹ thuật này chủ yếu dựa trên sự cố định củacác phân tử ở pH đẳng điện trong quá trình điện di Độ pH ổn địnhđược thiết lập (thường ở dạng gel) để bao gồm các điểm đẳng điệncủa hỗn hợp Khi điện di xảy ra, các phân tử (nói protein) di chuyểntương ứng với các điểm đẳng điện của chúng, bất động và hình thànhliên kết đứng yên Các khối gel có thể được nhuộm và xác định Bằngcách tập trung đẳng điện, protein huyết thanh có thể được tách thành

40 dải Sự tập trung đẳng điện có thể được sử dụng thuận tiện cho quátrình tinh chế protein

Hình 41.8: Biểu đồ biểu diễn điện di miễn dịch

Protein phân tách điện di vòng cungkết tủa

Máng có kháng thể

3) Điện di miễn dịch : Xét nghiệm miễn dịch là tên gọi chung của một

số phương pháp sinh hóa để phân tách và mô tả đặc tính của proteindựa trên điện di và phản ứng với kháng thể Điện di miễn dịch kháhữu ích cho việc phân tích các hỗn hợp phức tạp của kháng nguyên và

Các protein phức tạp của các mẫu sinh học (ví dụ là huyết thanhngười) sẽ bị ảnh hưởng bắt buộc từ điện di Kháng thể (huyết thanhmiễn dịch từ thỏ hoặc ngựa không phản ứng với người) sau đó được

áp dụng trong một máng đi song song với sự phân tách điện di Cáckháng thể khuếch tán và khi chúng tiếp xúc với các kháng nguyên, sự

kết tủa xảy ra, dẫn đến sự hình thành các dải precipitin có thể được

Phép quang trắc - Máy đo màu và Máy đo quang phổ

Phương pháp quang trắc liên quan đến việc nghiên cứu hiện tượnghấp thụ ánh sáng của các phân tử trong dung dịch Độ đặc hiệu của hợpchất để hấp thụ ánh sáng ở bước sóng cụ thể (ánh sáng đơn sắc) được sửdụng trong phòng thí nghiệm để đo định lượng Từ quan điểm của nhàhóa sinh học, quang trắc là một công cụ phòng thí nghiệm quan trọng để

ước tính chính xác nhiều loại hợp chất trong các mẫu sinh học Máy đomàu và máy đo quang phổ là các dụng cụ phòng thí nghiệm cho mụcđích này Họ làm việc trên các nguyên tắc được thảo luận dưới đây.

Khi một ánh sáng ở bước sóng cụ thể được truyền qua một hỗnhợp (ánh sáng tới), một lượng của nó bị hấp thụ và do đó, ánh sáng phát

ra (ánh sáng truyền qua) bị giảm đi Bản chất của sự hấp thụ ánh sángtrong một hỗn hợp được xác định bởi định luật Beer-Lambert

Định luật Beer nói rằng lượng ánh sáng truyền đi giảm theo cấp sốnhân với sự gia tăng nồng độ của vật liệu hấp thụ (tức là lượng ánh sánghấp thụ phụ thuộc vào nồng độ của các phân tử hấp thụ) Và theo địnhluật Lambert, ánh sáng truyền đi giảm theo cấp số nhân với sự gia tăng

độ dày của các phân tử hấp thụ (tức là lượng ánh sáng hấp thụ phụ thuộcvào độ dày của môi trường)

Bằng cách kết hợp 2 định luật Beer-Lambert, ta có thể cho ra côngthức như sau:

I=I0εctct

Với: I = Cường độ của ánh sáng truyền qua

I0 = Cường độ của ánh sáng tới

ε = hệ số dập tắt phân tử (đặc trưng của chất điều tra)

c = Nồng độ của chất hấp thụ (mol/l)

t = Độ dày của môi trường ánh sáng đi qua

Khi độ dày của môi trường hấp thụ được giữ không đổi (định luậtLambert), cường độ của ánh sáng truyền tới chỉ phụ thuộc vào nồng độcủa vật liệu hấp thụ Nói cách khác, luật Beer sẽ bắt đầu có hiệu lực

Tỷ lệ của ánh sáng truyền (I) so với ánh sáng tới (I0) được gọi là hệ

T = I

I0