Khảo sát thành phần môi trường tới quá trình sinh tổng hợp chitinase từ trichoderma luận văn tốt nghiệp đại học

Là enzyme được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp vàtrong y dược như là trong kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm soát côn trùng,tổng hợp chitooligosaccharid … Enzyme chitinase

===  ===

đồ án tốt nghiệp

Đề tài:

khảo sát thành phần môi trờng tới quá trình

Lớp : 48K - Công nghệ thực phẩm

VINH - 12/2011

-

-NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Phan Thị Thỏa Số hiệu sinh viên: 0752040581 Khóa: 48K Ngành: Công nghệ thực phẩm 1 Tên đề tài: Khảo sát thành phần môi trường tới quá trình sinh tổng hợp chitinase từ trichoderma 2 Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp:

3 Họ tên cán bộ hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân

Ngày tháng năm 2011

Chủ nhiệm bộ môn Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm

Người duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

-

-BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Phan Thị Thỏa Số hiệu sinh viên: 0752040581 Khóa: 48K Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán bộ duyệt: ThS Nguyễn Tân Thành 1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

………

………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ………

………

………

………

………

………

……….

Ngày tháng năm 2011

Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên)

-

-BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: Phan Thị Thỏa Số hiệu sinh viên: 0752040581 Khóa: 48K Ngành: Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán bộ duyệt: ThS Nguyễn Tân Thành 1 Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………

………

………

………

………

………

………

2 Nhận xét của cán bộ duyệt: ………

………

………

………

………

………

……….

Ngày tháng năm 2011

Cán bộ duyệt

(Ký, ghi rõ họ, tên)

Để hoàn thành đồ án này ngoài sự cố gắng của bản thân, em xin chân thànhcảm ơn sự giúp đỡ về kiến thức, tinh thần cũng như những góp ý của các thầy, côtrong bộ môn Hóa thực phẩm - Khoa Hóa - Trường Đại học Vinh Đặc biệt em xin

chân thành gửi lời cảm ơn tới ThS Đào Thị Thanh Xuân, đã tận tình hướng dẫn

và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đồ án

Em xin được gửi lời cảm ơn đến cán bộ, giảng viên khoa Nông - Lâm - Ngư,

Trường Đại học Vinh đã cung cấp cho em bộ chủng Trichoderma

Em cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm khoa Hóa học

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đồ án

Cuối cùng em xin tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp

đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm đồ án Đây là nguồn động viên vững chắcgiúp em vượt qua những khó khăn để hoàn thành tốt đồ án này

Do hạn chế về trình độ và kinh nghiệm, nên bản đồ án còn nhiều thiếu sót,rất mong được sự giúp đỡ và góp ý của các thầy, cô và các bạn

Em xin chân thành cảm ơn !

Vinh, tháng 12 năm 2011

Sinh viên

Phan Thị Thỏa

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm sợi Trichoderma 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 4

1.1.4 Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma 5

1.1.5 Ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài lên sự phát triển của nấm Trichoderma .7

1.1.6 Hiện tượng ki sinh của nấm Trichoderma 8

1.1.7 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và họat động enzyme chitinase của Trichoderma spp 9

1.2 Hệ enzyme chitinase 13

1.2.1 Định nghĩa 13

1.2.2 Phân loại 13

1.2.3 Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase 16

1.2.4 Các loại cơ chất của enzyme chitinase 18

1.2.5 Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase 20

1.2.6 Cơ chế cảm ứng của enzyme chitinase 21

1.2.7 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 22

1.2.9 Ứng dụng của enzyme chitinase trong nông nghiệp và y dược 23

1.2.10 Sơ lược các nghiên cứu về chitinase 26

1.3 Qui hoạch thực nghiệm 29

1.3.1 Định nghĩa 29

1.3.2 Đối tượng của qui hoạch thực nghiệm trong các ngành công nghệ 29

1.3.3 Các phương pháp qui hoạch thực nghiệm 29

1.3.4 Các phương pháp kế hoạch thực nghiệm cực trị 29

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Vật liệu và thiết bị 31

2.1.1 Vật liệu và môi trường vi sinh vật 31

2.2.2 Thiết bị 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Điều kiện nuôi cấy 32

2.3.2 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 32

2.3.3 Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm 32

2.3.4 Xác định hàm lượng glucosamin (phương pháp Elson - Morgan) 33

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính của enzyme chitinase 35

2.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitinase 37

2.3.7 Phương pháp tối ưu thành phần môi trường nuôi cấy bằng qui hoạch thực nghiệm 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường đến quá trình sinh tổng hợp chitinase 44

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình sinh tổng hợp chitinase 45

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pepton đến quá trình sinh tổng hợp chitinase .46

3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chitin đến quá trình sinh tổng hợp chitinase .47

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình sinh tổng hợp chitinase .49

3.2 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase 50

3.2.1 Tối ưu hóa môi trường theo phương pháp bậc một hai mức tối ưu 50

3.2.2 Tối ưu hóa môi trường theo phương pháp bậc hai trực giao 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

Bảng 2.1 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 38

Bảng 2.2 Bảng ma trận qui hoạch thực nghiệm 41

Bảng 3.1 Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase theo hàm lượng (NH4)2SO4 .45

Bảng 3.2 Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase theo nồng độ pepton 46

Bảng 3.3 Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase theo nồng độ chitin 48

Bảng 3.4 Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase theo hàm lượng KH2PO4 49

Bảng 3.5 Các mức và khoảng biến thiên 51

Bảng 3.6 Ma trận mở rộng và kết quả qui hoạch thực nghiệm 52

Bảng 3.7 Ma trận mở rộng và kết quả qui hoạch thực nghiệm 57

Hình 1.1 Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát triển trên môi trường

PDA (Vùng màu xanh chứa bào tử) 4

Hình 1.2 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của nấmTrichoderma 4

Hình 1.3 A Trichoderma ký sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở các cây họ đậu (Trichoderma nhuộm màu vàng; Pythium nhuộm màu xanh) [41]; B Sự ký sinh của Trichoderma (T) trên nấm gây bệnh R.solani (R) 9

Hình 1.4 Sơ đồ phân cắt chitin bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase [38] .13

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc không gian của enzyme chitinase Serratia marcescens 14

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum vulgare 15

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất allosamidin [40] .18

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của chitin [40] 19

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma [24] .20

Hình 2.1 chitin thu được 33

Hình 2.2 Cường độ màu ở các nồng độ khác nhau 35

Hình 2.3 Chitin huyền phù 1% 36

Hình 3.1 Đường chuẩn glucosamin ( g/ml) 44

Hình 3.2 Sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nồng độ (NH4)2SO4 45

Hình 3.3 Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase theo nồng độ peptone 47

Hình 3.4 Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase theo nồng độ chitin 48

Hình 3.5 Sự biến thiên hoạt độ chitinase theo nồng độ KH2PO4 50

LỜI MỞ ĐẦU

Lý do chọn đề tài

Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có cấu trúc phân tửphức tạp và tinh vi, hoạt lực xúc tác cao hơn nhiều so với chất xúc tác thôngthường, có tính đặc hiệu cao…

Chitinase là một trong những nhóm enzyme quan trọng trong các enzymecông nghiệp, nó chứa các đơn phân là N-acetyl-Glucosamine, liên kết với nhau bởicác liên kết 1,4-β-glucoside Enzyme chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phâncắt chitin thành các sản phẩm khác nhau như oligosaccharide, N-acetyl-Glucosamine Là enzyme được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp vàtrong y dược như là trong kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm soát côn trùng,tổng hợp chitooligosaccharid …

Enzyme chitinase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật,thực vật, nấm, vi khuẩn … Tuy nhiên, những năm gần đây việc gia tăng sử dụng visinh vật là nguồn cung cấp chitinase đang được sử dụng nhiều, sản phẩm của nó tạo

ra nhiều hơn và rút ngắn thời gian thu nhận hơn, nhưng giá thành các chế phẩm thuđược vẫn còn khá cao, do đó sử dụng enzyme trong sản xuất vẫn còn hạn chế Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn

thuộc các chi Enterobacter và Streptomces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus, Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh.

Nấm sợi Trichoderma không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao,

nguồn lợi tài nguyên quí mà còn có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh họcsâu hại cây trồng và trong y dược Chitinase từ nấm sợi đang mở ra hướng mới là:nguyên liệu đế sản xuất thuốc trừ sâu sinh học để thay thế một phần các thuốc trừsâu hóa học vốn độc hại đối với con người và gây ô nhiễm môi trường

Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase, mục đích của tôi nhằm nghiên cứu

khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase từ Trichoderma trong môi trường cho hoạt

tính là cao nhất Vì vậy tôi đã lựa chọn đề tài: “Khảo sát thành phần môi trường tới quá trình sinh tổng hợp chitinase từ trichoderma”

Mục tiêu của đề tài: Lựa chọn được môi trường nuôi cấy cho hoạt tính

chitinase là cao nhất

Nhiệm vụ nghiên cứu:

Trong đồ án này chúng tôi có các nhiệm vụ

- Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường đến hoạt tínhenzyme chitinase

- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy theo phương pháp quihoạch thực nghiệm

Vật liệu, phạm vi và nội dung nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Nấm sợi Trichoderma

1.1.1 Vị trí phân loại

Trichoderma là một trong những vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác

phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biếtđầy đủ

Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma như sau:[42]

và Hypocreanum Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum

có giai đoạn telemorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea; nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum

không tìm thấy hình thức teleomorph [17]

hình elip hoặc hình thuôn Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục

vàng, xanh, lục xỉn đến lục đậm Các chủng của Trichoderma có tốc độ phát triển

nhanh chúng có thể đạt được đường kính khuẩn lạc từ 2- 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy

ở 200C [2]

Hình 1.1 Trichoderma harzianum KRL-AG2 phát triển

trên môi trường PDA (Vùng màu xanh chứa bào tử)

Hình 1.2 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử

của nấmTrichoderma

1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có pH từ 2,5 đến 9,5

và phát triển tốt ở pH = 4,5 - 6,5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường

là 25 - 30oC, ở một vài dòng phát triển tốt ở 35oC, một số ít phát triển được ở 40oC

(Gary.j Samuels, 2004) Theo Prasun và Kanthadai R (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau Ở 35oC chúngtạo ra những rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và mép bất thường, ở 37oCkhông tạo ra bào tử sau 7 ngày nuôi cấy.

Trichoderma là loại nấm mốc, sợi nấm có vách ngăn, tế bào hữu tính ít khi

thấy rõ Đính bào tử (conidi) là một tế bào hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn.Conidi không có chất nhầy bao bọc Cuống conidi và các nhánh bên của cuống dài

và mảnh, không có đoạn sợi vô sinh kéo dài, thể hình chai không cụm lại, có phầnmỏng manh

Trichoderma là loại sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme như chitinolytic

(enzyme phân giải chitin), Cellulolytic (enzyme phân giải cellulose) Đây là 2enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của nấm đối kháng

với Trichoderma Một vài loài Trichoderma có tác động làm tăng tỉ lệ nảy mầm, tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary.J Samuels, 2004)

Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng

đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào vàtác động của điều kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa

dạng trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loại Trichoderma Vì thế sẽ

tạo ra những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây lànhững dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như trong việc tạo chế phẩm sinh

học kiểm soát mầm bệnh thực vật (Gary E Harman.2000).

1.1.4 Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma

Nguồn Cacbon

Trichoderma nổi bật về khả năng tiết ra enzyme phân hủy nhiều loại

polysaccharide (như cellulose, hemicellulose) và những polymer liên quan nhưchitin Những enzyme này được công nhận có giá trị thương mại [24]

Manczinger và Pollner (1985) [33] đã sử dụng nguồn cacbon là phương thức

để phân loại các giống Trichoderma thành từng nhóm Theo phân tích, những

nguồn cacbon sau được sử dụng bởi tất cả những chủng đã nghiên cứu: D-glucose,

D-galactose, D-fructose, D-mannose, D-cellobiose, trehalose, D-xylose, arabinose… Nói chung nguồn cacbon tốt nhất là glucose, fructose, mannose,

L-galactose, xylose, rehalose và cellobiose Ngược lại Trichoderma spp thường không

có khả năng sử dụng α-methyl-D-xylosid, α-methyl-D-mannosid, methanol,ethanol, n-propanol, ethylamine…Việc sử dụng một vài nguồn cacbon (như inulin,tinh bột, xylan, pectin, lactose, sucrose, maltose, một vài polyol, sugar acid, hàu hếtcác amino acid và một vài pentoses) thì tùy thuộc vào từng loài, và có thể sử dụngcho mục đích phân loại hóa học

Nguồn nitơ hữu cơ như peptone thường được sử dụng trong môi trường đểhạn chế sự tăng trưởng chậm trên cơ chất polymeric như là cellulose Tuy nhiên cầnchú ý rằng peptone được sử dụng như là cả nguồn nitơ lẫn nguồn cacbon, và được

ưu tiên sử dụng khi được cung cấp đồng thời với polysaccharide Trong số những

amino acid, nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất cho Trichoderma là alanin, aid aspartic và

aicd glutamic [24]

Nguồn dinh dưỡng khác

Hầu hết các chủng phân lập hoang dại của Trichoderma không yêu cầu

những nhân tố tăng trưởng phức tạp hay vitamin Thành phần ion kim loại của sợi

nấm T.reeei đã được phân tích bởi Gaunt và cộng sự (1984) và được sử dụng để

tính toán nhu cầu về ion kim loại Những ion kim loại như sắt thì cần thiết cho sựtăng trưởng và có thể được tìm thấy ở một nồng độ rất thấp trong môi trường [24]

Một số lượng lớn những ion kim loại khác cũng rất quan trọng cho sự tăngtrưởng ở những nồng độ thấp, ngược lại nồng độ cao lại ức chế tăng trưởng Sựthêm vào của Cd2+ và Hg2+ ở nồng độ 1 - 10mM dẫn đến ức chế tăng trưởng

T.viride và dẫn đến kiểu hình bất thường của nấm Tuy nhiên tương tự như loài nấm khác, Trichoderma cũng bắt các ion kim loại trong màng tế bào của chúng, phát

hiện này đã được sử dụng trong việc loại bỏ những ion kim loại nặng ra khỏi nước

thải công nghiệp bằng hệ sợi nấm Trichoderma [24].

Oxi và CO 2

Trichoderma là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, mặc dù những chủng đã phân

lập đều được thu nhận trên những môi trường sống có áp suất từng phần oxi rất thấp[18] Sự cung cấp oxi và hoạt động của ti thể cũng được báo cáo là những nhân tố

điều hòa sự hình thành cellulase của T.reesei [21], và nồng độ O2 ở mức dưới cựcthuận dường như là thích hợp cho sự tổng hợp enzyme

CO2 sản phẩm cuối cùng của sự oxi hóa cacbon, sẽ được tích lũy ở một mức

độ nào đó trong môi trường tăng trưởng rắn, phụ thuộc pH và nhiệt độ Vì vậy, vài

loài Trichoderma spp bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào pH, sự ứcchế mạnh nhất trong môi trường kiềm nhẹ và trung tính Hutchinson và Cowan(1972) [27] báo cáo rằng T.harzianum tạo ra hiệu ứng ức chế CO2 và ethanol trên sự

tăng trưởng và tạo bào tử của nhiều nấm khác (Aspetgillus niger, Pestalotia

rhododendri), trên cây con của Lactuca sativa Điều này cho thấy môt vài chủng

Trichoderma có thể chấp nhận sự tích tụ CO2 nhiều hơn một số nấm khác

1.1.5 Ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài lên sự phát triển của nấm Trichoderma

Nước

Jackson và CS (1991) đã khảo sát trên T.virens, T.citrinovride và T.viride

và thấy rằng mức độ phát triển của sợi nấm của tất cả các loại nấm giảm khi tăngđiện thế nước vượt qua ngưỡng -0,7 ÷ -14,0 Mpa Trong khoảng này, tất cả nhữngchủng phân lập này dễ chấp nhận điện thế thấm lọc (NaCl, glycerol) hơn là điện thếchất nền (polyethyeneglycol) [8]

Sự giảm lượng nước đã thúc đẩy sự tạo bào tử của T.harzianujm, đặc điểm này

có thể sử dụng trong môi trường nuôi cấy lỏng để tạo đính bào tử cùng với việc tăngmức độ sấy khô rất có ích cho những mục đích điều khiển sinh học Sự nẩy mầm của

đính bào tử của Trichoderma đặc biệt nhạy cảm với việc tăng áp suất thấm lọc [8].

Nồng độ ion H +

Nồng độ ion H+ có ảnh hưởng lớn trên sự tăng trưởng của nấm, vì nhiều chấtdinh dưỡng (ví dụ như đường và amino acid), đều được thu nhận bằng sự đồng vậnchuyển với H+ Vì vậy nấm thường phù hợp với môi trường có pH hơi acid Sự tăng

trưởng tối ưu thường trong khoảng pH= 4 - 6,5, và một vài chủng Trichoderma spp

thích hợp với pH < 3

Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của hầu hết Trichoderma là trong khoảng

25 - 300C

Sự tăng trưởng phụ thuộc nhiệt độ là một hiện tượng có tính thích nghi ở

Trichoderma, là loài có nguồn gốc từ vùng khí hậu ấm áp, có nhiệt độ tối ưu cao.

Những loài thuộc Trichoderma nhóm Longibrachium có nhiệt độ tối ưu cao nhất từ

38 - 440C Bên cạnh đó, T.polysporum và T.viride được quan sát có mật độ cao nhất

ở nhiệt độ hơi lạnh 20 - 250C Những chủng phân lập của T.viride thậm chí có thể

tăng trưởng ở 50C [8]

1.1.6 Hiện tượng ki sinh của nấm Trichoderma

Hiện tượng kí sinh của nấm Trichoderma spp bao gồm một số bước sau:

Bước 1: Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm ký chủ

[12]. Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma spp, hướng về nơi có

chất hóa học do tơ nấm ký chủ tiết ra (Chet và Elad, 1983, [15]) Khi tơ nấm

Trichoderma đã đến tơ nấm ký chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và cuộn xung

quanh sợi nấm ký chủ hình thành cấu trúc móc hoặc ép sát sợi nấm và phát triểnsong song với nấm ký chủ Theo Chet và Baker (1981), sự tiếp xúc nhận biết của

nấm Trichoderma với ký chủ của nó rất đặc trưng Ví dụ: Trichoderma harzianum nhận biết tơ nấm R.solani nhờ một chất bám dính (agglutinin), chất này liên kết đặc hiệu với lectin có trong cấu trúc vách tế bào của nấm Rhizoctonia slain [12]

Bước 2: Tơ nấm ký sinh thủy phân vách nấm ký chủ bằng cách tổng hợp tiết

ra các enzyme: glucanase, chitinase, cellulose (Elad, 1983 [15]) Enzyme

β-1,3-glucanase và chitinase của Trichoderma harzianum không chỉ tác động kết hợp với

nhau mà còn kết hợp với các hợp chất kháng nấm

Tóm lại, các chúng Trichoderma có thế được sử dụng làm tác nhân sinh học

là dựa trên khả năng ký sinh nấm của chúng (chủ yếu là ký sinh trên các loài nấm

gây bệnh thực vật) Quá trình ký sinh nấm của Trichoderma bao gồm các bước sau:

- Tiết enzyme ngoại bào và chất kháng sinh

Đặc tính ký sinh của loài Trichoderma trên các loài nấm gây bệnh thực vật

đã được nghiên cứu khá kỹ [12,16] Các nhà khoa học đa số tập trung tìm hiểu quátrình ký sinh nấm trong kiểm soát bệnh cây

Hình 1.3 A Trichoderma ký sinh trên nấm Pythium gây bệnh ở các cây

họ đậu (Trichoderma nhuộm màu vàng; Pythium nhuộm màu xanh) [41];

B Sự ký sinh của Trichoderma (T) trên nấm gây bệnh R.solani (R)

1.1.7 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và họat động enzyme chitinase của Trichoderma spp

Trichoderma spp có khả năng phân giải vách tế bào nấm Harran đã khảo sát

cơ chế phân tử của enzyme phân giải liên quan đến hoạt động kiểm soát sinh học

của T harzianum Sự thủy phân vách tế bào nấm chủ yếu dựa vào hoạt tính của

chitinase, glucanase và protease Sau khi bám và quấn quanh nấm bệnh, khuẩn tycủa nấm ký sinh tạo ra lỗ hổng trên vách của khuẩn ty ký chủ Màu sắc của khuẩn ty

ký sinh thay đổi và phát huỳnh quang mạnh bởi sự kết hợp của fluoresceinisothiocyanat với lectin gắn vào chitotriose hoặc với calcofluor White Cả phức hợpnày được gắn với β - glucan và oligomer N - acetyl - D - glucosamin Hiện tượng

này được nhận định do enzyme phân giải được tiết ra tại vị trí tiếp xúc bởi T.

harzianum khi phân hủy vách của R solani và S rolfsii Nếu có sự hiện diện của

cycloheximid, hiện tượng đối kháng bị ngăn chặn và hoạt tính của enzyme bị suy

giảm Hoạt tính của enzyme chitinase cũng được tìm thấy khi Trichoderma tấn công

R solani và S rolfsii trong môi trường đất [25].

T.harzianum có khả năng tấn công lên nấm bệnh thì tiết β - 1,3 - glucanase

và chitinase nhiều hơn những chủng không có khả năng tấn công nấm bệnh, khả

năng đối kháng của S rolfsii khi bị T harzianum tấn công cũng đã được nghiên cứu Khuẩn ty T harzianum khi xâm chiếm vào hạch của S rolfsii và tạo lỗ trên bề

mặt của hạch này, cuối cùng làm thay đổi hình dạng và làm biến mất tế bào chất của

nó [25]

Chủng Trichoderma khác nhau tùy thuộc ở cấp độ enzyme phân giải tạo ra

để tấn công sợi nấm của các loại nấm bệnh Để tìm ra sự hình thành enzymechitinase trong quá trình tương tác ký sinh, Harran đã thực hiện thí nghiệm nuôi cấy

ghép (dual - culture) trong đó T.harzianum đương đầu riêng lẻ với hai loại nấm bệnh đều chứa chitin trong thành phần cấu tạo vách tế bào là R solani, nhưng khó

có thể mọc tràn qua phần môi trường có chứa khuẩn ty của S rolfsii trong cùng

điều kiện [25]

Sự biểu hiện của hệ enzyme chitinase T harzianum trong tương tác này

được điều hòa rất đặc biệt bởi tùy loại tế bào ký chủ Hiệu quả đối kháng chống

lại R solani cao do sự biểu hiện của cả 3 loại endochitinase là CHIT52, CHIT42

và CHI33 và N - acetylglucosaminidase 102kDa Ngược lại, việc chống lại S.

rolfsii của T harzianum trong tương tác ký sinh không có hiệu quả do chỉ có

duy nhất 2 loại exochitinase là N-acetylglucosaminidase (CHIT102, CHIT73)được phát hiện [25].

1.1.7.1 Sự đối kháng giữa T harzianum và nấm bệnh S rolfsii

Inbar và Chet nghiên cứu sự cảm ứng chitinase đặc thù của T harzianum trong suốt quá trình ký sinh với S rolfsii Trước khi tiếp xúc, cả T harzianum lẫn

S rolfsii đều có chứa β-1,4-N-acetylgucosaminidase của riêng mình Nhưng khi có

sự tương tác β-1,4-N-acetylgucosaminidase của S rolfsii biến mất Trong giai đoạn

đầu của quá trình tương tác thì enzyme 1,4-N-acetylgucosaminidase 102 kDa

(CHIT102) của Trichoderma được cảm ứng đầu tiên Ngay sau đó (khoảng 12 gờ

sau khi tiếp xúc) thì hoạt động của CHIT102 bị suy giảm nhanh chóng đồng thờivới sự cảm ứng tạo ra nhiều enzyme β-1,4-N-acetylgucosaminidase kDa (CHIT73)

Hiện tượng này sẽ không xảy ra nếu sợi nấm của S rolfsii khử trùng trước khi bổ

sung vào môi trường ủ với.T harzianum.

Để nhận biết hiệu ứng của quá trình ký sinh, Inbar và Chet đã sử dụng hệ

thống biomimetic, gắn lectin tinh sạch từ S.rolfsii lên sợi nylon Khi Trichoderma

phát triển trên những sợi nylon được phủ lectin, hoạt tính của CHIT102 tăngnhanh hơn so với nuôi trên môi trường sợi nylon không gắn lectin Điều lưu tâm ởđây là hệ thống biomimetic tuyệt đối không có sự hiện diện của chitin, kết quả này

cho thấy cảm ứng CHIT102 ở Trichoderma trong quá trình đối kháng xảy ra rất

sớm [28]

1.1.7.2 Sự đối kháng giữa T harzianum và nấm bệnh R solani

Xem xét sự phức tạp trong tương tác in vivo giữa nấm ký sinh và ký chủ của

nó trên vùng rễ của thực vật hoặc ở trong đất Phương pháp phân tích tương tác kép(dual - interaction assay) là phương pháp khả thi nhất để nghiên cứu các đặc tínhsinh hóa của nấm ký sinh Flores đã sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sự

biểu hiện của gen protease (pbr1) ở T harzianum trong quá trình tương tác giữa T.

harzianum và R.solani Ông nhận thấy rằng, nồng độ mRNA của gen pbr1 tăng khi

sự tương tác xảy ra Carsolio nghiên cứu sự biểu hiện của CHIT42 ở T harzianum

IMI 206040 trong suốt thí nghiệm nghiên cứu sự ký sinh trực tiếp của nó trên

R.solani và ông nhận thấy sự biểu hiện của CHIT42 được cảm ứng mạnh mẽ trong

suốt quá trình tương tác đối kháng Trong quá trình đối kháng giữa T harzianum

và R.solani; CHIT102 cũng là enzyme được cảm ứng đầu tiên Tuy nhiên khoảng

12 giờ sau khi tiếp xúc hoạt tính của CHIT102 không hề suy giảm mà còn tiếp tụcgia tăng, đồng thời 3 loại endochitinase là CHIT52, CHIT42 và CHIT33 cũng đượccảm ứng Thời gian sau đó, hoạt tính của CHIT102 mới bắt đầu giảm dần trong khihoạt tính của CHIT52, CHIT42, CHIT33 dần dần gia tăng [11]

1.1.7.3 Những hợp chất kháng nấm của các chủng trichoderma

Gliotoxin (C13H14N2S2O4): là chất kháng sinh từ nấm T viride Gliotoxin

không bền và dễ bị phân hủy nhanh chóng trong ánh sáng, phổ kháng sinh củagliotoxin bao gồm vi khuẩn (chủ yếu vi khuẩn gram dương) và các nấm gây bệnhhoạt tính kháng sinh của gliotoxin liên quan đến sự có mặt của phân tử lưu huỳnhtrong cấu tạo của chúng

Viridin (C9H16O6): ngoài gliotoxin, người ta còn tách được chất kháng sinhViridin (sắc tố vàng), chúng có khả năng ức chế một số loài nấm gây bệnh như

Fusarium coeruleum, Botrytis alli, Penicillium notatum

- Trichozianine là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở

loài T harzianum Trichozianine kết hợp với những enzyme thủy phân vách trong

quá trình ức chế sự nảy mầm và kéo dài tơ nấm trong quá trình ký sinh nấm [36]

- Trichothecene từ T harzianum cũng có hoạt tính kháng nấm (Corley et

al.1994)

- Tricholin là protein bất hoạt ribosome do T viride tiết ra, chúng làm giảm

sự hình thành chuỗi polysome ở nấm bệnh Rhizoctonia solani [32].

- Claydon (1987) [6] xác định được chất alkylpyrons dễ bay hơi do T.

harzianum ức chế nấm R solani gây bệnh héo rũ trên cải trong điều kiện in vitro.

1.2 HỆ ENZYME CHITINASE

1.2.1 Định nghĩa

Chitinase hay poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid, glucanohydrolase,thuộc nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thànhchitobiose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4- β-glucosid giữa C1 và C4 của 2phân tử N-acetylglucosamine liên kết nhau trong chitin [8]

1.2.2 Phân loại

* Dựa vào phản ứng phân cắt

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4 chitobiosidse, acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase) [31]

N-Endochitinase: (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin

một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide Các enzyme này đã được nghiên

cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (loại

endochitinase: M1= 36kDa, pI1= 5,3 ± 0,2 và M2= 40kDa, pI2=3,9), Gliocladium viens (M=41kDa, pI=7,8) [31].

Chitin-1,4-chitobiosidse: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm

chính là các dimer chitobiose [31]

N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân

cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl- glucosamin [31]

β-D-Hình 1.4 Sơ đồ phân cắt chitin bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase [38]

* Dựa vào cấu trúc phân tử

Enzyme chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase [31]

Họ Glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu

trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộcEukaryote, Prokaryote và virus Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase,ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl- β-D-glucosaminidase Các chitinase này hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát màtrong đó các đoạn β- polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm β-anomer [31]

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcscens … [38].

Hình 1.5 Mô hình cấu trúc không gian

của enzyme chitinase Serratia marcescens

Họ Glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở

thực vật như cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)…, ngoài ra còn ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophillus influenzae …Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt

động thông qua cơ chế nghịch chuyển [39]

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc không gian

của chitinase Hodeum vulgare

Họ Glycohydrolase 20: Họ Glycohydrolase 20 bao gồm

β-N-acetyl-D-Glucosamin acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người

* Dựa vào trình tự amoni acid.

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện,peptid nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5nhóm: [33]

Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein

nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C)(peptid nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kếtenzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác [33]

Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác,

thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acidtương tự chitinase ở nhóm I Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm và vi khuẩn;chúng được cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài [33]

Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II

Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41

-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I,phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể sovới chitinase nhóm [33]

Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn

chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thựcvật bậc cao [33]

1.2.3 Các đặc tính cơ bản của enzyme chitinase

Một số ezyme chitinase có trọng phân tử thấp có thể được tạo ra từ mộtenzyme lớn hơn bằng cách phân cắt một số protein [31]

1.2.3.2 Điểm đẳng điện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị pI thay đổi rộng: 3,0 - 10,0 ở thực vật bậc cao vàtảo; 4,7 - 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá, 3,5 - 8,8 ở vi sinh vật [31]

Hệ số hấp thụ E280mg/ml = 1,24; phổ hấp thụ chỉ là bước sóng đơn 280μm.m.Hằng số Michaelis: 0,010 - 0,011 (g/100ml) [30]

1.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 - 500C(Frandberg và schnre, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998;Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001)

Nhìn chung, nhiệt độ tối ưu cho enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là

400C, ngoại trừ enzyme chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là

glycol chitin có nhiệt độ tối thích là 500C [30]

Tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có thể có những nhiệt độtối ưu khác nhau

Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III và các chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập từ suối nước nóng có khả năng chịu nhiệt độ đến 800C Mặtkhác, chitinase từ côn trùng (tằm…) không ổn định ở nhiệt độ 400C, có thể do côntrùng phát triển ở nhiệt độ 250C nên nhiệt độ tối ưu của enzyme chitinase côn trùngkhông cao

1.2.3.4 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH tối ưu của enzyme chitinase thường dao động trong khoảng từ 4

-9 đối với các chitinase ở thực vật bậc cao và tảo, ở thú là 4,8 - 7,5 và ở vi sinh vật là

3,5- 8,0 [31]

pH tối thích của enzyme chitinase còn phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng

Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pH tối thích khoảng 5,0 khi cơ

chất là chitin; enzyme chitinase của Streptomyces grieus có pH tối thích khoảng

6,3 Tùy mục đích phân tích, những cơ chất hòa tan như glycol chitin và N- acetylchicharidooligosacharid được sử dụng thay thế cho chitin thì pH tối ưu nằm trongkhoảng giá trị pH kiềm yếu [31]

Hoạt tính của enzyme chitinase sẽ nhanh chóng bị ức chế ở pH < 4,5 ngoạitrừ chitinase trong dạ dày của động vật có động vật có xương sống, vẫn hoạt động ở

pH 3,0 [31]

1.2.3.5 Chất tăng hoạt - chất ức chế

Allosamidin : allosamidin là chất ức chế được nghiên cứu, đặc biệt là với

chitinase côn trùng Allosamidin ức chế cạnh tranh với enzyme chitinase, giá trị KIkhoảng 0,1μm.m Chất này có cấu tạo tương tự dạng trung gian của cơ chất: một vòngoxazoline; vòng này có thể ở giữa carbonyl oxygen của nhóm N - acetyl và C1 củaN-acetyl-D-glucosamin trong quá trình thủy giải [31]

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất allosamidin [40]

Allosamidin: R1 = R2 = CH3

Demethylallosamidin: R1 = CH3, R2 = HDidemethylallosamidin: R1 = R2 = HCác ion kim loại: Các ion kim loại: Hg2+, Ag+ là những chất ức chế, còn ion

Cu+ thì tùy theo dạng enzyme chitinase: dạng chitinase bị ức chế hoặc tăng cườnghoạt tính (tìm thấy ở một số loài cá và vi sinh vật) Bên cạnh đó albumin cũng cóvai trò làm tăng hoạt động của enzyme chitinase, nhưng sự ảnh hưởng này chỉ rõràng sau 2 - 3 giờ đầu của phản ứng

1.2.3.6 Ổn định hoạt tính

Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnhkhoảng 2 năm Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370C trong trường hợp không

có mặt cơ chất Chu kỳ bán hủy ở 370C là 40 ngày và ở 50C là 230 ngày

Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200C là K = 0,145/

Chitin là một polymer mạch thẳng có cấu tạo dạng chuỗi, thành phần chủ yếu

là các monomer N acetyl D glucosmin nối với nhau bằng liên kết 1,4 β glucosid Mỗi đoạn chitin được xác định có độ dài là 10,4 A0 Về mặt cấu trúc,chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhómacetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay bằng nhóm hydroxyl(-OH) ở cellulose [1,35] Ngoài ra, chitin cũng có cấu trúc liên hệ với murein - cấutrúc polymer hiện diện ở vách tế bào vi khuẩn

-Ở lớp vỏ côn trùng và giáp xác chitin được gắn kết với các polysaccharidkhác (cellulose, mannan, glucan ) hàm lượng chiếm tối đa khoảng 3-5% sinh khốinấm tươi

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của chitin [40]

Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng: α, β, δ ; Sự khác nhau này biểuhiện ở sự sắp xếp các chuỗi Ở α- chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở β-chitin thì cùng hướng và ở δ- chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược Dạngchiếm nhiều nhất là α- chitin [29]

Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữacác mạch Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trongcồn và trong các dung môi thông thường Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơđặc như HCl, H2SO4…

1.2.4.2 Các dẫn xuất của chitin

Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4- methylumbellferyl - tri - N -acetyl chititrioside (MUC - phát huỳnh quang)

glycol-Enzyme chitinase không tác động trên các cơ chất: chitin nitrat, cellulose,hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin [29, 30]

1.2.5 Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin vàchitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân

tử nhỏ và khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 dohoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa (Hình 1.8A) [24]

Chitin 1,4- chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomers ở mức trùng hợplớn hơn hay bằng 3 [ (GlcNAc)2 với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thíchdiacetylchitobiose (GlcNAc)2 (Hình 1.8B) [24]

β-N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomers hay chitin một cáchliên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N - acetylglucosamin(GlcNAc)2 (Hình 1.8C)[17]

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của hệ enzyme chitinase ở Trichoderma [24]

1.2.6 Cơ chế cảm ứng của enzyme chitinase

Hiện nay, cơ chế cảm ứng hệ enzyme chitinase của Trichoderma là chủ đề

rất được nhiều nhà khoa học quan tâm Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu quả

khi nuôi cấy Trichoderma trong môi trường có nguồn carbon duy nhất là chitin tinh

sạch, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi nấm Không có hoặc rất ít có hiện tượng cảm ứngkhi thành phần môi trường có chứa chitosan, cellulose, chitin chưa tinh sạch hoặcliminarin [24]

Các enzyme khác nhau thì có cơ chế cảm ứng khác nhau Ví dụ: N - glucosamin chỉ cảm ứng đặc trưng cho việc tạo ra β-N- acetyl hexosaminidase (N-acetylglucosminidase) mà không cảm ứng tạo ra endochitinase hoặc chitobiosidase

acetyl-ở Trichoderma [24].

Trong quá trình ký sinh của Trichoderma trên những ký chủ khác nhau thì

mức độ cảm ứng và thành phần các sản phẩm enzyme tạo thành khác nhau, chủ yếu

là 1,4- β - N - acetylglucosaminiase 102 kDa và 72 kDa (CHIT102, CHIT72) vàmột vài enzyme endochitinase của nhóm II Hơn nữa vách tế bào nấm thu nhận từnhững loại nấm đảm Basidiomycetes khác nhau, được sử dụng để cảm ứng

endochitinase từ các chủng Trichoderma cũng khác nhau [24].

Sự hình thành hệ enzyme chitinase in vitri bị ức chế bởi tỷ lệ gia tăng của

lượng đường glucose, sucrose và sản phẩm cuối, điều này cho thấy rằng quá trìnhsinh tổng hợp enzyme được điều chỉnh một cách đặc hiệu bởi sự ức chế dị hóa.Điều này đã được nghiên cứu rõ hơn ở endochitinase 42kDa (CHIT42) và gen mã

hóa ThEn-42 của T Harzianum Nhiều tác giả cho rằng, glucose ức chế sự hình

thành CHIT42 cũng như ở cấp độ mRNA Sự hình thành CHIT72, CHIT42 vàCHIT33 được điều hòa ở cấp độ phiên mã [24]

Inbar và Chet đã chứng minh sự tạo thành enzyme chitinase của chủng T Harzianum ký sinh được bắt nguồn bởi việc tiết ra chất trung gian tương tác với ký

chủ là lectin Hiện tượng này xảy ra khi có sự cảm ứng của chitooligomer Lectin là

hệ thống nhận biết ký chủ của vi nấm ký sinh và rất có giá trị trong nghiên cứu pha

sớm của quá trình ký sinh nấm Sự thật là trong điều kiện in vitro hệ sợi nấm đã hấp

khử trùng có tác dụng cảm ứng CHIT33 và CHIT42 mạnh hơn tác nhân cảm ứng làchitin tinh sạch Do đó, khi có sự tồn tại của ký chủ nhưng không có chitin cũng đủ

để vượt qua được sự ức chế của glucose đối với CHIT42 [25]

Sự cảm ứng cũng bị hạn chế bởi ánh sáng, quá trình tạo bào tử hay sự tiếpxúc vật lý giữa tế bào và cơ chất Cũng có ý kiến cho rằng, hiện tượng bị ‘bỏ đói’cũng là tác nhân cảm ứng mạnh mẽ khả năng sinh tổng hợp CHIT42 Sự hoạt độngcủa hệ enzyme chitinase bị ảnh hưởng bởi các hoạt động của những hợp chất cảmứng khác nhau như các enzyme phá hủy vách khác (protease và glucanase), các liênkết protein trong vách tế bào chất, permease và chất kháng sinh

1.2.7 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase

Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các giới vi sinh vật Đến nay đã cónhiều nghiên cứu về enzyme chitinase của các vi sinh vật, thực vật, động vật [22]

1.2.7.2 Chitin nấm

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loại nấm sợi Các chủng nấm mốc cho

enzyme chitinase cao như: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, đặc biệt là ở các loài nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus các nấm phân hủy chitin cũng được tìm thấy trong các thủy vực như loài nấm Karlinggiomyces asterocystic thuộc lớp Phycomycetes [31]

Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm đóng vai trò quan trọng

về mặt dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình

phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chínhcủa vách tế bào nấm Chitinase còn giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấmđối kháng lại các loài nấm gây bệnh thực vật [31]

1.2.7.3 Chitinase thực vật

Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật chống lại các loại côn trùng

và nấm ký sinh gây bệnh [22] Người ta đã quan sát thấy chitinase tách chiết từ câycần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển Tuy nhiên cũng có tác giả cho rằngchitinase còn có vai trò khác như tham gia vào quá trình hình thành phôi [14] Các

thực vật bậc cao có khả năng tạo enzyme chitinase như: cao su (Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa mạch (Hordeum vulgare), cà rốt, hạt đậu nành và đặc

biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase [20]

1.2.7.4 Chitinase động vật

Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêuhóa của nhiều loài động vật không xương: ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân

đốt (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được

enzyme chitinase Đối với động vật có xương sống enzyme chitinase được tiết ra từtuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ; trong dung dịch

dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ [30]

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròntrong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thờiđiểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài(cutincun) trong quá trình biến thái hay lột xác [31]

1.2.9 Ứng dụng của enzyme chitinase trong nông nghiệp và y dược

1.2.9.1 Một số ứng dụng của enzyme chitinase trong nông nghiệp

1.2.9.1.1 Sử dụng enzyme chitinase trong kiểm soát nấm gây bệnh thực vật Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dùtrong cây không chứa chitin Chitinase và β - 1,3 - glucanase được tạo ra trong môthực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phânvách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh [26]

Sự kích thích hoạt tính enzyme chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bàođối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phângiải amoniac, phenylalanin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ởthực vật

Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại cácmầm bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất ra enzyme chitinase Thật vậy, vi

khuẩn có khả năng chống lại nấm bệnh bằng cách sản xuất ra chitinase [19].

Chitinase của Streptomyces có khả năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh Chủng Serratia marcescen hoang dại có khả năng kiểm soát sinh học đối với các mầm bệnh thực vật Ở chủng Serratia marcescens đột biến có mang gen ChiA (gen mã

hóa enzyme chitinase), khi gen bị bất hoạt thì chủng này mất hiệu lực kiểm soát

sinh học Khi tái tổ hợp gen ChiA từ Serratia marcescens vào E.coli, E.coli có khả năng làm giảm các bệnh gây ra bởi Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani [37].

Những thí nghiệm in vitro gần đây cho biết sự nẩy mầm của bào tử và sự kéo dài sợi nấm của các nấm gây bệnh thực vật như: Botrytis cinerea, Fusarium solani, F.graminearum bị ức chế bởi enzyme phân giải chitin và glucan tách chiết từ Trichoderma Harzianum.

Một số loài nấm có vách chứa chitin bị ức chế bởi enzyme chitinase bào gồm

Fusarium, Gliocladium, Rhizotonia, Ustilago, Erysiphe, Botrytis, Sclerotium và Alternaria

1.2.9.1.2 Sử dụng enzyme chitinase trong kiểm soát côn trùng

Phần lớn các nấm gây bệnh côn trùng như Metarhizium anisopliae, Nomuraerileyi, Aschersohonia aleyrodis, Verticillium lecanii và một số nấm thuộc

bộ Entomophtorales xâm nhập vào cơ thể sâu bằng sợi nấm xuyên qua lớp vỏcutincun (là phức chất protein - chitin) vào bên trong Các vòi nấm tiết ra enzymengoại bào bao gồm chủ yếu là enzyme phân giải chitin và protein, tạo thành những

lỗ giúp chúng xâm nhập vào trong và dễ dàng lây nhiễm bệnh côn trùng Các nhàkhoa học đã chứng minh mối liên hệ giữa khả năng tiêu diệt sâu bệnh của vi nấmđối kháng và sự tổng hợp enzyme chitinase ở các loài vi nấm này [4]

1.2.9.2 Ứng dụng của enzyme chitinase trong y dược

N,N’ - diacetylchtobiase được sử dụng rộng rãi làm nguyên liệu khởi đầu cho sinh

tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học Chitinase thu nhận từ S Griseus có khả

năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục được cải biến hóa họcthành một dẫn xuất disaccharid mới 2- acetamido- 2- deoxy- D- allopyranose, đây làchất trung gian để tổng hợp nên chất ức chế enzyme Ngược lại, Kobayashi và cộng

sự cho biết có thể sử dụng chitinase của Bacillus để tổng hợp chitobiose nhờ sự kết

nối N- acetyl- D- glucosamin với dẫn xuất đường oxazolin [9]

1.2.9.2.2 Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinaseNhiều phương pháp chẩn đoán bệnh nấm được đề xuất như ELISA, sự ngưngkết kháng thể, mẫu dò phân tử , để phát hiện đặc hiệu các nấm gây bệnh trong cácdịch cơ thể nhưng giá thành quá cao Những bất lợi chung trong hầu hết các phươngdiện sử dụng là khó áp dụng đối với các mẫu dịch cơ thể bởi vì khó cố định được

staining), calcofluor/cellufour, India Ink, lectin label, rylus BSU được dùng nhuộm

cố định các tiêu bản nấm nhưng không có tính đặc hiệu cao và cần sử dụng các thiết

bị đắt tiền [34]

Chitin hiện diện nhiều trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là mộtgiai đoạn trong chu trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong nhữngvết chồi Do đó cần một phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sởxây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, hiệu quả các loài nấm gâybệnh [34]

Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chẩn đoán mới cácbệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng enzyme chitinase đã được phân lập

tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó kết hợp chặt chẽ

với chitin và có thể sử dụng như một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao,

để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm mentrong những lát cắt mẫu mô bệnh [34]

1.2.9.2.3 Chế phẩm thuốc mới: enzyme chitinase và các dược chất kháng nấm Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân khángnấm có thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase [3, 20]

 Allylamines - thiocarbamates như olnaftat, terbinafin

 Griseofulvin ; acid undecylenic ; bezoic

Enzyme chitinase có thể phát huy hiệu quả các tác nhân kháng nấm ở liềulượng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân Ngoài ra việc kết hợp giữa enzymechitinase và laminarinase được ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vàovách tế bào nấm (so với chỉ dùng enzyme chitinase) [3, 20]

Các nhà khoa học đã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của enzyme chitinasetái tổ hợp trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các loại nấm khác nhau thuộc nhóm

Aspergillus, Candida Hiệu quả của sự điều trị với tác nhân kháng nấm được ước

lượng trên 3 điểm:

 Giảm tỷ lệ chết

 Giảm số lượng tế bào nấm được nuôi cấy từ các cơ quan

 Giảm mức độ lưu thông kháng nguyên nấm

1.2.10 Sơ lược các nghiên cứu về chitinase

1.2.10.1 Trên thế giới

So với cac enzyme khác như protease, amylase, pectinase… thì hệ enzymechitinase được nghiên cứu chậm hơn và các công trình nghiên cứu về chúng còn hạn

chế Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R Berger và D.M Renolds, 1958 ; R.Grupta, R.K Saxena, P Chatuvedi và J.S Windi, 1995) Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng

dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm Năm 1978, P.A Carroad vàR.A.Tom có công trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lýchất thải chứa chitin, và tiếp đó là nghiên cứu của I.G Cosio, R.A Fisher, P.A (1982)

đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin

Về sau trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên

cứu trên các đối tượng khác như Serratia liquefaciens (S.Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P Vyas và M.V Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng

dụng của chitinase trọng việc phá vỡ vách tế bào nấm

Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi

Trichoderma Năm 1991, C.J Ulhoa, J.F Peberdy nghiên cứu sự điều hòa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma Harzianum Năm 1999, P.A.Felse và T Panda nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp chitin từ Trichoderma Harzianum Năm 2000, P.A Felse và T Panda nghiên cứu quá trình nuôi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma Harzianum trong bể lắc Năm 2003, Ashok

Pandy và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp chitinase có tính kháng

nấm từ Trichoderma Harzianum nuôi cấy trên môi trường bán rắn Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện có hoạt tính chitinase khá cao, ứng

dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật Đối với chi nấm

Aspergillus cũng đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên môi trường bán rắn (Noakarn Rattanakit và cộng sự, 2002) Những chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A.A Sherief, 1990) ; A fumigatus (Jin - Ian Xia và Jing Xiong, 2009).

A.A Shubakow và P.S Kucheryavykh (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy nhiều chủng

nấm khác nhau trong đó có các chủng thuộc các chi nấm Aspergillus và Trichoderma…Tuy nhiên, những nghiên cứu về chitinase từ nấm sợi phần lớn thực

hiện trên môi trường nuôi cấy lỏng

Vi khuẩn cũng là một đối tượng được nghiên cứu về việc sinh tổng hợpchitinase Năm 1998, B Bhushan, G.S.Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu

nhiệt từ Bacillus sp G- 1 Và gần đây nhất, năm 2009, S.M Akhir và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme chitinase từ Bacillus licheniformis bằng phương pháp nghiên cứu bề mặt đáp ứng (RSM) Ưu điểm của

chitinase thu nhận từ vi khuẩn này là tính bền nhiệt của chúng

Trên đối tượng thực vật, cũng có một vài nghiên cứu thu nhận chitinase.Năm 2004, Isabela S Santos và cộng sự có công trình nghiên cứu về chitinase thu

nhận trên đối tượng thực vật (hạt cây Adenanthera pavonina L), cây họ đậu Phaseolumungo Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây Adenanthera pavonina L là

loại enzyme bền nhiệt Tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying-Chou Chen(1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang

1.2.10.2 Trong nước

Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước còn rất hạnchế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận.Năm 2001, tác giả Đình Minh Tiệp có công trình nghiên cứu đặc tính của enzyme

chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarus và một số ứng dụng trong lĩnh

vực bảo vệ thực vật và y dược

Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Tiệp, ĐồngThị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá

trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma sp.

Năm 2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp

chitinase từ Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh.

Năm 2008, tác giả Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát khả năng tác động lên

nấm Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma

Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu

quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme

chitinase có hoạt tính khá cao (hoạt độ đạt 192 UI/ml)

Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu

vẫn trên nấm trichoderma, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh vực bảo vệ

thực vật và khởi đầu trong lĩnh vực y dược

1.3 Qui hoạch thực nghiệm

1.3.1 Định nghĩa

Qui hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làmthực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đốitượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điềukiện tối ưu) ; trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng

1.3.2 Đối tượng của qui hoạch thực nghiệm trong các ngành công nghệ

Đối tượng của qui hoạch thực nghiệm trong các ngành công nghệ là một quátrình hoặc hiện tượng nào đó có những tính chất, đặc điểm chưa biết cần nghiêncứu Người nghiên cứu có thể chưa hiểu biết đầy đủ về đối tượng, nhưng đã có một

số thông tin tiên nghiệm dù chỉ là sự liệt kê sơ lược những thông tin biến đổi, ảnhhưởng đến tính chất đối tượng

1.3.3 Các phương pháp qui hoạch thực nghiệm

* Thực nghiệm sàng lọc: là thực nghiệm mà nhiệm vụ của nó là tách nhữngyếu tố ảnh hưởng đáng kể ra khỏi những yếu tố đầu vào để tiếp tục nghiên cứuchúng trong các thực nghiệm cần thiết

* Thực nghiệm mô phỏng: là thực nghiệm liên quan tới việc mô phỏng hiệntượng cần nghiên cứu Có nhiều dạng mô phỏng, ở đây chỉ quan tâm đến dạng thựcnghiệm được hoàn tất bằng mô hình hồi qui đa thức

* Thực nghiệm cực trị: là thực nghiệm được phát triển từ thực nghiệm môphỏng Nhiệm vụ của nó là xây dựng mô hình toán thực nghiệm, theo đó xác địnhgiá trị tối ưu của hàm mục tiêu và các tọa độ tối ưu của hàm Nói cách khác là xácđịnh bộ kết hợp giá trị các yếu tố mà tại đó hàm mục tiêu đạt cực đại

1.3.4 Các phương pháp kế hoạch thực nghiệm cực trị

1.3.4.1 Kế hoạch bậc một hai mức tối ưu

Nếu không có thông tin tiên nghiệm cho biết hệ đang ở vùng dừng (vùng phituyến, vùng cực trị) thì để mô tả quá trình nên dùng hàm tuyến tính và không có các