VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Mẫu nấm bệnh thực vật do Phytophthora gây ra tại Bình Dương
- Mẫu đất vườn thu được tại Bình Dương
2.1.2 Hóa chất và thiết bị
- Glucose, NaNO3, NaCL, Agar, KCL, MgSO4.7H2O, khoai tây, nước cất, cao thịt,
KH2PO4, pepton, cao nấm men.v.v
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Tủ sấy, máy đo pH, tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ lạnh Sanyo, máy hấp thanh trùng, lò vi ba, bếp điện, cân điện tử, đĩa petri, bình tam giác và micropipet là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu và đảm bảo độ chính xác trong các thí nghiệm khoa học.
MT1 : MT Czapek – Dox: Nuôi cấy, giữ giống nấm sợi, thử hoạt tính enzym ngoại bào (amilaza, proteaza, xenluloza) [5]
MT2: Meat peptone agar (MPA): Dùng để nuôi cấy giữ giống vi sinh vât kiểm định [5]
Agar 20g Nước cất 1000ml pH= 7,5
MT3: Malt Extract Agar ( MEA) : Dùng để phân loại nấm sợi [5]
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng kẹp và kéo vô trùng để cắt mẫu bệnh, sau đó cho vào túi nilong sạch, buộc chặt và đánh số, ghi rõ địa điểm Tiến hành phân lập mẫu bệnh trên môi trường PGA (MT4) và WA (MT5) trong vòng 24 giờ kể từ khi lấy mẫu.
Sử dụng muỗng vô trùng để lấy một ít lớp đất mặt cho vào túi nilong sạch, sau đó buộc chặt, đánh số và ghi rõ địa điểm Tiếp tục lấy mẫu đất ở độ sâu 5cm so với mặt đất Mẫu đất cần được phân lập trên môi trường MT2 trong vòng 24 giờ sau khi thu thập.
Sử dụng kéo và kẹp vô trùng đã được khử trùng để cắt mẫu bệnh thành những miếng nhỏ có diện tích 1mm Đặt các miếng mẫu vào đĩa petri đã được chuẩn bị với môi trường PGA và WA, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3 đến 5 ngày để quan sát kết quả.
Nguyên tắc nuôi cấy vi khuẩn bao gồm việc tách rời các tế bào vi khuẩn và nuôi chúng trong môi trường dung dịch đặc trưng, nhằm tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển Sau đó, quá trình cấy truyền được thực hiện một hoặc nhiều lần để đảm bảo thuần khiết cho chủng vi khuẩn.
Để tiến hành phân lập vi khuẩn từ mẫu đất, đầu tiên cân 1g đất và cho vào ống nghiệm cùng 9ml nước cất, khuấy đều để tạo dịch lọc có độ pha loãng 10^-1 Sau đó, hút 1ml dung dịch 10^-1 vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất để tạo dung dịch nồng độ 10^-2 Tiếp tục pha loãng theo cách tương tự để thu được các dung dịch nồng độ 10^-3, 10^-4, 10^-5, và 10^-6 Nhỏ 0,1ml (2 giọt) dung dịch từ mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa môi trường MPA, sử dụng que để trải đều trên bề mặt thạch và chuyển sang các đĩa khác Ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng từ 2-5 ngày, sau đó lựa chọn những khuẩn lạc vi khuẩn có đặc điểm mô tả để cấy chuyền làm thuần Cuối cùng, cấy giống thuần sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của vi khuẩn.
Sau khi thu được chủng vi khuẩn thuần khiết, cần tiến hành quan sát các đặc điểm sinh học để phân loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus, theo nghiên cứu của Lương Đức Phẩm (2011).
2.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus với nấm
Khi vi khuẩn trên khối thạch hình thành hoạt chất đối kháng, chúng sẽ ức chế sự phát triển của nấm, tạo ra một vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch.
Để kiểm tra hoạt tính đối kháng của vi khuẩn, sử dụng khoan nút chai vô trùng để khoan các khối thạch Sau đó, đặt các khối thạch này vào đĩa petri có môi trường MT4 đã được cấy nấm kiểm định và ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3-5 ngày.
- Đánh giá khả năng đối kháng: Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính vi khuẩn
20>(D-d)> 10mm: Đối kháng trung bình
(D-d)≥ 25mm: Đối kháng rất mạnh
2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV
2.2.5 Phương pháp nhuộm Gram[22] Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng rất phổ biến để theo dõi các đặc điểm hình thái
Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp thụ, liên quan đến muối magiê của acid riboleic Khi nhuộm phức tạp, muối này phản ứng với các loại thuốc nhuộm tryphenylmetan như gelatinviolet, oryatanviolet và metylviolet, cho phép chúng chịu được tác động của cồn mà không bị mất màu Những vi khuẩn này cho thấy khả năng giữ màu sắc bền vững dưới điều kiện này.
20 màu là những vi khuẩn gram (+), ngược lại những vi khuẩn mất màu là những vi khuẩn gram(-)
- Làm tiêu bản : + Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên phiến kính
+ Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứ tự sau:
+ Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn
- Nhuộm tiêu bản + Đặt 1 miếng giấy lọc lên 1 vết bôi
+ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút + Nhuộm lugol trong 1 phút
+ Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu
+ Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ 10 - 30 giây
Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 100
Catalase là một enzyme có khả năng phân hủy hydrogen peroxide(H2O2) thành nước (H2O) và oxygen (O)
Lấy khuẩn lạc 18-24h tuổi đặt lên lam kính sạch Nhỏ 1 giọt H2O2 3% phủ lên vi khuẩn và quan sát sự tạo thành bọt khí
Kết quả kiểm tra cho thấy bọt khí sủi mạnh và nhanh là dấu hiệu của vi khuẩn có catalase (+) Ngược lại, một số vi khuẩn không sản sinh catalase nhưng vẫn có khả năng phân hủy H2O2, tạo ra bọt khí nhỏ và chậm trong vòng 30 giây, thì không được coi là catalase (+).
2.2.7.Phương pháp giữ giống cấy chuyền[21]
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm là môi trường giữ giống
Để tiến hành, đầu tiên đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm (MT2) và nghiêng ống nghiệm để thạch đông Sau đó, sử dụng que cấy vô trùng để cấy zigzag trên bề mặt thạch nghiêng Nút ống nghiệm lại và đặt trong tủ ấm ở 37°C Sau 24 giờ, khi thấy xuất hiện khuẩn lạc, chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh ở 4°C để bảo quản giống.