Tuyển chọn các chủng trichoderma đối kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long

HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG TRICHODERMA ĐỐI KHÁNG NẤM BỆNH TRÊN CÂY THANH LONG VÀ TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH Ủ COMPOST TỪ CÀNH THANH LO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG TRICHODERMA ĐỐI

KHÁNG NẤM BỆNH TRÊN CÂY THANH LONG VÀ TĂNG CƯỜNG QUÁ TRÌNH Ủ COMPOST TỪ CÀNH

THANH LONG

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HAI

Sinh viên thực hiện : THÁI QUỐC ĐÔNG

MSSV: 1615101003 Lớp: 16HSH02

TP Hồ Chí Minh, 2018

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng em dưới sự hướng dẫn của tiến sĩ Nguyễn Thị Hai tại Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện

THÁI QUỐC ĐÔNG

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện học tập để chúng

em có thành quả như ngày hôm nay

Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh, chúng em được các thầy cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án Chúng em xin được gửi đến các Thầy Cô lời cảm ơn chân thành nhất, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện

đồ án này Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn cùng khóa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe trân trọng nhất

Trong quá trình làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên

có nhiều thiếu sót, mong các Thầy cô bỏ qua

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Sinh viên thực hiện

THÁI QUỐC ĐÔNG

MỤC LUC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Mục tiêu nghiên cứu 1

4 Nội dung nghiên cứu 2

5 Đối tượng nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam 3

1.1.2 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long 4

1.2.Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long 4

1.2.1 Phân loại nấm Neoscytalidium dimidiatum 4

1.2.2 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum 5

1.3.Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long 7

1.3.1 Phân loại 7

1.3.2 Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp 8

1.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long …10 1.5 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh 11

1.5.1 Phân loại 11

1.5.2 Các chủng nấm Trichoderma spp 11

1.5.3 Đặc điểm hình thái 14

1.5.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 15

1.5.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp 16

1.5.6 Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh….16 1.5.7.Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam 18

1.5.8.Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp 19

1.6 Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost 21

1.6.1 Định nghĩa compost 21

1.6.2 Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose 21

1.6.3 Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Vật liệu 25

2.2.1 Nguồn nấm đối kháng, nấm gây bệnh 25

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 25

2.2.3 Hóa chất 25

2.3 Phương pháp nhiên cứu 28

2.3.1 Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma 30

2.3.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp 30

2.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma với nấm gây bệnh. 32

2.3.4 Thử nghiệm ủ compost cành thanh long của nấm Trichoderma spp 34

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Đặc điểm sinh trưởng nấm Trichoderma spp 38

3.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma spp 45

3.2.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng nấm Trichoderma spp

45

3.2.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng Trichoderma spp 47

3.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Trichoderma spp với nấm bệnh 49

3.3.1 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum 49

3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên thanh long 52

3.4 Thử nghiệm ủ compost từ cành thanh long của chủng nấm Trichoderma T3 54

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

4.1.Kết luận 57

4.2.Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 62

Phụ lục A: Bảng số liệu thô 62

A.1 Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày 62

A.2 Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày 63

A.3 Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 64

A.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy 65

A.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy 66

A.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy 67

A.7 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày 68

A.8 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày 68

A.9 Hàm lượng C, N trong cành thanh long 69

Phụ lục B: Số liệu xử lý 70

B.1 Tốc độ sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày 70

B.2 Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày 71

B.3 Đường kính vòng phân giải chitin (cm) của các chủng Trichoderma spp sau 2 ngày. 73

B.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 3 ngày nuôi cấy 74

B.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 5 ngày nuôi cấy 76

B.6 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium dimidiatum sau 7 ngày nuôi cấy 78

B.7 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 5 ngày nuôi cấy 80

B.8 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp sau 7 ngày nuôi cấy 81

Phụ lục C: Hình ảnh 82

C.1 Hình thái đại thể của các chủng nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 82

C.2 Đường kính vòng phân giải cellulose (cm) và chitinase (cm) sau 2 ngày nuôi cấy

của các chủng Trichoderma spp 83 C.3 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium

dimidiatum 89

C.4 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp với nấm Colletotrichum sp

93

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma 12

Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí 24

Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Trichoderma spp sau 2 ngày nuôi cấy 38 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải cellulose của các chủng nấm Trichoderma spp 45 Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma sau 2NSC 47 Bảng 3.4 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma spp với nấm Neoscytalidium

dimidiatum 49

Bảng 3.5 Tỉ lệ đối kháng (%) của các chủng Trichoderma với nấm Colletotrichum sp.

52Bảng 3.6 Kết quả phân tích hàm lượng carbon, hàm lượng nitơ tổng của nguyên liệu ban đầu và 30 ngày sau ủ 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi thể của Neoscytadium dimidiatum 5

Hình 1.2 Hình thái vi thể của Colletotrichum gleoesporioides 7

Hình 1.3 Hình thái vi thể của Trichoderma harzianum 11

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose 22

Hình 3.1 Chủng nấm Trichoderma T22, T26 và T3 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 45

Hình 3.2 Vòng phân giải enzyme cellulase của chủng Trichoderma T3,T22,T26,TC6,TC15 47

Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng Trichoderma T3,T22,T7 49

Hình 3.4 Đĩa nấm đối chứng Neoscytalidium dimidiatum ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 51

Hình 3.5 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 51

Hình 3.6 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm

Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 51

Hình 3.7 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm Neoscytalidium dimidiatum trên đĩa petri ở 3,5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 52

Hình 3.8 Đĩa nấm đối chứng Colletotrichum sp ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua)…53 Hình 3.9 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T3 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 53

Hình 3.10 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T22 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 54

Hình 3.11 Kết quả đối kháng của các chủng nấm Trichoderma T26 với nấm

Colletotrichum sp trên đĩa petri ở 5,7 NSC (theo thứ tự từ trái qua) 54

Hình 3.12 Thanh long trước khi ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 55

Hình 3.13 Thanh long ở công thức đối chứng 30 ngày sau ủ: (a) đối chứng ; (b) công thức thí nghiệm 56

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CMC: Carboxymethyl cellulose NT: nghiệm thức

ĐC: đối chứng PDA: Potato D-glucose Agar VSV: vi sinh vật

NSC: ngày sau cấy

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết đề tài

Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới Thanh long hiện đang được trồng tại các vùng chuyên canh quy mô lớn như các tỉnh Bình Thuận, Tiền Giang và Long An Diện tích ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích cả nước Trong đó, Bình Thuận là tỉnh có diện tích trồng thanh long cao nhất nước Theo số liệu mới nhất của sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Bình Thuận, tính đến ngày 31/12/2017, toàn tỉnh có khoảng 27.845

ha thanh long với sản lượng 696.125 tấn Đi kèm với sự gia tăng về diện tích và sản lượng thanh long là sự gia tăng về dịch bệnh và lượng phế thải từ cành thanh long Trong

số các dịch bệnh hại trên thanh long, bệnh đốm nâu và bệnh thán thư là hai bệnh hại chính gây ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của thanh long Việc sử dụng thuốc hóa học có hiệu quả thấp đối với bệnh, đặc biệt trong điều kiện mưa Vì vậy các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các tác nhân sinh học để quản lý bệnh hại thanh long

Trong bộ sưu tập các chủng Trichoderma của phòng thí nghiệm Viện khoa học ứng

dụng, trường Đại học Công nghệ TP.HCM, có nhiều chủng có khả năng đối kháng cao với bệnh đốm nâu (Nguyễn Thị Bích Tuyền, 2016) Tuy vậy, chưa có nghiên cứu đánh giá nào trên bệnh thán thư Vì vậy, để làm cơ sở chọn tạo các chủng tốt làm chế phẩm trừ bệnh đốm nâu và thán thư (hai bệnh hại chính trên thanh long) cũng như hỗ trợ ủ

cành thanh long sinh viên tiến hành đề tài “Tuyển chọn các chủng Trichoderma đối

kháng nấm bệnh trên cây thanh long và tăng cường quá trình ủ compost từ cành thanh long”

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn các chủng Trichoderma spp có khả năng đối kháng nấm bệnh trên phế

phẩm thanh long và chủng có khả năng sinh enzyme cellulase để tăng cường quá trình

ủ compost từ cành thanh long

3 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định khả năng sinh trưởng của các chủng Trichoderma spp

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng Trichoderma spp

Xác định khả năng đối kháng với nấm bệnh Neoscytadium dimidiatum gây bệnh

đốm nâu trên cây thanh long

Xác định khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên

cây thanh long

Ứng dụng chủng nấm Trichoderma spp ủ compost

4 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng nấm Trichoderma spp

Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào cellulase và chitinase của chủng nấm

Trichoderma spp

Đánh giá khả năng đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm Đánh giá khả năng đối kháng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long của các chủng nấm Trichoderma spp trong điều kiện phòng thí nghiệm

Xử lý các phế phẩm của cây thanh long bằng phương pháp ủ compost ở phạm vi phòng thí nghiệm

5 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm đối kháng Trichoderma spp

Nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long

Nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long

Phế phẩm thanh long lấy từ Bình Thuận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình sản xuất thanh long ở Việt Nam

1.1.1 Tình hình trồng thanh long ở Việt Nam

Cây thanh long là cây ăn trái thuộc họ xương rồng, có nguồn gốc ở vùng sa mạc thuộc Mexico và Columbia, thuộc nhóm cây nhiệt đới khô Thanh long được người Pháp mang đến Việt Nam từ thế kỷ 19, trồng rải rác trong sân vườn, đến thập niên 1980 mới được trồng thương mại Phần lớn thanh long được trồng ở Việt Nam là loài Hylocereus undatus, có vỏ đỏ hay hồng/ruột trắng còn lại là loại ruột đỏ Loại vỏ đỏ ruột trắng chiếm 95%, 5% còn lại là loại vỏ đỏ, ruột đỏ

Mùa thanh long từ tháng 4 đến tháng 10, rộ nhất từ tháng 5 đến tháng 8 Nhiều giống thanh long được lai tạo để tăng năng suất, chất lượng và phù hợp đất đai và khí hậu từng vùng Tại Viện Cây ăn quả Miền Nam hiện đang bảo tồn 20 giống thanh long

từ nguồn thu thập trong nước và du nhập từ nước ngoài cùng 40 giống thanh long lai, phục vụ công tác nghiên cứu, bảo tồn gen, chọn tạo giống

Việt Nam là nước có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất châu Á và cũng là nước xuất khẩu thanh long hàng đầu thế giới Diện tích trồng thanh long ở Việt Nam tăng khá nhanh từ 5.512 ha năm 2000 lên đến 35.665 ha diện tích trồng thanh long với tổng sản lượng đạt khoảng 614.346 tấn vào năm 2014 Theo số liệu ước tính sơ bộ năm

2015, diện tích trồng mới gần 5.000 ha, sản lượng đạt khoảng 686.195 tấn

Hiện tại, thanh long đã được trồng rộng rãi ở các tỉnh thành trên toàn quốc Tuy nhiên, diện tích tập trung lớn nhất là: Bình Thuận, Long An, Tiền Giang (3 tỉnh này đã

có hơn 37 ngàn ha) tiếp theo là Tây Ninh, Đồng Nai, một số tỉnh Tây Nguyên và các tỉnh phía Bắc Phát triển mạnh thành các vùng chuyên canh quy mô lớn tập trung ở các tỉnh như Bình Thuận, Tiền Giang, và Long An Diện tích thanh long của ba tỉnh này chiếm 92% tổng diện tích và 96% sản lượng của cả nước, phần diện tích thanh long còn lại phân bố ở một số tỉnh miền nam như Vĩnh Long, Trà Vinh, Tây Ninh, Bà Rịa – Vũng Tàu và một số tỉnh Miền Bắc

Bình Thuận là nơi có diện tích và sản lượng thanh long lớn nhất chiếm 63,2% diện tích và 68,4% sản lượng cả nước, kế đến là Long An (chiếm 17,3% diện tích và 14,2% sản lượng) và đứng thứ ba là Tiền Giang (chiếm 10,9% diện tích và 13,7% sản lượng)

1.1.2 Thực trạng về nguồn phế phẩm thanh long

Thanh long là cây trồng có giá trị xuất khẩu cao của Việt Nam Bình Thuận là tỉnh

có diện tích trồng thanh long nhiều nhất trong cả nước Trong quá trình canh tác, nông dân gặp khó khăn trong khâu đảm bảo vệ sinh môi trường Một trong nhưng nguyên do

là sau lượng lớn cành thanh long, bông lép, trái thối sau khi được cắt tỉa không có chỗ tiêu hủy Như vậy, bình quân mỗi năm có từ 3 – 4 vụ nên lượng phế phẩm từ cây thanh long lớn, nhiều hộ dân đã dùng biện pháp tủ dưới gốc thanh long, hoặc đổ đống ngay tại vườn gây hôi thối, là nguồn phát sinh gây bệnh cho cây thanh long Điều này vừa ảnh hưởng đến môi trường, vừa không đảm bảo đúng quy trình sản xuất theo tiêu chuẩn ViệtGAP (Theo thời báo Úc, 2017)

1.2 Giới thiệu về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu trên cây thanh

long

1.2.1 Phân loại nấm Neoscytalydium dimidiatum

Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè, bệnh ma là những tên gọi khác nhau mà bà con nông dân trồng thanh long ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long An đặt cho một loại dịch hại mới phát sinh Theo ghi nhận của Viện Nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam thì trên thực tế bệnh đốm trắng bệnh này đã xuất hiện rải rác đầu tiên vào năm 2008 tại Bình Thuận và Tiền Giang và đến năm 2011 trở lại đây thì bệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn

Sau khi phân lập và định danh theo mô tả hình thái của Crous và cộng sự (2006),

xác định nguyên nhân gây bệnh đốm trắng là nấm Neoscytalidium dimidiatum Kết quả

này tương tự như với các nghiên cứu ở Đài Loan (Chuang, et al 2012) và ở Malaysia (Masratul Hawa, et al 2013)

Đặc điểm vị trí phân loại của nấm Neoscytalidium dimidiatum (Agrios, 2005;

Crous & Slippers, 2006)

Loài: Neoscytalidium dimidiatum

(Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh dưỡng

dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường có một nhân, đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạo thành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân Vách tế bào cấu tạo bằng chitin và glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất, trong nước, trên cạn, thực vật, động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật, động vật, người gây nên những thiệt hại lớn Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng sự chia đôi tế bào, nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản vô tính bằng bào tử đính (conidia)

và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi Các bào tử khác tính (+,-) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phân chia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội

rồi giảm nhiễm tạo thành bào tử túi Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai

đoạn đơn bội, giai đoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội

chiếm ưu thế Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở

lỗ và quả thể hở

Cơ chế gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum: Bào tử nấm nảy mầm trên

bề mặt tiếp xúc rồi xâm nhập vào trong mô gây hoại tử, bệnh gây hại trên thân cành và quả thanh long

1.2.2 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Theo báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum trên cây có múi tại Italya

(G Polizzi et al, 2009) vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi, cam ngọt 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh

Hình 1.1 Hình thái vi thể của

Neoscytadium dimidiatum

(nguồn internet)

mới với triệu chứng điển hình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm

Theo nghiên cứu viện nghiên cứu sở nông nghiệp, Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan Triệu chứng của bệnh là các vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu

cam Bệnh được xác định do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra

Năm 2008, nấm Neoscytalidium dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở Malaysia Neoscytalidium dimidiatum đã gây ra triệu chứng như chấm tròn nhỏ,

thối và sau đó mục nát Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA

và ủ ở 250C trong 7 ngày Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA, nấm có quả cành màu đen, đường kính 90mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trong pha lê có 2 vách ngăn DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA thực hiện phản ứng khuếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5 Cuối cùng thực hiện lây bệnh nhân tạo để so sánh đánh giá bệnh

1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Sự xuất hiện một loại dịch hại mới phát sinh gần đây gây thiệt hại nghiêm trọng

và có xu hướng càng ngày lan rông, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả là mối

lo ngại cho người nông dân trồng thanh long Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên

cứu cây ăn quả Miền nam (2011), bệnh đốm trắng do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra, nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola,

Hendersonula toruloidea,…(Crous et al 2006) bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn công mạnh

và mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển từ 20 – 30˚C Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ở những vùng có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị che mát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay phân bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung, vi lượng đều có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi

có bệnh thì khó phòng trừ hơn Vết bệnh ban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàng cam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổi lên và gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây, năng suất

và giá trị thương phẩm của quả Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch

Theo Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2014) khi so sánh trình tự vùng gen

ITS-RADN của mười một mẫu phân lập nấm Neoscytalidium dimidiatum tại Viện Nghiên

Cứu CNSH và Môi Trường - trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh cho thấy các

mẫu phân lập tương đồng rất cao với trình tự của loài Neoscytalidium dimidiatum đã

được định danh về hình thái

Hà Thị Thúy và các cộng sự (2016) tại Viện Môi trường Nông nghiệp đã nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long do nấm

Neodiumdimidiatum gây ra Nghiên cứu đã xác định được 2 chủng vi sinh vật có khả

năng ức chế Neoscytalidium dimidiatum cao là chủng Bacillus polyfermenticus và

Streptomyces fradiea và đảm bảo an toàn sinh học khi đưa ra môi trường

1.3 Giới thiệu nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây thanh long

thật, gồm có sự phát triển sợi nấm mảnh, phân nhánh, không màu và vách ngăn sợi nấm

Hệ sợi nấm có gian bào và nội bào, mỗi tế bào chứa nhiều nhân Nhiều hạt dầu được sản xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm Khi chín, sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005)

Sợi nấm già đôi khi hình thành vách dày, màu nâu sậm, hình cầu hoặc không đều gọi là bào tử hậu (= bào tử áo = chlamydospores), nó có thể ở tận cùng hoặc chen giữa sợi nấm và tồn tại trong thời gian dài và khi tách ra chúng cũng mọc mầm để hình thành sợi nấm mới (Nguyễn Văn Bá và cs, 2005)

Hình 1.2 Hình thái vi thể của

Colletotrichum gloeosporioides

(nguồn intrernet)

Theo Agrios (2005) thì ở giai đoạn vô tính chúng cho ra các bào tử đính đơn bào,

có dạng hình thoi, hình liềm hoặc hình trụ không màu và đôi khi có giọt dịch trong bên trong bào tử Bào tử vô tính được sinh ra trong đĩa đài (acervulus) chứa nhiều đính bào đài (conidiophore) và gai cứng (setae) ở mép bìa đĩa đài hoặc giữa các cành bào đài Đĩa đài dạng tròn hoặc dạng gối, có sáp, màu đen, có thể được quan sát trên bề mặt môi trường thạch agar bằng kính hiển vi Trên mô bệnh, đĩa đài được tìm thấy bên dưới lớp biểu bì Cành bào đài đơn giản, thon dài, bào tử trong suốt, một tế bào, dạng trứng hoặc

dạng thon đến dạng liềm (Barnett và Hunter, 1998) Colletotrichum thường sản xuất

khối bào tử nhày dính bên trong đĩa đài Khối bào tử màu hồng hay màu da cam và đĩa

đài đôi khi nhầm lẫn với ổ bào tử của nấm Fusarium

Những loài trong chi nấm Colletotrichum có thể hoặc không thể sinh ra gai Theo

Barnett và ctv(1998), trong nuôi cấy, gai cũng có thể không xuất hiện Các gai dài cứng,

thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ Riêng ở loài Colletotrichum

gloeosporioides, Padman và Janardhna còn ghi nhận thêm là mỗi loài nấm đều có bào

tử và gai đặc trưng, sự sinh ra gai của nấm Colletotrichum chịu ảnh hưởng của ẩm độ

không khí, gai được sinh ra nhiều ở điều kiện ẩm độ không khí tương đối thấp (Nguyễn Văn Bá và ctv., 2005)

Phần lớn các chủng nấm Colletotrichum phân lập được ở Việt Nam thuộc loài C

gloeosporioides, chúng có khả năng gây bệnh trên cây thanh long cao hơn so với các

loài khác Các chủng của loài C gloeosporioides chủ yếu được phân nhóm về mặt di

truyền theo nguồn gốc địa lý

Thán thư (Anthracnose) mang nghĩa là “thui đen”, là bệnh hại trên tán lá cây, thân cành hoặc trái với đặc điểm là sự xuất hiện của những đốm màu đen hoặc những vết thương lõm xuống với mép rìa mảnh nhô lên (Agrios, 2005) Nó cũng là nguyên nhân của một số hiện tượng chết ngược của cành non, nhánh Trong sự xâm nhiễm ở trái, triệu chứng thán thư thường có giai đoạn tiềm ẩn kéo dài Triệu chứng ở một số cây

ăn trái là những đốm nhô cao và có hóa bần trên bề mặt (Agrios, 2005)

1.3.2 Hình thức xâm nhiễm của nấm Colletotrichum sp

Để nấm Colletotrichum xâm nhập vào mô kí chủ, chúng có 2 hình thức:

Bằng cách bào tử đính nảy mầm và hình thành đĩa áp để xâm nhập trực tiếp

Trong chi Colletotrichum có cấu trúc xâm nhiễm đặc biệt giúp nấm xâm nhập vào

mô kí chủ được gọi là đĩa áp Đĩa áp được xem là bộ phận rất quan trọng và cần thiết cho sự xâm nhiễm thành công của nấm (Perfec et al, 1990)

Trong điều kiện môi trường thích hợp, ống mầm sẽ được tạo ra từ bào tử Điều này được gọi là nảy mầm hay mọc mầm của bào tử Với sự tăng trưởng liên tục của ống mầm, đĩa áp sẽ được phân biệt ở hai đầu của nó và dần dần tối màu lại (O'Connell et al, 2000) Trong đó, tín hiệu đầu tiên của bào tử nảy mầm là tiết ra chất extracellular matrix (ECM), chất ECM được coi là dấu hiệu trong suốt quá trình nảy mầm và hình thành đĩa

áp, tổng thời gian để bào tử nảy mầm và tạo thành đĩa áp là 6 ˗ 9 giờ Quá trình hình thành và phát triển của đĩa áp trải qua 7 giai đoạn:

(1) Tiết ECM

(2) Phân chia nhân

(3) Tạo thành vách ngăn đầu tiên

(4) Mầm nhú ra

(5) Đỉnh phồng lên

(6) Tạo thành vách thứ cấp

(7) Sự hình thành melanin của đĩa áp

Bằng cách xâm nhập thụ động vào mô kí chủ

Bên cạnh xâm nhiễm trực tiếp bằng cách hình thành đĩa áp, nấm còn có thể xâm nhiễm bằng các con đường khác một cách thụ động Nấm có thể xâm nhập qua các lỗ

hở tự nhiên hoặc qua các vết thương trên cây (Đường Hồng Dật, 1984)

Vết thương trên cây có thể do côn trùng, sâu bọ, tuyến trùng chích hút, cắn phá hoặc do các động vật lớn gây ra (trâu, bò, chim, chuột, gà, vịt, …) ở các bộ phận trên mặt đất và trong đất Vết thương còn do dụng cụ trong quá trình chăm sóc cây gây ra hoặc do bứng cây đem trồng,… Vết thương cũng có thể là vết nứt trong lúc chồi non, mầm hoa đâm ra từ thân, cành của cây Ngoài ra, vết thương còn do yếu tố tác động của giông bão, lũ lụt Sự tích tụ các muối độc trong điều kiện đất ẩm cũng có thể làm cho rễ

và cổ rễ bị tổn thương do tế bào ở nơi tiếp xúc với các chất độc đó bị chết đi Cũng theo ông, các vết thương nhỏ li ti sẽ nhanh chóng được hàn gắn lại nên ít bị kí sinh xâm nhập vào, còn các vết thương to là nơi thuận lợi nhất cho tất cả các mầm bệnh xâm nhập vào

Các cửa ngõ tự nhiên trên cây bao gồm các khí khẩu (Stoma) ở lá, bì khẩu (Lenticles)

ở thân, cành và các thủy khẩu (Hydathodes) ở trên lá của một số loài cây Các cửa ngõ này do không có các bộ phận bao che tốt như lớp cutin hoặc lớp sáp, chúng được cấu tạo hở nên rất dễ bị các loại mầm bệnh lợi dụng và xâm nhập vào một cách dễ dàng

1.4 Các biện pháp trong phòng trừ bệnh đốm nâu và thán thư trên cây thanh long

Để đảm bảo cây thanh long sinh trưởng và phát triển tốt hạn chế bệnh hại cây cần kiểm soát và quản lý từ giống, môi trường, biện pháp canh tác trong phòng trừ và trị bệnh cho cây trồng

Trồng các giống sạch bệnh, cần lựa chọn kỹ các cây con trước khi trồng, các cây

có dấu hiệu nhiễm bệnh cần loại bỏ

a Biện pháp canh tác

Trước khi trồng cần làm sạch vườn để loại bỏ các nguồn có nguy cơ gây bệnh cho cây từ đất, nước, xác bã thực vật, dọn dẹp cỏ và các loại dây leo hoang dại xung quanh vườn thanh long

Tỉa cành tạo độ thông thoáng, thu gom và tiêu hủy các bộ phận của cây bệnh bằng cách chôn sâu hoặc đốt, ngoài ra, có thể xử lý bằng các chế phẩm sinh học làm phân bón, không vứt cành, quả bệnh xuống mương nước sẽ làm mầm bệnh dễ lây lan

Bón phân hữu cơ đã ủ hoại mục, cung cấp thêm vôi trước và sau mùa mưa Bổ sung thêm vi lượng ( Bo, Canxi, Magie, Silic, Bo…) tăng sức kháng chịu cho cây Cuối mùa khô, những cành còn phấn non nên tiến hành cắt 2 – 3 cm ở đầu mút cành để thoát nước đọng trên cành, giúp thúc nhanh quá trình già hóa cành nhằm hạn chế bệnh gây hại

Không để chồi non trong mùa mưa, nếu chồi non ra phải cắt tỉa hết và khử trùng ngay vết cắt bằng thuốc có chứa gốc đồng, tăng cường chăm sóc cây trong mùa mưa

b Biện pháp sinh học

Các tác nhân sinh học có khả năng phòng bệnh tốt không kém hơn thuốc hóa học nhưng lại an toàn và tiết kiệm chi phí hơn Có thể bổ sung chế phẩm sinh học

Trichoderma trộn với phân hữu cơ bón cho đất nhằm cung cấp nguồn dinh dưỡng cần

thiết đồng thời tăng khả năng kiểm soát nguồn bệnh

c Biện pháp hóa học

Khi cây ra đọt non có thể phun ngừa luân phiên các loại thuốc bảo vệ thực vật có chứa hoạt chất Propiconazole, Trifloxystrobin, Iprodione, Mancozeb 7 – 10 ngày/lần (tuỳ vào điều kiện mưa bão) Thường xuyên kiểm tra vườn để kịp thời phát hiện bệnh khi mới xuất xuất hiện để phun thuốc kịp thời

Ngoài ra, nên rút râu bông thanh long sớm ở thời điểm 2 – 3 ngày sau trổ và tương

tự phun ngừa các loại thuốc nêu trên cho giai đoạn trái non và trái chuẩn bị thu hoạch Lưu ý khi phun xịt thuốc ở giai đoạn chuẩn bị thu hoạch trái phải tuyệt đối tuân thủ và đảm bảo thời gian cách ly thuốc an toàn

1.5 Giới thiệu về nấm Trichoderma spp đối kháng với nấm bệnh

Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn

(Deuteromycetes) không có giai đoạn sinh sản

hữu tính, sinh sản vô tính bằng bào tử Nhóm nấm

bất toàn là những nấm sinh sản vô tính bằng bào

tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhau (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử

1.5.2 Các chủng nấm Trichoderma spp

Kubicek và Harman (1998) đã mô tả chi tiết 33 loài Trichoderma, ông cho rằng

tùy từng loài nấm mà chúng có hình dạng và kích thước khác nhau

Hình 1.3 Hình thái vi thể của

Trichoderma harzianum

(nguồn internet)

Bảng 1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Trichoderma

Trichoderma

atroviride

Đại thể: Khuẩn lạc phát triển nhanh,

đạt 8 – 9cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 20˚C, sợi nấm trong suốt, vách dày, trơn láng rộng 2 – 14µm Bào tử màu xanh, có hình cầu méo hoặc bầu dục đường kính từ 4 – 12µm, khi nấm già thường mất màu hay màu vàng nhạt hoặc xám, bào tử già phát ra mùi hương dừa (Kubicek và Harman,

Sinh hóa: Là loài nấm rất phổ biến

trong đất (Cook và Baker, 1983), nảy mầm tốt nhất trong môi trường mùn cưa có độ ẩm khoảng 30% (Domsch

và Gams,1980)

Trichoderma

koningii

Đại thể: Khuẩn lạc có đường kính

3 – 5cm sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt

độ 20˚C, bào tử có hình trụ ngắn, vách trơn láng, kích thước (3,0 – 4,8) x (1,9 – 2,8)µm

Sinh hóa: Hiện diện nhiều ở lớp đất

mặt, nhưng ở độ sâu 120cm vẫn có

sự hiện diện của loài nấm này Nấm phát triển tốt ở nhiệt độ từ 26˚C trở lên tùy theo nguồn gốc của loài, pH:

3,7 – 6,0 (Cook và Baker, 1983)

Trichoderma

hamatum

Đại thể: Đường kính khuẩn lạc đạt 7

cm khi nuôi cấy 5 ngày ở 20˚C Bào

tử màu xanh lục, trơn, dạng elip, có kích thước khác nhau tùy theo chủng (Domsch và Gams,1980)

Sinh hóa: Nhiệt độ 24˚C và pH: 3,7

– 4,7 là những điều kiện rất thuận lợi

cho sự phát triển của Trichoderma

Baker, 1983)

Sinh hóa: Có thể sử dụng cả hai

nguồn nitrogen đơn giản và phức

tạp Khi Trichoderma tăng trưởng

trên nguồn carbonhydrate như là

nguồn carbon cho dinh dưỡng thì ammonium được sử dụng tốt hơn là nitrate (Danielson và Davey, 1973)

tính hoặc kiềm

Cành bào tử không màu, sợi nấm không màu, có vách ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều và cho lượng bào tử rất lớn Bào tử thường có màu xanh, đơn bào hình trứng, tròn, elip hoặc hình oval tùy từng loài Bào tử đính ở đỉnh của cành Bào tử của hầu hết các loài có hình elip, 3 – 5 x 2 – 4 µm (L/W=1,3), bào tử hình cầu (L/W < 1,3) rất hiếm, chỉ thấy ở một vài loài Đa số các bào tử trơn láng, kích thước không quá 5

µm

Khuẩn lạc Trichoderma tăng trưởng rất mạnh đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9

cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25˚C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998) Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này mất dần đi Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của

Trichoderma Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất (mật độ

duy trì cân bằng trong đất từ 9 – 36 tuần sau khi cấy nấm vào đất)

Nhờ có khả năng tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà Trichoderma

harzianum có thể tồn tại 110 – 130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng

Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sót của

Trichoderma trong môi trường không được cung cấp chất dinh dưỡng nên

Chlamydospores có thể được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học (Nguyễn Hoàng

Anh, 2013)

1.5.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Là một loại nấm hoại sinh trong đất nên Trichoderma có thể sử dụng hỗn hợp nguồn carbon và nitrogen Nguồn carbon mà Trichoderma có thể sử dụng được là

monosaccharide, disaccharide, polysaccharide….NH3 là nguồn đạm mà nấm

Trichoderma dễ sử dụng, nên trong môi trường nuôi cấy Trichoderma người ta thường

bổ sung NH3, những nguồn nitrogen khác phần nào cũng hỗ trợ cho môi trường có nhiều dinh dưỡng Muối và các hỗn hợp vitamin cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng

của Trichoderma (Gary, 2005)

Trichoderma phát triển nhanh ở 25 – 30˚C, có một vài loài Trichoderma tăng

trưởng được ở 35˚C Một số ít phát triển tốt ở 40˚C Trichoderma phát triển tốt ở đất có

độ pH từ 3,5 – 7,0 nhưng không thể phát triển trong điều kiện pH < 3,5 và phát triển tốt

ở pH trung tính (Vũ Triệu Mân, 2007)

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có độ pH từ 2,5 đến 9,5 Phát triển tốt ở pH 4,5 – 6,5 Nhiệt độ tối ưu của Trichoderma trong khoảng 25 – 30˚C

Một vài dòng phát triển tốt ở 35˚C, một số ít phát triển được ở 40˚C (Gary J.Samuels, 2004) Theo Prasun K.M và Kanthadai R (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của

Trichoderma khác nhau ở những nhiệt độ khác nhau

Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác nhau

Ví dụ: Trichoderma hamatum, Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống trong môi trường có độ ẩm rất cao, Trichoderma viride và Trichoderma polysporum thích hợp ở nhiệt độ thấp, Trichoderma harzianum thường phân bố ở vùng có khí hậu ấm áp

Ánh sáng có tác động sâu sắc trên nhiều loại nấm bằng cách ảnh hưởng đến quá trình sống đa dạng của chúng, chẳng hạn như: tác động đến tốc độ tăng trưởng, quá trình chuyển hóa, sắc tố, và sự chuyển hóa Tác động của ánh sáng trên nấm đã là chủ đề được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và bàn luận (Kubicek và Harman, 1998) Quá trình hình thành bào tử được cảm ứng theo hai con đường khác nhau: thiếu dinh dưỡng hoặc ánh

sáng Khi khuẩn lạc của Trichoderma viride phát triển trong cảm ứng tối do thiếu dinh

dưỡng, hình thành bào tử màu xanh đậm và bắt đầu khuếch tán từ trung tâm của khuẩn lạc, tại đó chất dinh dưỡng đã bị sử dụng hết Mặt khác, việc hình thành bào tử được

cảm ứng bởi các xung ánh sáng tạo điều kiện cho các khuẩn lạc phát triển trong tối, trước khi để chiếu (Gary,2004)

1.5.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của Trichoderma spp

Theo Lynch và Harper (1985) thì Trichoderma có khả năng phân hủy xác bã thực

vật còn sót lại sau mùa vụ và chuyển chúng thành đường, đồng thời chúng còn có khả năng ký sinh và diệt một số nấm bênh gây hại cho cây trồng

Những chất do nấm Trichoderma tiết ra bao gồm: endochitinase, chitobiosidase,

N-acetyl-β-D-glucusaminidase (NADase), trypsin chymotrypsin, glucan glucosida, cellulase, proterase, lypase (Marco, 2002; Kredics và ctv, 2003)

1,3-β-Enzyme cellulase thuộc lớp Hydrolase (phản ứng thủy phân), tố Gycosidases (thủy phân liên kết glucoside), nhóm hydrolyzing O-glycosyl compounds (Phạm Thị Trân Châu và cộng sự, 2006)

Cellulase là enzyme thủy phân cellulose, là hệ thống enzyme phức hợp bao gồm cellulase C1, cellulase Cx và glucosidase Trong đó, cellulase C1 và Cx thủy phân cellulose thành cellobiose, còn glucosidase tiếp tục thủy phân cellsobiose thành glucose (Trần Minh Tâm, 2000)

Trichoderma là nấm hoại sinh trong đất có khả năng tiết enzyme cellulase nên

trong hệ sinh thái vi sinh vật có vai trò quan trọng trong xử lý xác bã thực vật Khả năng

phân hủy cellulose của nấm Trichoderma bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như:

ẩm độ, độ thoáng khí, pH, hàm lượng nitrogen Bên cạnh đó hiệu quả của sự phân hủy này còn phụ thuộc vào cơ chất sử dụng và sự sinh trưởng của nấm

1.5.6 Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma spp phòng trừ nấm gây bệnh

Nấm Trichoderma còn được sử dụng như một tác nhân sinh học bảo vệ cây trồng chống lại các loại nấm gây hại như: Pythium spp., Phytophthora spp., sclerotinia spp.,

Botrytis spp và Fusarium spp gây bệnh khô vằng ở lúa, bệnh thối gốc chảy mủ ở cam

quýt, sầu siêng,bệnh thối gốc trên các loại cây trồng như lú, hồ tiêu, bắp đậu, cà rốt, cà chua (Bùi Xuân Đồng,1982)

Theo Harman (1996), nấm Trichoderma spp có các cơ chế đối kháng như: cơ

chế ký sinh, tiết kháng sinh, cạnh tranh dinh dưỡng và cạnh tranh không gian sống

1.5.6.1 Ký sinh

Trichoderma có thể nhận ra vật chủ của nó nhờ tính hướng hóa chất, nó ký sinh

phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước (do những nấm này tiết ra các hóa

chất) Ngoài ra, vật ký sinh và vật đối kháng được Trichiderma nhận dạng bằng phân

tử, sự nhận dạng này có thể tự nhiên hay hóa học (qua trung gian lectin trên bề mặt tế

bào của mầm bệnh và vật đối kháng) Đồng thời, Trichoderma ký sinh và cuộn quanh

sợ nấm vật chủ thông qua hình thành các dạng móc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β-glucanase, protease, những enzyme này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn công

trực tiếp của Trichoderma

1.5.6.2 Tiết kháng sinh

Sản xuất kháng sinh giúp ngăn cả sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong

sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá hủy thành tế bào, ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh (Nguyễn Hoàng Anh, 2013)

Cho tới nay đã phát hiện được nhiều kháng sinh khác do Trichoderma sinh ra có

liên quan tới khả năng đối kháng của chúng như pyridine, anthraquinones, butenolides,

isonitrin D và F, trichorzianines, furanone do T harzianum sinh ra; các kháng sinh gliovirin, viridian, viridiol và valinotricin do T virens sinh ra

1.5.6.3 Cạnh tranh

Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng

bằng cách hút hết chất dinh dưỡng một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chóng chịu (chlamydospores)

Ngoài ra, Trichoderma còn cạnh tranh mô già hoặc chết với nấm Brotrysis spp

và Slerotina spp gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mô già hoặc mô chết, sử dụng chúng làm nền tảng, từ đó xâm nhập vào những mô khỏe) Nấm Trichoderma sử dụng

những mô già và mô chết của cây chủ làm nguồn dinh dưỡng, bằng cách đó nấm

Trichoderma cạnh tranh triệt tiêu đường xâm nhiễm của nấm Botrysis spp và nấm Sclerotina spp

Không những thế, Trichoderma còn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Pythium

spp do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào

tử Pythium spp (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Pythium spp bằng cách sử dụng dịch tiết của cây vì thế mà các bào

tử Pythium spp không thể nảy mầm Trichoderma còn đối kháng với các nấm gây bệnh

bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thương, do đó ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thanh Thuần, 2009)

Trichoderma có thể cạnh tranh nguồn carbon, nitơ và yếu tố cần thiết cho sự tăng

trưởng khác với nấm bệnh T harzianum có thể kiểm soát nấm Botrysis cinerea (gây

bệnh trên nho) bằng cách chiếm các mô ở hoa và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tại những vùng bị nhiễm, đã chứng minh rằng sự cạnh tranh chất dinh dưỡng là cơ chế

chính được T harzianum sử dụng để kiểm soát nấm bệnh F oxysporum

1.5.7 Một số nghiên cứu của nấm Trichoderma spp trên thế giới và ở Việt Nam

1.5.7.1 Nghiên cứu trên thế giới

Eman R Hamed, 2015 đã phân lập và sử dụng Trichoderma Asperellum nhưng

một tác nhân sinh học kích thích sinh trưởng và có khả năng đối kháng với nấm bệnh trên đậu đũa

Theo Buimistru (1997) dùng chế phẩm Trichoderma spp có tác dụng phòng trừ

bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm

Trichoderma có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác

dụng kích thích sinh trưởng đối với cây

Năm 2010, Vinit Kumar Mishra đã chọn được 10 chủng Trichoderma để đối kháng với Pythium aphanidermatum bằng phương pháp đồng nuôi cấy

1.5.7.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Tricoderema đã được biết đến gần đây, có ảnh hưởng lớn đến nền nông nghiệp

Việt Nam Các chế phẩm Trichoderma đã được sử dụng trong quá trình canh tác cây

trồng, góp phần làm giảm đáng kể nấm gây bệnh Có tác dụng lâu dài không ảnh hưởng

đến sức khỏe do việc sử dụng thuốc hóa học Một số nghiên cứu về nấm Trichoderma:

Năm 2006, Huỳnh Văn Phục với đề tài nghiên cứu “ Khảo sát tính đối kháng của

nấm Trichoderma spp đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp” Kết quả thu được là phân lập được 17 dòng nấm Trichoderma spp có khả năng đối kháng tốt với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum

Trần Thị Thanh Thuần và cộng sự (2009) đã nghiên cứu enzyme cellulase và

pectinase chủng Trichoderma Viride và Aspergillus Niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê cho thấy điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase của T.vỉide là 4 ngày, độ

ẩm 58%, hàm lượng giống là 8% Điều kiện tối ưu cho sự phân giải trên vỏ cà phê là 14 ngày, độ ẩm 60% hàm lượng giống 8%

Hồng Châu, (2009) cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải

chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn thời gian hoại mục

Năm 2017 Nguyễn Đức Huy và cộng sự đã phân lập và đánh giá khả năng đối

kháng của Trichoderma asperellum đối với tác nhân gây bệnh cây có nguồn gốc trong đất Kết quả thu được nấm T.asperllum có khả năng ức chế tốt sự phát triển của nấm R

solani gây bệnh lở cổ rễ và nấm S clerotiorum gây bệnh thối hạch bắp cải trong điều

kiện invitro

Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2017) đã tiến hành đề tài đánh giá khả năng đối

kháng của một số dòng Trichoderma đối với Phytopythium helicoides trong điều kiện

phòng thí nghiệm

Các chế phẩm sinh học của Viện Sinh học nhiêt đới như BIO-F, chế phẩm sinh

học chứa các VSV do nhóm phân lập và tuyển chọn: xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp và vi khuẩn Bacillus sp Những VSV trên trong chế phẩm sinh

học có tác dụng phân hủy nhanh các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà và bò (protein

và xenlulo), gây mất mùi hôi Trước đó, chế phẩm sinh học BIO-F đã được sử dụng để sản xuất thành công phân bón hữu cơ vi sinh từ bùn đáy ao, vỏ cà phê và xử lý rác thải sinh hoạt

1.5.8 Ứng dụng Trichoderma trong nông nghiệp

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long, Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu

quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng Sông Cửu

Long và Đông Nam Bộ

1.5.8.1 Khả năng kiểm soát bệnh cây

Nhiều chủng nấm Trichoderma có khả năng kiểm soát các loài nấm gây bệnh cho cây trồng Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với các loại nấm gây bệnh thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium

(Dương Xô Hoa, 2005)

Các loài nấm Trichoderma nói chung phát triển trong môi trường tự nhiên trên bề

mặt của rễ cây, do đó có tác dụng kiểm soát sinh học với một số bệnh trên rễ gây ra bởi tuyến trùng và nấm, nó còn giúp tái tạo, phục hồi các rễ bị tổn thương do tuyến trùng

hoặc rệp sáp gây ra Nấm Trichoderma còn tạo ra các chất có hoạt tính tương tự như

“thuốc kháng sinh”, có tác dụng kìm hãm sự tăng trưởng của các tác nhân gây bệnh đồng

thời Trichoderma còn ký sinh các loài nấm gây bệnh, tiết ra các enzyme phân hủy chúng Ngoài ra nấm Trichoderma phòng trừ được các bệnh trên lá do loài nấm này kích

thích bộ rễ tổng hợp chất đề kháng để chống lại các tác nhân vi sinh vật xâm nhập, các chất đề kháng này từ rễ di chuyển đến các bộ phận phía trên của cây (Dương Xô Hoa, 2005)

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số chủng nấm Trichoderma có

khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những chủng nấm này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khác ngoài nấm

1.5.8.2 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Nấm Trichoderma kích thích sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ Trichoderma

bám vào những vùng rễ cây như những sinh vật cộng sinh khác Nó tiết ra đất những chất kích thích để rễ cây ăn sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp thành bảo vệ vùng rễ

tránh sự xâm nhập của nấm bệnh, làm giảm khả năng nhiễm bệnh nhờ Trichoderma bám

vào các đầu rễ cây, tăng khả năng ra hoa, thụ phấn, tăng trọng lượng quả và chiều cao của cây, tăng năng suất cây trồng

Hiện nay, một chủng nấm Trichoderma đã được phát hiện có khả năng tăng số

lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1m dưới mặt đất) Những rễ sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán

1.5.8.3 Khả năng phân hủy cellulose , phân giải lân chậm tan

Lợi dụng khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân của nấm Trichoderma mà trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng Sử dụng chế phẩm Trichoderma ủ phân hữu cơ để bón

cho cây trồng sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất Phân giải nhanh các chất hữu cơ thành dạng dễ tan, cung cấp dinh dưỡng cho cây, phòng một số nấm bệnh gây hại cho cây trồng, chất lượng phân cao hơn

Chế phẩm nấm Trichoderma được sử dụng để xử lý giúp phân hủy rơm rạ, sau đó

được dùng phối hợp với phân lân sinh học như dạng phân hữu cơ Phân hữu cơ được bón riêng rẽ hoặc phối hợp với phân vô cơ (NPK) trên nền sét nặng Kết quả nghiên cứu hai năm trên giống lúa IR64 cho thấy: nếu bón liên tục 100% phân hữu cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 13,58% và nếu bón kết hợp 50% phân hữu cơ với 50% phân vô cơ cho năng suất tăng hơn so với đối chứng là 22,46% Khi bón 100% phân hữu

cơ thì côn trùng và bệnh khô vằn xuất hiện trễ hơn và ít gây hại cho cây lúa và quần thể

vi sinh vật đất ổn định hơn, có chiều hướng gia tăng hơn so với bón 100% phân vô cơ

Với những hiệu quả mà chế phẩm Trichoderma mang lại, bà con nông dân nên sử dụng

chế phẩm sinh học thay cho việc dùng các loại phân bón hóa học để cải thiện năng suất

và chất lượng cây trồng, góp phần bền vững môi trường đất canh tác nông nghiệp

1.6 Khái niệm về ủ compost và sử dụng xác bã hữu cơ để ủ compost

1.6.1 Định nghĩa compost

Ủ phân (composting): Là quá trình phân hủy chất hữu cơ tự nhiên chủ yếu là cenlulose bởi quần thể vi sinh vật (vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh,…) dưới tác động của nhiệt độ, độ ẩm, không khí tạo nên sản phẩm cuối cùng là chất mùn

và chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể hấp thụ được (Haug,1993)

1.6.2 Cấu trúc và cơ chế phân giải cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (polyme hóa) từ gốc β–D–glucose bằng cầu nối β–1,4–glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật Vì vậy, cellulose là hợp chất phổ biến nhất trong tự nhiên Cellulose có cấu trúc mạch thẳng dạng sợ rất bền, khó bị phân hủy

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử cellulose (nguồn internet)

Theo cơ chế thủy phân của King (1969) và Reese (1952) ngoài 3 enzyme chính của quá trình thủy phân :

Exo–β–1,4D glucanaza (hay 1,4–β–D glucan4–glucanohydrolaza) Enzyme này thủy phân Cellulose vô định hình hoặc Cellulose đã biến tính như Cacboxymethylcelluloza (CMC)

Exo–β–1–4 glucanaza (hay exocellobbiohydrolaza) tấn công lên các liên kết Cellilose kết tinh vô định hình như các xenlo-saccarit từ các đầu không thử của chuỗi Cellulose Exo–glucanaza tác động rất yếu lên các Cellulose biến tính như CMC.HEC (hydroxyl etyl celluloza)

β–1–4glucanaza (hay xenlobioaza) thủy phân các xenlobiaza và xenlo-sacarit mạch ngắn Glucoza là sản phẩm thủy phân duy nhất của enzyme này

Còn có C1 là tiền nhân tố thủy phân có tác dụng làm trương nở Cellulose tự nhiên làm cho phân tử trở nên hoạt động Chuỗi cellulose hoạt động sẽ bị phân cắt bởi endo

và exo-glucanaza thành các xenlo-oligosacarit tạo cơ chất cho xenlobiaza thủy phân tiếp thành đường glucoza

Cenlulose bị VSV phân hủy thành các thành phần có phân tử lượng nhở hơn Chính những thành phần nhỏ này kết hợp với những thành phần khác trong đất tạo thành mùn

Cơ chế phân giải: Cenlulose → disaccarit → monosaccarit (glucose)

Khi mùn được hình thành, vi sinh vật lại tiếp tục phân hủy mùn bằng quá trình amon hóa, sự chuyển hóa này giúp đất tích lũy NH3 Sự tạo thành NH3 trong đất xảy ra

chậm chạp và điều này rất có lợi cho cây trồng vì quá trình cây hấp thụ NH3 cũng chậm, không làm dư đạm dễ phát sinh dịch bệnh

Chất mùn + O2 + Vi sinh vật ==>CO2 + H2O + NH3 Trong tự nhiên, nhiều loài vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc phân giải cellulose rất

mạnh nhờ tiết ra cenlulase ngoại bào Nấm Trichoderma có thể phân giải 48% cellulose trong 10 ngày lên men nguyên liệu lingo-cellulose Nấm Phnerochaete chrysosporium

phân giải 69% cellulose tự nhiên trong 28 ngày

Trong điều kiện thoáng khí, cellulose được phân giải bởi các vi sinh vật hiếu khí Ngoài ra, còn có một số vi khuẩn kỵ khí có khả năng tham gia tích cực vào quá trình

phân giải cellulose Các sinh vật như: Cytophaga, Cellulomonas, Bacillus, Clostridium,

Aspergillus, Penicillium,…

• Các nhóm vi sinh vật có mặt trong quá trình ủ phân

Vi khuẩn: trong đất người ta phân lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí

như Brevibacllus, PaeniBacillus, Bacillus và Geobacillus Đối với các dòng ưa ấm, pH

và nhiệt độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và

550C còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 750C (Rastogi, G., et al 2009)

Xạ khuẩn: có vai trò trong việc phân hủy các chất hữu cơ phức tạp như cellulose, lignin, chitin và protein trong quá trình ủ Enzyme của chúng cho phép xạ khuẩn phân hủy hóa học các mảnh vụn như thân cây, vỏ cây Một vài loài xuất hiện trong giai đoạn chịu nhiệt trung bình, những loài khác đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn làm mát

1.6.3 Các thông số quan trọng trong quá trình ủ compost

Bảng 1.2 Các thông số quan trọng trong quá trình làm phân hữu cơ hiếu khí

1 Kích thước Quá trình ủ đạt hiệu quả tối ưu khi kích thước cơ chất khoảng 25 –

75mm

2 Tỉ lệ C/N

Tỉ lệ C/N tối ưu dao động trong khoảng 25 – 40

Ở tỉ lệ thấp hơn, dư NH3, hoạt tính sinh học giảm

Ở tỉ lệ cao hơn, chất dinh dưỡng bị hạn chế

4 Độ ẩm Nên kiểm soát trong phạm vi 50 – 60% trong suốt quá trình ủ Tối

ưu là 55%

5 Đảo trộn

Nhằm ngăn ngừa hiện tượng khô, đóng bánh và sự tạo thành các rảnh khí, trong quá trình làm phân hữu cơ, cơ chất phải được xáo trộn định kỳ Tần suất đảo trộn phụ thuộc vào quá trình thực hiện

9 pH Tối ưu: 7 – 7,5 Để hạn chế sự bay hơi Nitơ dưới dạng NH3, pH

không được vượt quá 8,5

10 Mức độ

phân hủy Đánh giá qua sự giảm nhiệt độ vào thời gian cuối

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nấm Neoscytilidium dimidiatum gây bệnh đốm nâu và nấm Colletotrichum sp gây

bệnh thán thư trên cây thanh long do phòng thí nghiệm Viện khoa học Ứng dụng HUTECH cung cấp

Hệ thống chưng cất mẫu kjeldahl

2.2.3 Hóa chất

2.2.4 Các loại môi trường

2.2.4.1 Môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA

Cách pha môi trường:

Khoai tây gọt vỏ rửa sạch cắt thành hạt lựu, cân 200g rồi cho nước cất vào đun sôi khoảng 20 phút từ lúc bắt đầu sôi Sau đó lọc bỏ bã, lấy dịch chiết, tiếp tục đun sôi bổ sung thêm đường và agar, khuấy đều để tránh agar vón cục Đem môi trường hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút

2.2.4.2 Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase

Đun tan CMC trong nước cất rồi cho các thành phần môi trường còn lại vào chai thủy tinh và khấy đều sau đó đậy nắp rồi đem hấp khử trùng ở 1210C, 15 phút, 1atm Sau khi hấp khử trùng xong lấy ra chờ nguội trong tủ cấy vô trùng.Trên ngọn lửa đèn cồn, lần lượt đổ môi trường vào đĩa đã hấp vô trùng, chờ cho môi trường nguội và đặc lại

2.2.4.3 Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase

Cách pha huyền phù chitin 1%

Cân 1g bột chitin cho dần vào 20ml HCl đậm đặc, ủ ở 40C và để qua đêm

Thêm vào hỗn hợp 200ml ethanol lạnh(-200C) khấy đều thật nhanh và ủ qua đêm

Ly tâm hỗn hợp ở 4000 vòng/phút, trong 10 phút thu lấy kết tủa và rửa bằng nước cất cho đến khi pH trung tính Thêm vào tủa nước cất cho đến thể tích 100ml

2.2.4.4 Môi trường Czapeck dox để nhân giống cấp 2 Trichoderma

Cách pha môi trường:

Cân và cho lần lượt từng chất vào erlen khuấy đều để tránh các chất phản ứng vào nhau tạo tủa, thêm nước cất, điều chỉnh pH 6 Đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút, áp suất 1atm

2.3 Phương pháp nhiên cứu

Thuyết minh sơ đồ

Các chủng nấm Trichoderma được giữ giống trong ống thạch nghiêng Các chủng

này sẽ lần lượt cấy lên đĩa petri môi trường PDA để hoạt hóa sự phát triển sau thời gian giữ giống Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 1 tuần để nấm phát triển và hình thành bào tử

Các chủng nấm Trichoderma

đã được hoạt hóa từ ống giống

Các chủng nấm bệnh đã được hoạt hóa từ ống giống

Khảo sát khả năng sinh trưởng

Test sinh hóa

Thử nghiệm đối kháng ở điều

Sử dụng các chủng nấm này để tiến hành quan sát sự sinh trưởng, hình thái vi thể, kiểm tra khả năng sinh enzyme và khả năng đối kháng với nấm bệnh ở điều kiện invitro

Sàng lọc lựa chọn các chủng nấm đạt yêu cầu theo mục tiêu đã đề và tiến hành lên men tạo chế phẩm

Sử dụng môi trường nhân giống cấp 2 Czapeck dox được trình bày ở mục 2.2.4.4

để nhân sinh khối nấm Sau khi cẩn đúng khối lượng từng chất, hòa tan từng chất với nước cất theo đúng thứ tự tránh kết tủa khi pha, kết thúc pha dịch trong không màu Đổ 200ml môi trường vào các erlen đã chuẩn bị sẵn, đem hấp khử trùng nhiệt độ 1210C trong 15 phút, áp suất 1atm

Sau hấp xong để môi trường nguội từ từ đến nhiệt độ phòng rồi tiến hành cấy

giống Trichoderma đã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA, với mỗi erlen chứa 200ml

môi trường cấy 1/4 đĩa nấm đã cấy và ủ 7 ngày trước đó

Lắc đều trên máy lắc với tốc độ 60 vòng/phút, trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng Giống sau khi được nhân giống cấp 2 trên môi trường lỏng Czapeck dox sẽ được cấy vào 200g môi trường rắn với cơ chất lúa bổ sung D-glucose 3% và (NH4)2SO4 1%

ủ ở nhiệt độ phòng

Quá trình lấy mẫu được thực hiện khi tơ nấm đã ăn lan và bảo tử bắt đầu phủ kín

cơ chất trên môi trường nhân sinh khối, tiến hành lấy 10g mẫu sau đó đem đi pha loãng với nồng độ thích hợp và đếm số bào tử bằng phương pháp đếm gián tiếp từ đó xác định được (số bào tử)/g chế phẩm theo công thức sau:

A: số khuẩn lạc trong 1g mẫu

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n là số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i

V là thể tích mẫu (ml) cấy vào mô trường

F là hệ số pha loãng tương ứng

Chế phẩm Trichoderma sau quá trình lên men thể rắn được sử dụng cho thử nghiệm

ủ compost từ cành thanh long

2.3.1.Quan sát khả năng sinh trưởng của Trichoderma

Dùng que cấy thẳng đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, gạt nhẹ lấy một ít bào tử

nấm Trichoderma trong ống giống cấy chuyền vào tâm đĩa petri chứa môi trường PDA,

ủ ở nhiệt độ phòng Dùng khoan thạch hình trụ đường kính 5mm đục một miếng thạch (từ đĩa nấm thí nghiệm đã ủ 7 ngày) đặt lên tâm đĩa petri môi trường PDA rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng Quan sát hình thái tản nấm (hình dạng, màu sắc) ở mặt trên và mặt dưới theo từng ngày cho tới khi tản nấm mọc đầy đĩa

2.3.2.Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng nấm Trichoderma

và tiến hành đo đường kính vòng phân giải

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng phân giải (dựa theo Trần Thị Thuần, 1996)

D – d ≥ 2,5 cm: hoạt tính enzyme rất mạnh

D – d ≥ 2 cm: hoạt tính enzyme mạnh