Tính cấp thiết của đề tài
Nấm Linh chi đã được sử dụng làm thuốc từ hàng ngàn năm trước, được ghi chép trong nhiều sách dược thảo của các triều đại Trung Quốc Sách “Thần nông bản thảo” mô tả Linh chi như một loại thuốc quý, giúp duy trì sức khỏe cho các bậc đế vương Vào đời Minh, tác giả Lý Thời Trân phân loại Linh chi thành sáu màu sắc và khái quát tác dụng trị liệu của từng loại Tất cả các loại Linh chi đều có tính bình, không độc, và có tác dụng chữa trị hiệu quả các bệnh về tim mạch, phổi, gan Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nấm Linh chi còn được chứng minh có tác dụng trong điều trị các bệnh như ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, và viêm gan siêu vi Do đó, việc nghiên cứu và phát triển nấm Linh chi đang được chú trọng, mặc dù việc nuôi trồng và thu hoạch nấm này tốn khá nhiều thời gian.
Linh chi đen, một loại nấm hiếm thuộc họ Ganodermataceae, thường xuất hiện ở các rừng quốc gia Việt Nam Hoạt tính của A subresinosum vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Do đó, nghiên cứu “Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá một số hoạt tính sinh học trong tơ nấm Linh chi đen Amauroderma subresinosum” được thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất hoạt tính cần thiết của nấm Linh chi mà không cần phải chờ đợi thời gian ra quả thể, đáp ứng nhanh chóng nhu cầu sử dụng của con người.
Tình hình nghiên cứu
Trên thế giới, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm Linh chi cũng như những ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau
Nghiên cứu của Mekkaway và Min (1998) chỉ ra rằng các hợp chất như Ganoderiol F, ganodermanontriol, acid ganoderic beta, ganodermanondiol, ganoderma nontriol, acid ganolucidic A, và gucidumol B có trong dịch chiết nước của nấm Linh chi có khả năng chống HIV cùng với nhiều ứng dụng có lợi khác.
Năm 2014, Huey Jen Lin và cộng sự đã nghiên cứu một loại protein điều hòa miễn dịch từ nấm Linh Chi Ganoderma lucidum, cho thấy khả năng chữa lành nhanh chóng vết thương sau phẫu thuật điện ở mô gan chuột.
Trong những năm gần đây, thị trường thuốc y học cổ truyền tại Việt Nam, đặc biệt là TP.HCM, đã chứng kiến sự xuất hiện của nhiều loại thuốc mới mang tên Linh chi với giá bán cao hơn cả nhân sâm Nhu cầu sử dụng nấm Linh chi làm thuốc chữa bệnh trong nước và xuất khẩu đang gia tăng mạnh mẽ Nhiều cơ sở đã bắt đầu chế biến, nuôi trồng và nghiên cứu các dược chất có trong nấm Linh chi để đáp ứng nhu cầu này.
Nghiên cứu về tác dụng của nấm linh chi Việt Nam (Ganoderma lucidum) đã được công bố, trong đó có các công trình như “Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm linh chi Việt Nam qua một số chỉ số lipid máu ở chuột cống” và “Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của nấm Linh chi Việt Nam”.
Nghiên cứu về tác động của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) cho thấy nó có khả năng bảo vệ cấu trúc mô tinh hoàn của chuột nhắt trắng dòng SWISS khi bị chiếu xạ liều cao Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Mai Anh và Đào Văn Phan chỉ ra rằng Ganoderma lucidum có thể gây suy gan trên chuột trong thí nghiệm Ngoài ra, nghiên cứu về nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) được thực hiện tại vùng núi Chứa Chan, Việt Nam, đã phát hiện ra sự sinh trưởng của loại nấm này trong môi trường tự nhiên.
Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc nuôi cấy và thu nhận sinh khối của hệ sợi nấm linh chi đen Amauroderma subresinosum, đồng thời khảo sát các hoạt tính sinh học của hệ sợi nấm và các phân đoạn cao chiết của nó.
Nhiệm vụ nghiên cứu
- Thu nhận sinh khối của tơ nấm Linh chi Amauroderma subresinosum
- Định tính sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum
- Khảo sát khả năng kháng khuẩn và khả năng bắt các gốc tự do có trong tơ nấm Linh chi A.subresinosum.
Phương pháp nghiên cứu
- Tăng sinh tơ nấm Linh chi trong môi trường lỏng để thu nhận sinh khối
- Thu dịch chiết tơ nấm để khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong tơ nấm Linh chi
- Dùng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch để khảo sát khả năng kháng khuẩn của tơ nấm với các phân đoạn dung môi khác nhau
- Dùng phương pháp thử nghiệm DPPH để khảo sát khả năng chống oxy hóa của tơ nấm Linh chi A.subresinosum
- Ghi chép và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, Statgraphics centurion.
Các kết quả đạt được của đề tài
- Thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận sinh khối tơ nấm linh chi là 18 ngày trong điều kiện nhiệt độ 30 o C và đặt nơi tránh ánh sáng
Tơ nấm linh chi được nuôi cấy ở nhiệt độ 30 độ C chứa nhiều hoạt chất quan trọng như antraglycosid, acid béo, tinh dầu, phytosterol, tanin, đường khử, saponin, acid uronic và acid hữu cơ.
Cao Methanol từ tơ nấm cho thấy khả năng kháng khuẩn vượt trội đối với các vi khuẩn như S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa ở nồng độ 20 mg/ml, đồng thời có khả năng bắt gốc tự do với giá trị IC50 là 1,094 mg/ml.
- Các phân đoạn cao chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate, nước của tơ nấm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn cao tổng Methanol, khả năng kháng oxy hóa
4 của cao Chloroform và cao Ethyl acetate thì tốt hơn cao tổng, cao Hexane thì tương đương, còn cao nước thì khả năng kháng oxy hóa yếu nhất
Phân tích các phân đoạn chiết cho thấy cao Hexane chứa 3 hợp chất, cao Chloroform có 1 hợp chất, cao Ethyl acetate có 2 hợp chất, trong khi cao nước vẫn chưa xác định được thành phần.
Kết cấu đồ án tốt nghiệp
Đồ án gồm có 4 chương:
• Chương 1: Tổng quan tài liệu
• Chương 2: Vật liệu và phương pháp
• Chương 3: Kết quả và thảo luận
• Chương 4: Kết luận và kiến nghị
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ 4/5/2015 đến 16/8/2015, tại phòng Vi sinh thuộc Viện sinh học nhiệt đới TP Hồ Chí Minh.
Đối tượng nghiên cứu
Nấm Linh chi đen (Amauroderma subresinosum) được thu hái tại vùng núi Chứa Chan tỉnh Đồng Nai và giữ giống tại Viện sinh học Nhiệt đới TP.HCM.
Vật liệu nghiên cứu
- Nồi hấp Autoclave TOMY, ES-315
- Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710ATS, Japan
- Máy đo OD, Elisa 96 giếng
- Máy Votex Disruptor genie, USA
- Bể điều nhiệt Cole-parmer, BT-15
- Máy HPLC Waters 2695 Separations Module
- Cột HPLC Silica Chrom_Silicycle (Canada) Kớch thước 4,6 ì 250 mm, 5àm
- Hóa chất vô cơ: H2SO4, HCl, NH4OH, KOH, Mg, CHCl3, (CH3CO)2O, Na, FeCl3, Na2CO3, HgCl2, KI, I2, Bi(NO3)3, CuSO4, NaOH
- Hóa chất hữu cơ: methanol, hexane, chloroform, ethyl acetate, diethyl ether,
Nước cất: 1000 ml Khoai tây: 200 g D-glucose: 20 g Agar: 20 g
Nước cất: 1000 ml Khoai tây: 200 g D-glucose: 20 g
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Theo dõi sự tăng sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng
Nghiên cứu theo dõi sự phát triển của tơ nấm Linh chi trong môi trường lỏng, thu nhận sinh khối vào các ngày 3, 6, 9, 12, 15, và 18 Mỗi lần thu, 5 chai mẫu được sấy ở 55°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi và sau đó cân trọng lượng khô.
Cách tiến hành: đổ 80 ml môi trường lỏng vào chai thủy tinh Hấp khử trùng ở
Để nuôi cấy tơ nấm, đầu tiên cần tiệt trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 15 phút, sau đó để nguội và cấy một lượng giống nhất định Giống tơ nấm được lấy từ môi trường agar, cắt thành miếng nhỏ khoảng 1,5 x 1,5 cm và nhẹ nhàng cho vào chai, lưu ý không để mẫu chìm xuống vì sẽ làm khó khăn cho sự phát triển của tơ nấm Chai đã cấy cần được ủ ở nhiệt độ 30 độ C và đặt ở nơi tránh ánh sáng.
2.4.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi đen A subresinosum
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc tách các hợp chất hữu cơ thành các nhóm khác nhau, dựa vào sự khác biệt về độ hòa tan của chúng trong các dung môi.
22 môi hữu cơ có tính phân cực khác nhau, sau đó mỗi nhóm được phát hiện bằng các thuốc thử đặc trưng
Hình 2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết tơ nấm để phân tích thành phần hóa hoc
Trong một erlen 100 ml, cho 5g mẫu khô và 30ml dietyl eter, khuấy đều trong 5 phút ở nhiệt độ phòng và lọc qua giấy lọc Tiến hành lặp lại quá trình chiết với dietyl eter nhiều lần cho đến khi dung dịch chiết cuối có màu nhạt.
Cho dịch chiết dietyl eter vào bình lóng, chiết 3 × 20 ml dung dịch nước KOH 10%: trong bình lóng có hai lớp là lớp nước kiềm và lớp dietyl eter
Để lấy lớp nước kiềm, cho vào becher và trung hòa bằng dung dịch HCl 25% cho đến khi đạt độ pH trung tính Sau đó, lọc bằng phễu để thu được tủa Hòa tủa này vào 5ml ethanol 90 độ và chia đều dung dịch vào 3 ống nghiệm.
▪ Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10%, nếu thấy có màu đỏ, có thể có antraglycosid
▪ Ống 2: Acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một vài hột Mg kim loại, nếu thấy có màu đỏ, có thể có flavonoid
▪ Ống 3: Nhỏ một vài giọt dung dịch lên tờ giấy lọc, nếu thấy trên tờ giấy lọc có vết mờ, có thể có acid béo
Lấy lớp dietyl eter: cho vào bình lóng, rửa dung dịch eter này với nước cất (3 x
20 ml), tiếp theo chiết với dung dịch H2SO4 2% (3 x 5 ml) sẽ có hai lớp: lớp etyl eter và lớp nước của acid
▪ Lớp nước acid được gom chung lại, định tính với các thuốc thử alkaloid
Thuốc thử Mayer cho tủa màu vàng nhạt; thuốc thử Bouchardat cho tủa màu nâu;
▪ Lớp ethyl eter được chia đều vào ba chén sứ và cho bốc hơi đến khô:
* Chén 1: nếu có mùi thơm có thể có tinh dầu
* Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu có màu xanh có thể có carotenoid
Chén 3: Để kiểm tra sự hiện diện của phytosterol (steroid thực vật), sử dụng thuốc thử Lieberman bằng cách nhỏ 10 giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, sau đó rót dung dịch vào ống nghiệm Tiếp theo, nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm Nếu thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch có màu vàng lục hoặc lục đỏ, điều này cho thấy có khả năng tồn tại phytosterol.
Bã cao được chiết bằng ethyl eter và sau đó tiếp tục chiết với ethenol (3 x 30ml) Sau mỗi lần chiết, dung dịch được lọc qua giấy lọc và ba lần chiết được gộp lại để thu được dung dịch alcol.
Dung dịch được chia làm 6 phần, mỗi phần khoảng 15 ml dung dịch
Phần 1: Pha loãng dung dịch alcol với 4 lần thể tích nước cất Kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH đậm đặc, sẽ có tủa Lọc để có phần tủa và phần dung dịch qua lọc
• Phần tủa được hòa với 1 ml chloroform, cho vào ống nghiệm Thêm vào thuốc thử Lieberman gồm 1 ml anhidrid acetic và nhỏ chầm chậm vào dọc
24 theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu dung dịch có màu xanh dương lục, có thể có steroid
• Phần dịch lọc được acid hóa bằng HCl, sẽ có tủa Lọc lấy tủa và hòa tủa với
3 – 4 ml etanol 90 o và chia đều vào hai ống nghiệm
* Ống 1: cho và giọt KOH 10%, nếu có màu đỏ, có thể có antraglycosid
* Ống 2: cho vào một ít bột Mg kim loại và vài giọt HCl đậm đặc, nếu có màu đỏ, có thể có flavonoid
Phần 2: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào hay ống nghiệm
* Ống 1: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh đen, có thể có tanin
* Ống 2: Cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt, có thể có acid hữu cơ
Phần 3: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn Hòa cặn này với 3 – 4 ml
H2SO4 2% Dung dịch này được thử với 2 loại thuốc thử alkaloid: Mayer, Bouchardat Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid
Phần 4: Dung dịch alcol được cô cách thủy đến cạn Hòa cặn này với 3 – 4 ml nước cất, đun nóng và lọc Cho vào dung dịch lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử
Phần 5: Pha loãng dung dịch alcol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2 ống nghiệm Ống 1: acid hóa, nếu có màu đỏ Ống 2: kiềm hóa nếu có màu lục Nếu cả hai ống nghiệm đều có màu như nêu trên, có thể có antocyanosid
Phần 6: Chia dung dịch alcol đều vào 2 ống nghiệm và cho bốc hơi đến cạn
* Ống 1: Cho vào 5 ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin
* Ống 2: Cho vào 0,5 ml chloroform và 0,5 ml anhidrid acetic Nhỏ chầm chậm vào dọc theo thành ống nghiệm vài giọt H2SO4 đậm đặc, nếu ở mặt phân
25 cách xuất hiện màu tím, có thể có saponin triterpen ; nếu có mặt phân cách xuất hiện màu xanh dương lục, có thể có saponin steroid
➢ Chiết với dung dịch nước H 2 SO 4 1%
Phần bả còn lại được chiết với dung dịch nước H2SO4 1% (3 x 20 ml) Lọc và chia dịch chiết vào 5 ống nghiệm
Phần 1: Lắc mạnh theo chiều dài của ống, nếu có bọt bền, có thể có saponin Phần 2: Kiềm hóa với dung dịch NH4OH 10%, chiết với diethyl eter (3 x 5 ml) Lóng lấy lớp dietyl eter Lại chiết lớp dietyl eter này với dung dịch H2SO4 1% Lóng lấy lớp nước, để định tính với 2 loại thuốc thử Mayer, Bouchardat Nếu dương tính với tất cả 2 loại thuốc thử, có thể có alkaloid
Phần 3: Cho vào dung dịh lọc 4 -5 giọt thuốc thử Fehling A và 4 -5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa màu đỏ gạch, có thể có đường khử
Phần 4: Trung hòa bằng acetate natri , sau đó thêm dung dịch FeCl3 5%, nếu có màu xanh đen, có thể có tanin
Phần 5: Pha loãng với 2 lần thể tích etanol cao độ, nếu có tủa nhiều, có thể có hợp chất đường loại acid uronic
2.4.3 Khảo sát hoạt tính của tơ nấm linh chi khi chiết với các phân đoạn dung môi khác nhau
Từ 30g sinh khối tơ nấm khô, có thể ly trích được 5,7 g cao Methanol thô Sau khi hòa tan cao này vào nước, tiến hành trích lỏng với các dung môi hexane, chloroform và ethyl acetate, thu được lần lượt 1,7 g cao Hexane, 0,3 g cao Chloroform, 0,23 g cao Ethyl acetate và 2,8 g cao nước.
Hình 2.2 Sơ đồ điều chế cao chiết chứa hoạt chất từ tơ nấm Linh chi đen
2.4.3.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi
Dịch chiết nấm linh chi có khả năng khuếch tán trong môi trường thạch và tác động lên các vi khuẩn được kiểm tra Khi dịch chiết có khả năng kháng vi khuẩn, sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch Kích thước của vòng kháng khuẩn tỷ lệ thuận với độ nhạy cảm của vi khuẩn đối với dịch chiết này.
❖ Mục đích: Đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm Linh chi thu được
- Các chủng vi khuẩn được khảo sát là: S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa Tất cả các chủng trên sẽ được nuôi cấy lắc trong môi trường
- Mẫu dịch chiết thô được hòa tan trong DMSO 10%, votex kỹ, để đạt được nồng độ 20 mg/ml
Chuẩn bị đĩa petri với môi trường thạch LB đã được hấp khử trùng ở 121 °C trong 15 phút Tiến hành đục bốn giếng có đường kính 5 mm, bao gồm một giếng đối chứng âm và ba giếng chứa dịch chiết nấm.
Hỳt 100 àl dịch nuụi cấy của từng loại vi khuẩn vào các đĩa thạch, sau đó sử dụng que cấy để trải đều dịch vi khuẩn trên bề mặt thạch.
- Hỳt 60 àl nước cất vụ trựng cho vào giếng đối chứng õm và hỳt 60 àl dịch chiết thô lần lượt cho vào các giếng còn lại
- Quan sát và đo vòng kháng khuẩn và so sánh khả năng kháng khuẩn của các loại cao thu được
2.4.3.2 Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết tơ nấm Linh chi
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được ghi chép và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics centurion
KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN
Thu nhận sinh khối của tơ nấm linh chi trong môi trường lỏng
Trong thí nghiệm, sinh khối được nuôi cấy trong chai 80 ml trong 18 ngày, với thời gian lấy mẫu mỗi 3 ngày Mẫu sau đó được sấy khô ở 55°C đến khi đạt khối lượng không đổi, rồi được cân và ghi nhận số liệu Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1 Khả năng tích lũy hệ sợi nấm trong môi trường lỏng của nấm linh chi đen
Thời gian (ngày) Sinh khối (gam)
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có ký tự a, b, c,… cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê, chỉ phản ánh sự khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05.
Hình 3.1 Khả năng tích lũy sinh khối của sợi nấm Amauroderma subresinosum trong môi trường lỏng
- Trong 6 ngày đầu, tơ nấm thích nghi với môi trường, sinh khối tăng lên rất ít
- Từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9, sinh khối phát triển rất nhanh
Vào ngày thứ 12, sự phát triển của sinh khối diễn ra chậm, xuất hiện sắc tố đỏ nâu xung quanh mẫu cấy, và vòng sắc tố này dần lan rộng và trở nên đậm hơn theo thời gian.
Từ ngày 15, sinh khối bắt đầu tăng chậm và đến ngày thứ 18 gần như không thay đổi Để tiết kiệm thời gian nuôi cấy và phù hợp với thời gian sinh hoạt chất của tơ nấm Linh chi, chúng tôi quyết định thu nhận sinh khối vào ngày thứ 18 để tiến hành sấy khô và khảo sát một số hoạt tính hóa học.
Thời gian nuôi cấy (ngày )
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học nấm Linh chi A subresinosum
Hình 3.2 Định tính anthraglycosid Ống 1: Nước cất + KOH 10% Ống 2: Dịch chiết diethyl ether + KOH 10% Ống 3: Dịch chiết ethanol + KOH 10%
Khi nhỏ vài giọt KOH 10% vào dịch chiết nấm linh chi, mẫu thử ống 2 và 3 cho kết quả dương tính với sự xuất hiện của màu đỏ Quan sát sơ bộ màu sắc ở Hình 3.2 cho thấy sự hiện diện của anthraglycosid trong dịch chiết etanol nhiều hơn so với dịch chiết diethyl eter.
Hình 3.3 Định tính flavonoid Ống 1: Nước cất + HClđđ + Mg Ống 2: Dịch chiết với diethyl eter + HClđđ + Mg Ống 3: Dịch chiết với ethanol + HClđđ + Mg
Thêm vài giọt HCl đậm đặc vào mẫu thử và sau đó cho bột Mg kim loại vào Quan sát cho thấy không có sự chuyển sang màu đỏ của dịch chiết, từ đó có thể kết luận rằng dịch chiết tơ nấm linh chi không chứa flavonoid.
Hình 3.4 Định tính acid béo
Nhỏ 1 giọt dịch chiết tơ nấm lên giấy lọc, hơ khô, quan sát vết mờ để lại trên giấy lọc, mẫu đối chứng là nước cất không để lại vết mờ, còn với dịch chiết nấm thì có (Hình 3.4) Ta có thể kết luận được sự có mặt của acid béo trong dịch chiết tơ nấm linh chi với diethyl eter
Trong thí nghiệm định tính alkaloid, các mẫu được kiểm tra bằng thuốc thử Mayer Cụ thể, ống 1 chứa nước cất kết hợp với thuốc thử Mayer, ống 2 là dịch chiết từ diethyl ether với thuốc thử Mayer, ống 3 là dịch chiết từ ethanol với thuốc thử Mayer, và ống 4 là dịch chiết nước cũng sử dụng thuốc thử Mayer.
Trong thí nghiệm định tính alkaloid, các ống thử với thuốc thử Bouchardat cho thấy không có sự xuất hiện của tủa màu vàng nhạt hay màu nâu khi tác dụng với dịch chiết từ bột tơ nấm Linh chi đen Cụ thể, ống 1 chứa nước cất, ống 2 chứa dịch chiết diethyl eter, ống 3 chứa dịch chiết ethanol và ống 4 chứa dịch chiết nước, tất cả đều không phát hiện alkaloid Kết quả này cho thấy tơ nấm Linh chi đen có thể không chứa alkaloid.
Dịch chiết từ tơ nấm linh chi đen khi được chiết xuất bằng diethyl eter và bốc hơi đến khô sẽ tỏa ra một mùi thơm đặc trưng, cho thấy khả năng có sự hiện diện của tinh dầu trong dịch chiết này.
Dịch chiết tơ nấm linh chi đen được thực hiện bằng diethyl eter và sau đó bốc hơi đến khô Khi nhỏ vài giọt H2SO4 đđ vào, không xuất hiện màu xanh, cho thấy tơ nấm không chứa carotenoid.
Dịch chiết tơ nấm linh chi đen được thực hiện bằng cách sử dụng diethyl ether, sau đó bốc hơi đến khô trong chén sứ Sử dụng thuốc thử Lieberman, nhỏ vài giọt anhidrid acetic vào chén để hòa tan cắn, và từ từ nhỏ vào thành chén Quan sát thấy mặt phân cách giữa hai dung dịch có màu vàng lục, điều này cho thấy trong dịch chiết có thể chứa phytosterol.
Hình 3.9 Định tính steroid Ống 1: Mẫu nước cất Ống 2: Mẫu dịch chiết tơ nấm với ethanol
Hòa mẫu thử với 1 ml chloroform và cho vào ống nghiệm Thêm 1 ml anhidrid acetic vào thuốc thử Lieberman, sau đó nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ vào thành ống nghiệm Nếu không thấy xuất hiện màu xanh dương lục, kết luận sơ bộ cho thấy không có steroid trong dịch chiết tơ nấm Linh chi đen.
The qualitative analysis of tannins was conducted using three test tubes: Test Tube 1 contained distilled water, sodium acetate, and 5% FeCl3; Test Tube 2 included fungal extract with ethanol, sodium acetate, and 5% FeCl3; and Test Tube 3 comprised fungal extract with water, sodium acetate, and 5% FeCl3.
Trung hòa mẫu thử bằng acetate natri và thêm dịch FeCl3 5%, quan sát ống 3 cho thấy phản ứng tạo màu xanh đen Kết luận sơ bộ cho thấy dịch chiết tơ nấm linh chi với nước có thể chứa tanin.
Hình 3.11 Định tính đường khử trước khi đun
Sau khi thực hiện thí nghiệm với thuốc thử Fehling A và B, ống nghiệm 2 và 3 cho thấy sự xuất hiện của kết tủa đỏ gạch, chứng tỏ có sự hiện diện của đường khử Quan sát từ Hình 3.12 cho thấy rằng lượng đường khử trong dịch chiết tơ nấm với nước nhiều hơn so với dịch chiết với ethanol.
Pha loãng dịch chiết tơ nấm linh chi trong ethanol với 1 lần thể tích nước cất, rồi rót đều vào 2 ống nghiệm
Hình 3.13 Định tính antocyanosid Ống 1: Dịch chiết tơ nấm trong ethanol + HClđđ Ống 2: Dịch chiết tơ nấm trong ethanol + NaOH
Sau khi acid hóa, ống 1 không chuyển sang màu đỏ, và ống 2 cũng không có sự chuyển sang màu lục trong thử nghiệm kiềm hóa Điều này cho thấy tơ nấm linh chi không chứa antocyanosid.
Hình 3.14 cho thấy kết quả định tính saponin từ dịch chiết tơ nấm linh chi trong hai dung môi khác nhau: ethanol và nước Khi thêm 5ml nước cất vào mỗi ống nghiệm và lắc mạnh, cả hai ống đều tạo bọt Tuy nhiên, hợp chất saponin được chiết xuất từ tơ nấm linh chi bằng nước cho thấy độ bền cao hơn so với khi sử dụng ethanol.
Hình 3.15 minh họa quá trình định tính acid uronic, trong đó ống 1 chứa nước cất và ethanol 96 độ, còn ống 2 chứa dịch chiết tơ nấm hòa trộn với ethanol 96 độ Sau khi pha loãng mẫu thử với hai lần thể tích ethanol, dịch chiết tơ nấm xuất hiện nhiều kết tủa, cho thấy có khả năng tồn tại hợp chất đường loại acid uronic trong tơ nấm linh chi.
3.2.14 Định tính acid hữu cơ
Khảo sát hoạt tính cao chiết Methanol tổng của tơ nấm Linh chi đen
3.3.1 Khả năng kháng khuẩn của tơ nấm linh chi trong cao Methanol Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn: S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao chiết được chuẩn bị ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu và được ủ ở 37 0 C, trong 24 giờ Quan sát và đo vòng kháng khuẩn (Bảng 3.4)
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao MeOH thu được trên đĩa thạch
STT Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình được ký hiệu bằng các ký tự a, b, c,… cho thấy không có sự khác biệt về mặt thống kê, chỉ có sự khác nhau ở mức ý nghĩa 0,05.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao MeOH có khả năng kháng lại bốn loại vi khuẩn với đường kính ức chế từ 17 đến 20 mm sau 24 giờ ủ ở 37 độ C.
P.aeruginosa và E.coli (đường kính 19 – 20 mm) cao hơn so với 2 chủng còn lại
Hình 3.17 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao MeOH
3.3.2 Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết Methanol tổng
Khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn được khảo sát thông qua phản ứng DPPH (2,2 diphenyl-1-picryl-hydrazyl) trên đĩa 96 giếng, ủ ở nhiệt độ 37°C trong 30 phút và đo OD tại 517 nm Kết quả của nghiên cứu được thể hiện trong bảng 3.5 và hình 3.18.
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao MeOH thu được
OD 1 OD 2 OD 3 Trung bình
% bắt gốc tự do % sai số
Hình 3.18 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao MeOH thu được
Cao MeOH cho thấy khả năng bắt gốc tự do DPPH với tỷ lệ tăng dần từ 10,39% ở nồng độ 0,125 mg/ml lên đến 81,21% ở nồng độ 4 mg/ml Đặc biệt, nồng độ ức chế gốc tự do DPPH ở mức 50% (IC50) của cao MeOH là 1,094 mg/ml.
Khảo sát hoạt tính các phân đoạn cao của tơ nấm Linh chi A.subresinosum
3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết tơ nấm linh chi Để khảo sát hoạt tính kháng lại một số chủng vi khuẩn: S.aureus, B.subtilis, E.coli và P.aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, các loại cao chiết được chuẩn bị ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó được bơm vào các giếng đã đánh dấu và được ủ ở 37 0 C, trong 24 giờ Quan sát và đo vòng kháng khuẩn
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn cao thu được trên đĩa thạch Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Chủng VK Hexane Chloroform Ethyl acetate Nước Bacillus subtilis 10 ± 0,30 16 ± 0,36 10 ± 0,30 0
Theo bảng 3.6, dịch chiết tơ nấm cho thấy khả năng kháng vi khuẩn gram dương tốt hơn so với gram âm Trong bốn phân đoạn thu được, phân đoạn Chloroform có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, vượt trội hơn so với phân đoạn Hexane và Ethyl acetate, trong khi cao nước hầu như không có khả năng kháng khuẩn.
Methanol có khả năng kháng 4 chủng vi khuẩn, trong khi các phân đoạn chỉ kháng được B.subtilis và S.aureus Điều này xảy ra do hợp chất kháng khuẩn trong các loại phân đoạn có thể bị mất trong quá trình tách chiết, dẫn đến khả năng kháng khuẩn của chúng giảm so với cao ban đầu.
Hình 3.19 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Hexane
Hình 3.20 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Chloroform
Hình 3.21 Kết quả khảo sát kháng khuẩn của cao Ethyl acetate
3.4.2 Khả năng kháng oxy hóa của các loại cao chiết
Khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn được tiến hành khảo sát bằng phản ứng DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) trên đĩa 96 giếng, ủ ở 37 0 C, trong 30 phút và đo OD517nm
Kết quả được thể hiện ở các hình 3.22, 3.23, 3.24, 3.25 tương ứng cho các phân đoạn chiết Hexane, Chloroform, Ethyl acetate và nước
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Hexane thu được
OD 1 OD 2 OD 3 Trung bình
% bắt gốc tự do % sai số
Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Hexane thu được
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Chloroform thu được
OD 1 OD 2 OD 3 Trung bình
% bắt gốc tự do % sai số
Hình 3.23 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Chloroform thu được
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Ethyl acetate thu được
OD 1 OD 2 OD 3 Trung bình
% bắt gốc tự do % sai số
Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao Ethyl acetate thu được
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát khả năng bắt gốc tự do của cao Nước thu được
OD 1 OD 2 OD 3 Trung bình
% bắt gốc tự do % sai số
Hình 3.25 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao nước thu được
Kết quả nghiên cứu cho thấy các phân đoạn thu được có khả năng bắt gốc tự do DPPH theo nồng độ tăng dần, với nồng độ ức chế 50% lần lượt là 1,115 mg/ml cho cao Hexan, 0,336 mg/ml cho Chloroform, 0,521 mg/ml cho Ethyl acetate và 1,218 mg/ml cho nước.
Các giá trị IC50 của các phân đoạn chiết và cao tổng MeOH cho thấy rằng phân đoạn chiết với Chloroform và Ethyl acetate có khả năng bắt gốc tự do tốt hơn so với cao tổng, với các giá trị IC50 lần lượt là 0,336 và 0,521 mg/ml Phân đoạn Hexane có giá trị IC50 tương đương với cao tổng Methanol, trong khi phân đoạn nước có giá trị IC50 cao nhất.
Hình 3.26 Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết
MeOH Hexan Cloroform Ethyl acetate H2O
Kết quả phân tích thành phần có trong cao chiết tơ nấm A subresinosum bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Để xác định các thành phần hoạt chất chính trong các phân đoạn cao, kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được áp dụng Các sắc ký đồ của cao Hexane, Chloroform, Ethyl acetate và nước được trình bày lần lượt trong các hình 3.27, 3.28, 3.29 và 3.30.
Hình 3.27 Sắc ký đồ của dung dịch cao Hexane đo ở bước sóng 254 nm
Theo phân tích sắc ký đồ, có ba đỉnh đặc trưng trong cao Hexane Đỉnh đầu tiên xuất hiện ở thời gian lưu 24 phút, đỉnh thứ hai vào khoảng 31 phút, và đỉnh thứ ba ở thời gian lưu 35 phút.
Hình 3.28 Sắc ký đồ của dung dịch cao Chloroform đo ở bước sóng 254 nm
Trong cao Chloroform, phân tích được một chất đặc trưng, thời gian lưu của chất ở phút thứ 24
Hình 3.29 Sắc ký đồ của dung dịch cao Ethyl acetate đo ở bước sóng 254 nm
Sắc ký đồ của cao Ethyl acetate cho thấy hai peak đặc trưng, cho thấy sự hiện diện của chất chính và một số tạp chất khác Thời gian lưu của các chất này lần lượt là 14 phút và 21 phút.
Hình 3.30 thể hiện sắc ký đồ của dung dịch cao Nước đo ở bước sóng 254 nm Đối với phân đoạn cao nước, các chất có thời gian lưu ngắn khi phân tách bằng cột C18, dẫn đến việc phân tách không hiệu quả Những chất này có thể bao gồm đường khử và polysaccharide Hiện tại, phân đoạn này đang được phân tách bằng các hệ thống sắc ký khác, như cột carbohydrate và cột amine.