TỔNG QUAN
1.1.1) Thành phần hóa học trong đầu tôm
Vỏ tôm chứa các thành phần hóa học quan trọng như chitin (27.2%), canxi (10%), tro (31.7%), photpho (3.16%) và lipit (0.4%) Trong khi đó, đầu tôm có chứa 25-28% protein, bao gồm 4-5% lizin và 2.7% metionin, đồng thời giàu canxi, photpho, các khoáng vi lượng và chất màu.
- Protein: thành phần protein trong phế liệu tôm thường tôn tại ở 2 dạng: dạng tự do và dạng liên kết
Dạng tự do của protein trong tôm xuất hiện từ những con tôm bị biến đổi và phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng Việc công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật có thể dẫn đến tổn thất protein vào phế liệu, làm tăng tiêu hao nguyên vật liệu và gây khó khăn trong việc xử lý phế liệu này.
Protein ở dạng phức tạp không hòa tan, thường liên kết với chitin, canxi cacbonat, lipit để tạo thành lipoprotein, và với sắc tố tạo thành protein carotenoid Những yếu tố này kết hợp với nhau tạo thành một phần thống nhất, quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
Chitin tồn tại dưới dạng phức hợp chitin - protein, được liên kết bằng các liên kết đồng hóa trị với protein, cùng với các hợp chất khoáng và hữu cơ khác Sự kết hợp này gây khó khăn trong việc tách và chiết xuất chitin.
Vỏ và đầu tôm chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối CaCO3 Mặc dù hàm lượng Ca3(PO4)2 không cao, nhưng trong quá trình khử khoáng, nó dễ dàng hình thành hợp chất CaHPO4 không tan trong HCl, gây khó khăn cho quá trình này.
- Sắc tố: trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là astaxanthin
1.1.2) Tình hình sử dụng nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm
Vấn đề xử lý phụ phẩm từ tôm, bao gồm đầu và vỏ, đang trở thành thách thức lớn trong ngành xuất khẩu thủy sản Hiện nay, nhiều công ty và cơ sở chế biến thủy sản đã triển khai một số giải pháp nhằm cải thiện tình hình này.
Việc bán tươi hoặc khô các phụ phế phẩm làm thức ăn gia súc yêu cầu phải tiến hành nhanh chóng để tránh tình trạng phân hủy, gây ô nhiễm môi trường và trở thành chất độc hại cho gia súc, gia cầm Sấy khô tốn nhiều năng lượng và chi phí, trong khi phơi nắng phụ thuộc vào thời tiết, kém vệ sinh và cũng gây ô nhiễm Cả hai phương pháp này đều không loại bỏ được khoáng và chitin, gây khó tiêu cho gia súc, gia cầm Hơn nữa, phần phế phẩm dư không được bán hoặc xử lý sẽ trở thành rác thải, gây ô nhiễm môi trường và không mang lại giá trị kinh tế cao.
Một số phương pháp vi sinh đã được áp dụng để tận dụng nguồn phế thải làm thức ăn gia súc, chẳng hạn như việc sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua để nuôi heo Tuy nhiên, phương pháp này còn gặp nhiều hạn chế như thực hiện nhỏ giọt, không đồng bộ, dẫn đến hiệu suất thấp và chi phí cao.
Sản xuất chitin từ vỏ tôm thông qua phương pháp thủy phân protein hóa học đòi hỏi phải khử protein trong đầu tôm Phương pháp phổ biến hiện nay để khử protein là sử dụng NaOH hoặc KOH Quy trình này giúp tách chitin hiệu quả từ vỏ tôm.
Quy trình khử protein bằng NAOH hoặc KOH
Khử protein bằng NaOH là phương pháp thủy phân các liên kết peptit của protein không hòa tan, tạo thành các dạng peptit và acid amin hòa tan trong nước, dễ dàng loại bỏ khỏi nguyên liệu Nồng độ NaOH thường sử dụng từ 1 – 10% và nhiệt độ từ 50 – 100 độ C Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng độ và tỉ lệ dung dịch so với khối lượng vỏ giáp xác Ngoài NaOH, quá trình khử protein cũng có thể đạt được bằng cách xử lý với dung dịch KOH.
• Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:
CHOCOR2 + 3NaOH CHOH + R1COONa + R2COONa + R3COONa
Khi sử dụng NaOH để khử protein, năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn đầu khá lớn, yêu cầu nồng độ NaOH cao và thời gian xử lý dài, dẫn đến suy giảm chất lượng chitin và protein tách ra Quy trình này cũng tạo ra lượng chất thải lớn, bao gồm các chất ăn mòn và chất lơ lửng khó xử lý Do đó, cần thiết phải áp dụng các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường.
Nghiên cứu và phát triển giải pháp xử lý protein trong đầu tôm là cần thiết để giảm chi phí xử lý, nâng cao giá trị sử dụng phụ phẩm từ tôm Điều này không chỉ cải thiện hiệu quả kinh tế cho ngành chế biến tôm mà còn giúp hạn chế ô nhiễm môi trường do chất thải từ phụ phẩm tôm.
1.1.3) Hiệu quả môi trường mà đề tài mang lại :
Hàng năm, ngành chế biến thủy hải sản thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu từ đầu và vỏ tôm, trong đó chỉ một phần nhỏ được xử lý Nếu không được xử lý triệt để, lượng phế thải này có thể gây ô nhiễm nghiêm trọng cho nguồn nước và không khí, tạo ra nguy cơ lớn cho môi trường.
Các phương pháp xử lý truyền thống như phơi và sấy đã được áp dụng để tận dụng nguồn phế thải, nhưng chúng gây ra mùi khó chịu, ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và làm việc của cư dân xung quanh các cơ sở tái chế.
Việc sử dụng phế thải thông qua phương pháp hóa học không chỉ tiêu tốn nhiều hóa chất mà còn tạo ra nước thải hóa học cùng với các chất phân giải protein, dẫn đến nhu cầu xử lý nước thải để ngăn ngừa ô nhiễm môi trường.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là đầu tôm sú Penaeus monodon, được phân tách trực tiếp tại xưởng sản xuất của Công Ty Cổ Phần Thuỷ Hải Sản Việt Nhật Sau đó, nguyên liệu này được cấp đông và bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi sử dụng.
- Proteaza được mua tại CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI HÓA CHẤT VÀ
Quy trình thuỷ phân được tiến hành qua các bước như sau :
Hình 1 : Sơ đồBố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu đầu, vỏ tôm
Thủy phân ở các nhiệt độ:
Bột nhão protein Sấy Sản phẩm protein
HCl 10% Kết tủa đẳng điện
Bổ sung chất trợ lắng Chitosan 1.5%
Dịch trong Ly tâm 10000 vòng/ph, 15 phút
Quy trình thu nhận đầu và vỏ tôm từ chế biến tôm sú đông lạnh xuất khẩu bao gồm các bước rửa sạch, để ráo, nấu chín ở nhiệt độ 98°C trong 5 phút, sau đó làm nguội và xay nhỏ thành kích thước 3-5mm Khi hỗn hợp đã nguội đến nhiệt độ cần thiết, bổ sung Proteaza với nồng độ khác nhau và khuấy trộn để thủy phân protein Mẫu được lọc qua nhiều lớp vải thô, dịch lọc được kết tủa bằng HCl 10% đến pH đẳng điện, rồi thêm dung dịch chitosan đạt nồng độ 100ppm và để lắng ở 4°C trong 2 giờ Cuối cùng, bột nhão protein thu được từ quá trình ly tâm 15 phút ở 10.000 vòng/phút được sấy khô để thu nhận bột protein.
Để đánh giá hàm lượng protein sau quá trình thủy phân, thêm 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme và ổn định dung dịch trong 25 phút Tiến hành lọc qua giấy lọc để loại tủa, sau đó cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1 ml dịch lọc và thêm 1 ml thuốc thử Folin Trộn đều và để yên ở 37 ± 0,5 °C trong 20 phút Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm để xác định nồng độ OD tương ứng với đường chuẩn tyrosin, từ đó tính toán hàm lượng peptid và acid amin sau thủy phân, giúp xác định nhiệt độ, nồng độ và thời gian tối ưu cho hàm lượng protein cao nhất.
2.2.2) Phương pháp phân tích đã áp dụng:
Phương pháp Kjeldahl được sử dụng để định lượng protein thông qua việc xác định tổng nitơ và nitơ phi protein Sau đó, hiệu số giữa hai loại nitơ này được nhân với hệ số tương ứng để tính toán lượng protein.
Nitơ tổng được xác định bằng cách sử dụng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, trong đó các hợp chất hữu cơ chứa nitơ bị phân huỷ và oxi hoá thành CO2 và H2O Trong quá trình này, nitơ chuyển thành amoniac và kết hợp với H2SO4 để tạo ra muối amoni sunfat.
Nitơ phi protein được xác định bằng cách sử dụng dung môi thích hợp, như etanol 70%, để chiết xuất tất cả các dạng N-phi protein Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn còn tồn tại một số loại protein, vì vậy cần sử dụng chất kết tủa để tách biệt phần protein hòa tan trong quá trình chiết rút.
Phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Phương Pháp Amano)
Sử dụng protein casein làm cơ chất để khảo sát hoạt tính phân giải protein của enzyme protease, chúng tôi định lượng sản phẩm tạo thành thông qua phản ứng màu với thuốc thử Folin Bằng cách tham khảo đồ thị chuẩn, chúng tôi tính toán lượng Tyrosin tương ứng với sản phẩm thủy phân do enzyme gây ra.
Phương pháp xác định hàm lượng chất khô
Hàm lượng chất khô được xácđịnh bằng phương pháp sấyở nhiệt độ 85oC cho đến khi hàm lượng chất khô không thay đổi
Phương pháp xác định hàm lượng chất tro
Hàm lượng chất tro được xácđịnh bằng phương pháp nung ở nhiệt độ 500oC cho các chất hữu cơ cháy hoàn toàn
2.2.3) Phương pháp xử lý số liệu:
Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê toán học dựa trên các phần mềm Excel
So sánh chi phí và lợi ích của việc mở rộng kế hoạch thủy phân phế liệu tôm sú nhằm tận thu protein với các phương pháp khác là cần thiết để đánh giá hiệu quả Việc này không chỉ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất mà còn nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Bằng cách phân tích các yếu tố kinh tế và kỹ thuật, chúng ta có thể xác định được phương pháp nào mang lại lợi ích tốt nhất cho ngành công nghiệp chế biến thủy sản.
2.3.1) Phương pháp 1 : Sản xuất thức ăn gia súc :
Việc sử dụng phế phẩm tôm sú làm thức ăn gia súc không mang lại hiệu quả cao do chitin trong vỏ tôm chưa được xử lý, gây đầy bụng và khó tiêu cho vật nuôi Khi sấy khô và xay mịn, việc bổ sung vào thức ăn gia súc sẽ tiêu tốn nhiều nhiệt lượng Hơn nữa, hàm lượng protein trong phế liệu tôm chỉ đạt 25-28%, thấp hơn so với các sản phẩm khác trên thị trường như bột xương (45-50% protein) và bột cá (55-60%) Giá của bột xương và bột cá cũng rất cạnh tranh, chỉ từ 9.000-10.000 VNĐ/kg và 18.000-26.000 VNĐ/kg bột thành phẩm.
Khi sử dụng phế liệu tôm làm thức ăn cho gia súc và gia cầm, cần lưu ý rằng phương pháp sấy hoặc phơi nắng thông thường không thể loại bỏ khoáng và chitin Hai chất này có thể gây ra chứng khó tiêu cho động vật, ảnh hưởng đến sức khỏe và hiệu suất chăn nuôi.
Phương pháp hóa học để tận thu chitin và chitosan yêu cầu 80 kg HCl 10% và 75 kg NaOH 40% để sản xuất 1 kg chitosan, dẫn đến lượng phế thải hóa học và protein lớn thải ra môi trường hàng năm từ các cơ sở sản xuất Tại Việt Nam, các dự án nghiên cứu chitosan mới chỉ đang ở giai đoạn đầu, mở ra triển vọng cho một ngành công nghiệp chitosan khả thi trong tương lai.
Trong công nghệ sản xuất chitosan, phương pháp hóa học bao gồm hai bước chính: xử lý bằng axit và xử lý bằng kiềm để loại bỏ protein khỏi hỗn hợp bán thành phẩm Tuy nhiên, có thể thay thế bước này bằng phản ứng enzyme thủy phân protein, giúp tránh sử dụng hóa chất Phương pháp này không chỉ an toàn hơn mà còn tạo ra sản phẩm phụ là dịch thủy phân chứa các axit amin và peptit, có thể được tận dụng trong sản xuất chăn nuôi.
Nhiều loại enzyme protease như protease từ nội tạng gia súc, bromelain từ dứa và papain từ đu đủ đã được trích ly thành công và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên, chưa có công bố khoa học nào về việc ứng dụng chúng trong sản xuất chitin-chitosan Hiện nay, nghiên cứu và ứng dụng phương pháp sử dụng vi sinh vật tái tổ hợp để sinh enzyme chitinase, chitosanase hoặc protease từ vi sinh vật đang được chú trọng trong sản xuất chitosan.
2.3.3) Phương pháp 3 : Phương pháp tận thu protein
Có nhiều phương pháp để tận thu protein, trong đó phương pháp hóa học sử dụng NaOH cần nồng độ cao và thời gian dài, dẫn đến tiêu tốn nhiều năng lượng và hóa chất Do đó, nghiên cứu tận thu protein bằng enzyme là một giải pháp hiệu quả Phương pháp này không chỉ cho phép thu được protein với hàm lượng cao mà còn giúp tận thu chitin và chitosan, mang lại hiệu quả kinh tế và môi trường tốt nhất.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Hàm lượng peptid và acid amin sau khi thuỷ phân đầu tôm bằng enzyme protease được xác định thông qua việc lọc dịch thuỷ phân, ổn định bằng TCA, loại bỏ tủa, và thêm Na2CO3 cùng với Folin, sau đó đo ở bước sóng 660 nm Nồng độ OD thu được sẽ tương ứng với đường chuẩn tyrosin, từ đó cho biết hàm lượng peptid và acid amin Kết quả thuỷ phân sẽ khác nhau tùy thuộc vào nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thuỷ phân.
3.1.1) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, thời gian đến quá trình thuỷ phân ở nhiệt độ 50oC
Hình 3 : Kết quả thuỷ phân ở nhiệt độ là 50oC
Trong quá trình thủy phân, phản ứng chưa diễn ra trong khoảng thời gian đầu, dẫn đến việc các mẫu khác nhau không có sự khác biệt về kết quả Sự khác biệt chỉ bắt đầu xuất hiện từ 1 giờ trở đi ở tất cả các nồng độ.
Hàm lượng pep tid v à ac id amin ( μ g /ml)
Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian ở nhiệt độ 50oC
Tại nồng độ enzyme 0.025% và thời gian thủy phân 1 giờ, kết quả thu được là 25,5 μm/ml, cho thấy mức độ thủy phân rất thấp Điều này cho thấy khoảng thời gian này là quá ngắn để enzyme có thể thủy phân hoàn toàn lượng protein có trong đầu tôm.
• Khi thời gian thuỷ phân tăng lên kết quả thuỷ phân cũng tăng theo và tăng nhanh nhất trong khoảng từ 0h đến 9h
Việc tăng thời gian thủy phân từ 9h đến 12h dẫn đến kết quả thủy phân tăng, nhưng với tốc độ chậm hơn Đặc biệt, từ 12h đến 15h, mặc dù thời gian thủy phân vẫn tăng đều (3h), nhưng kết quả lại không tăng nhiều và có xu hướng bão hòa Điều này cho thấy rằng từ 12h trở đi, kết quả thủy phân đã gần đạt đến giới hạn cực đại, nên việc tiếp tục tăng thời gian thủy phân sẽ không mang lại sự gia tăng đáng kể về kết quả.
Nồng độ enzyme 0.05% cho kết quả thủy phân cao hơn nồng độ 0.025% trong mọi thời gian thử nghiệm, cho thấy nồng độ 0.025% là chưa đủ để thủy phân toàn bộ lượng protein có trong đầu tôm.
Sau 1 giờ thuỷ phân, kết quả cho thấy nồng độ protein đạt 31μm/ml, cao hơn so với nồng độ 0,025%, nhưng vẫn ở mức thấp Thời gian 1 giờ được xem là quá ngắn để enzyme có thể thuỷ phân hoàn toàn lượng protein trong đầu tôm.
Khi thời gian thủy phân tăng lên, kết quả thu được cũng gia tăng, với tốc độ tăng nhanh nhất trong khoảng thời gian từ 0 đến 6 giờ Từ 6 đến 12 giờ, mặc dù kết quả vẫn tiếp tục tăng, nhưng tốc độ tăng chậm hơn so với giai đoạn 0 đến 6 giờ.
Khoảng thời gian từ 12h trở đi, kết quả vẫn tăng nhưng xu hướng tăng rất chậm Lượng peptid và acid amin gần đạt đến giới hạn cực đại, do đó, dù có kéo dài thời gian thêm, kết quả thu được cũng không tăng nhiều.
Tại nồng độ enzyme 0.075%, kết quả thủy phân vượt trội so với nồng độ 0.05% trong tất cả các thời gian thủy phân Điều này cho thấy nồng độ enzyme 0.05% vẫn còn thấp và chưa đủ để thủy phân hoàn toàn lượng protein có trong đầu tôm.
Với thời gian thuỷ phân 1h, kết quả thuỷ phân có cao hơn so với nồng độ 0,05% tuy nhiên kết quả vẫn ở mức thấp 32,3μm/ml
Khi tăng thời gian thủy phân, kết quả thu được cũng tăng lên, với tốc độ nhanh nhất trong khoảng từ 0 đến 3 giờ Từ 3 đến 12 giờ, kết quả vẫn tiếp tục tăng, nhưng với tốc độ chậm hơn Điều này cho thấy thời gian có ảnh hưởng lớn đến kết quả của quá trình thủy phân.
Trong khoảng thời gian từ 12h đến 15h, kết quả cho thấy sự gia tăng chậm của peptid và acid amin, từ 75,7μm/ml lên 76,4μm/ml Điều này cho thấy rằng lượng peptid và acid amin gần đạt đến giới hạn cực đại trong điều kiện nồng độ và thời gian này.
Tại nồng độ enzyme 0.1%, kết quả thủy phân cao hơn nồng độ 0.075% ở mọi thời gian thủy phân, nhưng mức độ tăng không rõ rệt như khi tăng nồng độ từ 0.025% lên 0.05% hoặc từ 0.05% lên nồng độ cao hơn.
=> 0.075% Từ đó ta có thể thấy là nồng độ enzyme 0,1% là đã gần đủ để thuỷ phân lượng protein có trong đầu tôm
Sau 1 giờ thủy phân, kết quả cho thấy nồng độ protein đạt 33,7μm/ml, cao hơn so với nồng độ 0,075%, nhưng vẫn ở mức thấp Thời gian 1 giờ quá ngắn để enzyme có thể thủy phân hoàn toàn lượng protein trong đầu tôm.
• Khi ta tăng thời gian thuỷ phân, kết quả thu được cũng tăng theo, tăng nhanh nhất vẫn là khoảng từ 0h=>1h và từ 1h-3h : tăng 21,57μm/ml peptid và acid amin
• Khoảng thời gian từ 3h=>12hkết quả thu nhận tăng đều tuy nhiên vẫn chậm hơn khoảng từ 1h-3h
Từ 12h trở đi, kết quả vẫn tiếp tục tăng nhưng với xu hướng chậm lại, cho thấy lượng peptid và acid amin đã gần đạt đến giới hạn cực đại trong điều kiện này.
Ở nồng độ enzyme 0.125%, kết quả thuỷ phân đạt cao hơn so với nồng độ 0.1% trong tất cả các thời gian thuỷ phân, mặc dù mức độ tăng không đáng kể Tương tự, khi tăng nồng độ enzyme từ 0.075% lên 0.1%, nồng độ enzyme 0.125% gần như đủ để thuỷ phân lượng protein có trong đầu tôm, nhưng vẫn chưa đạt mức dư thừa.