Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc

Kết quả nội dung 2: Nghiên cứu tiềm năng của ADSCs trong trị liệu bệnh gan thông qua đánh giá sự biểu hiện gen liên quan đến dòng tế bào gan và khả năng biệt hoá thành tế bào gan in vitr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG HẢI NHUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH XƠ GAN TRÊN

MÔ HÌNH CHUỘT BỊ XƠ GAN SỬ DỤNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG HẢI NHUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH XƠ GAN TRÊN

MÔ HÌNH CHUỘT BỊ XƠ GAN SỬ DỤNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

Mã số: 62 42 30 01

Phản biện 1: PGS TS Phạm Thị Lệ Hoa Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Văn Thuận Phản biện 3: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 1: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 2: TS.BS Ngô Quốc Đạt

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 GS.TS NGUYỄN VĂN THANH

2 PGS.TS HUỲNH NGHĨA

Tp Hồ Chí Minh – Năm 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào hay ở bất kỳ công trình nào khác

Tôi cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Trương Hải Nhung

LỜI CẢM ƠN

Luận án tiến sĩ này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng

Tế bào gốc, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn khoa học của GS.TS Nguyễn Văn Thanh và TS.BS Huỳnh Nghĩa Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy về sự quan tâm và định hướng khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn các nhà khoa học, các tác giả công trình công bố đã trích dẫn trong luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Thầy Phan Kim Ngọc, Thầy Phạm Văn Phúc – Lãnh đạo PTN NC&UD Tế bào gốc vì đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu của mình Xin chân thành cảm ơn các Thầy vì đã dìu dắt

và chỉ bảo, định hướng nghiên cứu cho tôi từ khi tôi tiếp cận lĩnh vực tế bào gốc Xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô trong Bộ Môn Sinh lý học và CNSH Động vật, Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên

đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các bạn đồng nghiệp, bạn bè và nhất là nhóm cộng tác nghiên cứu Y học tái tạo Gan vì đã hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Cuối cùng là lòng tri ân tới Ba Mẹ, gia đình và những người thân yêu quý trong gia đình nhỏ của tôi vì đã luôn ủng hộ, động viên, cảm thông và chia sẻ các khía cạnh của cuộc sống trong cả quá trình tôi thực hiện luận án

Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2016

Tác giả

Trương Hải Nhung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ xi

DANH MỤC HÌNH xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Xơ gan – Định nghĩa và bệnh nguyên 4

1.1.1 Định nghĩa 4

1.1.2 Bệnh nguyên 5

1.1.3 Dịch tễ học 6

1.2 Xơ gan: từ cơ chế đến điều trị 9

1.2.1 Yếu tố tế bào góp phần gây nên xơ gan 10

1.2.2 Cơ chế chuyển dạng biểu mô-trung mô (epithelial mesenchymal transition-EMT) 13

1.2.3 Yếu tố miễn dịch trong cơ chế phát sinh xơ gan 15

1.2.4 Cơ chế phân tử xơ gan 17

1.2.5 Chẩn đoán và điều trị 20

1.3 Mô hình xơ gan bằng CCl4 trên động vật phục vụ nghiên cứu 27

1.4 Liệu pháp tế bào/tế bào gốc trong xơ gan 28

1.4.1 Cơ sở khoa học của liệu pháp tế bào gốc trong điều trị xơ gan 29

1.4.2 Cơ chế điều trị xơ gan dùng liệu pháp tế bào gốc 31

1.4.3 Các loại tế bào gốc có thể ứng dụng trong điều trị bệnh gan 32

1.4.4 Tổng quan về nghiên cứu tế bào gốc trong điều trị xơ gan trên thế giới 33

1.4.5 Tổng quan về tình hình nghiên cứu tế bào gốc ở Việt Nam 36

1.5 Tế bào gốc trung mô (MSC) và tiềm năng điều trị xơ gan của MSC 37

1.5.1 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (ADSC) 37

1.5.2 Tiềm năng của MSC trong trị liệu xơ gan 38

1.5.3 Khả năng điều biến miễn dịch theo hướng ức chế viêm của tế bào gốc trung mô 38

1.5.4 Khả năng di cư và định cư (homing) đến vị trí tổn thương 40

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 42

2.1 Vật liệu 42

2.1.1 Đối tượng thí nghiệm 42

2.1.2 Thiết bị 42

2.1.3 Dụng cụ 42

2.1.4 Hoá chất 42

2.2 Phương pháp 47

2.2.1 Phương pháp thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 49

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy thứ cấp 50

2.2.3 Khẳng định tế bào gốc ứng viên là tế bào gốc trung mô 51

2.2.4 Phương pháp đánh giá thông qua hình thái hiển vi của tế bào 51

2.2.5 Phương pháp đánh giá kiểu hình miễn dịch bằng FCM 52

2.2.6 Phương pháp biệt hóa thành tế bào mỡ 54

2.2.7 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 55

2.2.8 Phương pháp qRT-PCR (RT-qPCR) 56

2.2.9 Quy trình biệt hoá mADSCs thành tế bào giống tế bào gan 57

2.2.10 Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tế bào (ICC) 58

2.2.11 Phương pháp nhuộm PAS (Periodic acid-Schiff) 59

2.2.12 Quy trình cho chuột uống CCl4 60

2.2.13 Quy trình thu nhận máu và huyết tương 61

2.2.14 Quy trình định lượng AST, ALT (phụ lục) 62

2.2.15 Quy trình định lượng albumin (theo hướng dẫn của nhà sản xuất Bioassay Systems, USA, phụ lục) 62

2.2.16 Quy trình xét nghiệm bilirubin trực tiếp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Bioassay Systems, USA, phụ lục) 62

2.2.17 Phương pháp đánh giá mô học 62

2.2.18 Phương pháp hoá mô miễn dịch 63

2.2.19 Quy trình đọc chỉ số viêm/xơ gan theo Ishak Nodell (HAI modified) 64

2.2.20 Phương pháp đánh dấu tế bào bằng 5-6 Carboxyflourescein Diacetate (CFDA) 66

2.2.21 Quy trình cấy ghép tế bào vào tĩnh mạch 67

2.2.22 Phương pháp thu nhận huyết tương giàu tiểu cầu (PRP – Platelet Rich Plasma) 68

2.2.23 Quy trình chuẩn bị dịch chiết gan xơ 68

2.2.24 Phương pháp định lượng protein bằng thuốc thử Bradford 71

2.2.25 Quy trình điện di protein SDS-PAGE 72

2.2.26 Phương pháp đánh giá độc tính của dịch chiết trên tế bào bằng hoá chất MTT 73

2.2.27 Quy trình cảm ứng dịch chiết lên mADSCs 75

2.2.28 Phương pháp theo dõi tế bào sau ghép 76

2.2.29 Phương pháp đánh giá sự ức chế tế bào viêm của chuột sau khi ghép mADSCs 76

2.2.30 Phương pháp đánh giá sự thay đổi các gen liên quan đến khả năng tan xơ của mADSCs 77

2.2.31 Đánh giá khả năng biệt hoá của mADSCs trong cơ thể chuột nhắt xơ gan 78

2.2.32 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Trypan Blue 78

2.2.33 Các phần mềm xử lý số liệu 79

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 80

3.1 Kết quả nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và xác định đặc điểm của của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột nhắt 80

3.1.1 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột nhắt xơ gan do CCl4 80

3.1.2 Đánh giá kiểu hình miễn dịch, khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ của mADSCs 82 3.1.3 Kết quả đánh giá khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ 83

3.2 Kết quả nội dung 2: Nghiên cứu tiềm năng của ADSCs trong trị liệu bệnh gan thông qua đánh giá sự biểu hiện gen liên quan đến dòng tế bào gan và khả năng biệt hoá thành tế bào gan in vitro của mADSCs 85

3.2.1 Kết quả đánh giá sự biểu hiện các gen ở mức độ phiên mã liên quan đến gan như: HGF, HNF4α, CK18, CK19, c-met, CYP1A1, ALB, AFP và SDF-1 của mADSCs P3 85 3.2.2 Thử nghiệm cảm ứng mADSCs thành tế bào gan sử dụng môi trường bổ sung yếu tố tăng trưởng và các chất cảm ứng khác 88

3.3 Kết quả nội dung 3: Nghiên cứu gây tạo mô hình chuột nhắt xơ gan bằng hoá chất carbon tetraclorua (CCl4) 93

3.3.1 Kết quả khảo sát liều CCl4 94 3.3.2 Kết quả gây tạo mô hình xơ gan với liều CCl4 đã chuẩn hoá 98

3.4 Kết quả nội dung 4: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm xơ gan trên chuột nhắt bằng liệu pháp cấy ghép tế bào gốc 104

3.4.2.1 Cấy ghép mADSCs cải thiện giảm mức độ hoại tử tế bào gan (cải thiện chỉ số AST và ALT) 105 3.4.2.2 Cấy ghép mADSCs cải thiện chức năng gan (cải thiện chỉ số albumin và bilirubin trực tiếp) 106 3.4.2.3 Cấy ghép mADSCs cải thiện mức độ biểu hiện các gen liên quan đến sự

xơ hoá 107

3.4.2.4 Cấy ghép mADSCs giúp phục hồi cấu trúc mô học và chỉ số xơ gan 108 3.4.2.5 Cấy ghép mADSCs/PRP giảm biểu hiện protein liên quan đến xơ gan như collagen type I và sma-anfa 110

3.5 Kết quả nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá vai trò của tế bào gốc mô mỡ trong trị liệu xơ gan 116

3.5.1 Đánh giá ở mức độ in vitro 117

3.5.2 Đánh giá ở mức độ in vivo 122

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 131

Kết luận 131

Kiến nghị 132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 133

Công bố chính liên quan đến đề tài 133

Các công bố khác có liên quan 134

TÀI LIỆU THAM KHẢO 135

PHỤ LỤC 167

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AAT Anfa- antitrypsin

ALT Alanine transaminase

AST Aspartate aminotransferase

bFGF

Basic Fibroblast Growth Factor

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi CCl4 Carbon tetraclorua

CFDA 5-6 Carboxyfluorecein Diacetate

CK18 Cytokeratin 18

CK19 Cytokeratin 19

EMT Epithelial menchymal transition Chuyển dạng biểu mô-

bào gan HNF Hepatocyte Nuclear Factor Yếu tố nhân tế bào gan

ICAM InterCellular Adhesion Molecule Phân tử kết dính liên

tế bào

LSEC Liver sinusoidal endothelial cells Tế bào nội mô xoang

OLT Orthotopic Liver Transplantation Ghép gan

PDGF Platelet derived growth factor Yếu tố tăng trưởng từ

tiểu cầu

PRP

Platelet rich plasma

Huyết tương giàu tiểu cầu

SDF-1 Stromal cell-derived factor 1 Yếu tố từ tế bào nền

STAT-3 Signal transducer and activator of

transcription 3

TGF Transforming Growth Factor Yếu tố tăng trưởng

chuyển dạng TIMP Tissue Inhibitor Metalloproteinase

VEGF Vascular endothelial growth factor Yếu tố tăng trưởng nội

mô mạch máu α-SMA Alpha-Smooth Muscle Actin

DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Bảng 1 1 Các nguyên nhân gây xơ gan 5

Bảng 1 2 Các thành phần miễn dịch liên quan đến xơ gan 15

Bảng 1 3 Tóm tắt các hệ thống tính điểm xơ gan 22

Bảng 1 4 Chỉ số MELD và tiên lượng thời gian sống của bệnh nhân 23

Bảng 1 5 Hệ thống tính điểm số Child-Pugh trong bệnh gan 25

Bảng 1 6 Phân độ xơ gan theo điểm số Child-Pugh 25

Bảng 1 7 Tỷ lệ tử vong liên quan đến phẫu thuật trên bệnh nhân xơ gan 26

Bảng 1 8 Tổng hợp các nghiên cứu điều trị xơ gan trên động vật bằng tế bào gốc trung mô 33

Bảng 1 9 Một số thử nghiệm lâm sàng điều trị xơ gan bằng tế bào gốc trung mô 35 Bảng 2 1 Thiết bị sử dụng trong đề tài (phụ lục) 42

Bảng 2 2 Dụng cụ sử dụng trong đề tài (phụ lục) 42

Bảng 2 3 Danh mục kháng thể sử dụng trong đề tài 43

Bảng 2 4 Danh mục các gen sử dụng trong đề tài (xem thêm ở phụ lục) 45

Bảng 3 1 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột xơ gan 80

Bảng 3 2 Tổng kết phần trăm biểu hiện marker của mADSCs ở các thế hệ 82

Bảng 3 3 Kết quả phân tích các protein liên quan đến tế bào gan trên dòng mADSCs P3 86

Bảng 3 4 Tỷ lệ phần trăm chuột sống ở các liều CCl4 tại thời điểm tuần 0, tuần 8 94

Bảng 3 5 Mức độ viêm và xơ gan được đọc theo hệ thống tính điểm Knodell-Ishak 97

Bảng 3 6 Chỉ số các loại men gan trên nhóm đối chứng và nhóm mô hình 98

Bảng 3 7 Tổng kết quả chỉ tiêu của mô hình chuột xơ gan do CCl4 (1ml/kg) 101

Bảng 3 8 Đánh giá mức độ viêm và xơ theo hệ thống tính điểm HAI 110

Biểu đồ 1 1 Tỷ lệ tử vong do xơ gan từ 1980 đến 2010 7

Biểu đồ 1 2 Tỷ lệ tử vong chuẩn hoá theo tuổi do xơ gan ở các nước Châu Âu 8

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Tế bào gan và tế bào xoang mạch trong gan bình thường và gan tổn

thương 4

Hình 1 2 Khởi sự và duy trì sự xơ hoá gan 10

Hình 1 3 Sự hoạt hoá tế bào hình sao 11

Hình 1 4 Nguồn gốc của nguyên bào sợi cơ 14

Hình 1 5 Con đường truyền tín hiệu TGF-beta trong xơ gan 18

Hình 1 6 Vai trò của NF-κB trong hoạt hoá và duy trì tế bào hình sao 19

Hình 1 7 Sơ đồ kiểm soát biến chứng xơ gan 24

Hình 1 8 Các hướng tiếp cận thay thế tế bào gan bằng liệu pháp tế bào/tế bào gốc 29

Hình 1 9 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ sau 35 ngày biệt hoá thành tế bào gan (mũi tên đen) 31

Hình 1 10 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ - nguồn tế bào cho điều trị bệnh gan 32

Hình 1 11 Cơ chế di cư của tế bào gốc trung mô 41

Hình 2 1 Sơ đồ mô phỏng phương thức hoạt động của máy FCM 53

Hình 2 2 Sự phân tách các pha sau tách chiết bằng Easy Blue 56

Hình 2 3 Thao tác cho chuột uống CCl4 60

Hình 2 4 Thao tác lấy máu má chuột nhắt 61

Hình 2 5 Cấu trúc phân tử của thuốc nhuộm MTT và sản phẩm formazan 74

Hình 3 1 Hình thái tế bào sau nuôi cấy 81

Hình 3 2 Hình ảnh phân tích FCM trên mADSCs ở các thế hệ tế bào thứ 5 82

Hình 3 3 mADSCs sau 21 ngày biệt hoá thành tế bào mỡ 83

Hình 3 4 Kết quả đánh giá sự biểu hiện các protein liên quan đến tế bào gan 86

Hình 3 5 Kết quả phân tích FCM các marker liên quan đến tế bào gan trên mADSCs 87

Hình 3 6 Sự thay đổi hình dạng của mADSCs khi nuôi trong môi trường biệt hoá gan 88

Hình 3 7 Kết quả nhuộm kháng thể kháng AAT sau biệt hoá bằng hoá chất 89

Hình 3 8 Kết quả nhuộm kháng thể kháng ALB sau biệt hoá bằng hoá chất 90

Hình 3 9 Kết quả nhuộm PAS sau 21 ngày cảm ứng, sử dụng HepG2 là chứng dương và mADSCs nuôi trong môi trường bổ sung nhân tố biệt hoá làm chứng âm 91

Hình 3 10 Kết quả sự thay đổi khối lượng chuột 94

Hình 3 11 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR 96

Hình 3 12 Kết quả nhuộm H&E 97

Hình 3 13 Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện các gen xơ hoá giữa nhóm mô hình và nhóm đối chứng 99

Hình 3 14 Kết quả nhuộm mô bằng H&E và Masson Trichrom 100

Hình 3 15 Kết quả nhuộm collagen trên nhóm đối chứng, nhóm uống dầu olive và nhóm chuột uống CCl4 101

Hình 3 16 Kết quả nhuộm sma-anfa trên nhóm đối chứng, nhóm uống dầu olive và nhóm chuột uống CCl4 101

Hình 3 17 Kết quả chỉ số AST, ALT ở các thời điểm điều trị 7 và 21 ngày sau ghép mADSCs 105

Hình 3 18 Kết quả chỉ số Bilirubin và Albumin ở các thời điểm điều trị 7 và 21 ngày sau ghép mADSCs 107

Hình 3 19 Kết quả biểu các gen liên quan đến xơ hoá sau 21 ngày cấy ghép mADSCs 108

Hình 3 20 Kết quả nhuộm H&E sau 21 ngày cấy ghép tế bào 109

Hình 3 21 Kết quả nhuộm Massion Trichrome sau 21 ngày cấy ghép tế bào 110

Hình 3 22 Kết quả nhuộm kháng thể collagen sau 21 ngày cấy ghép tế bào 111

Hình 3 23 Kết quả định lượng phần trăm diện tích mô gan dương tính với collagen I sau 21 ngày ghép mADSCs 111

Hình 3 24 Kết quả nhuộm kháng thể sma-anfa sau 21 ngày cấy ghép tế bào 112

Hình 3 25 Điện di dịch chiết bằng phương pháp SDS-PAGE 118 Hình 3 26 Kết quả khảo sát tác động của các nồng độ dịch chiết trên mADSCs 118

Hình 3 27 Sự thay đổi hình dạng của mADSCs khi nuôi trong môi trường biệt hoá

gan 120

Hình 3 28 Kết quả nhuộm kháng thể AAT và ALB sau 14 và 21 ngày cảm ứng trong môi trường bổ sung dịch chiết 121

Hình 3 29 Kết quả nhuộm PAS sau 21 ngày cảm ứng dịch chiết 122

Hình 3 30 Kết quả phân tích FCM tế bào dương tính CFDA 123

Hình 3 31 Kết quả nhuộm IHC mô gan sau 21 ngày cấy ghép 123

Hình 3 32 Kết quả sự thay đổi thành phần bạch cầu tại các thời điểm sau ghép mADSCs 124

Hình 3 33 Kết quả phân tích biểu hiện gen tan xơ sau 7 và 21 ngày cấy ghép mADSCs 125

Hình 3 34 Kết quả đánh giá sự biểu hiện marker tế bào gan của các tế bào mADSCs sau ghép 7 ngày 126

Hình 3 35 Kết quả nhuộm kháng thể AAT và ALB mô gan chuột sau 21 ngày cấy ghép 126

Hình 3 36 Tế bào mADSCs/GFP khi nuôi cấy thứ cấp và tại các thời điểm 1,2,4 tuần sau khi ghép lên mô hình chuột xơ gan cảm ứng bởi CCl4 127

MỞ ĐẦU

Gan là cơ quan có khả năng tái sinh nhưng trong các trường hợp tổn thương mạn tính khả năng tự tái tạo của gan mất dần và sau đó dẫn đến tình trạng xơ hóa Hiện nay, xơ gan được xếp vào danh sách 25 căn bệnh gây tử vong cao nhất trên toàn thế giới Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến tiến trình hình thành xơ gan mạn tính gồm: viêm gan do virus, rượu, hiện tượng ứ mật, hóa chất độc Trong đó, HBV là nguyên nhân gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao nhất, lên đến 4,8/10.0000 người [158, 164] Việt Nam là nước có tỷ lệ viêm gan và xơ gan rất cao (~20%) so với nhiều nước trên thế giới Các biện pháp điều trị xơ gan hiện tại chưa thực sự mang lại kết quả như mong đợi

Hiện nay, ghép gan được cho là phương pháp điều trị hiệu quả và là lựa chọn tốt nhất cho các bệnh nhân mắc bệnh gan giai đoạn cuối Trong hầu hết các nghiên cứu lâm sàng về hiệu quả của ghép gan trong nhiều năm, ở nhiều vùng trên thế giới,

tỉ lệ bệnh nhân sống sau một năm dao động từ 70% đến 90%, tỉ lệ bệnh nhân sống sau 5 năm, 10 năm tương ứng là >80% và >60% [5, 44, 45, 220] Rào cản lớn nhất của ghép gan là sự khan hiếm nguồn tạng Ngoài ra, ghép gan trên bệnh nhân xơ gan có nhiều rủi ro liên quan đến quá trình phẫu thuật

Với các kiến thức nền tảng và chuyên sâu về tế bào gốc và y học tái tạo, các nhà khoa học có thể đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc trong tái tạo mô gan ở các bệnh nhân xơ gan Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, có thể ghép tự thân, vượt qua rào cản về đạo lí Nhiều

nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng trên thế giới, in vitro lẫn in vivo trong đánh

giá hiệu quả và vai trò của tế bào gốc khi ghép lên cá thể bị xơ gan đã cho thấy những phát hiện đáng chú ý về hiệu quả và vai trò của tế bào gốc, như khả năng di

cư đến vị trí gan tổn thương [122, 161, 165, 255], khả năng biệt hóa thành các tế bào chức năng của gan để thay thế các tế bào đã mất [19, 29, 48, 100, 115, 121,

155, 236, 248], khả năng kích thích sự tăng sinh tế bào gan [231], khả năng điều biến hệ thống miễn dịch của cơ thể [235], và khả năng tăng cường hay giảm biểu hiện của các gen chức năng trong quá trình tái tạo gan tổn thương

Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về liệu pháp tế bào gốc trong điều trị

xơ gan, do đó việc phát triển liệu pháp mới ứng dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan là rất cấp thiết và sẽ mở ra hướng mới trong điều trị xơ gan nói riêng và các bệnh về thoái hoá tế bào nói chung

Mô hình gây xơ gan trên động vật bằng CCl4 là mô hình kinh điển đã được nghiên cứu nhiều, do vậy các kết quả thử nghiệm trên động vật xơ gan có độ tin cậy cao Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ là một ứng cử viên giàu tiềm năng và gần đây được quan tâm nghiên cứu nhằm hướng tới liệu pháp ghép tế bào tự thân Từ cơ sở

phân tích và nhận định, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc” nhằm đánh giá hiệu quả và vai trò điều trị của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ

tự thân trên mô hình chuột nhắt xơ gan

Mục tiêu đề tài

Mục tiêu chung:

Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan do CCl4 trên chuột nhắt bằng cấy ghép

tế bào gốc mô mỡ tự thân qua đường tĩnh mạch ngoại vi

Mục tiêu cụ thể:

- Thu nhận được tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột nhắt xơ gan

- Gây tạo được mô hình bệnh xơ gan trên chuột bằng CCl4

- Phân tích và đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm của tế bào gốc mô mỡ trên chuột nhắt bệnh xơ gan

- Phân tích và đánh giá vai trò điều trị của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ trên

mô hình chuột nhắt thực nghiệm

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng chính được sử dụng trong đề tài này là chuột nhắt xơ gan do CCl4

và tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột tự thân

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và xác định đặc điểm của tế bào gốc trung

mô từ mô mỡ chuột nhắt (mADSCs)

Nội dung 2: Nghiên cứu tiềm năng của mADSCs trong trị liệu bệnh gan thông qua đánh giá sự biểu hiện gen liên quan đến dòng tế bào gan và khả năng biệt hoá thành

tế bào gan in vitro của mADSCs

Nội dung 3: Nghiên cứu gây tạo mô hình chuột nhắt xơ gan bằng hoá chất carbon tetraclorua (CCl4)

Nội dung 4: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm xơ gan trên chuột nhắt bằng liệu pháp cấy ghép tế bào gốc

Nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá vai trò của tế bào gốc mô mỡ trong trị liệu xơ gan thực nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Định nghĩa

Tên gọi: Xơ gan - tên Hy lạp là “kirrhose” có nghĩa là gan bị xơ, được Laennec đặt

ra từ năm 1819 khi mô tả tổn thương gan do nghiện rượu lâu ngày Từ đó bệnh được mang tên ông gọi là xơ gan Laennec

Mặc dù có rất nhiều nguyên nhân gây bệnh gan mạn tínhnhư tổn thương của các tế bào gan (do rượu, hóa chất, viêm gan siêu vi, vv), tổn thương ống dẫn mật, bệnh tự miễn dịch/bệnh di truyền và rối loạn chức năng trao đổi chất Do đó tùy theo nguyên nhân mà bệnh cảnh xơ gan, ngoài các triệu chứng chung của nó, có thể kèm theo các biểu hiện lâm sàng khác đặc trưng cho nguyên nhân gây bệnh

Hình 1 1 Tế bào gan và tế bào xoang mạch trong gan bình thường và gan tổn

thương [188]

Tổn thương gan gây ra sự hình thành nốt sần, và khuếch tán xơ hóa hay mô sẹo Xơ gan dẫn đến giảm chức năng gan và nguy cơ ung thư gan [64, 215] Các tổn thương này đưa đến hoại tử tế bào gan, làm xẹp khung lưới nâng đỡ của gan từ đó dẫn đến

sự lắng đọng của các tổ chức liên kết, các sàn mạch máu trong gan trở nên ngoằn ngoèo khúc khuỷu, các nhu mô gan còn sót lại phát sinh thành từng nốt [71] Xơ gan được đặc trưng bởi tình trạng viêm hoại tử và được cảm ứng bởi các tế bào

Kupffer và sự hoạt hóa các tế bào hình sao Tế bào Kupffer và tế bào hình sao là hai loại tế bào chính gây ra sự thoái hóa của mô gan [71]

1.1.2 Bệnh nguyên

Bệnh xơ gan là bệnh không thể phục hồi vì các cấu trúc trong gan đã bị biến đổi Biến chứng tồi tệ nhất của xơ gan là ung thư tế bào gan (carcinom tế bào gan) (HCC-Hepatocellular carcinoma), một trong những loại ung thư gây tử vong nhiều nhất trên người Giai đoạn đầu của xơ gan là do sự tổn thương các tế bào gan bởi một tác nhân nào đó, làm cho tế bào gan chết đi và được thay thế bằng các tế bào gan mới thông qua quá trình tự tái sinh của gan Theo thời gian, các tổn thương này không được sửa chữa và tái tạo đủ về chất và lượng sẽ dẫn đến sự thay đổi hình thái của gan và gây nên xơ gan [2, 64, 152, 215]

Xơ gan là căn bệnh chủ yếu xuất hiện ở người trưởng thành và người lớn tuổi Một

tỷ lệ nhỏ bệnh xơ gan cũng được ghi nhận ở trẻ em Phần lớn các trường hợp xơ gan

ở người lớn liên quan đến các tác nhân môi trường bên ngoài Do vậy, các nguyên nhân/căn nguyên của xơ gan là có thể phòng ngừa được Xác định nguyên nhân của

xơ gan rất quan trọng không chỉ cho phác đồ điều trị trên bệnh nhân mà còn cho việc lập kế hoạch phòng ngừa Các nguyên nhân gây xơ gan được tóm tắt trong Bảng 1.1

Bảng 1 1 Các nguyên nhân gây xơ gan [152]

Người lớn

Bệnh thiết huyết tố di truyền Thiếu hụt Alpha-1-Antitrypsin Virus viêm gan B (HBV- Hepatitis B

(NAFLD – Nonalcoholic Fatty liver

disease)

Virus viêm gan B/C và rượu Virus viêm gan B/C và NAFLD Bệnh liên quan đến đường ống mật

trong gan

Xơ ống mật sơ cấp (PBC - Primary

biliary cirrhosis)

Viêm xơ chai đường mật nguyên phát

(PSC - primary sclerosing cholangitis)

Thuốc (Méthotrexate, maleate de

perhexilene, methyl dopa, thuốc ngừa

thai, oxyphenisatin, izoniazide), hoá

chất, độc tố sinh học

Bệnh gan tự miễn (AILD – Auto

immune liver disease)

Crytogenic (căn nguyên ẩn)

Nhiễm ký sinh trùng, bệnh tim*

Trẻ em

glycogen

Đồng trong huyết thanh tăng **

* Hầu hết các trường hợp ghi nhận là xơ hoá (fibrosis) nhưng không chắc chắn tiến triển thành chai gan/xơ gan (cirrhosis)

** Xơ gan ở trẻ em Ấn Độ và các bệnh tương tự

Theo thống kê, khoảng 57% trường hợp xơ gan là do nhiễm các loại virus viêm gan như HBV và HCV [175]

năm 2010 [16] Trong năm 2010, bệnh xơ gan được xếp hạng là nguyên nhân thứ

23 của gánh nặng bệnh tật trên toàn thế giới [16, 164]

Biểu đồ 1 1 Tỷ lệ tử vong do xơ gan từ 1980 đến 2010 (Mokdad et al BMC

Medicine 2014 12:145 doi:10.1186/s12916-014-0145-y)

Ở Mỹ, xơ gan chiếm khoảng 0,27%, tương ứng với 633.323 người trưởng thành, 69% trong số này nói rằng họ không biết họ bị bệnh Tỷ lệ mắc cao hơn ở người da đen và người Mỹ gốc Mexico, những người sống dưới mức nghèo đói, và những người có trình độ văn hoá dưới phổ thông trung học Bệnh đái tháo đường, nghiện rượu, viêm gan C và B, đồng tính nam, và tuổi già đều có liên quan đến xơ gan, với phân bổ là 53,5% do viêm gan siêu vi (chủ yếu là viêm gan C), còn lại là liên quan đến bệnh tiểu đường, và lạm dụng rượu Tỷ lệ tử vong là 26,4% mỗi 2 năm [201]

Ở Châu Âu, xơ gan và ung thư gan nguyên phát là gánh nặng bệnh tật trong các bệnh về gan Khoảng 0,1% nam giới Hungary chết vì xơ gan mỗi năm so với 0,001% nữ giới Hy Lạp Lạm dụng rượu, virus viêm gan B, C và rối loạn trao đổi chất liên quan đến thừa cân và béo phì là nguyên nhân hàng đầu của bệnh xơ gan và ung thư gan nguyên phát ở Châu Âu Viêm gan B ảnh hưởng đến 0,5-0,7% dân số châu Âu Trong thập kỷ qua, tỷ lệ mắc bệnh viêm gan C mạn tínhlà 0,13-3,26% Khoảng 90% người bị nhiễm viêm gan siêu vi không biết tình trạng bệnh của họ

Biểu đồ 1 2 Tỷ lệ tử vong chuẩn hoá theo tuổi do xơ gan ở các nước Châu Âu [42]

Dữ liệu hiện có cho thấy tỷ lệ mắc NAFLD trong dân số của Châu Âu (bao gồm cả trẻ em béo phì) là 2-44% và 42,6-69,5% ở những người bị bệnh đái tháo đườngtype

2 [42] Theo báo cáo của WHO, tử vong do xơ gan chiếm 1,8% trong tất cả các trường hợp tử vong ở Châu Âu (170.000 ca tử vong mỗi năm) với tỷ lệ cao nhất là ở phía Đông Nam và Đông Bắc Châu Âu [253] Tuy nhiên, ở một số quốc gia Châu

Âu (ví dụ như Vương quốc Anh và Ireland) tử vong liên quan đến xơ gan đã tăng lên trong mười năm qua Ở Châu Âu, rượu được xem là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh xơ gan [185] Tuy nhiên, nhiễm trùng do viêm gan B và C virus (HBV và HCV) cũng là yếu tố quyết định quan trọng gây nên xơ gan

Ở Châu Á, tỷ lệ tử vong do xơ gan tương đối cao ở các nước Trung Á, đặc biệt là Mông Cổ, Uzbekistan và Kyrgyzstan Tỷ lệ tử vong chuẩn hoá theo tuổi (trên 100.000 dân) thống kê từ 1980 đến 2010 ở các khu vực của Châu Á lần lượt như sau: (1) Trung Á tăng từ 26,3% lên 33,7%; (2) Đông Á (Trung Quốc, Hàn Quốc, Triều Tiên và Đài Loan) giảm từ 21,2% xuống 8,2%; (3) Nam Á tăng từ 18,8% lên 21,3%; (4) Đông Nam Á gần như ít thay đổi (khoảng 21-22%) [16]

Tại Việt Nam, theo thống kê của WHO năm 2012, tỷ lệ tử vong chuẩn hoá theo tuổi

do xơ gan gây ra ở nam giới là 39,3% và 9,2% ở nữ giới (thống kê trên 100.000 dân) Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính cao nhất thế giới [73] Trong một nghiên cứu lớn gần đây, kết quả xét nghiệm máu từ tất cả các

bệnh nhân đến 12 bệnh viện lớn tại Việt Nam giai đoạn 2005-2008 (không bao gồm các bệnh nhân thuộc nhóm "nguy cơ cao" nhiễm HBV, HCV và HIV) cho thấy có 12% bệnh nhân dương tính với HBV (HBsAg+) Bởi vì không có chỉ định điều trị

và kiểm soát HBV mạn tính nên nguy cơ tiến triển thành xơ gan và ung thư gan trên nhóm này là từ 25-30% Tương tự cho HCV mạn tính, khoảng 25% người có HCV mạn tính sẽ tiến triển thành xơ gan [73]

1.2 Xơ gan: từ cơ chế đến điều trị

Giai đoạn cuối của sự xơ hoá có thể dẫn đến ung thư tế bào gan, tăng áp lực tĩnh mạch cửa, suy thận, phổi và dẫn đến tử vong Xơ gan thường là hậu quả của các bệnh gan mạn tính như viêm gan mạn, bệnh gan do rượu hoặc không do rượu, các bệnh tự miễn và bệnh liên quan đến sự biến dưỡng Cơ chế của sự xơ hoá trong hầu hết các trường hợp đều có nhiều điểm tương đồng nhưng khác nhau về cơ chế chi tiết bên trong

Một đặc điểm quan trọng của xơ gan là sự kích hoạt và gia tăng của các nguyên bào sợi và tế bào hình sao Tế bào hình sao là tế bào lưu trữ vitamin A và cư trú trong khoảng Disse Tổn thương gan mạn tính dẫn đến sự hoạt hóa các tế bào hình sao, các tế bào này co lại và sản xuất các thành phần chất nền ngoại bào và tiết ra các cytokine tiền viêm và chemokine như yếu tố tăng trưởng chuyển dạng ß (TGF ß)

Sự kích hoạt các tế bào này được cho là yếu tố quan trọng trong cơ chế phát sinh xơ hoá ở gan [67] Sự hoạt hóa tế bào hình sao phụ thuộc vào tín hiệu của tế bào Kupffer, các tế bào nội mô, tế bào gan, và tiểu cầu (Hình 1.2) Trong gan, sự lắng đọng của chất nền ngoại bào là đối ngược với quá trình phân giải các protein này Ở bệnh nhân xơ gan tiến triển, sự mất căng bằng này theo hướng tích luỹ chất nền ngoại bào Metalloproteinase và các chất điều hoà của nó (các chất ức chế mô của metalloproteinase, TIMPs) điều khiển sự lắng đọng và suy thoái của chất nền ngoại bào Trong cơ chế phát sinh xơ hoá ở gan, TIMP-1 cũng được sản xuất bởi các tế bào hình sao (Hình 1.2) [215]

Hình 1 2 Khởi sự và duy trì sự xơ hoá gan [193]

1.2.1 Yếu tố tế bào góp phần gây nên xơ gan

Gan được tạo thành bởi tế bào nhu mô gan và các tế bào khác Thành xoang mạch gan gồm 3 loại tế bào là: tế bào nội mô xoang mạch (Liver sinusoidal endothelial cells - LSECs), tế bào Kupffer (Kupffer cells- KCs) và tế bào hình sao (HSCs) Tế bào nhu mô gan và các tế bào không phải là tế bào nhu mô đều tham gia vào quá trình tiến triển của xơ gan [259]

a) Tế bào hình sao – HSCs [188]

Dưới tác động của các cytokine như yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGF-β), yếu tố hoại tử khối u (TNF-α) và interleukin 1 (IL-1), HSCs bị kích thích từ dạng bất hoạt thành dạng được hoạt hoá Sự hoạt hoá của HSCs đóng vai trò rất quan trọng trong khởi đầu và tiến triển của xơ gan và góp phần gây nên sự tích luỹ collagen Sự hoạt hoá của HSCs được xác định bởi sự tăng sinh, sự chuyển HSCs thành nguyên bào sợi cơ (myofibroblast), và quá trình tạo ra lượng lớn phân tử collagen và các chất nền ngoại bào khác dẫn đến xơ gan (Hình 1.3) [259]

Hình 1 3 Sự hoạt hoá tế bào hình sao [188]

b) Tế bào nội mô xoang mạch - LSECs [259]

Các tế bào này tạo thành các lỗ trên lớp nội mô để giúp cho sự trao đổi chất (như đã trình bày ở trên) Tuy nhiên, trong các trường hợp viêm gan mạn tính do rượu thì thành mạch có thể mất đi các lỗ này và dẫn đến các tổn thương ở gan Trong trường hợp xơ gan, sự mất các lỗ ở nội mô xoang mạch là hiện tượng thường thấy Việc mất các lỗ và sự mao mạch hoá của nội mô gan được cho là nguyên nhân quan trọng khởi phát sự xơ hoá ngoài mao mạch liên quan đến sự thay đổi con đường biến dưỡng retinol [259] Các nghiên cứu cho thấy thiếu hụt retinol có thể dẫn đến hoạt hoá và chuyển HSCs thành nguyên bào sợi cơ, từ đó làm tăng tiết chất nền ngoại bào và dẫn đến xơ gan Các nghiên cứu trên người và động vật cho thấy LSECs tiết ra IL-33 để hoạt hoá HSCs dẫn đến xơ gan [143] Việc mất lỗ và mao mạch hoá của LSECs dẫn đến sự bất thường trao đổi chất và đóng góp chính vào quá trình gây nên xơ gan Ngược lại, sự biệt hoá LSECs có thể đảo ngược quá trình hoạt hoá HSCs và làm cho HSCs trở thành dạng bất hoạt qua đó có thể ngăn chặn tiến triển của xơ gan thông qua việc sản xuất NO dưới kích thích của yếu tố tăng trưởng mạch máu (VEGF) [243, 259]

c) Tế bào Kupffper KCs [259]

Các nghiên cứu trên mô hình động vật đã chỉ ra vai trò của KCs trong nhiều bệnh lý khác nhau ở gan KCs được hoạt hoá bởi nhiều yếu tố tổn thương khác nhau như virus, rượu, chế độ ăn nhiều mỡ và sự tích luỹ sắt Các KCs hoạt hoá sẽ phá huỷ các

tế bào gan bằng cách tiết ra các yếu tố hoà tan gây độc cho tế bào thông qua quá trình trình diện kháng nguyên của KCs Phản ứng viêm gan trung gian bởi KC được cho là nguyên nhân dẫn đến tổn thương gan và xơ gan [133, 259] Ngoài ra, KCs

còn liên quan đến sự hoạt hoá HSCs và hình thành sự xơ hoá Các nghiên cứu in vitro cho thấy môi trường điều kiện của KCs có thể hoạt hoá HSCs, kích thích tổng

hợp chất nền ngoại bào, kích thích HSCs tăng sinh và dẫn đến sự biểu hiện thụ thể PDGF trên HSCs TGF-β1 từ KCs kích thích sự tăng sinh HSCs và hình thành collagen khi nghiên cứu trên mô hình chuột có chế độ ăn giàu béo và rượu Sự tích

tụ quá nhiều sắt làm cho KCs kích thích tế bào gan biểu hiện nhiều phân tử bám dính xuyên màng (ICAM-1) và từ đó tạo điều kiện cho quá trình hoạt hoá HSCs và tích luỹ collagen trong mô gan Sự hoạt hoá KCs dẫn đến tiết ra các enzyme phân huỷ gelatin (gelatinase) điều này gia tăng sự thay đổi kiểu hình HSCs do sự phân huỷ collagen type IV Sự chết theo chương trình của KCs sản sinh ra các phối tử gây chết tế bào như Fas ligand và TNF-α, từ đó làm gia tăng phản ứng viêm và sự

xơ hoá Ngoài ra, sự hoạt hoá KCs thông qua β-glucan gây nên trình trạng tăng áp lực tĩnh mạch cửa do việc giải phóng nhiều thromboxane A2 trong gan [216]

d) Tế bào gan [259]

Tế bào gan là tế bào đích của nhiều tác nhân gây bệnh như virus viêm gan, rượu, hoá chất, và các acid mật Viêm gan mạn tính dẫn đến sự apotosis trên tế bào gan hoặc tăng sản sinh bù các tế bào gan Các tế bào gan tổn thương giải phóng các gốc

tự do oxy hoá (reative oxygen species-ROS), các yếu tố trung gian cho sự xơ hoá, cảm ứng HSCs và kích thích nguyên bào sợi cơ Sự chết theo chương trình ở tế bào gan góp phần gây nên phản ứng viêm và kích thích quá trình xơ hoá Nghiên cứu trên chuột tổn thương gan do CCl4 cho thấy tế bào gan góp phần gây nên xơ gan tiến triển và xơ gan giai đoạn cuối Tế bào gan là nguồn sản xuất chủ yếu các phân

tử matrix metalloproteinase (MMP-2, MMP-3 và MMP-13) và tác nhân ức chế matrix metalloproteinase (TIMP-1 và TIMP-2), tất cả các yếu tố này đều liên quan đến cơ chế bệnh học của xơ gan trên mô hình chuột cống xơ gan do CCl4 [69] Trong giai đoạn cuối của xơ gan, các tế bào gan thiếu oxy chiếm chủ yếu trong gan

và là nguồn sản sinh TGF-β Gần đây, các nhà khoa học tin rằng sự ngắn dần telomere và sự lão hoá tế bào gan có thể là kết quả của việc hình thành các sẹo xơ hoá trong xơ gan

1.2.2 Cơ chế chuyển dạng biểu mô-trung mô (epithelial

mesenchymal transition-EMT) [222]

EMT là quá trình cần thiết trong sự phát triển phôi và gần đây EMT được xem như

là cơ chế di cư của tế bào ung thư và sự di căn trong ung thư EMT là quá trình mất

đi các đặc điểm của tế bào biểu mô (E-cadherin) và mang các đặc điểm của tế bào trung mô (vimentin và fibronectin) Dựa theo kết quả nghiên cứu các quá trình sinh học, EMT được chia thành 3 kiểu phụ: EMT type 1 xảy ra trong quá trình phát triển của phôi; EMT type II cảm ứng sự thay đổi trong xơ hoá cơ quan hay chữa lành tổn thương, liên quan đến sự sản sinh ECM và các đặc tính của mô cơ; ECM type III liên quan đến sự di cư của tế bào ung thư

Hình 1 4 Nguồn gốc của nguyên bào sợi cơ ( cơ chế chưa rõ; đã

rõ cơ chế) [222]

Bằng chứng về mối liên hệ giữa EMT và xơ hoá được đề cập trong một nghiên cứu

ở thận Nghiên cứu in vitro cho thấy các tế bào biểu mô ống thận có xảy ra hiện

tượng EMT Hiện tại, nguồn gốc của các nguyên bào sợi cơ trong xơ gan vẫn còn là chủ đề gây tranh luận, nhiều nhà khoa học cho rằng ngoài HSCs thì cơ chế EMT cũng có thể góp phần tạo ra các nguyên bào sợi cơ trong xơ gan (Hình 1.4) Các bằng chứng trong nghiên cứu đã củng cố cho quan điểm này đó là sự biểu hiện α-SMA trên tế bào tiền thân biểu mô gan [208] Kaimori và cs [13] đã chỉ ra rằng các

tế bào gan vừa phân lập có thể chuyển thành tế bào trung mô trong điều kiện in vitro EMT trên tế bào gan đặc trưng bởi sự giảm biểu hiện E-cadherin và tăng biểu

hiện các marker trung mô (vimentin và collagen type I) Nghiên cứu trên mô hình chuột xơ gan do CCl4 cho thấy 45% tế bào gan biểu hiện protein đặc trưng của tế bào trung mô (FSP-1) và β-galactosidase Các kết quả nghiên cứu cho thấy sự EMT trên tế bào gan nhiều hơn khi có sự hiện diện của TGF-β1 trong xơ gan Cơ chế

chuyển thành tế bào trung mô; 2 Tế bào trung mô chuyển thành nguyên bào sợi cơ [145]

1.2.3 Yếu tố miễn dịch trong cơ chế phát sinh xơ gan

Bảng 1 2 Các thành phần miễn dịch liên quan đến xơ gan

Tế bào Kupffer IL-1, IL-6, TNF-α Tiết ra các yếu tố tiền viêm và

trung gian gây xơ Loại bỏ KC làm giảm xơ gan

Tế bào NK IFN-γ,

TNF- α, GM-CSF

Cảm ứng sự chết theo chương trình trên HSCs

Loại bỏ tế bào NK làm tăng xơ gan

Tế bào NKT IFN-γ, IL-4, IL-3 Gây tiến triển xơ gan thông qua

tiết cytokine tiền xơ gan type 2 Loại bỏ tế bào NKT làm giảm tổn thương và xơ gan

(dendritic cells)

IL-12, IL-10 IL-6, IFN-γ

Chất lượng và số lượng của DC thay đổi trong suốt quá trình xơ gan Tăng khả năng kích thích

NKT và HSCs Loại bỏ tế bào DC giúp giảm yếu tố trung gian gây viêm trong xơ gan

Tế bào T IL-2, IFN-γ

IL-4, IL-5, IL-6, IL-10

Th1 sản xuất các cytokine kháng xơ

Th2 sản xuất các cytokine tiền

xơ

Tế bào B IL-12, IL-8, IL-1, TNF- α Loại bỏ tế bào B giúp giảm tích

luỹ xơ gan

b) Cytokine [184]

Cytokine đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng viêm và tình trạng xơ gan Monocyte chemotactic protein 1 và RANTES kích thích phát sinh xơ hoá, IL-10 và IFN-γ lại tác động theo chiều hướng ngược lại Trong số các nhân tố tăng trưởng, TGF-β1 góp phần gây ra sự chuyển dạng các tế bào thành nguyên bào sợi cơ và kích thích sinh tổng hợp ECM PDGF là yếu tố kích thích các tế bào hình sao Endothelin-1 - một chất co mạch mạnh, kích thích phát sinh xơ hoá thông qua một loại thụ thể của nó Trong số các cytokine vận mạch, angiotensin II dường như đóng một vai trò quan trọng trong xơ hoá gan Angiotensin II là các peptide effector của

hệ thống renin-angiotensin Một số thành phần chính của hệ thống này biểu hiện cục bộ trong các trường hợp tổn thương gan mạn tính, và kích hoạt HSCs tạo ra angiotensin II Angiotensin II gây viêm gan và kích thích xơ gan bằng cách kích hoạt tăng sinh tế bào, di cư tế bào, bài tiết các cytokine tiền viêm, và tổng hợp collagen trên HSCs Những phản ứng này phần lớn là qua trung gian của ROS được tạo ra bởi một dạng không thực bào của NADPH oxidase NADPH oxidase đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng viêm trên tế bào Kupffer Sự gián đoạn hoạt động của NADPH oxidase bảo vệ chuột khỏi sự tổn thương gan nghiêm trọng sau uống rượu kéo dài và/hoặc thắt ống dẫn mật

Adipokine, là cytokine chủ yếu có nguồn gốc từ mô mỡ, điều hoà sự xơ hoá ở gan Leptin cần thiết cho hoạt hóa HSC và phát triển xơ Ngược lại, adiponectin ức chế

rõ rệt quá trình xơ hoá gan in vitro và in vivo Những hoạt động của các cytokine có

thể giải thích lý do tại sao bệnh béo phì ảnh hưởng sự phát sinh xơ gan ở bệnh nhân viêm gan C mạn tính

1.2.4 Cơ chế phân tử xơ gan

TGF-β1 đóng vai trò chính trong điều hoà sự tích luỹ ECM và điều hoà sự biểu hiện các thành phần ECM, sợi collagen, fibronectin, các protease ức chế sự phân giải ECM như PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) và TIMPs

TGF-β1 có thể khởi sự và duy trì cơ chế chuyển biệt hoá tế bào biểu mô trong cơ chế EMT bằng cách hoạt hoá các con đường truyền tín hiệu quan trọng và điều hoà

sự phiên mã trên tế bào Trong tế bào MCKII thì claudin-1, claudin-2, occluding và E-cadherin không biểu hiện trong 72 giờ xử lý với TGF-β1 Điều này gợi ý rằng sự không biểu hiện các phân tử này thông qua cơ chế không phụ thuộc Smad Ngược lại, sự không biểu hiện hoàn toàn E-cadherin và sự chuyển dạng thành tế bào trung

mô của tế bào biểu mô thì cần các tín hiệu theo cơ chế phụ thuộc Smad Con đường truyền tín hiệu phụ thuộc Smad sẽ tạo ra β-catenin/yếu tố thúc đẩy lympho (lymphoid enhancer factor-1 complex) để kích thích cơ chế EMT Hơn nữa, TGF-

β1 điều hoà tín hiệu Notch trong cơ chế EMT trên mô tuyến vú, ống thận và biểu

mô

Hình 1 5 Con đường truyền tín hiệu TGF-beta trong xơ gan [222]

b) NF-κB trong xơ gan [137]

NF-κB điều hoà sự phát sinh xơ hoá gan qua 3 con đường liên quan đến tế bào: 1 Điều hoà sự tổn thương tế bào gan, kích thích đáp ứng phát sinh xơ hoá trong gan;

2 Điều hoà tín hiệu viêm để chiêu dụ các tế bào đại thực bào và các tế bào viêm khác trong gan; 3 Điều hoà đáp ứng phát sinh xơ hoá trong HSCs Sự giảm hoạt động của NF-κB trong tế bào gan dẫn tới tăng tổn thương tế bào gan và kết quả dẫn đến xơ gan Tác động của việc tăng hoạt tính NF-κB trong xơ gan vẫn chưa được biết rõ (Hình 1.6)

Một loạt các chất trung gian tiền viêm kích hoạt NF-κB trong HSCs, bao gồm LPS, TNF, IL-1β, angiotensin II và CD40L [167] Sự kích hoạt NF-κB hầu như chỉ tìm thấy trong HSCs /nguyên bào sợi cơ trong khi NF-κB hoạt động rất ít trong tế bào gan [167] Tương tự, con đường truyền tín hiệu c-Jun /JNK [110] cho thấy rằng các

tế bào này đóng vai trò quan trọng trong tình trạng viêm ở bệnh gan mạn tính và xơ

gan HSCs là một mục tiêu tác động trực tiếp của các yếu tố trung gian ví dụ như liposacharide Theo đó, một số gen phụ thuộc NF-κB như IL6, CXCL5, CH25H và SAA3P, được điều hoà tăng trong HSCs phân lập từ mô hình tắc ống mật được xử

lý với CCl4

Hình 1 6 Vai trò của NF-κB trong hoạt hoá và duy trì tế bào hình sao [137]

NF-κB điều hoà HSCs/nguyên bào sợi cơ thông qua các đáp ứng: hoạt hoá, khả năng sống sót và phản ứng viêm NF-κB hoạt động theo 2 con đường là xơ hoá và

chống lại sự xơ hoá (thông qua việc ức chế phiên mã gen Col1a1)

Hơn nữa, NF-κB liên quan đến giảm điều hoà miR-29 trong HSCs, dẫn đến giảm sự

ức chế collagen và các protein ECM khác trong HSCs Ngoài việc ảnh hưởng đến

sự phát sinh xơ hoá trong HSCs /nguyên bào sợi cơ, sự kích hoạt NF-κB cũng thúc đẩy sự bài tiết các chất trung gian gây viêm khác nhau từ các tế bào, bao gồm các chemokine như CCL2, CCL3, CXCL2 và CXCL5 Việc tăng tiết chemokine dẫn đến một làn sóng của các tế bào viêm trong đó có các đại thực bào

Tóm lại, sự kích hoạt của NF-κB trong HSCs /nguyên bào sợi cơ nhằm thúc đẩy xơ gan thông qua nhiều cơ chế, bao gồm cả các hiệu ứng sinh xơ hoá trực tiếp, hiệu ứng kháng sự chết theo chương trình và sự bài tiết của chemokine dẫn dụ đại thực

bào Việc kích hoạt tăng NF-κB trong HSCs /nguyên bào sợi cơ cũng có thể góp phần vào vi môi trường khối u trong gan xơ, ví dụ bằng cách sản sinh ra các cytokine và chemokine gây viêm cũng như những thay đổi về số lượng và chất lượng ECM Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện để chỉ ra vai trò của NF-κB trên HSCs /nguyên bào sợi cơ trong cơ chế phát sinh ung thư từ xơ gan [137]

1.2.5 Chẩn đoán và điều trị

1.2.5.1 Chẩn đoán

a) Phương pháp chẩn đoán không gây xâm lấn

Xét nghiệm aminotransferase huyết thanh

AST – Aspartate Transaminase (hay GOT – Glutamic-Oxaloacetic Transaminase)

và ALT – Alanine Transaminase (hay GPT – Glutamic-Pyruvic Transaminase) là các enzyme liên quan đến biến dưỡng amino acid Tuy nhiên, AST được tìm thấy ở

cơ tim, thận, tuỵ, cơ xương, hồng cầu và các mô khác; ALT được dùng trong phương pháp sàng lọc hiệu quả cho các trường hợp tổn thương gan, nhưng marker này cũng hạn chế trong chẩn đoán mức độ viêm và xơ gan Cả 2 loại enzyme này sẽ được giải phóng vào máu khi tế bào gan bị tổn thương hoặc bị chết Tuy nhiên, mức

độ aminotransferase bình thường vẫn không loại trừ trong chẩn đoán của bệnh xơ gan [3]

Nhiều nghiên cứu đã khảo sát tỷ lệ AST:ALT trong mối tương quan với xơ gan Tỷ

lệ khoảng 0,8 được ghi nhận trong các trường hợp khoẻ mạnh Trong các bệnh nhân viêm gan do rượu, tỷ lệ này thường cao hơn 2 Tuy nhiên, trong các trường hợp viêm gan mạn tiến triển xơ gan, tỷ lệ AST/ALT >1 thường được ghi nhận trong khoảng 80% trường hợp xơ gan

Xét nghiệm chức năng tổng hợp của gan

Gồm có xét nghiệm bilirubin, phosphatase kiềm, gamma glutamyl transferase (GGT)

Xét nghiệm bilirubin (sắc tố mật) gồm có bilirubin toàn phần, trực tiếp và gián tiếp Sắc tố biliburin sẽ tăng nếu xơ gan phát triển, đặc biệt ở xơ gan do tắc mật nguyên

phát

Xét nghiệm phosphatase kiềm (PK) và γ-glutamyl transpeptidase (GGT) thường bình thường, chỉ tăng cao khi bị ứ mật hoặc tắc mật PK còn tăng trong các điều kiện sinh lý (có thai, trẻ đang tăng trưởng xương) hoặc trong các bệnh lý: xương (Paget xương, huỷ xương, di căn xương), tắc ruột non GGT có nguồn gốc chủ yếu

ở gan nên xét nghiệm này rất nhạy để đánh giá chức năng bài tiết ở gan Tăng GGT thường do nghiện rượu mạn, sau khi uống các thuốc gây cảm ứng men (acetaminophen, phenytoin, ), gan nhiễm mỡ không do rượu hoặc nguyên nhân khác: suy thận, nhồi máu cơ tim, tiểu đường, hoặc không rõ nguyên nhân

Xét nghiệm albumin huyết thanh, globulin huyết thanh và thời gian đông máu Do khả năng dự trữ lớn và thời gian bán hủy dài (3 tuần) nên albumin huyết thanh chỉ giảm trong bệnh gan mạn (xơ gan) Sự giảm lượng albumin huyết thanh và thời gian đông máu kéo dài tương ứng với sự suy yếu chức năng tổng hợp của gan – thường xảy ra ở giai đoạn cuối Albumin cũng có thể thấp do thiếu dinh dưỡng Globulin huyết thanh tăng ở xơ gan và ở hầu hết những chứng rối loạn về gan.
 Xét nghiệm dựa trên dấu ấn sinh học (biomarker)

Các xét nghiệm chẩn đoán tình trạng tổn thương gan và trực tiếp cho xơ gan: các tiền chất của ECM như procollagen type III amino-terminal peptide (P3NP), procollagen type I, IV, hyaluronic acid, laminin Các enzyme điều hòa sinh tổng hợp ECM như lysyloxidase, prolyl hydroxylase, enzyme phân giải xơ như MMP9 Các phương pháp chụp hình, quan sát hình ảnh gan gồm các phương pháp đang

áp dụng rộng rãi như siêu âm, chụp CT, fibro scan, chụp MRI [66]

b) Phương pháp chẩn đoán gây xâm lấn

Sinh thiết (biopsy) gan là tiêu chuẩn vàng trong việc đánh giá tình trạng mô học gan Tuy nhiên, tỉ lệ sai sót khoảng 30% khi mẫu nhỏ, độ chính xác phụ thuộc vào

kích thước mẫu, vị trí và dụng cụ sinh thiết

Nhiều hệ thống tính điểm mô học đã được xây dựng để đánh giá mức độ viêm và mức độ xơ gan Nhiều hệ thống tính điểm phức tạp như Knodell hay Ishak thường được sử dụng trong nghiên cứu lâm sàng Đối với các mục đích chẩn đoán lâm

sàng, các hệ thống đơn giản hơn thường được sử dụng như Batts and Lugwig, METAVIR và IASL (International Association for Study of the Liver- Hiệp hội quốc tế về nghiên cứu gan) Tuy nhiên, sinh thiết còn gặp nhiều bất lợi như không cho biết cơ chế, và trở ngại lớn nhất của việc sinh thiết là gây viêm, đau và xâm lấn

Bảng 1 3 Tóm tắt các hệ thống tính điểm xơ gan

METAVIR F0, F1, F2, F3, F4 Ứng dụng trong

xơ gan do HCV

1994

đoạn trung gian

1981

Desmet & Schenuer Tương tự METAVIR Dựa theo hướng

dẫn của Đức về đánh giá xơ gan

Ngăn ngừa tiếp xúc với tác nhân gây xơ gan

Trong xơ gan do rượu, việc ngừng uống rượu sẽ giúp dừng tiến triển xơ gan Tương tự, việc ngừng dùng thuốc độc đối với gan hoặc loại bỏ chất độc ngoài môi trường sẽ dừng tiến triển xơ gan Việc điều trị các bệnh chuyển hóa, như điều trị chứng thừa sắt trong hội chứng hemochromatosis hay thừa đồng trong bệnh Wilson cũng là những liệu pháp có hiệu quả Các bệnh viêm gan B và C có thể đáp ứng với việc điều trị bằng interferon và viêm gan tự miễn với prednisone và azathioprine

(Imuran) Các loại thuốc như ursodiol (Actigall) có thể làm chậm tiến triển của xơ gan do tắc mật nguyên phát và bệnh viêm xơ chai đường mật

Kiểm soát xơ gan – Cần liệu pháp mới?

Chỉ số MELD

Trong năm 2010, một tập hợp các chỉ tiêu chất lượng để sử dụng trong công tác quản lý xơ gan được phát triển bởi hội đồng gồm 11 thành viên là các chuyên gia từ khắp nơi trên thế giới Bảng điểm đánh giá bệnh gan giai đoạn cuối (MELD) được

đề xuất nhằm tính toán thời gian sống sót của bệnh nhân (Bảng 1.4)

Nếu bệnh nhân có chỉ số MELD trên 15 sẽ được chỉ định cấy ghép gan Những bệnh nhân có chỉ số nhỏ hơn 15 nhưng có các biến chứng của xơ gan như bệnh não gan và biến chứng chảy máu cũng được chỉ định cấy ghép gan Chỉ số MELD giúp ích cho bác sĩ trong việc hỗ trợ bệnh nhân kiểm soát tình trạng bệnh Bệnh nhân xơ gan được khuyến khích xét nghiệm sàng lọc ung thư tế bào gan mỗi 6-12 tháng bằng chẩn đoán hình ảnh kết hợp với xét nghiệm α-fetoprotein (Hình 1.7)

Bảng 1 4 Chỉ số MELD và tiên lượng thời gian sống của bệnh nhân

Chỉ số MELD = 6,43 + 3,7878 ln (tổng bilirubin mg/dL) + 11,2 ln (international normalized ratio) + 9,57 ln (creatinine mg/dL)

Việc tính toán chỉ số này có thể tham khảo tại http://

www.thedrugmonitor.com/meld.html and http://www.mdcalc.com/ model-for-end-stage-liver-disease-12-and-older

Hình 1 7 Sơ đồ kiểm soát biến chứng xơ gan [214]

Hệ thống tính điểm Child - Pugh [135, 181, 214]

Bên cạnh chỉ số MELD, thang độ Child-Pugh cũng được đề xuất trong tiên lượng giai đoạn xơ gan Ngoài ra, nguy cơ phẫu thuật trong xơ gan cũng được tiên lượng dựa theo thang độ Child-Pugh

Cấy ghép gan ≥15 hoặc ≤15

có biến chứng Chỉ số MELD Xơ gan ?

Có

Chưa khẳng định

Cổ trướng Bệnh não gan

Hạn chế muối, lợi tiểu Chọc hút dịch cổ trướng

Disaccharide Rifaximin (Xifaxan)

Viêm phúc mạc do vi khuẩn

Liệu pháp kháng sinh

Sàng lọc Ung thư gan mỗi 6-12 tháng

Bảng 1 5 Hệ thống tính điểm số Child-Pugh trong bệnh gan

>2,20

Bảng 1 6 Phân độ xơ gan theo điểm số Child-Pugh

bệnh nhân sống được 1 năm (%)

Phần trăm bệnh nhân sống được 2 năm (%)

Ghép gan

Các liệu pháp hiện tại không giải quyết triệt để và chỉ duy trì trong thời gian tới khi bắt đầu xuất hiện những biến chứng như gan mất khả năng bù thì liệu pháp cuối cùng và hiệu quả nhất cho tới ngày nay là ghép gan Ghép gan là một cách chữa trị hiệu quả cao cho xơ gan giai đoạn cuối Ghép gan thường cần đến khi các biến chứng như bệnh não, cổ trướng hay giãn tĩnh mạch xuất huyết không thể kiểm soát được hoặc khi chức năng sinh hóa bị suy giảm nghiêm trọng Trong hầu hết các