VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu - Hóa chất thí nghiệm
Dầu vỏ hạt điều là sản phẩm được chiết xuất từ vỏ hạt điều sau khi đã tách lấy nhân, quy trình ép nguội không sử dụng ly tâm và gia nhiệt, đảm bảo giữ nguyên các dưỡng chất tự nhiên Sản phẩm này được cung cấp bởi Doanh nghiệp tư nhân Hùng.
Lộc) số 265A Bùi Văn Hoà, phường An Bình, Biên Hòa, Đồng Nai
- Sâu khoang (Spodoptera litura) thu từ các vườn rau cải khu Nông nghiệp Công nghệ cao Tp HCM
- Hạt giống rau cải ngọt (Brassica juncea) (công ty Trang Nông) được gieo trồng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới
- Chuột nhắt trắng cái giống Swiss trọng lượng 25 – 26 g được cung cấp bởi
- Các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, Lactobacillus sp.; Azotobacter sp.;
E.coli được cung cấp bởi phòng Công nghệ biến đổi sinh học, và chủng
Erwinia sp được phân lập từ cây bắp cải bị bệnh thối nhũn thu từ vườn rau tại Đà Lạt
Hóa chất thí nghiệm bao gồm các dung môi hữu cơ như cồn 96, cồn tuyệt đối và eter dầu hoả, được sử dụng để tách chiết AnAc từ DVHĐ Ngoài ra, các muối vô cơ và acid-base cũng là những hóa chất thông dụng trong tổng hợp AnAc-LDH Các chất chuẩn khác được sử dụng cho phân tích cũng rất quan trọng trong quy trình này.
HPLC, HR-MS, phân tích các chỉ tiêu sinh hoá đều đạt độ tinh sạch cần thiết theo đúng tiêu chuẩn.
Dụng cụ và Thiết bị
Sử dụng các máy móc thiết bị, dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm hoá sinh
Tại Tp HCM, các phòng thí nghiệm phân tích trung tâm và phòng thí nghiệm trọng điểm về vật liệu nano uy tín cung cấp dịch vụ phân tích các chỉ tiêu về vật liệu, đáp ứng nhu cầu sử dụng và thuê của các tổ chức và cá nhân.
- Chụp hình SEM, Phân tích EDX, XRD, FT-IR
- Phân tích HPLC, HR-MS.
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Tách chiết anacardic acid từ dầu vỏ hạt điều
- Cân 10g DVHĐ thêm dung môi vào khuấy tan, sau đó ly tâm loại cặn, thu dịch
Thêm Ca(OH)2 vào dung dịch DVHĐ và khuấy đều trên máy khuấy từ cho đến khi xuất hiện kết tủa màu hồng đậm Tiếp tục khuấy để phản ứng diễn ra hoàn toàn, sau đó ly tâm để thu và rửa kết tủa Kết tủa thu được là muối canxi anacardate, sau đó được sấy khô để chuẩn bị cho bước tiếp theo.
Kết tủa canxi anacardate được hòa tan bằng HCl đậm đặc, tạo ra anacardic acid và canxi clorua Anacardic acid được chiết xuất bằng petroleum ether, với pha dung môi hữu cơ nằm ở lớp trên sau khi loại bỏ lớp dưới chứa CaCl2 Phần dịch nổi chứa AnAc được rửa hai lần với nước khử ion để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất tan trong nước khác Cuối cùng, dịch này được cô quay để loại bỏ dung môi, thu được cao chiết AnAc.
Phương pháp tách chiết, tinh sạch AnAc từ được cải tiến dựa trên patent của công ty
2.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol để hòa tan DVHĐ
+ Chọn ra nồng độ ethanol thích hợp để hòa tan tốt DVHĐ nhưng có thể loại bỏ được cặn
+ Có khả năng loại bỏ sáp – polyphenol (tan trong ethanol nồng độ cao, không tan trong ethanol nồng độ thấp)
+ Tiết kiệm dung môi – hạ giá thành
Bảng 2.1 Các nồng độ ethanol dùng để hòa tan AnAc
Nghiệm thức Nồng độ ethanol (%)
- Cách thức thực hiện: Hòa tan DVHĐ vào ethanol với các nồng độ khác nhau
Sau khi ly tâm, thu được dịch và cặn sáp riêng biệt Cân cặn sáp để đánh giá hiệu quả tách sáp theo từng nồng độ ethanol Thí nghiệm được thực hiện hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần gồm 5 mẫu.
- Chỉ tiêu theo dõi: Lượng cặn thu được trong các nghiệm thức
2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng Ca(OH) 2 để tách AnAc từ DVHĐ
Mục đích: Tách AnAc khỏi hỗn hợp phenol từ DVHĐ
Dùng Ca(OH)2 để thực hiện phản ứng acid – base tạo kết tủa calcium anacardate
Bảng 2.2 Ảnh hưởng của lượng Ca(OH)2 để tách AnAc từ DVHĐ
Nghiệm thức Khối lượng Ca(OH) 2 (g)
Khảo sát lượng Ca(OH)2 từ 1,5 g đến 3,5 g cho 10 g
Chỉ tiêu theo dõi: khối lượng kết tủa anacardate canxi
Cách thức thực hiện: Cân lần lượt Ca(OH)2 với 5 khối lượng 1,5 g; 2,0 g; 2,5 g;
Cho 3,0 g và 3,5 g vào erlen, thêm 10 mL ethanol vào mỗi erlen và lắc đều Sau đó, làm ấm đến 50 °C, thêm 10 g DVHĐ đã hòa tan trong ethanol, lắc đều và siêu âm trong 10 phút ở 50 °C Ly tâm để thu kết tủa, rửa bằng ethanol 90%, sau đó thu tủa, sấy khô và cân khối lượng để xác định lượng Ca(OH)2 tối ưu Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần với mỗi lần có 5 mẫu.
Cao chiết AnAc được phân tích bằng phương pháp HPLC và HR-MS để xác định hàm lượng và thành phần các loại AnAc có trong DVHĐ Kết quả phân tích giúp định danh và xác định tỷ lệ các loại AnAc trong cao chiết, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hiệu suất tách chiết AnAc từ DVHĐ được tính là lượng AnAc trong cao chiết so với lượng AnAc trong nguyên liệu DVHĐ và tính theo công thức sau:
A: nồng độ AnAc tổng trong DVHĐ n: Khối lượng DVHĐ (g)
B: nồng độ AnAc tổng trong cao chiết AnAc m: khối lượng cao chiết AnAc (g)
2.3.2 Nghiên cứu tạo chế phẩm kết hợp dẫn xuất AnAc-LDH bằng phương pháp gắn trực tiếp trong quá trình tổng hợp vật liệu nano LDH
Chế phẩm kết hợp dẫn xuất AnAc-LDH được tạo ra thông qua phương pháp tổng hợp trực tiếp, sử dụng vật liệu nano MgAl LDH Vật liệu này được tổng hợp bằng phản ứng đồng kết tủa nhanh, thông qua việc đổ nhanh hỗn hợp dung dịch muối MgCl2.6H2O 0,2 M và AlCl3.
Dung dịch A gồm 0,1 M H2O được hòa tan trong dung dịch AnAc và cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 2:1 để tạo ra dung dịch B Tiếp theo, dung dịch B được hòa tan với NaOH 1 M dưới điều kiện khuấy ở 50 o C và sục khí N2 Sau đó, nhanh chóng đổ dung dịch A vào dung dịch B, tiếp tục sục khí và điều chỉnh pH bằng NaOH 1 M Sau 1 giờ, bịt kín cốc và ủ ở 50 o C trong 24 giờ trên máy khuấy từ để già hóa tinh thể và ổn định cấu trúc hạt.
Sau khi quá trình phản ứng hoàn tất, tiến hành ly tâm để thu hồi kết tủa, sau đó dịch rửa được phân tích để xác định hàm lượng AnAc dư Hiệu suất gắn AnAc được tính toán dựa trên hàm lượng AnAc còn lại, được xác định thông qua phương pháp đo quang phổ trong dung dịch sau phản ứng.
Kết tủa được rửa bằng nước cất cho đến khi pH ổn định, sau đó được sấy khô ở 50 độ C bằng máy sấy chân không Khối lượng bột khô của sản phẩm phản ứng được cân và ghi nhận, một phần bột khô này sẽ được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu.
XRD, EDS, FT-IR SEM (mục 2.4.3)
Phương pháp tổng hợp cải tiến SiRNA dựa trên phương pháp tổng hợp trực tiếp LDH, được thực hiện bằng cách đồng kết tủa nhanh mà không cần sử dụng dung môi hữu cơ, đã được Li và cộng sự (2016) đề xuất.
2.3.2.1 Ảnh hưởng lượng cao chiết AnAc đến hiệu quả tạo chế phẩm kết hợp dẫn xuất AnAc-LDH
Thí nghiệm nghiên cứu tác động của lượng cao chiết AnAc, đóng vai trò là anion cố định, lên hạt nano LDH trong quá trình đồng kết tủa nhằm tạo ra hạt nano.
LDH được sử dụng trực tiếp thay vì các phương pháp cố định gián tiếp như trao đổi ion hay hiệu ứng nhớ Do đó, cần xác định lượng AnAc thích hợp để tham gia vào phản ứng tạo chế phẩm dẫn xuất với hiệu quả cao.
Thí nghiệm khảo sát dựa theo khối lượng cao chiết tham gia phản ứng từ 0 –
Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 7 nghiệm thức, bao gồm 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung cao chiết AnAc Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, với trọng lượng mẫu là 7,68 g như trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của lượng cao chiết AnAc đến hiệu quả cố định AnAc tạo AnAc-
Dung dịch A (mL) 50 50 50 50 50 50 50 mcao chiết AnAc (g) 0 1,28 2,56 3,84 5,12 6,4 7,68
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất hấp phụ AnAc, lượng AnAc được hấp phụ và lượng bột khô sản phẩm được tạo thành sau phản ứng
2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình tạo chế phẩm kết hợp dẫn xuất
Thí nghiệm để xác định pH thích hợp có khả năng cố định AnAc lên hạt nano
LDH cao nhất nhưng đảm bảo sự hình thành cấu trúc hạt nano
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 04 nghiệm thức là
Trong thí nghiệm 2.3.2.1, khối lượng cao chiết tối ưu được sử dụng là 5,12g, với mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần pH của phản ứng được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1 M, đạt giá trị 4 điểm pH (Bảng 2.4).
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả cố định AnAc để tạo AnAc-LDH
Nghiệm thức pH 9 pH 10 pH 11 pH 12
Dung dịch A (mL) 50 50 50 50 mcao chiết AnAc (g) 5,12 5,12 5,12 5,12
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất hấp phụ AnAc, lượng AnAc được hấp phụ và lượng bột khô sản phẩm được tạo thành sau phản ứng
2.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả tạo chế phẩm kết hợp dẫn xuất AnAc-
Thí nghiệm nhằm tìm ra điều kiện nhiệt độ thích hợp để tạo được AnAc-LDH với lượng AnAc được cố định cao
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 04 nghiệm thức là
Thí nghiệm được thực hiện trên máy khuấy từ gia nhiệt Thermo với 04 điểm nhiệt độ (Bảng 2.5), mỗi nghiệm thức lặp lại 03 lần Kết quả được chọn là khối lượng cao chiết và pH từ các thí nghiệm 2.3.2.1 và 2.3.2.2.
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả cố định AnAc để tạo AnAc-LDH
Dung dịch A (mL) 50 50 50 50 mcao chiết AnAc (g) 5,12 5,12 5,12 5,12
Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất cố định AnAc, lượng AnAc được hấp phụ và lượng bột khô sản phẩm được tạo thành sau phản ứng
2.3.3 Nghiên cứu giải hấp phụ AnAc từ chế phẩm kết hợp dẫn xuất AnAc-LDH
Phương pháp phân tích
2.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp
Quy trình chạy sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Xác định hàm lượng anacardic acid trên hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp
Hệ thống Agilent 1200 (USA) bao gồm bơm đôi cao áp, bộ tiêm mẫu tự động bằng Syringe (kdScientific, USA) và lò cột Hệ thống này sử dụng chất chuẩn anacardic acid - C22H36O3 (Sigma) với các thông số kỹ thuật chính xác.
Pha tĩnh: cột Inertsil ODS-4 (3.0 ì150mm, 3,0 àm), được ổn nhiệt ở 40 0 C
Pha động: chương trình pha động được thực hiện đẳng dòng với tỉ lệ pha A:pha
B là 10:90 v/v, tại tốc độ dòng 0,4 mL/phút Trong đó, pha A là hỗn hợp dung dịch
MeOH-H2O khử ion 50:50 v/v, chứa 0,1 % acid formic và pha B là Acetonitril –
Mẫu đo LC-UV được ghi tín hiệu tại bước sóng 310 nm
Số khuẩn lạc trên đĩa thí nghiệm
Số khuẩn lạc trên đĩa đối chứng
Sắc ký lỏng ghép khối phổ HR-MS:
The Bruker Daltonics micrOTOF-QII high-resolution MS/MS system features an ESI ion source, a Dual Ion Funnel combined with a Hexapole ion filter, an Analytical Quadrupole for mass isolation, an internal CID ionization source, a high-resolution TOF mass separator, and a multichannel ion detector Data processing is conducted using Bruker's Data Analysis software.
Độ đúng ion m/z của đầu dò MS được hiệu chỉnh bằng dung dịch ESI – L tuning mix thông qua bộ bơm mẫu trực tiếp Syringe với tốc độ 200 μL/giờ (Hình 2.1).
Hình 2.1 Hiệu chỉnh độ đúng ion m/z của đầu dò MS
Quy trình nhận danh bằng phổ MS/MS
Thông số kỹ thuật của nguồn tạo ion ESI, bộ lọc ion (Funnel), bộ cô lập ion (Q), nguồn tạo ion nội (CID), và bộ tách khối (TOF) được minh họa rõ ràng trong Hình 2.1, cùng với các thông số quá trình liên quan.
MRM được thể hiển trên Hình 2.2
65 Hình 2.2 Thông số thiết bị MS/MS dùng để nhận danh
2.4.2 Xác định hàm lượng AnAc thông qua hàm lượng polyphenol bằng phương pháp Folin – Ciotalteau [68]
Hợp chất polyphenol oxy hóa với thuốc thử Folin – Ciocalteau tạo ra sản phẩm màu xanh lam, trong đó giá trị OD màu tỷ lệ thuận với hàm lượng polyphenol trong dung dịch Cường độ màu được đo trên máy so màu ở bước sóng 765 nm và dựa vào đồ thị đường chuẩn của acid gallic với thuốc thử Folin.
Ciocalteau sẽ xác định được hàm lượng polyphenol trong mẫu khảo sát
Dung dịch Na2CO3 bão hòa được tạo ra bằng cách hòa tan 200 g NaHCO3 trong 800 mL nước cất và đun sôi Sau khi làm lạnh, thêm vài tinh thể Na2CO3 và để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Cuối cùng, lọc thêm nước cất cho đến đạt 1000 mL và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Pha dung dịch acid gallic 5 g/L: Hòa tan 0,5 g acid gallic trong 10 mL ethanol tuyệt đối, sau đó pha loãng với nước cất đến 100 mL Dung dịch có thể bảo quản ở 4
Bảng 2.14 Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn định lượng polyphenol tổng số Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Chiết xuất hợp chất polyphenol
Dịch nổi sau ly tõm được lọc qua giấy lọc ỉ 5 um để loại vỏng dầu
1 Cho 1mL mẫu vào ống nghiệm 100 mL
2 Thêm 70 mL nước, sau đó cho vào 5 mL thuốc nhuộm Folin – Ciotalteau lắc và ủ ở nhiệt độ phòng 1-8 phút
3 Thêm 15mL dung dịch đệm Na2CO3
4 Thêm nước cho đủ 100 mL, trộn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ
5 Cho vào cuvette và đo ở bước sóng 765 nm trên máy quang phổ kế
Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo công thức sau:
V: tổng số dịch chiết của mẫu nghiên cứu (L) m: khối lượng polyphenol xác định từ đường chuẩn (mg)
2.4.3 Các phương pháp phân tích về đặc trưng hóa lý của bản mỏng nano LDH Để xác định các tính chất hóa lý của vật liệu tổng hợp được cũng như vật liệu mang hoạt chất, ta thực hiện các phương pháp phân tích hóa lý sau:
- Cấu trúc tinh thể và phân bố kích thươc hạt bằng chụp anh SEM
- Phân tích thành phần các nguyên tố bằng EDX
- Xác định cấu trúc vật liệu bằng phương pháp phổ nhiễu xạ tia X (XRD)
- Nghiên cứu phổ hồng ngoại FT-IR để xác định sự thay đổi các nhóm chức khi có sự hấp phụ anion lên vật liệu nano LDH
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) là thiết bị quang học cho phép tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật Thiết bị này sử dụng một chùm điện tử hẹp để quét trên bề mặt, giúp quan sát chi tiết cấu trúc và đặc điểm của mẫu vật.
Quá trình tạo ảnh của mẫu vật diễn ra bằng cách ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ sự tương tác giữa chùm điện tử và bề mặt mẫu vật.
Chuẩn bị mẫu bằng cách trải lên băng dính cácbon 2 mặt, với một mặt dán trên đế đựng mẫu và mặt còn lại để dính mẫu Sau đó, mẫu được đưa vào buồng mẫu và tiến hành đo trên máy chụp SEM Hitachi S-4800 của Nhật Bản.
EDX (Phổ X-quang phân tán năng lượng) yêu cầu chọn thế gia tốc tối thiểu là 15kV và chế độ dòng điện (Probe current) ở mức cao Sau đó, tiến hành chụp hình khu vực cần phân tích và thực hiện phân tích trên máy Horiba H-7593 của Anh.
Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) được thực hiện trên các mẫu MgAl LDH và AnAc-LDH nhằm xác định các phổ đặc trưng của LDH và anacardic Kết quả thu được sẽ chỉ ra sự tương đồng và khác biệt giữa MgAl LDH và LDH sau khi hấp phụ AnAc.
Nó cũng cho thấy sự thay đổi về chiều cao vùng trung gian khi có sự hiện diện của
Phương pháp AnAc gặp hạn chế về dữ liệu phân tích của máy, dẫn đến việc không thể tính toán giá trị khoảng cách giữa các lớp cũng như sự biến động khi có sự thay đổi ở lớp trung gian hoặc trên bề mặt của các phiến mỏng LDH.
Để chuẩn bị mẫu, các mẫu được sấy đông khô thành dạng bột khô và sau đó cho vào chén đựng mẫu Mẫu sẽ được đưa vào buồng đo để tiến hành đo tán xạ tia X ở điện thế 40kV và cường độ dòng 40 mA bằng bức xạ Cu Kα trên máy đo.
FT-IR (quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier) được sử dụng để phân tích các mẫu LDH, anacardate canxi và AnAc-LDH Các mẫu này được nghiền nhỏ bằng cối nghiền bi và rây qua rây 200 mesh Khoảng 3-5 mg mẫu bột được trộn với 100 mg KBr trong cối mã não và sau đó ép viên trên máy ép chuyên dụng trong khoảng 10 phút.
Tiến hành đo phổ IR trên máy FT-IR 8400S Shimadzu, Nhật Bản
Phương pháp phân tích thống kê
Tổng hợp và xử lý số liệu với các phần mềm máy tính sau:
- Tổng hợp số liệu: Microsoft excel 2010
Phân tích thống kê được thực hiện để so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức thông qua phương pháp phương sai đơn yếu tố (One-way ANOVA) với mức độ tin cậy 95% Kết quả phân tích được phân hạng bằng phương pháp Tukey Tất cả các phân tích này được thực hiện bằng phần mềm chuyên dụng.
- Các đồng thị được vẽ bằng phần mềm Graphpad Prism 5, độ tin cậy 95 %
- Tài liệu tham khảo được trích dẫn bằng phần mềm Ennode X8
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN
Tách chiết anacardic acid từ dầu vỏ hạt điều
3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol để hòa tan DVHĐ
Trong 4 nồng độ ethanol khảo sát thì nồng độ 50% hòa tan không tốt do dung dịch có hiện tượng tách thành 3 pha (nước, dầu và cặn) Với ethanol 70% dung dịch
DVHĐ hòa tan tốt mà không xảy ra hiện tượng tách pha như ethanol 90% và ethanol tuyệt đối Trong các nghiệm thức 50%, 70%, và 90%, lượng cặn thu được tương đối bằng nhau, dao động từ 6,5% đến 6,8%, cao hơn so với ethanol tuyệt đối (5,2%) Khi sử dụng ethanol nồng độ thấp, sáp có thể không hòa tan và lắng xuống, trong khi với ethanol tuyệt đối, lượng sáp này có thể bị hòa tan, dẫn đến lượng cặn thu được thấp hơn Vì vậy, ethanol 70% được chọn để hòa tan phenol trong DVHĐ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến tỉ lệ cặn thu hồi trong quá trình hòa tan
C Tỉ lệ cặn thu hồi (%)
Các số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD Trong mỗi cột, các giá trị có ký tự khác nhau cho thấy sự khác biệt thống kê Sự khác biệt giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm có ý nghĩa khi p
