Phân lập và xác định tính chất các chủng vi khuẩn bacillus từ ruột gà để sản xuất probiotic tăng trọng cho gà siêu thịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC NGUYỄN VĂN ĐỨC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT L

KHOA SINH HỌC

NGUYỄN VĂN ĐỨC

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG

VI KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT

PROBIOTIC TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI- 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

NGUYỄN VĂN ĐỨC

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CÁC CHỦNG VI

KHUẨN Bacillus TỪ RUỘT GÀ ĐỂ SẢN XUẤT PROBIOTIC

TĂNG TRỌNG CHO GÀ SIÊU THỊT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh

TS Nguyễn Thị Hồng Loan

Hà Nội – 2014

ThịVân Anh và TS Nguyễn Thị Hồng Loan đã giúp đỡ và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Từ tận đáy lòng, tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, người đã luôn động viên, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, người đã chỉ dạy tôi những kiến thức khoa học cũng như cách làm việc một cách khoa học đồng thời

đã tạo điều kiện để tôi tiếp tục được nghiên cứu khoa học Tôi cũng chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ, và các bạn bè trong phòng Sinh học Nano và Ứng dụng cũng như phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình làm luận văn cao học

Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Phòng công tác chính trị học sinh và sinh viên, Phòng sau đại học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ này!

Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới công ty ANABIO R&D đã giúp đỡ tôi trong quá trình sản xuất bào tử của một số chủng Bacillus phân lập trong khóa luận, cảm ơn

KS Nguyễn Thị Loan, Trung tâm chẩn đoán Thú y – Tập đoàn DABACO đã giúp

đỡ tôi trong việc thử nghiệm các chế phẩm probiotic trên gà siêu thịt

Cho phép tôi giửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, đồng nghiệp ở bộ môn Tự nhiên, trường THPT Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội đã tạo điều kiện về mặt thời gian

và chuyên môn cũng như động viên để tôi yên tâm đi học cao học

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Văn Đức

Từ viết tắt Từ/cụm từ viết đầy đủ

CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

FAO/WHO Food and Agriculture Orgaization of the United

Nations/ World Health Organization FCR Feed conversion ratio (hệ số chuyển đổi thức ăn)

RFLP Restriction fragment length polymorphism

Trang Bảng 1 pH và thời gian tồn tại của thức ăn ở các phần khác nhau

trong ống tiêu hóa của gà

4

Bảng 2 Các chi của vi khuẩn đã phát hiện trong hồi tràng và

manh tràng bằng kỹ thuật giải trình tự 16S rDNA

6

Bảng 3 Một số mô tả và khái niệm về probiotic được chính dẫn

nhiều trong các năm qua

Bảng 10 Các phân đoạn thu được khi cắt gen 16S ribosome của

các chủng vi khuẩn bằng bộ enzyme Alf II và Alw 26I

Bảng 12 Thử nghiệm trên diện rộng thức ăn bổ sung bào tử B

subtilis CH16 trên gà siêu thịt

63

Hình 1 Cấu tạo hệ tiêu hóa ở gà 3 Hình 2 Thành phần của hệ vi khuẩn trong hồi tràng và manh tràng của gà

giò được xác định bằng giải trình tự 1230 dòng từ cộng đồng 16S

rDNA trong thư viện DNA

7

Hình 3 Chu trình hình thành, nảy mầm của nội bào tử thuộc chi Bacillus

và cấu trúc của nội bào tử

CH16, và khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch của các chủng PY79

và CH22 ở điều kiện

60

Hình 16 Ảnh chụp chế phẩm chứa bào tử dạng bột (A), ảnh bào tử dưới kính

hiển vi điện tử (B) và ảnh khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (C) của 2

chủng CH16 và CH22

61

MỞ ĐẦU 1

1.1 Hệ tiêu hóa của gà 2

1.1.1 Cấu tạo hệ tiêu hóa và sinh lí tiêu hóa ở gà 2

1.1.2 Hệ vi khuẩn đường ruột của gà 4

1.1.3 Các vi khuẩn Bacillus phân lập từ ruột gà 7

1.2 Probiotic 9

1.2.1 Khái niệm chung về probiotic 9

1.2.2 Probiotic sử dụng cho gia cầm 21

1.2.3 Các chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng làm probiotic cho gia cầm 27

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 29

2.1.1 Mẫu ruột gà 29

2.1.2 Các chủng vi khuẩn tham chiếu 29

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 29

2.1.4 Hóa chất sinh học phân tử 32

2.1.5 Các hóa chất khác 33

2.1.6 Dụng cụ và thiết bị 33

2.2 Phương pháp nghiêu cứu 33

2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn từ ruột gà 33

2.2.2 Các kỹ thuật vi sinh và hóa sinh cơ bản 34

2.2.3 Phân tích trình tự 16S rRNA 38

2.2.4 Kỹ thuật PCR-RFLP 39

2.2.5 Điều kiện sinh trưởng tối ưu 40

2.2.6 Sản xuất bào tử trong nồi lên men 40

2.2.7 Thử nghiệm chế phẩm probiotic trên gà siêu thịt ở diện rộng 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 Các chủng vi khuẩn Bacillus không sắc tố được phân lập từ ruột gà 43

3.3 Định danh loài bằng phân tích 16S rRNA 47

3.4 Phân biệt các chủng đã phân lập bằng kỹ thuật PCR-RFLP 50

3.5 Một số tính chất probiotic của các chủng Bacillus được tuyển chọn 53

3.5.1 Tính kháng kháng sinh 53

3.5.2 Hiệu suất tạo bào tử 55

3.5.3 Độ bền của bào tử trong các môi trường pH khác nhau 56

3.5.4 Độ bền của bào tử trong dung dịch muối 57

3.5.5 Khả năng tạo biofilm 58

3.6 Điều kiện sinh trưởng tối ưu và thu chế phẩm probiotic dạng bào tử sau lên men 59

3.7 Tăng trọng trên gà siêu thịt và giảm chỉ số tiêu thụ thức ăn 60

KẾT LUẬN 63

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

MỞ ĐẦU

Theo định nghĩa của WHO/FAO, Probiotic hay còn gọi là lợi khuẩn là những

vi sinh vật sống, khi được sử dụng với lượng thích hợp sẽ mang lại các tác dụng có

lợi cho vật chủ Probiotic dạng bào tử của một số vi khuẩn thuộc chi Bacillusnhư B subtilis và B licheniformis được sử dụng ngày càng rộng rãi trong chăn nuôi và

thủy sản vì bào tử có tính chất bền nhiệt giúp sản phẩm ổn định chất lượng trong quá trình chế biến với thức ăn và bảo quản Với gia cầm, đặc biệt là đối vớigà siêu thịt, đã có nhiều sản phẩm probiotic nổi tiếng được sản xuất cả ở Châu Âu và ở Mỹ Đặc điểm chung của các sản phẩm này là các chủng vi khuẩn được nghiên cứu sâu

về tính chất và độ an toàn, cũng như các hoạt tính có lợi cho sức khỏe của vật chủ Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn thường không có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa mà thường được phân lập từ đất, duy nhất chỉ có 01 sản phẩm Clostat của hãng Kemin,

Mỹ, gồm chủng B subtilis PB6 là có nguồn gốc từ hệ tiêu hóa Ngoài ra, một số chế

phẩmcũng chưa được sản xuất ở dạng bào tử hoàn toàn mà còn lẫn một tỷ lệ tế bào sinh dưỡng nên bị giảm sút độ sống khi xử lý nhiệt trong quá trình chế biến thức ăn cho gia cầm

Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng probiotic trong nuôi gà siêu thịtngày càng tăng với mục đích chủ yếu kích thích tăng trọng và tăng cường sức khỏe, phòng bệnh cho gà Các chủng vi khuẩn sử dụng làm probiotic cho gà cũng đã được nhiều tác giả tại các trường đại học và viện nghiên cứu trong nước phân lập, xác định tính chất và thử nghiệm tác dụng trên gà Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào đề cập tới

việc phân lập các chủng Bacillus từ chính ruột gà để tạo chế phẩm probiotic sử

dụng cho gà Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập và xác định tính chất

các chủng vi khuẩn Bacillus từ ruột gà để sản xuất probiotic tăng trọng cho gà siêu thịt” nhằm sàng lọc các chủng vi khuẩnBacillus có hoạt tính probiotic ưu việt

và thân thiện với hệ tiêu hóa của gà, nhờ đó phát huy hiệu quả tác dụng tăng trọng cho gà siêu thịt

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Hệ tiêu hóa của gà

1.1.1 Cấu tạo hệ tiêu hóa và sinh lí tiêu hóa ở gà

Hệ tiêu hóa ở gà có cấu tạo khá đặc biệt để thích nghi với thức ăn là thực vật

và khoang miệng hẹp, không có răng Thức ăn được đưa vào diều, diều là một cái túi phình to của thực quản, là nơi chứa thức ăn và nhào trộn với dịch tiết để làm cho thức ăn mềm ra Một trong cấu tạo đặc biệt khác trong hệ tiêu hóa ở gà đó là dạ dày

cơ, dạ dày cơ có thành cơ chắc khỏe, là nơi nghiền nát thức ăn trước khi được đưa tới tá tràng Một dặc điểm khác biệt so với dạ dày của động vật nói chung đó là dạ dày cơ không có khả năng tiết bất cứ loại enzyme nào, một số enzyme đươc dạ dày tuyến tiết ra để hòa trộn vào trong thức ăn giúp tăng hiệu quả tiêu hóa ở dạ dày cơ Đặc biệt, để tăng hiệu quả tiêu hóa cơ học, gà còn ăn thêm những hạt sỏi nhỏ, đó là cách tăng ma sát cơ học giúp thức ăn thực vật bị nghiền nhỏ thành những mảnh vụn

li ti để quá trình tiêu hóa ở ruột diễn ra hiệu quả

So với tất cả các động vật ăn thực vật, gà là nhóm động vật có cách tiêu hóa khá đặc biệt, thời gian tồn tại của thức ăn tại diều và dạ dày của gà là khá lâu so với

các phần còn lại trong ống tiêu hóa [67], điều này được thể hiện rất rõ qua Bảng 1

Lối tiêu hóa diễn ra từ từ ở phần đầu của ống tiêu hóa với pH thấp đã ức chế sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật Đó cũng là một vấn đề khó khăn khi đưa các loại probiotic là các tế bào sinh dưỡng vào trong ống tiêu hóa của gà vì có thể số tế bào probiotic vượt qua được dạ dày với nồng độ không đủ lớn để phát huy tác dụng

Quan sátHình 1 cho thấy, lượng axít hữu cơ tiết ra trong ống tiêu hóa với nồng độ

cao làm cho pH ở các phần đầu ống tiêu hóa thấp, điều này khẳng định rằng các axít hữu cơ có vai trò trực tiếp quyết định đến hệ vi khuẩn đường ruột, làm giảm các vi nhuẩn gây bệnh và kiểm soát các quần thể chủ yếu cạnh tranh chất dinh dưỡng đối với gà [28] Đây cũng chính là cơ sơ để các nhà nghiên cứu đánh giá về tác động

của các axít hữu cơ cũng nh

bệnh ở gà [28,65]

Ở tá tràng là nơi tiêu h

chủ yếu của hệ tiêu hóa khi có nhi

trong tuyến tụy cũng như các mu

niêm mạc ruột lượn sóng và có nhi

nơi khu trú của nhiều loài vi sinh v

quan trọng giống như manh

chúng Chức năng của manh tràng đư

khó tiêu hóa, hấp thu nướ

thông với hậu môn, nơi có pH 8 và c

khuẩn diễn ra khá mạnh m

Hình 1 C

ũng như các vi khuẩn sinh axít đối với việc kiểm soát các m

tá tràng là nơi tiêu hóa hóa học thức ăn cũng như hấp thụ ch

tiêu hóa khi có nhiều enzyme được tiết ra từ thành ru

ư các muối mật được tiết ra từ gan Cấu tạo c

n sóng và có nhiều nhung mao đã làm tăng diện tích bũng giống như đa số các động vật ăn thực vật khác, ru

gà dài và có đôi mang tràng lớn Thời gian tồn tại của hỗn dịch tiêu hóa

n, với thành phần chất dinh dưỡng đa dạng, pH trung tính ), đây có thể sẽ là điều kiện thuận lợi để cho vi sinh v

t có lợi phát triển Với đôi manh tràng lớn, có l

u loài vi sinh vật, tuy nhiên, đây không phải là cơ qua

ng như manh tràng ở thỏ, nơi đây-manh tràng là dạ dày th

a manh tràng được cho là có liên quan đến sự tiêu hóa các ch

ớc, glucose và và các axít béo Trực tràng là m

u môn, nơi có pH 8 và cũng là nơi mà quá trình lên men c

nh mẽ

Hình 1 Cấu tạo hệ tiêu hóa ở gà [28]

m soát các mầm

chất dinh dưỡng thành ruột, các enzyme

o của ruột non với

n tích bề mặt hấp

t khác, ruột của

ch tiêu hóa ở hỗn tràng

ng, pH trung tính cho vi sinh vật gây bệnh

n, có lẽ đây cũng là

i là cơ quan tiêu hóa dày thứ hai của tiêu hóa các chất

c tràng là một đoạn ngắn ình lên men của các vi

Bảng 1 pH và thời gian tồn tại của thức ăn ở các phần khác nhau trong ống tiêu hóa của gà [67]

Các cơ quan trong ống tiêu hóa Thời gian tồn tại của

1.1.2 Hệ vi khuẩn đường ruột của gà

Vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe thông qua các tác động của nó tới hình thái ruột, dinh dưỡng, sinh bệnh học của các bệnh đường ruột và các đáp ứng miễn dịch [34] Hệ vi khuẩn đường ruột cũng được cho

là có khả năng chống xâm lấn của các mầm bệnh trong đường ruột và kích hoạt các đáp ứng miễn dịch [45]

Các nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong đường tiêu hóa của gà ngày càng được chú ý Các vi khuẩn dễ nuôi cấy chiếm ưu thế trong manh tràng, đa số là các vi khuẩn kỵ khí bắt bắt buộc, với mật độ 1011/g trọng lượng [10] Ít nhất có 38 loại vi khuẩn kỵ khí khác nhau đã được phân lập từ manh tràng của gà và chúng bao gồm nhiều chủng khác nhau [9] Mead (1989) đã tìm thấy các cầu khuẩn gram dương

như Peptostreptococcus chiếm 28% tổng số vi khuẩn có thể nuôi cấy, các nhóm khác bao gồm Bacteroidaceae (20%), Eubacterium spp (16%), Bifidobacterium spp (9%), cầu khuẩn nảy mầm (6%), Gemmiger formicilis (5%), và Clostridium

spp (5%) Tuy nhiên, các nghiên cứu về mặt vi sinh học thông qua nuôi cấy đã cho

ra những kết quả không đồng nhất [9,44] Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân

trong những năm gần đây [34] Netherwood và cộng sự (1999) đã dùng phản ứng lai

để theo dõi đáp ứng của hệ vi khuẩn với sự bổ sung probiotic Apajalahti và cộng sự (2001) đã phân tích sự khác biệt về hệ vi khuẩn ruột- manh tràng do chế độ ăn bằng cách sử dụng nhận dạng % G+C trong các trình tự của 16S rDNA Họ đã chỉ ra rằng phần lớn các gen phát hiện không phải là từ các vi khuẩn đã biết rõ Các kết quả nghiên cứu này đã được xác nhận bởi Gong và cộng sự (2002) và Zhu và cộng sự (2002), những người đã ghi nhận rằng một số trình tự trong 16S rDNA khôi phục lại

từ thư viện manh tràng biểu hiện trình tự tương đồng thấp với các gen của các chi vi khuẩn đã biết

Trong nghiên cứu của mình,Jiangrang và cộng sự (2003) đã dùng phương pháp phân tích trình tự của 16S rDNA của cộng đồng vi khuẩn phân lập trong ống tiêu hóa của gà Kết quả cho thấy cộng đồng vi khuẩn trong ruột gà được chia thành

4 nhóm: Nhómvi khuẩn gram dương có G+C thấp, nhóm vi khuẩn gram dương có

G+C cao, nhóm vi khuẩn cổ và nhóm Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides Nhóm vi khuẩn gram dương có G+C thấp bao gồm Lactobacillus, clostridia, Bacillus và streptococci Bacillus và streptococci là nhóm phổ biến nhất trong hồi tràng và

manh tràng Mười ba chi đã được tìm thấy trong cả hồi tràng lẫn manh tràng nhưng

sự phong phú ở các cơ quan này là khác nhau Trong hồi tràng, Lactobacillus chiếm 67% nhưng Clostridiaceae lại phong phú hơn ở trong manh tràng (68%) Sự khác

biệt về thành phần loài trong cộng đồng vi khuẩn ở hồi tràng và manh tràng được

thể hiện chi tiết qua Bảng 2 và Hình 2 dưới đây

Bảng 2 Các chi của vi khuẩn đã phát hiện trong hồi tràng và manh tràng bằng ngân hàng 16S rDNA [34]

Hồi tràng Manh tràng Nhóm G+C thấp, gram dương

sinh đấu tranh với các m

cáo bởi nhiều tác giả cũng nh

[36] Thành phần hệ vi sinh v

vật làm cho FCR thấp bao g

vi sinh vật đường ruột cũng đóng góp quan trong trong vi

gây bệnh đường ruột, đặ

cereus, B flexus, B firmus, B indicus, Bacillus ssp.

khuẩn Bacillus trong ruột gà là không ph

ủa hệ vi khuẩn trong hồi tràng và manh tràng c

i trình tự 1230 dòng từ trình tự 16S rDNA trong thư vi (A) Thành phần vi khuẩn trong hồi tràng (B) Thành ph

ng ruột có vai trò cực kì quan trọng đối sức kh Các vi sinh vật đường ruột bám dọc theo đường tiêu hóa t

ng lại các vi khuẩn gây bệnh [58] Việc những vi khumầm bệnh theo nguyên tắc loại trừ cạnh tranh đũng như ở các đối tượng vật chủ khác nhau, k

vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến FCR [6, 16], các nhóm vi sinh

p bao gồm Lachnospiraceae, Lactobacillus và Clostridiales H

ũng đóng góp quan trong trong việc chống l

ặc biệt là một số vi khuẩn hội sinh có khả năng ti

sự phát triển của các mầm bệnh [6]

ẩn Bacillus phân lập từ ruột gà

tìm thấy trong đất, rễ cây, trong ống tiêu hóa c

p phổ biến trong chi Bacillus bao gồm Bacillus subtilis B.licheniformis, B clausii, B amyloliquefaciens, B pumilus, B cereus, B flexus, B firmus, B indicus, Bacillus ssp [4, 5, 7, 20, 32, 68]

t gà là không phổ biến và thành phần loài cũng khác nhau

i tràng và manh tràng của gà giò

16S rDNA trong thư viện

ng tiêu hóa của động vật và

Bacillus subtilis, B

B amyloliquefaciens, B pumilus, B

[4, 5, 7, 20, 32, 68] Tỉ lệ vi

ũng khác nhau ở

các cơ quan khác nhau [34] Trong nghiên cứu của Jiangrang và cộng sự, đã chỉ ra trong hồi tràng của gà chỉ có 0,67% và ở manh tràng là 1,45% (chi tiết thể hiện rõ ở

Bảng 2 và Hình 2) Các loài Bacillus phân lập được trong ống tiêu hóa của gà bao

gồm Bacillus subtilis, B megaterium, B.licheniformis, B clausii , B pumilus, B cereus, B firmus, Bacillus ssp [4, 20]

Mặc dù với số lượng loài không phải là đa dạng nhưng các loài Bacillus có

vai trò rất quan trọng đối với đời sống cũng như sức khỏe của động vật nói chung

cũng như gia cầm nói riêng Bacillus có khả năng hình thành nội bào tử có khả năng

kháng nhiệt, chị được muối mật, sản xuất các chất kháng khuẩn, kích thích sự đáp ứng của hệ thống miễn dịch của vật chủ, tốc độ hình thành bào tử cũng như tốc độ nảy mầm cao, tăng cường khả năng sinh trưởng của vật chủ [5, 20, 32, 63] Với

những tính năng ưu việt như vậy, các loài Bacillus cần được phân lập, sàng lọc đánh

giá một cách chi tiết để chế tạo probiotic chất lượng cao cung cấp cho chính vật chủ

là gà để đem lại năng suất, chất lượng cũng như hiệu quả cho người chăn nuôi, đồng thời có thể kiểm soát được bệnh dịch ở gia cầm Chu trình nảy mầm, tạo bào tử

cũng như cấu trúc của nội bào tử được mô phỏng chi tiết thông qua Hình 3 dưới

đây

A B

Hình 3: Chu trình hình thành, nảy mầm của nội bào tử thuộc chi Bacillus và cấu trúc của nội bào tử [16] A: VC (tế bào sinh dưỡng) khi thiếu dinh dưỡng bắt đầu hình thành F (tiền bào tử) nằm trong MC (tế bào mẹ) và tách ra sau khoảng 8 giờ, trở thành bào tử dạng tự do S B: vị trí hình thành bào tử (A), lát cắt ngang cấu trúc bào tử (B), bào tử khi nảy mầm (C)

1.2 Probiotic

1.2.1 Khái niệm chung về probiotic

Những vi khuẩn có lợi đã được con người biết đến từ rất lâu Năm 1899, Tissier đã xác định các tính chất của trực khuẩn và đề xuất được sử dụng nó để điều trị bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh [61], ông cũng đặt tên cho loài vi khuẩn có lợi mà

mình phân lập được là Bacillus bifidus communis [69] Tuy nhiên, khởi nguồn của

những quan sát về các vi sinh vật có lợi phải kể đến công trình của Elie Metchnikoff vào những năm 1907 [8, 22, 69].Metchnikoff thấy một số loài vi khuẩn lactic làm tăng tuổi thọ cho người nông dân Bulgari Ông cũng cho rằng sự phụ thuộc của các

vi khuẩn đường ruột vào thức ăn làm cho chúng có khả năng biến đổi hệ vi khuẩn đường ruột và thay thế các vi khuẩn có hại bằng các vi khuẩn có lợi [22] Do vậy,

ông đã phát triển một chế độ ăn với sữa được lên men bằng vi khuẩn mà ông đặt tên

cho nó là “Bulgarian bacillus” Vào những năm 1930 thì Minoru Shirota đã phân lập được vi khuẩn Lactobacillus casei Shirota và sau đó đã phát triển thành nước

giải khát để tăng cường sức khỏe cho người dân Nhật Bản [61]

Những công trình của Metchnikoff và Tissier lần đầu tiên đã tạo nên những gợi ý khoa học về việc sử dụng vi khuẩn probiotic Các quan sát của họ rất hấp dẫn

về mặt thương mại nhưng thật không may rằng, không phải quan sát nào cũng có kết quả dương tính và hầu hết các quan sát đó chỉ mang tính chủ quan Đó cũng là lí

do tại sao khái niệm probiotic đã không nhận được nhiều sự quan tâm trong nhiều thập kỉ với chỉ một số ít các nghiên cứu liên quan đến động vật nuôi để tìm ra cách cải thiện sức khỏe và tăng khả năng sinh trưởng cho vật nuôi Thuật ngữ “probiotic” không được chú ý nhiều cho tới những năm 1960, khi nghiên cứu của Lilly và Stillwell được tiến hành Để làm rõ bản chất của vi khuẩn probiotic, Fuller (1989)

đã định nghĩa lại thuật ngữ probiotic là vi khuẩn sống được bổ sung vào thức ăn để đem lại những tác động có ích đối với vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng trong ruột của chúng Một định nghĩa cũng khá tương đồng với định nghĩa của Fuller, được đề xuất bởi Havenaar và Huis in't Veld (1992), probiotic được hiểu là một nuôi cấy đơn hoặc hỗn hợp của vi khuẩn sống , khi bổ sung vào động vật hoặc người, đem lại lợi ích đối với vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của hệ vi sinh vật bản địa Một trong những định nghĩa về probiotic gây được nhiều chú ý đã được đưa ra bởi các tác giả Guarner và Schaafsma (1998), các tác giả đã định nghĩa probiotic là các vi sinh vật sống, khi được bổ sung với lượng vừa đủ, nó sẽ đem lại lợi ích về mặt sức khỏe cho vật chủ Như vậy định nghĩa chỉ ra rằng có hạn chế sự

sự dụng thuật ngữ probiotic đối với những sản phẩm chứa các vi sinh vật sống đồng thời, nó cũng yêu cầu rằng để đạt được tác dụng tối ưu đối với vật chủ thì cần phải đưa vào liều lượng probiotic thích hợp

Việc nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong thực tiễn tăng nhanh kể từ 30 năm trở lại đây, điều này kéo theo nhiều quan điểm khác nhau về việc định nghĩa

probiotic Thuật ngữ probiotic đôi khi còn được sử dụng nhầm và đánh đồng với tác động có lợi do các vi sinh vật hội sinh đem lại, sự lạm dụng này đã gây ra hiểu nhầm rằng các yếu tố dinh dưỡng hoặc các yếu tố môi trường có thể kích hoạt các probiotic bẩm sinh trong cơ thể Các vi khuẩn hội sinh trong cơ thể thường là nguồn quan trọng để phân lập và tuyển chọn ra các probiotic Tuy nhiên, ngay cả khi các chủng ưu việt đó được xác định đầy đủ các tính chất như khối lượng, độ ổn định và các tác động về mặt sức khỏe thì chúng chưa hẳn đã là các probiotic Cơ quan Quản

lí Thuốc và Thực phẩm Hoa Kì (FDA) lại áp dụng các định nghĩa về probiotic khác nhau trong các lĩnh vực khác nhau Vi khuẩn sống được sử dụng trong thức ăn dành cho động vật thì gọi là các vi khuẩn làm thức ăn trực tiếp, còn nếu được sử dụng như là thuốc dành cho người thì chúng thuộc nhóm các liệu pháp sinh học sống Khi không có một thuật ngữ chính thống nào mang tính pháp lí thì việc tiếp thị các sản phẩm được dán nhãn là “probiotics” sẽ khó có thể đáp ứng được các tiêu chí cơ bản được quy định trong các định nghĩa khoa học [60] Đứng trước nhu cầu thực tiễn, FAO/WHO (2002) đã ra hướng dẫn về đánh giá probiotic trong thực phẩm, trong hướng dẫn đó đã thống nhất áp dụng định nghĩa về probiotic là “Các vi sinh vật sống khi bổ sung một lượng vừa đủ sẽ đem lại lợi ích về sức khỏe cho cơ thể vật

chủ” Bảng 3 dưới đây mô tả lại các khái niệm về probiotic qua các năm cho tới khi

có được một định nghĩa chính thức về probiotic

Bảng 3.Một số mô tả và khái niệm về probiotic được trích dẫn nhiều trong các năm qua [8]

Probiotics có phổ biến trong thực phẩm rau quả như các

vitamin, các hợp chất thơm, các emzyme, và các chất có ích

khác để kết nối các quá trình sống

Kollath (1953)

Probiotic đối lập với các chất kháng sinh Vergin (1954)

Các ảnh hưởng có hại của các chất kháng sinh có thể được

ngăn chặn bằng liệu pháp brobiotic

Kolb (1955)

Một hợp chất được tiết ta bởi một vi sinh vật, nó kích thích

sinh trưởng của các vi sinh vật khác

Lilly và Stillwell (1965)

Các chất chiết của mô, nó kích thích sự sinh trưởng của vi

sinh vật

Sperti (1971)

Các hợp chất mà dựng lên hàng rào ngăn chặn sự nhiễm

trùng trong cơ thể vật chủ nhưng nó lại không ức chế sự sinh

trưởng in vitro của các vi sinh vật

Fujii và Cook (1973)

Các sinh vật và các hợp chất mà nó góp phần vào duy trì cân

bằng hệ vi sinh vật ruột

Parker (1974)

Bổ sung vào thức ăn các vi sinh vật sống mà nó đem lại các

tác động có lợi đối với vật chủ là động vật bằng cách cải

thiện cân bằng vi sinh vật

Fuller (1989)

Nuôi cấy đơn hoặc nuôi cấy hỗn hợp của các vi sinh vật, nó

được bổ sung vào động vật hoặc con người, có lợi ích đối

với vật chủ bằng cách cải thiện các tính chất của hệ vi khuẩn

bản địa

Havenaar và Huisint’Veld (1992)

Dịch nuôi chứa vi khuẩn sống hoặc sản phẩm được nuôi cấy

tại trại sản xuất bơ sữa, nó đem lại các tác dụng có lợi về mặt

sức khỏe và dinh dưỡng đối với vật chủ

Salminen và cộng

sự (1996)

Các vi khuẩn sống, khi uống với một số lượng nhất định nó

sẽ phát huy các lợi ích về sức khỏe chứ không phải là do chế

độ dinh dưỡng vốn có

Schaafsma (1996)

Các chế phẩm tế bào vi sinh vật hoặc các hợp chất của các tế

bào vi sinh vật có tác động có lợi về sức khỏe và thể chất của

vật chủ

Salminen và cộng

sự (1999)

Một chế phẩm hoặc một sảm phẩm chứa vi khuẩn sống, khi

đưa vào với lượng cần thiết, nó thay đổi hệ vi sinh vật (bằng

cách gắn chặt hoặc khuẩn lạc hóa) trong một bộ phận của vật

chủ, qua đó nó thúc đẩy lợi ích về mặt sức khỏe trong cơ thể

vật chủ

Schrezenmeir và Vrese (2001)

Các vi sinh vật sống khi nó được đưa vào một lượng vừa đủ

thì đem lại lợi ích về mặt sức khỏe đối với vật chủ

FAO/WHO (2002) Probiotic thực sự là một lĩnh vực hấp dẫn đối với các nhà khoa học cũng như đối với các nhà sản xuất thương mại trong vài thập kỉ gần đây Tuy nhiên, việc tạo

ra một sảm phẩm chất lượng cao và an toàn thì cần phải có các tiêu chuẩn chặt chẽ quy định cho các sản phẩm được gắn nhãn là probiotic Các đặc tính và các tác động

có lợi của một probiotic lí tưởng được thể hiện rõ qua Bảng 4 và Hình 4

Bảng 4 Các tiêu chí lựa chọn probiotic ứng dụng trong thương mại [8, 54]

Tiêu chí an toàn Có nguồn gốc phân lập từ vật chủ

Không gây độc và gây nhiễm trùng

Có khả năng hoạt hóa trao đổi chất và các đặc tính vốn

có như khả năng kháng lại một số chất kháng sinh Tiêu chí công nghệ Ổn định khi sản xuất và khi bảo quản

Có tính nhạy cảm cao khi ở giai đoạn nghỉ

Có thể sản xuất ở quy mô lớn Tiêu chí chức năng Chịu đựng được dịch và axít dạ day

Chịu đựng được muối mật

Có khả năng bám dính tốt vào bề mặt niêm mạc Thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột

Ngăn chặn sự xâm lấn của các mầm bệnh Giảm các ô nhiễm trong cơ thể động vật Nâng cao năng suất vật nuôi

Có hoạt tính đối kháng với các mầm bệnh trong dạ dày

như Helicobacter pylori , Candida albicans

Tiêu chí sinh lí học Tăng cường khả năng miễn dịch

Có khả năng trao đổi cholesterol, lactose Giảm các phản ứng viêm

Giảm bài tiết amoniac và urê Các đặc tính về ngăn chặn đột biến gen, ngăn chặn sản xuất các chất gây ung thư

Hình 4 Hướng dẫn cho đánh giá Probiotic s n cho đánh giá Probiotic sử dụng cho thực phẩm (FAO/WHO, 2002) m (FAO/WHO, 2002)

Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể động vật thông qua đường uống và đem lại những lợi ích về mặt sức khỏe cho vật chủ Một vấn đề đặt ra là, cơ chế hoạt hóa của nó trong ống tiêu hóa của vật chủ diễn ra như thế nào? Ống tiêu hóa của động vật là một môi trường cho các vi khuẩn hoạt động, chúng ảnh hưởng lên cơ thể vật chủ theo những cách khác nhau Sự xâm nhập của các vi khuẩn diễn ra ngay khi động vật sinh ra sau đó hình thành nên một hệ vi khuẩn đường ruột Chính sự tương tác giữa các vi khuẩn với nhau cũng như sự tương tác giữa các vi khuẩn với vật chủ tạo nên một sự cân bằng động [64] Có một số cơ chế hoạt động của các prbiotic trong cơ thể vật chủ như: 1) Duy trì hệ vi sinh vật đường ruột bằng cách loại trừ vi sinh vật cạnh tranh và các vi sinh vật đối kháng [3, 33, 36, 47, 54]; 2) Thúc đẩy trao đổi chất bằng cách tăng hoạt tính của các enzyme tiêu hóa và giảm hoạt tính enzyme của các vi khuẩn cũng như giảm sản xuất amoniac, tổng hợp các chất kháng vi sinh vật [33, 36, 57]; 3) Cải thiện lượng thức ăn và khả năng tiêu hóa [36, 57]; 4) Kích thích thệ thống miễn [3, 8, 33, 36, 47, 64]

Cơ chế cạnh tranh theo kiểu loại trừ đã được sử dụng như một phương pháp

để kiểm soát loài đặc hữu cũng như các tác nhân gây bệnh ở gia cầm Rantala và Nurmi (1973) là những người đầu tiên áp dụng phương này để kiểm soát sự bùng

phát nghiêm trọng của Salmonella infantis trong các đàn gà ở Phần Lan Trong các

nghiên cứu của họ đã chỉ ra rằng chỉ cần một liều lượng yêu cầu rất thấp của

Salmonella (1-10 tế bào trong dạ dày tuyến) đã đủ khởi động cho bệnh nhiễm Salmonella Các tác giả cũng nhận thấy rằng, gà con ở tuần thứ thất sau khi nở thì

dễ bị nhiễm trùng Salmonella nhất Khi sử dụng một chủng Lactobacillus đã không

gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể vật chủ Từ đó, họ ước lượng được kích thước quần thểvi khuẩn tương đối ổn định trong đường ruột của gà trưởng thành

kháng lại Salmonella infantis Việc bổ sung bằng đường uống một nuôi cấy hỗn hợp của Lactobacillus và Salmonella cho gà con đã tạo ra khả năng kháng lại Salmonella một cách hiệu quảở dạng gà trưởng thành Cách làm này sau này trở

thành phương pháp Nurmi hay khái niệm cạnh tranhtheo kiểu loại trừ

Cạnh tranh theo kiểu loại trừ được cho là có nhiều cơ chế khác nhau như cạnh tranh về các vị trí của thụ thể trên niêm mạc ruột, tiết ra các chất kháng lại vi sinh vật, sản xuất các sản phẩm lên men phụ như axít béo bay hơi, cạnh tranh về các chất dinh dưỡng thiết yếu và kích thích chức năng miễn dịch của vật chủ [3, 22] Tuy nhiên, cơ chế tăng cường khả năng miễn dịch của vậ chủ mới được các nhà nghiên chú ý hơn cả [65] Nhiều tác động của probiotic là sự điều hòa miễn dịch thông qua các yếu tố trung gian, đặc biệt là thông qua điều khiển cân bằng của tiềm viêm và chống viêm các cytokine [25, 35] Các probiotic cũng được chứng minh rằng nó kích thích các tiểu phần của các tế bào trong hệ thống miễm dịch để sản xuất các cytokine [13, 42] Tuy nhiên, một số chủng probiotic đặc hiệu có thể kích thích miễn dịch bẩm sinh [12, 52] cũng như để tăng miễn dịch qua trung gian [21, 27, 46] Gill và cộng sự (2001) đã chỉ ra rằng, probiotic có thể làm tăng hoạt tính ở của tế bào giết tự nhiên ở người già thậm chí là có thể kích hoạt các cơ chế bảo vệ không đặc hiệu của vật chủ [19] Kabir và cộng sự (2004) đã đánh giá các động lực của probiotic trong việc đáp ứng miễn dịch của gà thịt và họ đã báo cáo rằng sự sản xuất kháng thể ở nhóm thí nghiệm cao hơn so với nhóm đối chứng Một khả năng khác của probiotic là tương tác với các vi khuẩn hội sinh thông qua các phân tử nhận dạng hay thụ thể TLR như TLR-2 và TLR-4 có ở trên biểu mô Tương tác như vậy gây ra tăng cường tiết cytokine để bảo vệ biểu mô và ức chế quá trình

tự chết của các tế bào [55].Lactobicullus casei có khả năng ngăn chặn dextran

sodium sufate (DSS)- tác nhân gây cảm ứng đại tràng trong chuột độtbiến TLR-4 bằng cách ức chế hoạt tính của myeloperoxidase và tăng hoạt tính của TGF-beta và

IL-10 mRNA Các tác động này được gọi là cơ chế hoạt động của L.casei phần lớn

phụ thuộc vào tình trạng của TLR-4 [14] Các vi khuẩn kích hoạt đáp ứng tiền viêm trong các tế bào biểu mô ruột bằng cách hoạt hóa yếu tố phiên mã NF-κB Ngược lại, các loài không gây bệnh có khả năng làm giảm các đáp ứng tiền viêm bằng cách ngăn chặn sự suy giảm của yếu tố điều hòa- ngược IκB Phương pháp ngăn chặn phản ứng tiền viên có ở vi khuẩn không gây bệnh đã được chứng minh, ví dụ như

Salmonella pullorum có khả năng làm giảm tiết IL-8 của vi khuẩn gây bệnh

Salmonella typhimurium [49] Một phương pháp giảm đáp ứng tiền viêm khác của

vi khuẩn hội sinh đã được chứng minh như trong trường hợpBacteroides

thetaiotaomicron, nó có khả năng ngăn chặn phản ứng tiền viêm trong các tế bào

biểu mô bằng cách chuyển yếu tố phiên mã NF-κB ra khỏi nhân tế bào bằng một con đường liên quan đến thụ thể của hormon nhân PPARγ, kết quả là giảm NF-κB- thông qua sự biểu hiện trung gian gen gây viêm, độc lập với con đường IκB [38]

Các nghiên cứu trên thỏ hoặc chuột đối với các probiotic Bacillus [33] đã chỉ

ra rằng probiotic có khả năng làm giảm sự tổng hợp INFγ cũng như cảm ứng sự sinh trưởng nhanh của của các tế bào CD4+ T Điều này phù hợp với các nghiên cứu sử dụng tế bào đơn nhân ở người cho thấy rằng các tế bào sinh dưỡng chứ không phải bào tử có khả năng kích thích phân chia- tăng sinh của tế bào lympho

[15] Một điều đáng lưu ý, các nghiên cứu in vivo chỉ ra rằng cytokine tiền viêm

IL-6 được sản xuất trong các đại thực bào được nuôi cấy với các bào tử Bacillus

subtilis hoặc Bacillus pumilus [20] Các đáp ứng tiền viêm có thể không nhất thiết

phải được coi là một tính năng có lợi của một probiotic [62]

yếu phụ thuộc vào b

viêm thông qua trung gian IL

của bệnh viêm ruộ

hưởng khác nhau như th

hợp đơn giản của các d

B

ế các vi khuẩn thối giữa, tăng cường chức năng c đáp ứng miễm dịch niêm mạc của vi khuẩn probi các vi khuẩn thối giữa, (1) sự sản xuất các chất kháng vi khu

c chế cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh, (3) s năng di chuyển của các vi khuẩn gây bệnh, (4) gi

t và (5) tăng cường khả năng rào chắn của thành ru

ng niêm mạc; B Mô hình phân tử liên quan đến m

n probiotic được xác nhận bởi thụ thể nhận d các TLR trên các tế bào hình sao Vi khuẩn probiotic có thể

ch theo một mô hình không viêm hoặc dungnạp mi

a tế bào T với các đặc tính điều hòa Probiotic c

u hòa âm tính Th1 và ức chế sự sản xuất các cytokin

α và INF-γ bởi tế bào hình sao Các đặc tính củ

c vào bản chất của các kích thích và các dạng probiotic Tr thông qua trung gian IL-23/IL-17 gần đây đã liên qua đến sinh b

ột nhưng vẫn còn những điều chưa biết về

ng khác nhau như thế nào đối với tế bào Th17 Biểu đồ này là m

a các dữ liệu in vivo và in vitro

Cho đến nay, probiotic có nguồn gốc rất đa dạng Có thể probiotic được phân lập từ đất, từ thực vật, động vật và con người Thông thường, probiotic có tính an toàn cao và thân thiện với vật chủ là probiotic được phân lập từ chính cơ thể của vật chủ và đa số là từ hệ tiêu hóa Các probiotic phổ biến là từ các chi như

Saccharomyces, Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium, Enterococcus[52, 54, 61]

Bảng 5 dưới đây thống kê một số loài chủ yếu được dùng làm probiotic phổ biến trên thị trường

Bảng 5 Một số vi sinh vật được dùng làm probiotic

pullorum, typhimurium

[18, 24, 36, 41, 43, 46, 52, 54, 69]

Lactobacillus

acidophilus, plantarum, bulgaricus, helveticus, salivarius, sporogenes,

delbrueckii, paracasei

[8, 18, 33, 36, 43, 46, 47, 53,

54, 61, 68]

69]

Bifidobacterium

longum infantis, animalis, lactis,

thetaiotaomicron, adolescentis

[8, 18, 33, 36, 43, 46, 47, 53,

54, 61, 68]

Bacillus

megaterium, pumilus, toyoi, cereus,

1.2.2 Probiotic sử dụng cho gia cầm

Các chế phẩm probiotic ngày càng phổ biến trên thị trường, doanh thu từ các chế phẩm này có sự tăng mạnh trong khi đó tốc độ tăng trưởng của các nghành công nghiệp chế biến thực phẩm khác có vẻ như chậm lại Theo báo cáo từ http://www.companiesandmarkets.com/Marke/ Food-and-Drink/Market-Research/, daonh thu toàn cầu của các loạithực phẩm sung probiotic và các loại thực phẩm khácđạt 23,1 tỉ đô la trong năm 2012 Doanh thu của các nhóm hàng này sẽ có thể đạt 27,1 tỉ đô la vào năm 2013 và 36,7 tỉ đô la vào năm 2018 với tỉ lệ tăng trưởng hàng năm đạt 6,2% trong vòng năm năm , từ 2013 đến 2018 Trong đó, thực phẩm chứa probiotic chiếm tỉ trọng lớn nhất (90,1%) trong tổng doanh thu

Probiotic tiếp tục thu hút sự quan tâm đáng kể của nhiều nhà sản xuất, các nhà khoa học, các cơ quan quản lí và các công ty, tập đoàn hàng đầu trên thế giới đang có thị phần lớn trong ngành công nghiệp probiotic như BioGaia Biologics

AB, Chr Hansen A/S, ConAgra Functional Foods, Danisco, Groupe Danone, Institut Rosell, Lifeway Foods, Inc., Natren, Inc., Nestle S.A., Seven Seas Ltd., Stonyfield Farm và Yakult Honsha Co Ltd Thị phần tập trung ở các khu vực như Bắc Mĩ, Châu Âu, Châu Á- Thái Bình Dương và một lượng nhỏ ở các khu vực còn lại trên thế giới [73]

Số lượng các sản phẩm có gắn nhãn probiotic không chỉ đa dạng về thành phần, chủng loại probitic mà nó còn đa dạng bởi cách chế biến, từ dạng sữa, dạng bột, dạng nước, dạng viên Thậm chí, probitic có cả trong bánh kẹo, thuốc đánh

răng hay trong đồ ăn nhanh, nướcgiải khát [61] Dưới đây (Bảng 6) là một số các

sản phẩm probiotic dùng cho gia cầm đang được bán trên thi trường

Bảng 6 Một số sản phẩm probiotic dùng cho gia cầm có mặt trên thị trường

Sản phẩm

Trên thi

trường

Đối tượng

UK http://www.provita.co.uk

tử và có khả năng kháng nhiệt cao Chúng sản xuất ra các enzyme tiêu hóa giúp tiêu hóa và chuyển hóa thức ăn do đó làm tăng trọng và sinh trưởng nhanh

BioPlus® 2B Lợn con,

gà, gà tây

Christian Hansen Hoersholm,

Denmark http://www.chbiosystems

Tăng tốc độ sinh trưởng đối với động vật sử dụng sản phẩm

Esporafeed

Plus® Lợn Norel, S.A Madrid, Spain

1 x109B cereus (CECT

953)

Tăng tốc độ sinh trưởng, giảm chỉ

số FCR, làm tăng lứa đẻ ở lợn nái

Toyocerin®

Gia cầm,

bê con và

Có thể sử dụng cho thủy sản

Asahi Vet S.A., Tokyo (Head Off.), Japan

kasei.co.jp

http://www.asahi-B cereusvar toyoi

1012) ở nồng độ tối thiểu là

(NCIMB-40112/CNCM-1 x(NCIMB-40112/CNCM-1010 CFU/g

Ổn định hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện hiệu quả và khả năng tiêu hóa tốt hơn các chất dinh dưỡng

Ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật gây bệnh như

Salmonella và E coli

SYNLAC® II

Gia cầm, thú nuôi, đặc biệt

là gà và lợn

Synbio Tech Inc., Kaohsiung City, taiwan http://www.synbiotech.com.tw/

Lactobacillusacidophilus LAP5, Lactobacillus

SYNLAC® III Lợn, gia

cầm

Synbio Tech Inc., Kaohsiung City, taiwan http://www.synbiotech.com.tw/

Lactobacillusacidophilus LAP5, Lactobacillus

Bliss plusTM Gia cầm

Innova Biotechnologies, Uttakhand, India

http://innovabiotechnologies.tradeindia.com/

Saccharomyces cervisiae, Lactobacillus acidophilus, Bacillus

subtilis,Lactobacillus casei

Nồng độ 5x109 CFU/g

Sản xuất axít lactic và các axít béo mạch ngắn, cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột,kích thích thành ruột ruột hình thành tầng niêm mạc giúp tăng cường chức năng bảo vệ và miễn dịch Hạn chế

sự phát triển của các vi khuẩn có

hại như E.coli, Clostridia và Salmonella Giảm lượng amoniac,

amin độc và các chất độc do vi khuẩn tiết ra ở trong ruột Nhanh chóng phục hồi hệ vi khuẩn đường ruột sau khi ruột bị rối loạn, mất cân bằng

Spectra-DFM

Gia cầm

và thú nuôi

Neospark Drugs and Chemicals Private Limited, Telangana, India http://www.neospark.com/

Lactobacillus sp., Bacillus sp., Acetobacter sp và Saccharomyces sp Nồng độ

1x1012 CFU/g

Ức chế sự hình thành khuẩn lạc của các vi khuẩn gây bệnh Giảm cường

độ trao đổi chất của vi sinh vật cũng như giảm lượng amôniac và các amin độc đối với cơ thể vật

Neospark Drugs and Chemicals Private Limited, Telangana, India http://www.neospark.com/

Gồm 13 loài vi khuẩn sống của các chi như

Lactobacillus, Bacillus,

Saccharomyces 1×1012Nồng độ CFU/g (Tổng số vi

SPORULIN® Gia cầm

Pacific Vet Group USA http://www.pacificvetgroup.com/

Bacillus subtilis

Tăng sức khỏe đường ruột, tăng trọng trung bình hàng ngày lớn hơn Cải thiện khả năng chuyển hóa thức ăn Giảm tình trạng viêm ruột

GalliPro® Gia cầm

Chr Hansen, Hørsholm ,Denmark

hansen.com/

http://www.chr-Bacillus licheniformis Nồng

độ 1.6×109 bào tử/g

Kích thích sự tăng tiết enzyme tiêu hóa, qua đó cải thiện khả năng phân giải thức ăn Làm giảm chỉ số FCR Không làm thay đổi chế độ ăn của động vật sử dụng

Lacto Jet Gia cầm

http://www.indiamart.com/

chống lại hiện tượng viêm niêm mạc ống tiêu hóa Tăng trọng cho vật nuôi, giảm tỉ lệ tử vong, giảm chỉ số FCR và hàm lượng amôniac

Esprafeed Lợn, gia

cầm và thủy sản

Norel México, El Marqués, Mexico http://www.norel.es/

Bacillus cerus CECT 953

Mồng độ tối thiểu 1x1010

bào tử/g

Kích thích sinh trưởng của vật chủ, hạn chế các rối loạn đường tiêu hóa, tăng cường chống lại sự sinh trưởng của các vi khuẩn có hại cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn

Lactina®

Gia cầm,

bê con, thỏ, lợn

Lactina Ltd., 101 Sofia str., Bulgaria

ltd.com/

http://www.lactina-Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium Nồng

độ 5×109 CFU/g

Tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự thối rữa và đem lại sự cân bằng tối ưu của hệ vi khuẩn đường ruột Tăng cường nhu động trong lòng ống tiêu hóa Có tính đối kháng cao đối với vi sinh vật gây bệnh

1.2.3 Các chủng vi khuẩn Bacillus sử dụng làm probiotic cho gia cầm

Probiotic cho gia cầm có nguồn gốc rất đa dạng và phong phú, tuy nhiên

Bacillus đang được chú ý nhiều hơn bởi những đặc tính nổi trội như bền nhiệt, hình

thành nội bào tử, sinh trưởng nhanh, chịu được axít dạ dày, chịu được muối mật Điều đáng nói là, đa số các sản phẩm có dán nhãn probiotic còn chưa được sự cấp phép của các cơ quan quản lí chuyên ngành Việc không khắt khe trong kiểm soát chất lượng cũng như hiệu quả và an toàn sử dụng probiotic dẫn đến các sản phẩms ử dụng tràn lan trong chăn nuôi làm ảnh hưởng đến năng suất cũng như hiệu quả kinh

tế Các sản phẩm cần được đánh giá một cách chi tiết như hướng dẫn của FAO/WHO [23] là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả sử dụng cũng như tăng cường khả năng phòng bệnh cho vật nuôi Khi phân tíchBảng 7, cho thấy số lượng sản phẩm thương mại dán nhãn probiotic được cấp phép có cơ quan quản lí không phải là nhiều, một số sản phẩm thương mại cũng không có thông tin về sự kiểm soát của các cơ quan chức năng

Bảng 7 Một số sản phẩm thương mại chứa bào tử [33]a

Sản phẩm

Đối tượng sử dụng

Nhà săn xuất Thành phần/Tham chiếu

BioGrow®

Gia cầm,

bê con và lợn

Provita Eurotech Ltd., Omagh, Bắc Ireland, Vương Quốc Anh

http://www.provita.co.uk

Được liệt kê chứa B licheniformis(1.6 × 109

vỗ béob

Christian Hansen Hoersholm, Đan Mạch

http://www.chbiosyste

Hỗn hợp (1/1) của B licheniformis (DSM 5749)

và B subtilis (DSM 5750) ở

nồng độ 1.6×109 CFU/g của

ms.com mỗi loại vi khuẩn Được

Paciflor_

C10

Bê, gia cầm, thỏ

B cereus CIP5832 (ATCC 14893) 2×108–5×109 bào tử mỗi liều, tùy thuộc vào loài động vật sử dụng Đã ngừng sản xuất từ năm 2002

Toyocerin®c

Bê, gia cầm, thỏ

và lợn

Cũng được sử dụng cho thủy sản

Asahi Vet S.A., Tokyo (Head Off.), Japan http://www.asahi-kasei.co.jp

B cereus var toyoi

(NCIMB-40112/ 1012) ở nồng độ tối thiểu là 1×1010 CFU/g trộn với bột

CNCM-mì (4% trọng lượng) và canxi cacbonat (90% trọng lượng) Sản phẩm được cấp phép tại EUc

Calsporin® Gà giò, lợn

con

Orffa International Holding B.V

Werkendam, Hà Lan http://www.orffa.com/

Bacillus subtilis C-3102, nồng

độ 1×1010 CFU/g Sản phẩm được cấp phép bởi EU

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và hóa chất

2.1.1 Mẫu ruột gà

Gà được lựa chọn từ các vùng Bắc Ninh, Mê Linh, Phú Thọ, Thanh Hóa và Cao Bằng Tất cả các loại gà này đều được chăn thả và ăn thức ăn tự nhiên (không chứa các probiotic thương mại) Sau khi lựa chọn được các giống gà, gà được giết

mổ, lấy ruột Ruột được bảo quản trong nước muối sinh lí

2.1.2 Các chủng vi khuẩn tham chiếu

Trong đề tài này chúng tôi đã sử dụng một số loài vi khuẩn tham chiếu sau:

 Bacillus indicus HU36: Chủng vi khuẩn sắc tố màu vàng cam

sinh carotenoid được phân lập từ phân người, được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, Luân Đôn, Anh Quốc

 Bacillus subtilis HU58: Chủng vi khuẩn có khả chịu nhiệt cao,

sinh trưởng nhanh, được phân lập từ phân người, được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, Luân Đôn, Anh Quốc

 Bacillus subtilis PY79: Chủng vi khuẩn Bacillus subtilischuẩn

phòng thí nghiệm được cung cấp bởi Giáo sư Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, Luân Đôn, Anh Quốc

 Bacillus cereus:Chủng chuẩn được mua từ Viện Kiểm nghiệm

thuốc Trung ương, Việt Nam

 Probiotic có tên thương mại BioPlus YC (gồm 2 chủng B subtilis DSM 5750 và B licheniformis 5749) của hãng Chris Hasen, Đan

Mạch, nồng độ 1,6 x 109 CFU/g mỗi chủng

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

 Difco Sporulation Medium (DSM)

g/l Nutrient Broth 8

MgSO4.7H2O 0.25

ml/l Ca(NO3)2 1M 1

MnCl2 0.01M 1 FeSO4 1mM 1

2.1.4 Hóa chất sinh học phân tử

Tất cả các hóa chất dùng trong sinh học phân tử đều được cung cấp bởi các hãng nổi tiếng trên thế giới như Enzyomics, Promega, Bio Basic, Merck Millipore, Thermo Sicentific, Sigma-Aldrich,

Để tách chiết, khuếch đại cũng như tinh sạch DNA cần sử dụng các hóa chất như: Protease K (20 mg/ml), Ethanol, nước khử ion khử trùng, Lysozyme, Hot Taq, Taq Buffer, Taq Polymerase, Tris Base, dNTPs, Agarose Cặp mồi đề khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S rRNA là 27F:5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3' và 1527R:5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’, 1527R