ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
V t liệu
- Thu th p mẫu trong 15 tháng (từ tháng 3/2014 đến tháng 5/2015)
- Xét nghiệm (xét nghiệm và định type NoV): Tháng 4 - tháng 7 năm 2015
- Máy real time PCR Rotogene (Qiagen, Đức)
- Máy luân nhiệt (Eppendorf, Hoa Kỳ)
- Máy điện di (BioRad, Hoa Kỳ)
- Máy chụp ảnh gel VersaDoc (BioRad, Hoa Kỳ)
- Máy ly tâm (Hettick, Đức),
- Đĩa 96 giếng Maxisorp (Nunc, Hoa Kỳ)
- Đầu côn có lọc, ống khử trùng: 0,1 ml, 0,2 ml, 1,5 ml
Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị quan trọng như cân phân tích, máy đo pH, máy trộn, micropipet, máy minispin và lò vi sóng cũng đóng vai trò thiết yếu.
- Sinh phẩm cho phản ứng Realtime phát hiện các chủng NoV trong mẫu phân: + Kit tách chiết ARN – High pure viral RNA kit (Roche, Đức)
+ Bộ sinh phẩm real time RT-PCR (SuperScript III Platinum One-Step qRT- PCR Kits-Invitrogen, Hoa Kỳ)
+ Chứng dương NoV chủng GI.1 và GII.4 (Phòng Miễn dịch Vắc xin, Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)
+ Cặp mồi và đầu dò đặc hiệu NoV trong phản ứng Realtime RT-PCR
+ Bộ sinh phẩm One-step RT-PCR (Qiagen, Đức)
+ Bộ Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Kỳ)
- Sinh phẩm cho xác định kiểu gen FUT-2:
+ Kit tách chiết Gentra Puregene Buccal Cell Kit (Qiagen, Đức)
+ Mồi amplify đoạn 1033 bp của gen FUT 2 (IDT, Hoa Kỳ)
+ Bộ Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Kỳ)
- Sinh phẩm cho xác định kiểu hình HBGA (ABH và Lewis)
+ Các loại kháng thể đơn dòng A, B, H, Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b (Covance, Hoa kỳ)
+ Các loại kháng thể cộng hợp đề kháng chuột (KPL, Hoa Kỳ)
Để thu thập mẫu phân, bạn cần sử dụng thìa sạch để lấy khoảng 5g phân từ bô của trẻ, đảm bảo trẻ không có biểu hiện tiêu chảy Sau đó, cho mẫu vào ống vô trùng không chứa chất bảo quản và bảo quản ống ở nơi thích hợp.
20 0 C rồi v n chuyển đến viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương định kỳ 1 tháng/1 lần Tại phòng thí nghiệm mẫu được bảo quản ở -70 0 C đến khi làm xét nghiệm
Để thu thập mẫu niêm mạc, cần lấy mẫu ít nhất 30 phút sau khi trẻ ăn Sử dụng chổi lấy mẫu quệt vào hai má trong của trẻ, mỗi bên thực hiện 10 lần Sau đó, cắt phần lông chổi và cho vào ống chứa 1 ml đệm bảo quản Mẫu cần được bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 tháng trước khi tiến hành tách chiết ADN.
Để thu thập mẫu nước bọt, sử dụng ống hút để lấy khoảng 100-200ml nước bọt từ mỗi trẻ Sau khi lấy mẫu, bảo quản ở nhiệt độ 4 độ C và vận chuyển đến Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
Số lượng mẫu và mục đích nghiên cứu được thể hiện ở sơ đồ sau:
2.4.2 Kỹ thuật real time-RT PCR phát hiện ARN của NoV a Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân
Bước 1: Mẫu phân được lấy từ -80 o C Sau khi tan băng, pha loãng 4 lần bằng nước DEPC-H2O (100 àl mẫu: 300 àl nước DEPC-H 2 O)
Bước 2: Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4 o C, thu dịch nổi
ARN đ ợc tách chiết t eo ớng dẫn của bộ kít H pure v ral ARN của n à sản xuất Roc e, Đức Cụ thể:
Bước 1: Cho 200 àl dịch nổi mẫu pha loóng vào ống eppendorf 1,5 ml chứa hỗn hợp poly (A) carrier ARN: Binding Buffer, trộn đều trong 15 giây
Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thường (15-25 o C) trong 10 phút sau đó spindown
Để tiếp tục quy trình, hãy đặt cột vào tuýp hứng 2 ml mới Sau đó, đổ toàn bộ dung dịch mẫu và poly (A) carrier ARN: Binding Buffer lên cột, lưu ý không làm ướt mép cột Đóng nắp cột lại và ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 15 giây Cuối cùng, chuyển cột sang tuýp 2 ml mới.
Bước 4: Cẩn th n mở nắp cột, tránh không làm bắn giọt và nhiễm chéo Thêm
500 à l Inhibitor Removal Buffer vào cột.Đúng nắp và ly tõm 8.000 vũng/phỳt trong 1 phút Chuyển cột sang tuýp 2 ml mới
Bước 5: Mở nắp cột cẩn thận và thêm 450 ml Wash Buffer vào ống lọc, sau đó đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang ống 2 ml mới Bước 6: Mở nắp cột lần nữa và cho 450 ml Wash Buffer (lần 2) vào ống lọc, đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ dịch trong ống 2 ml và ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong khoảng 10 giây.
Bước 7: Chuyển cột sang tuýp 1,5 ml mới và cho 50 àl dung dịch Elution Buffer vào giữa cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút
Bước 8: Bỏ cột, thu dịch, bảo quản ARN của virus ở -80°C b Kỹ thuật realtime- RT PCR phát hiện ARN của NoV
Phát hiện ARN của NoV trong bệnh phẩm sử dụng cặp mồi và đầu dò đặc hiệu có độ nhạy và đặc hiệu cao Đầu dò đặc hiệu cho phép khẳng định sự có mặt của ARN NoV, trong khi cặp mồi nhắm vào đoạn gen ít thay đổi nhất giữa gen mã hóa protein polymerase và gen mã hóa vỏ virus Một đoạn ngắn khoảng 100 bp sẽ được khuếch đại và phát hiện qua tín hiệu huỳnh quang Quy trình này được Kageyama và cộng sự (2003) áp dụng, với ngưỡng dương tính của kỹ thuật real-time RT-PCR là 40 Các mẫu dương tính có Ct350àl, lặp lại bước trờn
Bước 6: Loại bỏ dịch Nhỏ 0,75ml dung dịch Membrane wash solution vào cột Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch
Bước 8: Thêm 0,5ml Membrane wash solution vào cột, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút
Bước 9: Loại bỏ dịch và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút
Chuyển cột sang tuýp 1.5ml mới và nhỏ 50µl H2O-DEPC vào giữa màng Ủ ở nhiệt độ thường trong 1 phút, sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút Để tăng nồng độ sản phẩm mong muốn, có thể giảm lượng H2O-DEPC sử dụng.
H 2 O cho vào ớt nhất là 15àl
Bước 11: Bỏ cột và bảo quản sản phẩm ở -20 o C
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được kiểm tra độ tinh khiết và hàm lượng thông qua phương pháp đo OD tại bước sóng 260 nm và điện di trên gel agarose 1% Những mẫu đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết (chỉ có một băng duy nhất trên gel agarose) và hàm lượng (nồng độ tối thiểu 20 ng/µl) sẽ được gửi đi giải trình tự gen tại công ty Macrogen ở Hàn Quốc.
Kết quả giải trình tự gen đã được phân tích bằng phần mềm Mega5, và cây phân loại được xây dựng dựa trên các trình tự gen từ Genbank cùng với các trình tự gen của các chủng NoV phát hiện trong nghiên cứu này.
2.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen FUT-2
ADN được tách chiết từ mẫu niêm mạc miệng của trẻ theo hướng dẫn của bộ kít Gentra Puregene Buccal Cell của nhà sản xuất Qiagen, Đức Cụ thể:
Để thu mẫu tế bào niêm mạc miệng, sử dụng chổi lấy mẫu quệt vào 2 má trong của trẻ, mỗi bên 10 lần, tốt nhất là thực hiện sau khi trẻ ăn hoặc uống 1 giờ Sau khi thu thập, cắt phần lông chổi và cho vào ống 1,5ml Mẫu có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15-25°C) tối đa 1 tháng trước khi tiến hành tách chiết ADN, hoặc ADN có thể được tách chiết ngay lập tức.
Xử lý số liệu
Các số liệu thu th p được xử lý bằng phương pháp thống kê y học và chương trình Epi info 7, SPSS
Xử lý trìn tự nucleot de
+ Sau khi nh n được các trình tự nucleotide từ Macrogen, các trình tự thô được xử lý bằng phần mềm Bioedit 7.0 và Mega 5.0
+ Kiểu gen của NoV được xác định bằng cách đăng tải trình tự nucleotide lên trang web http://www.rivm.nl/mpf/NoV/typingtool
Kiểu gen của FUT-2 tại các vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 được xác định thông qua phân tích đỉnh sóng bằng phần mềm Bioedit 7 Các trình tự đã được chỉnh sửa thủ công để phát hiện vị trí dị hợp tử, và vị trí đa hình của tất cả các trình tự được gửi để tính toán tỷ lệ đột biến ở các vị trí C357T, A385T, G428A, C571T, C628T, 685delTGG, G849A Nghiên cứu này cũng dự đoán mối quan hệ giữa các đột biến và độ nhạy cảm của NoV.
SƠ ĐỒ TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Hìn 2.2 S đồ tóm tắt nộ dun n ên cứu
Phát hiện ARN trong mẫu phân của NoV bằng kỹ thu t real time- RT PCR
Xác định NoV genotype bằng khuếch đại vùng gen C và giải trình tự
Xác định tỷ lệ nhiễm
NoV và kiểu gen của các chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh
Tách ADN từ mẫu niêm mạc miệng của trẻ khỏe mạnh
Xác định các kiểu SNP trên gen FUT2 và giải trình tự Đánh giá mối liên quan giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen FUT2
Phát hiện kháng nguyên trong mẫu nước bọt bằng kỹ thu t ELISA Đánh giá mối liên quan giữa kiểu hình của kháng nguyên HBGA với tính cảm nhiễm NoV
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Mối liên hệ giữa tính cảm nhiễm NoV với kiểu gen của FUT-2
Như v y, nghiên cứu này của chúng tôi đã góp phần đánh giá vai trò tiềm ẩn của NoV lưu hành ở trẻ em Việt Nam và thế giới nói chung
3.3 Mố l ên ệ ữa tín cảm n ễm NoV vớ k ểu en của FUT-2
Mức độ cảm ứng của cơ thể với virus norovirus (NoV) liên quan đến gen FUT-2, mã hóa enzym fucosyltransferase α(1,2) để điều chỉnh sự biểu hiện của kháng nguyên H, từ đó ảnh hưởng đến tình trạng tiết của các kháng nguyên ABH trong nhóm máu Việc xác định trạng thái tiết này là quan trọng trong các nghiên cứu liên quan đến bệnh và các đột biến nucleotit trong gen FUT-2, đặc trưng cho từng dân tộc Nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự hai exon của gen FUT-2 từ 85 mẫu trẻ em từ 6-60 tháng tuổi tại một trường mầm non ở tỉnh Hà Nam Mục tiêu là mô tả tỷ lệ đa hình nucleotit đơn (SNP) trên gen FUT-2 ở trẻ nhiễm và không nhiễm NoV, từ đó xác định mối quan hệ giữa SNP và sự nhạy cảm với nhiễm NoV.
3.3.1 Tần số SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2
Sau khi thực hiện giải trình tự, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Bioedit v7.1 để xác định các SNP, phát hiện 7 SNPs gồm C357T, A385T, G428A, C571T, C628T, 685delTGG, và G849A trong vùng mã hóa của gen FUT-2 Các mẫu này được thu thập từ 85 trẻ mẫu giáo ở Hà Nam thông qua xét nghiệm ADN trực tiếp từ tế bào niêm mạc miệng Hình tín hiệu của các SNP ở gen FUT2 đã được ghi nhận.
Tần số các đột biến nucleotit này được trình bày trong bảng 3.5
Bản 3.5 Tần số các SNP tạ v trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên en
FUT-2 ở trẻ tạ 01 tr ờn mẫu áo tạ Hà Nam
Từ bảng 3.5 cho thấy, đột biến C357T là phổ biến nhất ở Việt Nam Trong
Trong một nghiên cứu với 85 trẻ, chỉ có 1 trẻ mang kiểu gen AA (1,2%), trong khi tần số kiểu gen Aa và aa lần lượt là 15,3% và 83,5% Đột biến A385T, gây ra sự không ổn định của enzym, phổ biến trong cộng đồng người Việt Nam với tần số kiểu hình Aa tại vị trí 385 đạt khoảng 52,9%, và có 24 trẻ (28,2%) mang kiểu gen aa Đáng lưu ý, không có trẻ nào trong số 85 trẻ khảo sát mang SNP ở vị trí 685delTGG, cũng như không có kiểu hình aa ở các vị trí 428, 571, 628, 849 trong toàn bộ quần thể.
Kết quả thu được tương đồng với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam và các khu vực địa lý khác (bảng 3.6).
Bản 3.6 Các tần số đột b ết ở FUT-s ở các quần t ể C âu Á lán ền và V ệt Nam
Nam Hán 154 84,4 43,5 0 0,7 0 - 0 Chang et al[25]
Thái Lan 530 88,9 50,94 0 0,6 0,4 - 0,9 Chang et al[25]
3.3.2 Mối quan hệ giữa alen đồng hợp lặn A385T và sự kháng nhiễm NoV
SNP C357T không ảnh hưởng đến cấu trúc amino axit của enzyme fucosyltransferase, trong khi SNP A385T làm enzyme này trở nên không ổn định Nghiên cứu này mô tả mối liên hệ giữa SNP A385T và khả năng kháng nhiễm virus Norovirus (NoV) Các mẫu được thu thập từ trẻ em tại trường mầm non ở Hà Nam trong khoảng thời gian từ tháng 03/2014 đến tháng 05/2015, với 85 mẫu tế bào niêm mạc miệng được lấy từ 85 trẻ Virus NoV đã được phát hiện và xác định kiểu gen từ 83 mẫu phân, trong đó 31 trường hợp dương tính với NoV cho thấy 9 trẻ nhiễm nhóm gen NoV GI và 22 trẻ nhiễm nhóm gen NoV GII.
Bản 3.7 P ân bố k ểu en 385 tron 85 n ờ có mẫu p ân đ ợc xét n ệm lây n ễm NoV
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trẻ em nhiễm virus Norwalk (NoV) giữa các nhóm gen là tương đương Trong số 9 trường hợp nhiễm NoV genotype I (GI), có 3 trường hợp mang gen aa, chiếm 33,3% Đối với 22 trường hợp nhiễm NoV genotype II (GII), có 5 trường hợp mang gen aa, tương đương 22,7%.
Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng tình trạng tiết kháng nguyên HBGA trên niêm mạc và trong dịch tiết có liên quan đến nguy cơ nhiễm virus Norovirus (NoV) cao hơn, trong khi những người không tiết HBGA (non-secretors) có khả năng nhiễm NoV thấp hơn Hơn nữa, các nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học cho thấy những người tiết kháng nguyên có mức độ kháng thể cao hơn và thường xuyên bị tái nhiễm NoV hơn so với nhóm không tiết HBGA Bài viết này sẽ trình bày mối quan hệ giữa 7 đột biến ở gen FUT-2 và độ nhạy cảm với nhiễm NoV.
Nghiên cứu cho thấy số lượng cặp mẫu phân-niêm mạc miệng của trẻ thu thập không nhiều, do đó chưa thể kết luận rõ ràng về mối liên quan giữa kiểu gen đồng hợp lặn aa và sự kháng nhiễm NoV Tuy nhiên, có thể nhận thấy rằng trẻ em có kiểu gen aa ở vị trí A385T có xu hướng kháng nhiễm NoV nhóm GII.
3.4 Mố t n quan ữa k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức và k ả năn cảm n ễm NoV ở trẻ k ỏe mạn tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam
3.4.1 Kiểu hình HBGA ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non Hà Nam
Tình trạng tiết kháng nguyên HBGA được quyết định bởi enzyme FUT-2, trong khi kiểu hình Lewis ab, xy và ABO liên quan đến enzyme FUT-3 cùng với enzyme A/Enzyme B sau hoạt động của FUT-2 Sự xác định tình trạng tiết kháng nguyên HBGA dựa vào kiểu hình Lewis ab và xy, trong đó kiểu hình không tiết thể hiện sự vắng mặt của kháng nguyên Lewis b và Lewis y, cùng với sự hiện diện của kháng nguyên Lewis a và Lewis x Việc xem xét sự biểu hiện của hai loại kháng nguyên có tiền chất khác nhau (H1 cho Lewis ab và H2 cho Lewis xy) giúp đánh giá chính xác hơn tình trạng tiết HBGA.
Nghiên cứu này xác định HBGA, bao gồm kháng nguyên Lewis ab, Lewis xy và nhóm ABO, trong 119 mẫu nước bọt của trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non ở Hà Nam bằng phương pháp ELISA Kết quả cho thấy sự phong phú của kiểu hình HBGA, với kiểu hình Le a-b+ Le x-y+ là phổ biến nhất, chiếm 46,2% và 52,9% trong tổng số mẫu Tỷ lệ trẻ có kiểu hình tiết hoàn toàn (Le a-b+ Le x-y+) đạt 42,0%, trong khi kiểu hình tiết không hoàn toàn bao gồm các kiểu hình chứa Le a+b+ và/hoặc.
Kiểu hình Le x+y+ chiếm 53%, trong khi kiểu hình không tiết (Le a+b- Le x+y- , Le a+b- , Le x-y- , Le a-b- ) chỉ chiếm 2,5% Ngoài ra, kiểu hình không xác định được tình trạng tiết kháng nguyên (Le a-b- Le x-y- ) cũng chiếm 2,5%, như thể hiện trong bảng 3.8, 3.9 và 3.10.
Bản 3.8 P ân bố k ểu ìn k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức
Lew s a, b ở trẻ tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam (n9)
Kháng nguyên Số mẫu Tỷ lệ (%)
Bản 3.9 P ân bố k ểu ìn k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức
Lew s x, y ở trẻ ta tr ờn mầm non ở Hà Nam (n9)
Kháng nguyên Số mẫu Tỷ lệ (%)
Bản 3.10 Tổ ợp k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức Lew s ab và xy ở trẻ tạ tr ờn mầm non ở Hà Nam (n9)
Kháng nguyên Le xy (%) Tổn Tỷ lệ (%)
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kiểu hình tiết không hoàn toàn ở trẻ khỏe mạnh tại Việt Nam khá cao, với 5%, thấp hơn so với 20% ở các nước châu Á khác Các mẫu nước bọt từ trẻ tại Hà Nam cho thấy tỷ lệ trẻ có kiểu hình không tiết kháng nguyên chỉ chiếm 2,5% Điều này có thể giải thích cho tỷ lệ nhiễm NoV cao ở Việt Nam và các nước châu Á.
Theo bảng 3.8 và 3.9, tỷ lệ không tiết kháng nguyên Lewis ab (Le a- b-) và Lewis xy (Le x-y-) tương đương nhau, lần lượt là 7,6% và 6,8% Việc kết hợp phát hiện kháng nguyên Lewis ab và Lewis xy cho phép xác định tình trạng tiết kháng nguyên hoàn toàn, không hoàn toàn hoặc không tiết ở 97,5% các trường hợp.
Trong nghiên cứu, có 3 trường hợp không xác định được tình trạng tiết kháng nguyên (kiểu hình Le a-b- /Le x-y-), chiếm 2,5% tổng số mẫu (bảng 3.10) Việc xét nghiệm đồng thời các kháng nguyên Lewis ab và xy giúp nâng cao khả năng xác định kiểu hình tiết kháng nguyên HBGA.
Hiện nay, nghiên cứu về hai loại kháng nguyên có tiền chất H1 và H2 đối với tính cảm nhiễm virus còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào Lewis ab với tiền chất H1 Nghiên cứu của Bucardo và cộng sự (2009) chỉ ra rằng tỷ lệ người gốc Phi có kiểu hình Le a-b- khá cao (25%), ảnh hưởng đến việc đánh giá tình trạng tiết HBGA Trong nghiên cứu này, tỷ lệ kiểu hình Le a-b- là 7,6%, nhưng việc đánh giá Lewis xy diễn ra đồng thời giúp xác định rõ kiểu hình của 100% đối tượng, phân biệt giữa tiết hoàn toàn và không hoàn toàn Sự không thống nhất trong kết luận về mối liên hệ giữa kiểu hình Lewis ab và ABO với tình trạng nhiễm NoV trong các nghiên cứu trước có thể được giải thích bởi lý do này Do đó, cần kết hợp đánh giá kiểu hình Lewis xy với kiểu hình Lewis ab khi xem xét tình trạng tiết HBGA.
Khi đánh giá sự phân bố của kháng nguyên nhóm máu ABO trong mẫu nước bọt của 119 trẻ, trẻ không biểu hiện kháng nguyên A hoặc B (kiểu hình O) chiếm
(47,9%), trẻ mang kháng nguyên A tương đương với trẻ mang kháng nguyên B lần lượt là 20,2% và 23,5%, trẻ mang cả hai kháng nguyên A, B chiếm tỷ lệ thấp nhất (8,4%) (Bảng 3.11)
Bản 3.11 Tỷ lệ k án n uyên n óm máu t n dun tổ c ức ABO (n9)
Kháng nguyên ABO Số mẫu Tỷ lệ (%)