Nghiên cứu phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa black queen cell virus trên ong mật ở miền bắc việt nam

Ong mật thường bị tấn công bởi nhiều tác nhân gây bệnh bao gồm virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Các dữ liệu nghiên cứu về bệnh ong những năm gần đây cho thấy, một trong những nguyê

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRỊNH THỊ THU

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH

THỐI ĐEN MŨ CHÚA (BLACK QUEEN CELL VIRUS)

TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số : 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đồng Văn Quyền

TS Trần Thị Thanh Huyền

Hà Nội, năm 2014

ơn tới NCS Hà Thị Thu cùng các cô chú, các anh các chị và các em đang công tác tại phòng VSVHPT luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo cho tôi môi trường nghiên cứu và làm việc nghiêm túc

Tôi xin gửi lời biết ơn tới ban lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và phát triển Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.Trần Thị Thanh Huyền, các thầy

cô trong bộ môn Vi sinh vật học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại trường

Và cuối cùng, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, người thân, những người đã luôn sát cánh cùng tôi, chia sẻ và động viên tôi không ngừng nỗ lực vươn lên trong học tập cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Trịnh Thị Thu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LOÀI ONG 3

1.1.1 Nguồn gốc của ong 3

1.1.2 Hình thái cấu tạo ngoài của ong 3

1.1.3 Vị trí phân loại của ong 4

1.1.4 Các loài ong ở Việt Nam 4

1.1.5 Miễn dịch học ở ong 7

1.2 TÌNH HÌNH THỊ TRƯỜNG MẬT ONG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 8

1.2.1 Tình hình thị trường mật ong trên thế giới 8

1.2.2 Tình hình thị trường mật ong ở Việt Nam 10

1.3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP Ở ONG 12

1.3.1 Bệnh ở ong do các tác nhân gây bệnh không phải virus 12

1.3.2 Bệnh ở ong do virus gây ra 16

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÁT HIỆN VIRUS Ở ONG MẬT 23

1.4.1 Phương pháp ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) 23

1.4.2 Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 24

1.4.3 Phương pháp RT – PCR 25

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG VIỆT NAM 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 27

2.2 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 27

2.2.1 Vật liệu 27

2.2.2 Hóa chất và sinh phẩm 27

2.2.3 Trang thiết bị 28

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 30

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30

2.3.3 Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ nanodrop 31

2.3.4 Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số 31

2.3.5 Khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho BQCV từ cDNA bằng phản ứng PCR 33

2.3.6 Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% 34

2.3.7 Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 35

2.3.8 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli 36

2.3.9 Tách chiết plasmid 37

2.3.10 Cắt kiểm tra plasmid với enzyme giới hạn EcoRI 38

2.3.11 Tinh sạch plasmid tái tổ hợp 39

2.3.12 Giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100 40

2.3.13 Nhân dòng gen mã hóa helicase và xây dựng cây phát sinh loài 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 PHÁT HIỆN SỰ LÂY NHIỄM BQCV TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM 44

3.1.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 44

3.1.2 Phát hiện BQCV bằng kỹ thuật RT-PCR 44

3.1.3 Tách dòng sản phẩm RT-PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV 46

3.1.4 Kết quả giải trình tự đoạn DNA đặc hiệu BQCV 48

3.2 SỰ PHÂN BỐ CỦA BQCV TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM 51

3.3 XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA BQCV LƯU HÀNH TRÊN ONG MẬT TẠI CÁC TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tên Tiếng Anh đầy đủ Tên Tiếng Việt

BLAST Basic Local Alignment

Search Tool Công cụ tìm kiếm trình tự cơ bản

BQCV Black queen cell virus Virus gây bệnh thối đen mũ chúa

DEPC Diethyl pyrocacbonate

DNA Deoxyribonleotide acid

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Rnase Ribonuclease

RT-PCR Reverse transcriptase

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp sao chép ngược

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Ong chúa của đàn ong nội 5

Hình 1.2 Ong chúa của đàn ong ngoại 6

Hình 1.3 Tốp 10 nước đạt kim ngạch xuất khẩu mật ong lớn nhất thế giới năm 2013 9

Hình 1.4 Ấu trùng bị nhiễm BQCV 17

Hình 1.5 Nhộng bị nhiễm BQCV 17

Hình 1.6 Ong chúa khỏe mạnh với mũ chúa mở nắp 17

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc genom BQCV 18

Hình 2.1 Sơ đồ mô tả các bước thực hiện trong nghiên cứu 29

Hình 2.2 Vector tách dòng pCR2.1 36

Hình 3.1 Kết quả điện di trên gel agarose xác định các mẫu dương tính với 45

BQCV từ các mẫu ong ở miền Bắc Việt Nam 45

Hình 3.2 Kết quả tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc màu trắng và khuẩn lạc màu xanh 47

Hình 3.3 Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid 48

tái tổ hợp bằng EcoRI 48

Hình 3.4 Trình tự đoạn DNA ngoại lai gắn trong vector pCR2.1 tái tổ hợp 49

Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn DNA đặc hiệu BQCV lưu hành ở Việt Nam với trình tự nucleotide của BQCV từ Nam Phi 51

Hình 3.6 Tỷ lệ nhiễm BQCV giữa các tỉnh miền Bắc Việt Nam 53

Hình 3.7 Cây phát sinh loài BQCV dựa trên trình tự gen mã hóa Helicase 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tình hình nhập khẩu mật ong vào Mỹ năm 2013 11

Bảng 2.1.Thành phần phản ứng của hỗn hợp A 32

Bảng 2.2.Thành phần phản ứng của hỗn hợp B 32

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA 32

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu 33

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn nối DNA vào vector tách dòng 36

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid 39

Bảng 2.7.Thành phần phản ứng giải trình tự gen 40

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA mã hóa helicase 42

Bảng 3.1 Kết quả so sánh trình tự nuclotide đoạn DNA tách dòng với các trình tự gen của BQCV trên Genbank 49

1

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, ong cũng như các sản phẩm từ ong là những món quà quý giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người Ong có mặt ở khắp mọi nơi trên trái đất đặc biệt là những nơi có thảm thực vật phong phú và đa dạng Nghề nuôi ong đã và đang một đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người Ong cung cấp cho chúng ta các sản phẩm có giá trị cao như mật ong, phấn hoa, sữa chúa, keo ong, nọc ong Mật ong, phấn hoa là sản phẩm chính thu từ ong mật, nó không những có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho con người mà còn là phương thuốc quý chữa bệnh Sáp ong, keo ong, nọc ong cũng là sản phẩm có giá trị dùng để chữa bệnh và

là nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp [6] Ngoài việc cung cấp các sản phẩm quý kể trên thì con ong còn có vai trò hết sức quan trọng trong nông nghiệp, góp phần làm tăng năng suất cho nhiều loại cây trồng thông qua quá trình thụ phấn cho hoa

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, thảm thực vật phong phú và đa dạng Đó là điều kiện rất tốt để nước ta phát triển nghề nuôi ong mật, nhưng cũng là điều kiện thuận lợi cho các bệnh ở ong phát triển [1] Hiện nay, Việt Nam có khoảng 1.500.000 đàn ong với sản lượng trên 37.000 tấn mật ong Đây là một trong 10 sản phẩm xuất khẩu hàng đầu của cả nước và đang có xu hướng tăng theo từng năm Tuy nhiên những năm gần đây, ngành ong của nước ta đang phải đối mặt với việc xuất khẩu không ổn định do tình hình dịch bệnh và vấn đề tồn dư kháng sinh có trong mật ong

Ong mật thường bị tấn công bởi nhiều tác nhân gây bệnh bao gồm virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Các dữ liệu nghiên cứu về bệnh ong những năm gần đây cho thấy, một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất cho nghề nuôi ong của nước ta là do virus, đặc biệt là virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) Do còn thiếu kiến thức về bệnh ong mật, hoặc không biết chính xác nguyên nhân gây bệnh, người nuôi ong thường sử dụng kháng sinh để kiểm soát tất

cả các loại bệnh bao gồm cả virus Tuy nhiên, bệnh ong do virus không thể được điều trị bằng kháng sinh Việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh như là một điều trị

Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu phát hiện

virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam" với các mục đích nghiên cứu như sau:

- Chẩn đoán Black queen cell virus trên ong mật

- Xác định sự phân bố của Black queen cell virus tại các trại nuôi ong mật ở miền Bắc Việt Nam

- Xác định nguồn gốc tiến hóa của Black queen cell virus gây bệnh trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam

Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LOÀI ONG

1.1.1 Nguồn gốc của ong

Trong lịch sử phát triển của sinh giới thì động vật có hai hướng tiến hoá đó là động vật không xương sống và động vật có xương sống Trong động vật không có xương sống thì phát triển nhất là ngành chân đốt, trong đó có loài ong Ong có nguồn gốc từ ngành động vật chân đốt, có tên khoa học là Arthropoda, chân đốt có nguồn gốc từ giun đốt (Annelides) xuất phát từ lớp giun nhiều tơ (Polychaeta) Quá trình chuyển hoá từ giun nhiều tơ sang ngành chân đốt là một quá trình phức tạp hoá về mặt cấu tạo

Tầng Cuticul =>Vỏ kitin (bộ xương ngoài)

Biểu bì mô cơ => bó cơ

Chi bên => Chi phân đốt

Mạch máu lưng => Tim

Cơ quan thị giác phát triển phức tạp Các đốt trước tập hợp thành đầu, đốt giữa thành ngực, đốt phần sau chuyển thành phần bụng Bên cạnh đó xuất hiện thêm một

số cơ quan mới: ống khí, ống Malpighi [3]

1.1.2 Hình thái cấu tạo ngoài của ong

- Cơ thể ong chia làm 3 phần rõ rệt: Đầu, ngực và phần bụng, các phần này được nối với nhau bằng các khớp động

- Có 1 đôi râu

- Có 3 đôi chân và 2 đôi cánh

- Bên ngoài có lớp vỏ kitin gồm nhiều tấm nối với nhau tạo nên bộ xương ngoài

- Trong một tổ ong có 3 cấp: Ong chúa có kích thước lớn nhất, cánh ngắn, bụng dài, có màu nâu đen hoặc vàng; ong thợ có kích thước cơ thể nhỏ nhất, có màu

4

vàng hoặc màu nâu xám hoặc đen xám có sọc vàng, bụng nhọn; ong đực có màu đen, cánh dài, bụng ngắn

1.1.3 Vị trí phân loại của ong

Trong thế giới động vật, ong mật thuộc ngành chân đốt (Arthropoda) hay lớp

6 chân (Hecxapoda), phân ngành có ống khí (Tracheata)

Lớp côn trùng (Insecta)

Bộ cánh màng (Hymenoptera)

Họ ong mật (Aptsdae)

Giống ong mật (Apis)

Trên thế giới hiện nay có 7 loài ong cho mật, trong đó ở Việt Nam có 4 loài chính:

+ Ong châu Âu (Ong ngoại): Apis mellifera (A.mellifera)

+ Ong Nội địa (Ong châu Á): Apis cerana (A.cerana)

+ Ong Khoái (Ong gác kèo): Apis dorsata (A.dorsata)

+ Ong Hoa (Ong muỗi): Apis florea (A.florea)

Trong mỗi loài lại phân chia thành các phân loài khác nhau như: Đối với ong

châu Âu (A.mellifera) có các phân loài: Ong Ý, ong Trung - Nga, ong Cacpat, ong Crain, ong vùng Capcazơ; Đối với ong châu Á A.cerana có: A.cerana cerana,

A.cerana indica, A.cerana japonica Mỗi phân loài đó lại có nhiều dạng sinh thái

- sinh học hình thành từ lâu đời dưới tác động của các yếu tố ngoại cảnh khác nhau

và các đặc điểm thích nghi với điều kiện sống khác nhau Điều này dẫn đến các đặc điểm có ý nghĩa kinh tế đối với con người cũng khác nhau và có ý nghĩa rất to lớn trong công tác giống ong vì chúng bảo vệ và duy trì được tính đa dạng sinh học thông qua các hệ gen quý hiếm tồn tại trong tự nhiên [3]

1.1.4 Các loài ong ở Việt Nam

Trong 4 loài ong được nuôi ở Việt Nam thì có 2 loài ong có giá trị kinh tế

5

cao, được nuôi rộng rãi để lấy mật và các sản phẩm khác đó là ong nội (ong Châu

Á) A.cerana và ong ngoại (ong châu Âu) A.mellifera Hai loài này có những đặc

điểm khác nhau và bổ sung cho nhau Còn một số loài ong hoang dã như ong khoái

(A.dorsata), ong đá (A.laboriosa) hay ong hoa (A.florea) thì vẫn chưa được nghiên

cứu, thuần hóa và việc khai thác mật của các loài này chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ, chủ yếu mới dừng lại ở mức khai thác và săn bắt trong tự nhiên…

 Ong nội (Apis cerana)

Hình 1.1 Ong chúa của đàn ong nội

Ong nội A.cerana là giống ong bản địa ở Việt Nam, Trung Quốc và một số

nước khác Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp cả nước ngoại trừ rừng tràm U Minh Ong nội có kích thước trung bình, đặc tính chăm chỉ, chịu được các điền kiện sống bất lợi, ít dịch bệnh, chất lượng mật tốt, mật ong bán được với giá thành cao Tuy nhiên, ở ong nội năng suất mật thấp, ong khá hung dữ, dễ bốc bay và dễ chia đàn Do là loài ong bản xứ nên ong nội thích nghi tốt với nguồn hoa rải rác, điều kiện khí hậu hay thay đổi Ong nội có thể nuôi từ các quy mô từ hộ gia đình tới nuôi chuyên nghiệp, nhưng nó thích hợp hơn với kiểu nuôi quy mô nhỏ trong gia đình với vốn đầu tư ban đầu thấp và chủ yếu là cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước Năng suất mật ở ong nội chỉ đạt trung bình khoảng từ 10 - 15 kg/ đàn/năm Để phát triển ong nội, người nuôi ong cần chọn các đàn có tính tụ đàn

6

cao, chọn giống ong tốt và quan tâm tới phòng bệnh để nâng cao năng suất cũng như chất lượng mật [1]

 Ong ngoại (Apis mellifera)

Hình 1.2 Ong chúa của đàn ong ngoại

Ong ngoại A.mellifera có nguồn gốc từ châu Âu, châu Phi, được nhập vào

nước ta từ những năm 60 với hình thức thương mại và đã thích nghi tốt với điều kiện khí hậu và nguồn hoa ở nước ta Đặc biệt ở vùng Nam Bộ và Tây Nguyên là những nơi có nguồn hoa tập trung (cao su, cà phê, bông trắng ) do đó năng suất mật của ong ngoại rất cao, bình quân đạt khoảng 25 - 30kg/đàn/năm Loài ong này phát triển thích hợp với kiểu nuôi chuyên nghiệp với trình độ chuyên môn hóa cao, vốn đầu tư ban đầu lớn Ong ngoại có kích thước lớn hơn ong nội, chúng khá hiền,

có khả năng tụ đàn và dự trữ mật cao hơn so với ong nội Mật ong của ong ngoại chủ yếu là để xuất khẩu Tuy nhiên, so với ong nội thì ong ngoại có sức chịu đựng kém nên ở những nơi có nguồn hoa rải rác và điều kiện khí hậukhắc nghiệt thì việc nuôi ong ngoại là không thể Bên cạnh những giá trị kinh tế mà ong ngoại đem lại

thì việc nhập ong A.mellifera cũng mang theo các loài ký sinh và bệnh như bệnh

thối ấu trùng châu Âu, bệnh ấu trùng túi, bệnh bào tử trùng Nosema… gây nguy hại cho các loài ong bản địa Ở mỗi địa phương, trước khi lựa chọn nuôi giống ong nội hay ong ngoại thì người nuôi ong cần phải cân nhắc về số lượng cây, nguồn mật, khả năng đầu tư về thời gian cũng như nguồn vốn để quyết định [1]

1.1.5.2 Miễn dịch tế bào

Mặc dù các hàng rào vật lý và hóa học thường giữ cho tác nhân gây bệnh không xâm nhập vào cơ thể, tuy nhiên các tác nhân gây bệnh đôi khi vượt qua các hàng rào phòng thủ và bắt đầu nhân lên Bất cứ khi nào các rào cản vật lý và hóa học bị phá vỡ, ong mật có thể chủ động tự bảo vệ mình khỏi bị nhiễm trùng bằng cách sử dụng một phản ứng miễn dịch tế bào đại diện cho tuyến phòng thủ thứ hai

và nó xuất hiện ngay lập tức khi nhiễm trùng Mục tiêu chính của hệ thống miễn dịch là nhận ra các mầm bệnh và sự khác biệt giữa các phân tử của cơ thể và các phân tử lạ bên ngoài Khi một vi sinh vật được nhận ra là các phân tử lạ, hệ thống miễn dịch được kích hoạt để gắn kết một phản ứng phòng thủ để giết hoặc loại bỏ những kẻ xâm nhập Côn trùng thiếu globulin miễn dịch, sự nhận ra các phân tử lạ đạt được bằng các thụ thể (PRRS) - các protein miễn dịch được mã hóa để nhận ra các tác nhân gây bệnh liên quan (PAMPs) hiện diện trên bề mặt của vi sinh vật

8

PRRC có hai nhóm: Các protein nhận biết peptidoglycan (PGRPs) và các protein liên kết Gram âm (GNBPs) Các liên kết của PAMPs với PGRPs và GNBPs kích hoạt các tầng thủy phân protein bao gồm serine, protease và serpins và kích hoạt con đường thủy phân dịch nội bào để kiểm soát biểu hiện peptide kháng khuẩn và một loạt các phản ứng phòng vệ tế bào không đặc hiệu bao gồm sự thực bào, hình thành nốt nhỏ, đóng gói và melanin hóa

Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào bị nhiễm trùng đã được cho là đặc trưng của ong mật [29] Hai enzyme quan trọng là phenol oxidase và glucose dehydrogenase đóng một vai trò quan trọng trong việc tổng hợp melanin và cần thiết cho bảo vệ chống lại xâm nhập vi sinh vật và ký sinh trùng, có mặt trong máu của ong mật [47] Các gen mã hóa serine, protease và serpins mà tham gia vào các liên kết của PAMPs với PGRPs và GNBPs đã được xác định trong bộ gen của loài ong mật, cho thấy ong mật có một hệ thống miễn dịch cho phép chúng bảo vệ chống lại các vi sinh vật và ký sinh trùng Tuy nhiên, làm thế nào ong mật chống nhiễm virus qua phản ứng tự vệ trung gian tế bào vẫn chưa được xác định

1.2 TÌNH HÌNH THỊ TRƯỜNG MẬT ONG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC

1.2.1 Tình hình thị trường mật ong trên thế giới

Trong những năm qua, thị trường mật ong thế giới có khá nhiều biến động, giá mật ong liên tục tăng cao Theo số liệu thống kê năm 2013 của Hiệp hội nuôi ong quốc tế (APIMONDIA), sản lượng mật ong thế giới đạt khoảng 1,8 triệu tấn/năm Trong đó, đứng đầu là Trung Quốc có sản lượng mật ong lớn nhất (khoảng 440.000 tấn) Mặc dù, mật ong của Trung Quốc trong những năm 1999 bị nhiễm kháng sinh nên châu Âu và Mỹ đã hạn chế nhập khẩu bên cạnh đó mật ong Trung Quốc xuất khẩu vào thị trường Mỹ đang bị giảm xuống do việc áp đặt luật chống phá giá áp dụng cho các nhà xuất khẩu hiện nay của Trung Quốc Tuy nhiên, Trung Quốc vẫn là nước xuất khẩu lớn nhất với sản lượng xuất khẩu khoảng 185.000 tấn, đạt doanh thu khoảng 255 triệu USD trong năm 2013

9

Đứng thứ hai sau Trung Quốc về sản lượng xuất khẩu mật ong là Argentina Nước này đã xuất khẩu gần 115.000 tấn mật ong, đạt doanh thu 217 triệu USD trong năm 2013 Thị trường tiêu thụ mật ong của Argentina chủ yếu là các nước Châu Âu, trong đó Mỹ là nước nhập khẩu mật ong lớn nhất của Argentina với 41.581 tấn, tiếp đến là Đức với 34.988 tấn, Anh 16.843 tấn và Italia 14.811 tấn

Mêxicô là nước đứng hàng thứ ba trên thế giới với sản lượng xuất khẩu năm

2013 là 85.600 tấn mật ong, đạt doanh thu trên 116 triệu USD và đứng thứ 5 trên thế giới về kim ngạch xuất khẩu Theo số liệu công bố tại triển lãm mật ong 2013 (Exomiel 2013) tổ chức tại Mêxicô, hiện nay nước này có tới 58.000 gia đình chuyên nuôi ong với số lượng 2.3 triệu đàn Thị trường xuất khẩu chủ yếu của Mêxicô là Đức, Arập Xêút, Nhật Bản và Mỹ [48]

Tốp 10 nước đạt kim ngạch xuất khẩu mật ong lớn nhất thế giới năm 2013 được thể hiện cụ thể ở (hình 1.3) [50]

Hình 1.3 Tốp 10 nước đạt kim ngạch xuất khẩu mật ong lớn nhất thế giới năm 2013 Tuy nhiên, ngành thương mại mật ong thế giới đang đứng trước những thách thức đòi hỏi các nước phải đáp ứng được những yêu cầu của khách hàng, của các nhà nhập khẩu về các tiêu chuẩn và pháp chế Các thị trường quan trọng như châu

10

Âu và Mỹ đang đòi hỏi các tiêu chuẩn cao hơn về sản xuất, quản lý, đảm bảo chất lượng và các phương pháp kiểm soát chất lượng Sự tồn dư các chất kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và các loại dược phẩm khác còn lại trong mật ong được chứng minh là những rủi ro chủ yếu trong thương mại mật ong thế giới

Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh và thuốc bảo vệ thực vật đang trở nên phổ biến tại nhiều khu vực trên thế giới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Đây được xem là một trong những nguyên nhân chính làm cho mật ong tại các nước này khó cạnh tranh khi xuất khẩu sang các thị trường châu Âu và Mỹ,

1.2.2 Tình hình thị trường mật ong ở Việt Nam

Việt Nam có nhiều lợi thế, đặc biệt về điều kiện tự nhiên để phát triển sản xuất và xuất khẩu mật ong Năm 1994, cả nước mới chỉ có khoảng 40.000 đàn ong, đến năm 2001 là 270.000 đàn và hiện nay ước tính cả nước có khoảng trên 1.500.000 đàn Từ những năm đầu của thập niên 90, Việt Nam đã bắt đầu gia nhập thị trường xuất khẩu mật ong trên thế giới, tuy nhiên với số lượng hạn chế Từ năm

2000, Việt Nam đã trở thành một quốc gia xuất khẩu mật ong có uy tín trên thế giới Hiện nay, theo số liệu thống kê Việt Nam đứng thứ 6 trên thế giới và đứng thứ hai ở châu Á (sau Trung Quốc) về lượng mật ong xuất khẩu sang hai thị trường xuất khẩu lớn là EU và Mỹ Hội nuôi ong Việt Nam được Hội nuôi ong thế giới công nhận là một thành viên tích cực trong số 58 thành viên của tổ chức này Năm 2013 lượng mật ong xuất khẩu của Việt Nam vào Mỹ lần đầu tiên vượt mốc 30.000 tấn đạt kim ngạch gần 80 triệu USD [49]

Theo báo cáo thị trường mật ong của Hội đồng quốc gia Mỹ ngày 24/01/2014: Năm 2013 Mỹ nhập khẩu 142.925.543 kg mật ong với giá trị 455.511.802 USD Các nước xuất khẩu mật ong chủ yếu vào Mỹ là Argentina, Việt Nam, Ấn Độ, Uruguay, Canada và Brasin (bảng 1.1)

11

Bảng 1.1 Tình hình nhập khẩu mật ong vào Mỹ năm 2013

(kg) Giá trị (USD)

Giá bình quân/kg (USD)

Nguồn: Theo báo cáo thị trường mật ong của Hội đồng quốc gia Mỹ ngày 24/01/2014

Qua bảng số liệu trên có thể thấy:

- Về khối lượng mật ong nhập khẩu vào Mỹ, đứng đầu là Argentina 41.581.668 kg, đứng thứ hai là Việt nam 30.501.060 kg, thứ ba là Ấn Độ 24.852.692kg, tiếp theo là các nước Uruguay, Brasin và Canada

- Về giá trị đứng đầu là Argentina đạt giá trị 136.501.855 USD, thứ hai là Việt Nam 75.668.847 USD, rồi đến Ấn Độ, Canada, Brasin và Uruguay

- Về giá mật ong bình quân/kg cao nhất là Canada đạt 4,61 USD, các nước khác 3,99, tiếp đến Brasin 3,31, Argentina 3,28 và thấp nhất là Việt Nam 2,48 USD /kg Với lượng mật ong xuất khẩu sang cả Trung Đông, Nhật bản, EU và một số nước châu Á khác chúng ta đã xuất khoảng 34.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng

85 triệu USD là một bước tiến nhảy vọt của ngành nuôi ong Tuy nhiên, với giá xuất khẩu bình quân 2,48 USD/kg mật là giá quá thấp so với giá xuất khẩu bình quân vào Mỹ là 3,18 USD/kg Điều này nói lên chất lượng mật ong nước ta vẫn còn thấp hoặc chưa được đồng đều so với các quốc gia khác

Theo Hiệp hội nuôi ong Việt Nam, Việt Nam tiếp tục thu được kết quả tốt

12

trong việc xuất khẩu mật ong với thế giới trong bảy tháng đầu năm 2014 Tổng cộng, 27.000 tấn mật ong đã được xuất khẩu sang 14 quốc gia và vùng lãnh thổ Tuy nhiên, Mỹ vẫn là thị trường lớn nhất chiếm 95% tổng doanh thu xuất khẩu của

cả nước, với hơn 25.000 tấn trong 7 tháng đầu năm 2014 [49]

1.3 MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP Ở ONG

Giống như các động vật khác, ong mật cũng dễ dàng mắc một số dịch bệnh

và bị nhiều động vật khác tấn công Bệnh tật, đại dịch nếu ở mức độ nhẹ thì làm cho đàn ong suy yếu, giảm quân số, giảm năng suất và chất lượng mật, còn nếu ở mức

độ nặng thì làm cho đàn ong bị chết hoặc bỏ tổ bốc bay gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người nuôi ong

1.3.1 Bệnh ở ong do các tác nhân gây bệnh không phải virus

1.3.1.1 Bệnh thối ấu trùng châu Âu (TATCA)

Bệnh thối ấu trùng châu Âu do White tìm ra lần đầu tiên ở châu Âu vào năm

1912 Hiện nay bệnh có mặt ở khắp nơi, cả những vùng nuôi ong châu Âu A

mellifera và những vùng nuôi ong châu Á A cerana Người ta còn gọi bệnh thối ấu

trùng châu Âu là bệnh thối ấu trùng mở nắp hay thối ấu trùng tuổi nhỏ vì bệnh này thường gây chết các ấu trùng ở 3 - 4 ngày tuổi Trong một số trường hợp ấu trùng chết bị chua nên còn gọi là thối ấu trùng chua hay thối ấu trùng dấm Các ấu trùng mới chết có màu trắng bệch, sau ngả thành màu vàng nhạt, vàng sẫm rồi nâu đậm, xác chết thối rữa và tụt xuống đáy lỗ tổ Ở các đàn ong bị bệnh, năng suất mật giảm

từ 20 – 80% Bệnh thối ấu trùng châu Âu có ở Việt Nam từ năm 1969 do nhập ong

từ ngoài vào không qua kiểm dịch, và từ năm 1969 đến nay bệnh thối ấu trùng châu

Âu đã xuất hiện ở tất cả các nơi nuôi ong nội

Bệnh thối ấu trùng châu Âu do vi khuẩn Mellisococcus pluton (M pluton) gây ra M Pluton hình cầu, hai đầu hơi kéo dài như mũi giáo, bắt màu Gram dương

và có kích thước khoảng 0.5-0,7 х 1 μm Vi khuẩn không có khả năng sinh nha bào, chúng thường đứng đơn lẻ, thành cặp hoặc tạo thành chuỗi dài Khi bệnh xảy ra

13

thường thấy sự có mặt một số vi khuẩn như Paenibacillus alvei và Brevibacillus

laterosporus [42] Tuy nhiên, người ta mới chỉ xác định được M pluton là tác nhân

chính còn các vi khuẩn khác chỉ là nguyên nhân thứ phát M pluton chiếm đoạt

thức ăn của ấu trùng, nên nhu cầu ăn của ấu trùng tăng cao, buộc ong nuôi dưỡng

phải cho ấu trùng ăn nhiều lần Đây cũng là nguyên nhân làm lây lan M pluton

trong đàn ong Trước khi bước vào vụ mật, số lượng ấu trùng có trong đàn tăng lên nhanh, nhưng lượng ong nuôi dưỡng không đủ nên ấu trùng bị đói, bệnh dễ bùng

phát và biểu hiện rõ M pluton có khả năng tồn tại trên cầu ong khoảng 1 năm, và

khi gặp điều kiện thuận lợi nó lại tiếp tục gây bệnh cho đàn ong [20]

1.3.1.2 Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ (TATCM)

Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ do vi khuẩn Paenibacillus larvae (p lavae) gây

ra, vi khuẩn có khả năng sinh nha bào [28] P larvae là tên gọi được phân loại lại từ tên ban đầu là Bacillus larvae

P larvae có kích thước 2,5- 5 μm x 0,5-0,8 μm Nha bào có kích thước 1,3

μm x 0.6 μm [42] P larvae gây bệnh ở tất cả các giai đoạn của ấu trùng ong nhưng

ấu trùng non mẫn cảm với P larvae hơn các ấu trùng già [12] Mỗi ấu trùng nhiễm

bệnh sau khi chết chứa khoảng 2,5 tỷ nha bào Nha bào có khả năng nảy mầm sau nhiều năm tồn trữ Nha bào có sức chống chịu với môi trường nhiệt độ cao và cả tia

UV Nó vẫn có khả năng sống xót khi bị xử lý bằng formaldehyde 10% trong 5 giờ

Ấu trùng bị nhiễm P larvae từ nguồn thức ăn thông qua ong thợ nuôi dưỡng

hoặc từ ong thợ mang nha bào khi làm vệ sinh tổ [25] Sau khoảng 1 ngày ấu trùng

ăn phải nha bào, nha bào nảy mầm trong ruột giữa của ấu trùng và nhân lên với tốc

độ rất nhanh, di chuyển từ ruột ra khắp các mô Sự sinh sôi nảy nở của vi khuẩn gây bệnh nhanh đến mức ấu trùng bị chết trong vòng vài ngày, thường là sau khi lỗ tổ

đã được vít nắp, làm cho các cầu nhộng không đồng đều, màu bị sậm lại, trên mặt cầu nhộng xuất hiện những ấu trùng bị bệnh, nắp vít bị lõm xuống không bình thường

14

1.3.1.3 Bệnh ấu trùng vôi (Chalkbrood)

Bệnh ấu trùng vôi ở ong mật được gây ra bởi nấm Ascosphaera apis (A.apis) Nha bào nấm có dạng quả màu xanh nâu thẫm Cấu tạo của một nang nha

bào (kích thước khoảng 47 - 140µm) gồm nhiều bóng nha bào (9- 19µm), trên mỗi bóng lại có rất nhiều nha bào nấm có kích thước 3.0 – 4.0 × 1.4 – 2.0µm [42]

Ấu trùng nhiễm nha bào A apis từ thức ăn Nha bào nảy mầm trong lumen

của ruột ấu trùng, đặc biệt là ở vùng cuối cơ thể ấu trùng Hệ sợi nấm sau đó phá hủy thành ruột và thậm chí phá vỡ cả phần cuối cơ thể ấu trùng, phần đầu của ấu trùng ít bị ảnh hưởng Sau đó chúng bắt đầu phát triển bên ngoài ấu trùng

Bệnh thường xảy ra trên ấu trùng ong thợ và ong đực Ấu trùng chết sau khi

đã được vít nắp khoảng 2 ngày Trên các cầu nhộng xuất hiện lỗ thủng trên nắp vít của ấu trùng Khi chưa được vít nắp, những ấu trùng chết lúc đầu được phủ một lớp phấn trắng, căng phồng như bọt biển và chiếm hết lỗ tổ Sau đó, chúng trở nên cứng, khô và có hình dạng giống như xác ướp Thường những xác ấu trùng chết vẫn giữ nguyên màu trắng nếu chúng chỉ bị một chủng nấm ký sinh, nhưng nếu có hai chủng nấm ký sinh thì chúng sẽ chuyển sang màu xám và đen Ở giai đoạn này ấu trùng bệnh sẽ được ong loại bỏ ra ngoài Bệnh được tìm thấy ở châu Âu, Scandinavia ở Nga, New Zealand, Mỹ, Canada, Argentina, Nhật Bản, Philippines, Trung Mỹ và Mexico

1.3.1.4 Bệnh Nosema

Nosema apis là loài động vật nguyên sinh (đơn bào) gây ỉa chảy cho ong

trưởng thành nên bệnh này còn được gọi là bệnh ỉa chảy [33] Bệnh thường xuất hiện vào vụ đông - xuân sau những ngày mưa rét kéo dài, ong không bay ra ngoài được Ong bị bệnh thường biểu hiện bụng ong trướng to, trước cửa tổ và trong vách thùng ong có nhiều dấu vết phân màu vàng hoặc màu đen Bệnh gây chết ong trưởng thành, làm giảm tuổi thọ và làm thế đàn ong giảm sút dẫn đến giảm năng

suất mật Đôi khi bệnh này làm cho ong chúa bị chết Nha bào Nosema apis có hình

oval lớn, kích thước 4-6 x 2.4µm và chúng chỉ phát triển trong tế bào biểu mô hệ

15

tiêu hóa của ong trưởng thành [42] Khi các ong bị nhiễm bệnh đi bài tiết phân có nha bào rơi vào cây cỏ, ao hồ, rãnh nước sau đó ong khoẻ mạnh đi lấy nước, hoặc mật phấn hoa ăn vào bị nhiễm bệnh và lây lan ra cả tổ Để chẩn đoán chính xác phải nghiền nát bụng các con ong nghi là bị bệnh, thu lấy chất lỏng soi dưới kính hiển vi nếu thấy các nha bào dạng trực khuẩn ở các mép có phát huỳnh quang là nha bào

của Nosema apis Bệnh gây hại phổ biến trên các đàn ong nuôi ở nhiều nước trên

thế giới, cả các nước ôn đới và ở các nước nhiệt đới [1]

1.3.1.5 Ve ký sinh Varroa dectructor (Chí lớn)

Ve ký sinh Varroa dectructor thuộc họ Varrodiac có nguồn gốc từ ong Châu

Á Apis cerana nhưng lại ít gây tác động cho loại ong này Ve ký sinh trên nhộng

ong đực và rất ít thấy ký sinh trên nhộng ong thợ do vòng đời ong thợ ngắn, ấu trùng ong thợ chỉ nằm trong lỗ tổ vít nắp 11 ngày, mặt khác do ong thợ có tập tính

tự dọn vệ sinh cho nhau, cắn và tiêu diệt ve Khi nhộng ong đực bị ve ký sinh nhiều

thì đàn ong A cerana bỏ tổ bốc bay để lại các ấu trùng có ký sinh nên nguồn bệnh

còn rất ít [3] Khi đàn ong bị nhiễm chí và đặc biệt nhộng bị nhiễm chí lớn thì đàn ong trưởng thành nở ra bị các loại khuyết tật như: Thân hình nhỏ, què chân, xoăn cánh… Khoảng 80 – 100% tỷ lệ trại ong bị nhiễm chí lớn [11] Ong châu Á có khả năng loại bỏ ve ký sinh tốt hơn ong châu Âu Các đàn ong không được điều trị ve

ký sinh Varroa thường bị chết trong vòng từ 1 đến 3 năm

1.3.1.6 Ve ký sinh Tropilaelaps mercedesae (Chí nhỏ)

Loài ve này có nguồn gốc từ ong khoái Apis dorsata Khi ong Châu Âu

A.mellifera được du nhập vào Châu Á thì loài ve này chuyển sang ký sinh trên ong

Châu Âu và gây thiệt hại còn lớn hơn cả ve Varroa Tuy nhiên, ve Tropilaelaps chỉ

ký sinh trên ấu trùng vì vậy ở các nước ôn đới thời gian ong qua đông kéo dài 5 – 6

tháng, đàn ong không nuôi ấu trùng nên ve Tropilaelaps không tồn tại được [3] Các

kết quả nghiên cứu cho thấy nếu đàn ong khuyết nhộng và ấu trùng 21 ngày sẽ tiêu diệt được chí nhỏ Chính vì nguyên nhân này nên người nuôi ong áp dụng các biện pháp như loại bỏ cầu nhộng, nhốt hoặc thay chúa để đàn ong khuyết nhộng Theo

16

Báo cáo Dự án điều tra ngành ong 2010 của Nguyễn Ngọc Vững điều tra tình hình nhiễm chí nhỏ tại một số tỉnh chăn nuôi ong phát triển thì 95 – 100% trại ong bị nhiễm chí nhỏ [11]

1.3.2 Bệnh ở ong do virus gây ra

Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy virus là nguyên nhân chủ yếu lây nhiễm và gây chết ong thậm chí có thể hủy diệt cả đàn ong [15; 45] Ít nhất có 18 loại virus khác nhau đã được phát hiện ở trên ong [20, 27] Tuy nhiên, hầu hết các bệnh ở ong đều do 6 loại virus chính sau đây gây nên bao gồm: Sacbrood virus (SBV), Deformed wing virus (DWV), Acute bee paralysis virus (ABPV), Black queen cell virus (BQCV), Chronic bee paralysis virus (CBPV), và Kashmir bee virus (KBV) Trong đó BQCV là một trong những virus được phát hiện nhiều nhất trên thế giới [45] Các virus gây bệnh trên ong mật là các virus có bộ gen là RNA,

có 3 dạng kích thước 17, 30, 35 nm Hệ gen của những virus này có thể là RNA sợi đôi hoặc RNA sợi đơn RNA sợi đơn hoặc là RNA(+) hoặc là RNA(-) Các virus

ong mật đã được phân loại thành hai nhóm chính là: Iflavirus và Dicistriviridae

[16, 26]

1.3.2.1 Black queen cell virus (BQCV)

- Phát hiện và triệu chứng

Virus gây bệnh thối đen mũ chúa (BQCV) ở ong mật là một loại virus giống

picornavirus, gần đây nó đã được phân loại trong chi mới cripavirus (họ Dicistroviridae) [35, 38] Virus này lần đầu được phân lập từ ấu trùng ong chúa chết

và từ nhộng đã bị phân hủy một phần trong các mũ chúa màu đen, nơi chúng được nuôi dưỡng Khi bị nhiễm virus này, mũ chúa xuất hiện các mảng vá có màu đen,

do đó người ta gọi virus này là virus thối đen mũ chúa [36,17]

BQCV xuất hiện phổ biến ở các con ong trưởng thành Tuy nhiên, nó lại ảnh hưởng lâm sàng chủ yếu ở giai đoạn ấu trùng hoặc nhộng của ong chúa Trong giai đoạn đầu của bệnh, ấu trùng nhiễm bệnh xuất hiện màu vàng nhạt giống như những con bị bệnh do virus sacbrood (SBV) và khó khăn khi chui ra khỏi kén Ấu trùng và

17

nhộng bị nhiễm virus sẽ biến đổi thành màu đen và chết nhanh chóng Cuối cùng

mũ chúa trở thành màu đen là một triệu chứng đặc trưng của bệnh BQCV Ong thợ cũng có thể bị nhiễm BQCV Các nghiên cứu về ong thợ ở Pháp và Áo tìm thấy tỷ

lệ lây nhiễm BQCV tương ứng là 86% và 30% nhưng chúng thường không biểu hiện triệu chứng bệnh ra bên ngoài [15, 27]

Hình 1.4 Ấu trùng bị nhiễm BQCV Hình 1.5 Nhộng bị nhiễm BQCV

Hình 1.6 Ong chúa khỏe mạnh với mũ chúa mở nắp

- Cấu trúc virus

+ BQCV có hình dạng giống Picornavirus, là một thành viên thuộc họ

Dicistroviridae, chi cripavirus Hạt virus có đường kính 30nm, không có vỏ bọc

bao ngoài và hệ gen của nó là RNA sợi đơn có kích thước khoảng 8,5 kb, không

18

bao gồm đuôi polyA Hệ gen chứa một tỷ lệ cao của A và U, bao gồm 29,2% A, 30,6% U, 18,5% C và 21,6% G Virus có hai khung đọc mở (ORF) mã hóa protein không cấu trúc ở đầu 5' và protein cấu trúc ở đầu 3' Ở đầu 5′ (ORF1) bắt đầu từ codon khởi đầu là AUG tại vị trí nucleotit 658 đến 660 và codon kết thúc là UAG tại vị trí nucleotit 5623 đến 5625, mã hóa protein không cấu trúc (helicase, protease, RNA polymerase.…) Ở đầu 3′ (ORF2) bắt đầu từ codon khởi đầu là CCU từ vị trí nucleotit 5834 đến 5836 và codon kết thúc là UAA tại vị trí nucleotit 8393 đến

8395, mã hóa protein cấu trúc (protein capsid) Các protein này được kí hiệu là VP1, VP2, VP3, VP4 với kích thước lần lượt là 44, 42, 29 và 6kDa [39]

Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc genom BQCV + Đặc điểm của gen mã hóa helicase:

Helicase là một trong những enzyme cần thiết cho quá trình nhân đôi của DNA Nó sử dụng năng lượng ATP cắt đứt liên kết H2 để tháo xoắn cấu trúc xoắn kép của DNA Từ đó DNA xoắn kép trở thành DNA sợi đơn đồng thời tạo chạc tái bản giúp cho quá trình sao chép diễn ra theo đúng nguyên tắc bán bảo toàn

Trong cấu trúc hệ gen của BQCV, trình tự nucleotide của gen mã hóa Helicase nằm trong vùng mã hóa ORF1 Hiện nay vai trò chính xác của enzyme này trong BQCV vẫn chưa sáng tỏ Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho rằng enzyme này liên quan đến sự khác biệt về độc lực giữa các chủng BQCV khác nhau trên ong mật [22,32]

- Khả năng gây bệnh và mối quan hệ với Nosema apis

Giống như SBV, BQCV có thể nhân lên ở nhộng trong điều kiện phòng thí

19

nghiệm Tuy nhiên, khi cấy BQCV vào ấu trùng ong thợ và ong trưởng thành thì thường không phát triển được Khi ong trưởng thành bị đồng nhiễm BQCV và ký

sinh trùng N apis thì sẽ bị giảm tuổi thọ so với ong chỉ bị nhiễm ký sinh trùng [19]

Đặc biệt, nếu ong được nuôi bằng các nha bào đã bị nhiễm virus thì ong sẽ bị nhiễm

BQCV Khả năng nhiễm BQCV ở ong sẽ tăng lên khi có mặt của N apis BQCV liên quan đến ký sinh trùng đường ruột N apis cả trong tự nhiên và trong điều kiện phòng thí nghiệm.Theo khảo sát của những nhà nuôi ong ở Áo cho thấy N apis

được tìm thấy có mặt trong 78% mẫu ong dương tính với BQCV và 75% đàn ong bị

nhiễm N apis cũng đồng thời bị nhiễm BQCV Ong trưởng thành ở các đàn ong thường có nhiều khả năng bị nhiễm N apis và BQCV Ấu trùng ong chúa có thể bị

nhiễm bệnh do ăn phải thực phẩm chứa lượng lớn virus được tiết ra bởi các con ong trưởng thành bị nhiễm bệnh Trong tự nhiên ong thợ non dường như hiếm khi bị nhiễm với BQCV, bởi vì ấu trùng ong thợ nhận được ít thức ăn hơn trong một thời gian ngắn hơn so với ấu trùng ong chúa (ấu trùng ong thợ và ong đực chỉ được nuôi bằng sữa ong chúa trong 3 ngày đầu còn các ngày sau được nuôi bằng hỗn hợp mật

và phấn hoa) Tuy nhiên, virus này được phát hiện như là một bệnh nhiễm trùng không biểu hiện rõ ràng ở nhộng ong thợ từ các đàn ong ở Úc dường như khỏe mạnh [14]

- Phân bố địa lý và thời gian tác động

Một cuộc khảo sát trên 25 đàn ong ở Anh lấy mẫu hàng tháng từ năm 1977 đến 1979 sử dụng phương pháp huyết thanh học cho thấy có đến 90% các mẫu ong chết vào mùa xuân có chứa BQCV và ký sinh trùng Cả virus và ký sinh trùng theo chu kỳ hàng năm tăng nhiễm trùng vào cuối mùa đông đạt đỉnh điểm vào tháng năm hoặc tháng sáu và giảm nhanh chóng trong tháng tám [18] BQCV được phát hiện lên đến 58% số ong trưởng thành trong mùa hè Virus này tiếp tục tồn tại ở một số đàn ong trong suốt năm Tuy nhiên, tỉ lệ nhiễm trùng BQCV ở nhộng thấp hơn ở ong trưởng thành, với tối đa là 2% trong mùa hè

BQCV được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới Đó là nguyên nhân phổ biến

20

nhất gây tử vong ở ấu trùng ong chúa ở Úc Tại Úc, virus này đã được coi là nguyên nhân phổ biến nhất gây nên cái chết của ấu trùng ong chúa vì nó đã được phát hiện trong huyết thanh với tỉ lệ 49% của mẫu bệnh [13] BQCV cũng thường được phát hiện trong đàn ong mật không biểu hiện rõ ràng ở Đan Mạch Ở Đức vào năm 2001, BQCV đã được phát hiện trong ấu trùng ong thợ bị bệnh bằng phương pháp PCR [43] Ngoài ra, sự nhiễm BQCV trên ong cũng đã được báo cáo ở Bắc Mỹ, Trung

Mỹ, Châu Âu, Châu Đại Dương, châu Á, châu Phi và Trung Đông

- Con đường lây nhiễm và biện pháp điều trị BQCV

+ Con đường lây nhiễm:

BQCV có thể tấn công ở các giai đoạn phát triển khác nhau của ong mật, bao gồm trứng, ấu trùng, nhộng, ong thợ trưởng thành và ong chúa Số lượng cá thể trong đàn lớn và tỷ lệ tiếp xúc cao giữa các thành viên tạo điều kiện môi trường lý tưởng cho việc truyền các tác nhân gây bệnh Virus được lây truyền theo chiều ngang (giữa những con ong, thông qua thực phẩm bị nhiễm khuẩn/phân, hoặc ve varroa), hoặc theo chiều dọc (chuyển từ ong chúa cho con cái) Virus thường tồn tại trong ong một cách tiềm ẩn, không giết chết ong ngay cũng như không biểu hiện lập tức dấu hiệu của bệnh Tuy nhiên trong những điều kiện nhất định chúng có thể ảnh hưởng đáng kể sức khỏe ong và rút ngắn tuổi thọ của những con ong bị nhiễm bệnh…[24] Trên thực tế, virus chọn con đường truyền thích hợp dựa trên các điều kiện phát triển, sinh lý, sinh thái và dịch tễ học khi các đàn ong đang trong tình trạng không cạnh tranh và khỏe mạnh Đây có thể là một nguyên nhân chính gây lây lan nhanh chóng của bệnh trong cộng đồng và có thể làm sụp đổ của toàn bộ đàn ong

+ Biện pháp điều trị:

Hiện nay, đối với các loại virus trên ong mật nói chung và đối với BQCV nói riêng chưa có thuốc điều trị cũng như vacxin đặc hiệu Để ngăn chặn sự bùng phát dịch bệnh này cần phải kiểm soát được tác nhân gây bệnh Nosema và Varroa Ngoài ra, việc vệ sinh môi trường sạch sẽ, lựa chọn giống ong tốt và cho chế độ ăn uống phù hợp cũng góp phần ngăn chặn sự lây lan của BQCV trong các đàn ong

21

1.3.2.2 Acute bee paralysis virus (ABPV)

Đây là loại virus gây bệnh trên ong được tìm thấy phổ biến rộng rãi ở hầu hết các quốc gia trong liên minh châu Âu ABPV ảnh hưởng đến ong trưởng thành khỏe mạnh gây run và tê liệt trong vòng vài ngày sau khi bị nhiễm bệnh ABPV đã được xác định là một yếu tố chính góp phần vào tỷ lệ tử vong của loài ong mật ở các đàn

bị nhiễm khuẩn bởi V Jacobsoni ABPV lây nhiễm qua tuyến nước bọt của ong

trưởng thành và trong thức ăn mà các chất tiết được thêm vào đó Nó có bộ gen là sợi RNA đơn với 9.470 nucleotide không bao gồm đuôi poly A [37] ABPV chưa bao giờ được phát hiện ở ong trưởng thành đã chết hoặc ấu trùng… bằng phương pháp miễn dịch Phương pháp tối ưu được sử dụng để phát hiện virus này là kỹ thuật sinh học phân tử [23, 30]

1.3.2.3 Chronic bee paralysis virus (CBPV)

Virus này lây nhiễm ong ở các giai đoạn trưởng thành, ấu trùng và nhộng trong đó tấn công chủ yếu ở giai đoạn trưởng thành Các CBPV lần đầu tiên được phân lập vào năm 1963 và nhiễm trùng có thể ảnh hưởng tiêu cực bất kỳ đàn nào trong nhà nuôi ong dù yếu hay mạnh Nhiễm trùng CBPV biểu hiện một số triệu trứng: Đầu tiên, hầu hết ong mật xuất hiện màu đen, không có lông, bóng nhờn Thứ hai là ong bị nhiễm bệnh không tích cực đóng góp vào nhiệm vụ xây tổ và nó thường bị những con ong bình thường khác tấn công bằng cách rỉa cánh Thứ ba là ong không có khả năng bay, run rẩy, tê liệt hàng loạt và cuối cùng là chết [41] CBPV có bộ gen là RNA bao gồm hai sợi riêng biệt của RNA tương ứng được gọi

là RNA1 của 3674 bp và RNA2 của 2305 bp không bao gồm đuôi poly A [40]

1.3.2.4 Sacbrood virus (TATT)

Bệnh ấu trùng túi là một bệnh thường gặp ở ong mật Bệnh do Sacbrood virus gây ra làm chết hàng loạt ấu trùng ở trước giai đoạn hóa nhộng [28] Ấu trùng

khỏe mạnh thường phát triển thành nhộng trong vòng 4 ngày sau khi chúng được vít

nắp, nhưng nếu ấu trùng bị bệnh TATT thì không thể hình thành nhộng [21]

Dấu hiệu ban đầu của ong khi mới nhiễm SBV là tổ bị bít kín, toàn bộ cơ thể

22

ấu trùng bị biến dạng như một cái túi, phía trên nhọn, phía dưới chứa một chất lỏng trong suốt, có màu hơi vàng Ấu trùng chết không có mùi chua Màu sắc thay đổi từ màu trắng đục sang màu vàng, ấu trùng chết bị khô dần đóng vảy nâu Bệnh dịch

bùng phát vào mùa xuân khi mà các ấu trùng bắt đầu nở Bệnh xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới, ở Anh có đến trên 80% số ấu trùng bị chết là do virus Sacbrood gây

ra Tại Australia, bệnh ấu trùng túi gây hậu quả nghiêm trọng cho người nuôi ong, tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa tìm ra các loại thuốc nào đặc hiệu đối với virus này

Virus có hình dạng giống Picornavirus [34] Hiện nay, SBVđược xếp vào họ

Iflavirus có bộ gen là RNA sợi đơn dương, có đường kính là 28nm, không có vỏ

bọc xung quanh và không có biểu hiện đặc biệt khi xâm nhập Hệ gen RNA tương

tự với rhinovirus về thành phần base (G + C= 37-39%), và dễ bị phân hủy trong acid SBV là virus gây bệnh ở ong đầu tiên được giải trình tự hoàn chỉnh, hệ gen RNA khá dài (8,832 nucleotide), dài hơn so với các loại Picornavirus ở hệ gen động vật có vú và là sợi đơn, chứa một khung đọc mở lớn (179 đến 8752 nu) mã hóa cho chuỗi protein 2858 acid amin: protein cấu trúc, protein helicase, enzyme protease và

RNA polymerase

1.3.2.5 Deformed wing virus

Deformed Wing Virus (DWV) là virus có bộ gen là RNA, là 1 trong 18 virus

đã biết gây bệnh nhiều trên ong mật, Apis mellifera Virus này lần đầu được phân

lập từ ong mật có triệu chứng ở Nhật Bản vào đầu những năm 1980 và hiện nay

đang phổ biến trên toàn thế giới bất cứ nơi nào tìm thấy ve Varroa [15] DWV cũng

đã được phát hiện bằng xét nghiệm huyết thanh trong ong lùn A florae Fabr và ong mật châu Á A cerana Fabr (Allen and Ball, 1996) và bằng RT- PCR trong ong vò

vẽ [31] Virus DWV gây ra dị tật cánh và bụng thường được tìm thấy trên ong mật

đã trưởng thành ở các đàn bị nhiễm ve Varroa Những triệu chứng này bao gồm các phần phụ bị hư hỏng, đặc biệt cánh bị rút ngắn và trở nên vô dụng Ong có triệu chứng suy giảm nghiêm trọng tuổi thọ (thường ít hơn 48 giờ) và chúng thường bị trục xuất khỏi tổ

23

Hệ gen của virus này được công bố năm 2006 Hệ gen gồm 10140 nucleotide trừ 1 đuôi poly A và chứa 1 khung đọc mở đơn mã hóa cho 1 polyprotein 328 kDa Đầu 5’ của trình tự trung tâm mã hóa là trình tự dẫn đầu không mã hóa dài 1144 nucleotide (UTR) Đầu 3’trình tự mã hóa là vùng không mã hóa dài 317 nucleotide được gắn đuôi poly A.Thành phần hệ gen gồm 29,5% Adenosine; 15,8% Cytosine; 22,4% Guanine và 32,3% Uracil

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÁT HIỆN VIRUS Ở ONG MẬT

Chẩn đoán bệnh đã có những bước tiến rất lớn, đặc biệt từ khi phát triển các

kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại Hiện nay có rất nhiều các công nghệ và các công

cụ có sẵn để phát hiện, định lượng chính xác protein và tự nucleotide của các tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, ký sinh trùng… Các kỹ thuật hiện đại cho phép phát hiện những biến đổi dù rất nhỏ (thay đổi 1 hoặc 1 vài nucleotide) trong trình tự DNA của tác nhân gây bệnh Các phương pháp chẩn đoán cổ điển phát hiện bệnh bao gồm xác định triệu chứng biểu hiện bệnh, quan sát dưới kính hiển vi, xét nghiệm sinh học và phương pháp huyết thanh học Mỗi phương pháp có điểm mạnh

và điểm yếu riêng nên cần lựa chọn công nghệ phù hợp nhất với yêu cầu chẩn đoán của từng tác nhân gây bệnh Với sự phát triển của khoa học nói chung và sinh học phân tử hiện đại nói riêng, các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện hiện đại hiện nay có thể phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, với độ nhạy và độ chính xác cao, tiện lợi và đơn giản trong sử dụng [16]

1.4.1 Phương pháp ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme)

ELISA chữ viết tắt của cụm từEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Đây

là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để xác định kháng thể (KT) đặc hiệu chống virus ở thời điểm xuất hiện triệu trứng hay ngay sau khi xuất hiện triệu chứng Kỹ thuật này cho phép xác định KT ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml) Nguyên lý của phương pháp này là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể (KN -KT)

KT được đánh dấu bằng cách gắn với enzyme, khi thêm cơ chất thích hợp enzyme

sẽ phân giải cơ chất cho sản phẩm có màu ELISA giúp xác định sự có mặt hay

24

không có mặt cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu [10]

- Ưu điểm: Ưu điểm quan trọng nhất của kỹ thuật này là độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp KN – KT ở nồng độ thấp; thao tác nhanh, đơn giản, ít tốn kém

- Nhược điểm: Độ đặc hiệu không cao và đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu lớn

1.4.2 Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được Kary Mullis và các cộng sự phát triển vào năm 1983 Đây được xem là một trong những phát minh có tính chất đột phá lớn nhất của lĩnh vực sinh học phân tử và công nghệ sinh học hiện đai [7]

Hiện nay, PCR là một kỹ thuật phổ biến nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản

sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm

men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống

Nguyên tắc của PCR là dựa trên cơ sở tính chất biến tính và hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA.Trên cơ sở trình tự của đoạn DNA khuôn, đoạn mồi, nucleotid tự do và enzyme DNA polymerase có thể tổng hợp được DNA giới hạn bởi các đoạn mồi Một phản ứng PCR gồm nhiều sản phẩm ở các chu kỳ trước lại làm khuôn cho các chu kỳ tiếp theo, vì vậy số lượng bản sao tạo ra theo cấp số nhân Một phản ứng PCR thường thực hiện từ 20 – 40 chu kỳ nên từ 1 bản DNA khuôn ban đầu có thể tạo 220 – 240 bản sao DNA [2]

- Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự DNA đích Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời) Độ nhạy và

độ đặc hiệu cao

- Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại Kích thước

25

DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần) Sai sót trong phản ứng còn do sử dụng Enzyme -Taq-polymerase (khoảng 10-4 sai sót cho một lần sao chép)

1.4.3 Phương pháp RT – PCR

- RT – PCR (Reverse transcriptase polymerase chain rection) là kỹ thuật PCR cải tiến từ kỹ thuật PCR chuẩn, được sử dụng để nhân các đoạn DNA từ mạch khuôn RNA Thực chất kỹ thuật RT – PCR gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn đoạn phiên mã ngược từ mạch khuôn RNA tạo cDNA và giai đoạn khuếch đại đoạn cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu RT – PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA; sử dụng trong việc nhận biết các đột biến đa hình dựa vào trình tự phiên mã ngược và được sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của gen Ngoài ra, RT – PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA

- Nguyên tắc của phản ứng RT – PCR

Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã ngược

từ phiên mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA Trong kỹ thuật RT – PCR có sự tham gia của hai loại enzyme là enzyme phiên mã ngược (reversetranscriptase ) và DNA polymerase Một primer oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA Bản sao này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai Tùy theo mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế

để gắn vào nhiều vị trí trên mRNA.[5] Hiện nay, RT – PCR là một trong những phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để phát hiện virus gây bệnh trên ong mật

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG VIỆT NAM

Ở Việt Nam, nghề nuôi ong đã được hình thành từ rất lâu, tuy nhiên những nghiên cứu về virus gây bệnh trên ong vẫn còn rất hạn chế, có rất ít công trình được

26

công bố Trước đây, việc phát hiện sự có mặt virus thường dựa vào những phương pháp truyền thống như kính hiển vi điện tử, huyết thanh học hay miễn dịch học… Các phương pháp này có những hạn chế như tốn nhiều thời gian và độ đặc hiệu thấp dẫn đến xác định sai virus liên quan Ngày nay, kỹ thuật được sử dụng phổ biến để phát hiện các bệnh do virus hại trên thực vật và động vật nói chung và đối với bệnh

do virus gây hại trên ong mật nói riêng là kỹ thuật RT - PCR Năm 2004, lần đầu tiên Lê Thanh Hòa và cộng sự đã giám định virus gây bệnh trên ong bằng phương pháp sinh học phân tử tại các trại ong ở Hòa bình, Hải Hưng [4] Tại Trung tâm nghiên cứu ong TW, Lê Quang Trung và cộng sự (2008) đã bước đầu ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR/RFLP để phát hiện virus trên đàn ong nội tại Hòa Bình Phạm Hồng Thái và cộng sự (2011) đã sử dụng kỹ thuật RT- PCR để phát hiện SBV và DWV trên ong mật nuôi tại Hà Nội [8] Trương Anh Tuấn và cộng sự (2012) đã sử dụng kỹ thuật RT – PCR nghiên cứu mức độ nhiễm 6 chủng virus phổ biển và gây hại nghiêm trọng cho ong mật nuôi tại Việt Nam [9] Mặc dù vậy, các nghiên cứu mới chỉ tiến hành trên quy mô nhỏ nên cần thiết phải có những nghiên cứu ở quy mô toàn quốc về dịch tễ học phân tử của các virus gây bệnh trên ong, về đặc điểm phân tử hệ gen của các virus gây bệnh Đồng thời chúng ta cũng cần phát triển được các phương pháp chẩn đoán có thể đồng thời phát hiện được nhiều loại virus trên cùng một phản ứng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn Các kết quả nghiên cứu đó sẽ làm cơ sở để dự báo và đưa ra các biện pháp phòng trừ hiệu quả các bệnh do virus gây ra trên ong mật đang được nuôi và khai thác ở nước ta

27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỊA ĐIỂM THU MẪU

- Các mẫu ong mật được thu thập tại 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam, bao gồm: Hưng Yên, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An

- Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Vi sinh học phân tử -Viện công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Hóa chất

EDTA (Ethylendiamin tetraacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulphat), Trizol (phenol, pH=8, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), Chloroform, Iso amylalcohol, Phenol, Acetat natri, Acetat kali, Ethanol, NaCl, Tris-HCL, Tris base, Acid acetic, NaOH, Agarose, EtBr, Glycerol, Bromophen-l Blue, X-gal, Kháng sinh Ampicilin, TAE (Tris; acid acetic-Ethylendiamin tetraacetic acid) dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng uy tín như Sigma, Merck, Invitrogen…

28

 Dung dịch dùng cho điện di DNA

- Dung dịch đệm điện di gốc TAE 50X có thành phần như sau:

- Đệm tra mẫu DNA (Loading buffer) 5X:

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để xác định sự lây nhiệm của BQCV trên ong mật (Apis cerana và Apis

mellifera) ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, chúng tôi tiến hành theo sơ đồ nghiên

cứu như sau:

29 Hình 2.1 Sơ đồ mô tả các bước thực hiện trong nghiên cứu

Thu thập mẫu ong ấu trùng và trưởng thành

Tách chiết RNA tổng số

Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ

Tổng hợp cDNA từRNA tổng số

Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu BQCV

Điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%

Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Ecoli

Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng PCR2.1

Tách chiết DNA plasmid

Chọn dòng plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn EcoRI

Tinh sạch plasmid tái tổ hợp

Xác định trình tự đoạn DNA đặc hiệu của BQCV

Xây dựng cây phát sinh loài của BQCV

30

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Ấu trùng ong, ong trưởng thành được thu thập từ các trại nuôi ong ở 5 tỉnh miền Bắc Mỗi tỉnh thu mẫu ở 6 trại, mỗi trại thu 3 đàn khác nhau, mỗi đàn thu 100

ấu trùng và 100 ong trưởng thành Hai trại thu mẫu cách nhau ít nhất là 10 km Mẫu được ký hiệu bằng các chữ cái như ong trưởng thành ký hiệu là T và ấu trùng ký hiệu là A, chữ số kèm theo được đánh theo thứ tự thu thập mẫu như sau: Hưng Yên, Điện Biên, Hòa Bình, Bắc Giang, Nghệ An Sau đó mẫu được bảo quản trong Ethanol 100% và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng

2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Mỗi đàn ong lấy ngẫu nhiên 10 cá thể ấu trùng và 10 cá thể ong trưởng

thành Tách chiết RNA tổng số được thực hiện theo các bước sau [44]:

 Khử trùng dụng cụ nghiền mẫu

 Rửa mẫu ấu trùng và ong trưởng thành bằng DEPC

 Nghiền mẫu bằng N2 lỏng, bổ sung thêm nước đã xử lý Rnase

 Bổ sung 500µl Trizol, mix đều

 Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 2 phút

 Loại bỏ cặn, bổ sung Cloroform: isoamyl (24:1) theo tỉ lệ 1:1 với dịch mẫu

 Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 30 phút

 Hút dịch nổi và bổ sung Isopropanol với tỉ lệ 1:1

 Tủa ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

 Ly tâm 12000 v/p ở 40C trong 30 phút để thu tủa RNA

 Rửa tủa lại bằng 1 ml Ethanol 70%

 Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C

 Làm khô RNA trong box

 Hòa lại cặn RNA trong 30 l nước vô trùng đã loại RNase

 Xác định độ tinh sạch và nồng độ RNA trong các mẫu RNA tổng số bằng máy quang phổ nanodrop