Phân tích cấu trúc, hàm lượng của zerumbon được phân lập từ củ gừng gió bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ OANH PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG CỦA ZERUMBON ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CỦ GỪNG GIÓ BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI Thái Nguyê

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ OANH

PHÂN TÍCH CẤU TRÚC, HÀM LƯỢNG CỦA ZERUMBON ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CỦ GỪNG GIÓ BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ HIỆN ĐẠI

Thái Nguyên-2018

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn:

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Thắm cô

đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo và truyền đam mê nghiên cứu cho em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn, cô đã tận tình hướng dẫn để em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN, tập thể các thầy cô, anh chị và các bạn tại khoa Hóa học trường Đại học Khoa học - ĐHTN đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trường THPT Nguyễn Trãi - An Dương- Hải Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn

Em xin cảm sự hỗ trợ của nhóm nghiên cứu công ty TNHH Công nghệ cao Hải Anh đã hỗ trợ cùng hoàn thành các kết quả thực nghiệm

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô đã dạy dỗ em nên người!

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ em hoàn thành luận văn

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Oanh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN a MỤC LỤC b DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT c DANH MỤC SƠ ĐỒ d DANH MỤC HÌNH e DANH MỤC BẢNG BIỂU f

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc 2

1.1.1 Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4] 2

1.1.2 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1] 4

1.1.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 5

1.2 Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC [23] 10

1.3 Đặc điểm thực vật cây gừng gió 14

1.4 Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) 14

1.5 Các đặc trưng của zerumbon 20

1.5.1 Phân lập và chuyển hóa zerumbon 20

1.5.2 Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbon 22

1.6 Mục tiêu của luận văn 23

Chương 2 THỰC NGHIỆM 24

2.1 Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết bị 24

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu 24

2.1.2 Hóa chất và dung môi 24

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng 24

2.1.4 Xác nhận cấu trúc 24

2.2 Chuẩn bị mẫu zerumbon 25

2.2.1 Chuẩn bị mẫu gừng gió 25

2.2.2 Chưng cất tinh dầu gừng gió 25

2.2.3 Phân lập zerumbon 26

2.3 Phân tích cấu trúc zerumbon bằng các phương pháp phổ 27

2.3.1 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR 27

2.3.2 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ MS 27

2.3.3 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 1H-NMR 27

2.3.4 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ 13C-NMR 28

2.4 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ 2D (HSQC, HMBC, NOESY) 28

2.5 Phân tích độ sạch của zerumbone bằng LC 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Mục tiêu của đề tài 30

3.2 Kết quả chuẩn bị mẫu nghiên cứu 30

3.2.1 Phân tách tinh dầu 30

3.2.2 Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu 30

3.2.3 Phân tách zerumbone bằng sắc ký cột 31

3.3 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR 31

3.4 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ MS 33

3.5 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ NMR 34

3.6 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ HSQC và HMBC 37

3.7 Phân tích độ sạch của zerumbone bằng phương pháp LC 41

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MS Phương pháp phổ khối lượng

EI Phương pháp bắn phá bằng dòng electron

CI Phương pháp ion hóa hóa học

FAB Phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh

HSQC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều biểu

hiện tương tác trực tiếp giữa H với C mà nó liên kết trực tiếp

1H-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

hiđro

13C-NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

cacbon COSY Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều thể hiện

tương tác của các proton gần nhau trong không gian

tương tác xa của nguyên tử 1H với 13

C

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phổ khối lượng của axeton (CH3COCH3 ) 4

Hình 1.2 Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic 5

Hình 1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit 7

Hình 1 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều 9

Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan 10

Hình 1.6 Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC 11

Hình 1.7 Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.) 14

Hình 3.1: Phổ IR của hợp chất zerumbon 32

Hình 3.2 Phổ MS của hợp chất zerumbone 33

Hình 3.3 Phổ 1H-NMR của hợp chất zerumbone 35

Hình 3.4 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất zerumbone 35

Hình 3.5 Phổ 13C-NMR của hợp chất zerumbone 36

Hình 3.6 Phổ DEPT của hợp chất zerumbone 37

Hình 3.7 Phổ HSQC giãn của hợp chất zerumbone 38

Hình 3.8 Phổ HMBC của hợp chất zerumbone 40

Hình 3.9 Phổ HMBC giãn của hợp chất zerumbone 40

Hình 3.10 Một số tương tác của H với C trong HMBC 41

Hình 3.11 Phổ LC và dữ liệu MS bắn phá đỉnh 2.18 42

Hình 3.12 Đường chuẩn LC của zerumbone 42

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió 15

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió 16

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió 17

Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế 19

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát TDZ bằng SKLM 31

MỞ ĐẦU

Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ là một trong số các nhiệm vụ quan trọng của Hóa học vì chỉ khi biết chính xác cấu trúc, chúng ta mới có câu trả lời chính xác cho việc định tính, định lượng và phân tích chúng trong các mẫu nghiên cứu thực cũng như trong đời sống và công nghệ Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng Mỗi phương pháp cho ph p xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.) là cây thuốc quen thuộc của các

dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc và miền Trung Tây Nguyên Việt Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước nhiệt đới Châu Á, được sử dụng làm các bài thuốc chữa đau bụng, bồi dưỡng cho phụ nữ sau khi sinh nở, chống nôn, cảm gió… Gần đây, những kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy Gừng gió có hàm lượng

zerumbon rất cao (73,2% trong tinh dầu củ) Kết quả nghiên cứu in vivo và

in vitro cho biết zerumbon không những có khả năng kháng khuẩn mà còn

có khả năng chống ung thư mạnh và đang được đưa vào thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn III Do có cấu trúc phức tạp, hoạt tính sinh học mạnh nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Luận văn này tập trung vào nghiên cứu phân tích xác định cấu trúc và phương pháp định lượng zerumbon bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về c c phương ph p c nh cấ c

1.1.1 Phương pháp phổ khối lượng (MS) [1-4]

Phổ khối lượng là phương pháp công cụ xác định cấu trúc khác nhiều nhất so với các phương pháp sẽ được nói đến ở chương này Phương pháp phổ khối lượng không phụ thuộc vào sự hấp thụ chọn lọc các tần số cụ thể của bức xạ điện từ mà chú trọng nhiều hơn những gì xảy ra với phân tử khi

nó bị bắn phá bởi các electron có năng lượng cao Nếu một electron có năng lượng khoảng 10 electronvolt ( 10 eV = 230,5 kcal/mol) va chạm với một phân tử hữu cơ thì năng lượng được chuyển giao do kết quả của sự va chạm này đủ để làm bật ra một trong các electron của phân tử

A : B + e → + 2e

-Phân tử electron cation gốc Hai electron

Sơ đồ 1.1: Sự va chạm để làm bật ra một trong các electron

của phân tử

Chúng ta nói phân tử AB bị ion hóa bởi sự va chạm electron Dạng thu được gọi là ion phân tử mang điện tích dương và có số lẻ electron, được gọi là cation gốc Ion phân tử có cùng khối lượng (k m hơn một khối lượng không đáng kể của một electron) như phân tử mà từ đó nó được tạo thành

Để phá vỡ phân tử người ta có nhiều phương pháp: bắn phá bằng dòng electron (EI), phương pháp ion hóa hóa học (CI), phương pháp bắn phá nguyên tử nhanh (FAB)… Dùng dòng electron có năng lượng cao để bắn phá phân tử là phương pháp hay được sử dụng nhất Khi bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hòa sẽ trở thành các ion phân tử mang điện tích dương hoặc bị phá vỡ thành các ion và các gốc theo sơ đồ:

(1) 3e

2

ABC

2e ABC e

B A

B AB ABC

BC A

ABC

AB

Sơ đồ 1.3: Sơ đồ bắn phá các phân tử

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa Các ion dương hình thành đều có khối lượng m và mang điện tích e, tỉ số m/e được gọi là

số khối z Bằng cách nào đó tách các ion có số khối khác nhau ra khỏi nhau

và xác định được xác suất có mặt của chúng, rồi vẽ đồ thị biểu diễn mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay cường độ I) và số khối z thì đồ thị này được gọi là phổ khối lượng (Hình 1.1)

Hình 1.1 Phổ khối lượng của axeton (CH 3 COCH 3 )

Như vậy, khi phân tích phổ khối lượng người ta thu được khối lượng phân tử của chất nghiên cứu, từ các pic mảnh ion trên phổ đồ có thể xác định được cấu trúc phân tử và tìm ra qui luật phân mảnh Đây là một trong những thông số quan trọng để qui kết chính xác cấu trúc phân tử của một chất cần nghiên cứu khi kết hợp nhiều phương pháp phổ với nhau

1.1.2 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [1]

Trong số các phương pháp phân tích cấu trúc, phổ hồng ngoại cho nhiều thông tin quan trọng về cấu trúc của hợp chất Khi chiếu các bức xạ hồng ngoại vào phân tử các hợp chất, bức xạ hồng ngoại sẽ kích thích phân

tử từ trạng thái dao động cơ bản lên trạng thái dao động cao hơn Có hai loại dao động khi phân tử bị kích thích là dao động hóa trị và biến dạng, dao động hóa trị (ν) là dao động làm thay đổi độ dài liên kết, dao động biến dạng (δ) là dao động làm thay đổi góc liên kết

Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định (Hình 1.2)

Hình 1.2 Phổ hồng ngoại của ancol isopropylic

Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau

Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng Các pic nằm trong vùng từ 4000 – 1600 cm-1

thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức Vùng phổ từ 1300 – 626

cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là

để xác định nhóm chức Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ khoảng 3000 cm-1

đến

1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay

1.1.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [1]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ Phương pháp phổ biến

được sử dụng là phổ 1

H-NMR và 13C-NMR Hạt nhân của nguyên tử 1H và

13C có momen từ Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 [2]

x TMS







  

hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:

) ( 10 6 ppm o

x chuan







  

nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ

Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1

H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn [3]

Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm) Đối với 1

H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13

C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm

Hình 1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của axetanđehit

Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân

không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi là vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần Nguyên nhân gây nên

sự tách tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau Tương tác đó thể hiện qua các electron

liên kết Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết

và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác [3]

Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có

thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau [2]

Phổ 2D-NMR

NMR (nuclear magnetic resonance) là kỹ thuật có giá trị nhất để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ Phương pháp NMR có hạn chế là chỉ áp dụng cho các hạt nhân nguyên tử với số hiệu nguyên tử (số thứ tự Z) lẻ

hoặc số khối (A) lẻ vì các nguyên tử loại này có spin hạt nhân thì mới có tính chất từ như 1

H, 13C, 15N, 19F, 31P… Các hạt nhân không có tính từ như 2

D, 12C, 16O, 32S… không thể hiện trên phổ NMR

Ngày nay phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là công cụ hữu hiệu cho nhiều ngành khoa học như vật lý, hóa học, sinh học, dược học, y học, v.v Nó đã đạt được nhiều thành công trong phạm vi chế tạo thiết bị, cải tiến phương pháp đo và ứng dụng Một trong những hành động gần đây nhất là xây dựng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều ( 2D-NMR), ba chiều (3D-NMR), bốn chiều (4D-NMR) Sự phát triển của phương pháp 2D-NMR đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc phân tích cấu trúc các phân tử phức tạp Trước đây nhờ nâng cao cường độ từ trường nam châm, chế tạo các máy cộng hưởng từ hạt nhân có tần số cao từ 300 đến

1000 MHz đã làm giảm nhẹ đi một số khó khăn cho việc phân tích phổ 1

NMR của các phân tử phức tạp, tuy nhiên trong nhiều trường hợp vẫn chưa giải quyết được chính xác được cấu tạo của chất, ngày nay phương pháp phổ 2D-NMR cho ta một lượng lớn thông tin, giúp cho việc phân tích phổ một cách dễ dàng hơn, đặc biệt phổ 3D-NMR cho ph p xác định cấu trúc các phân tử sinh học phức tạp

H-Hình 1 4 Phổ cộng hưởng từ 2 chiều

Cơ sở của phương pháp 2D-NMR dựa theo phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier do đó được gọi là phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier hai chiều (2D-FT-NMR)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều COSY hay HHCOSY chỉ ra

sự tương tác của các proton ở hai nguyên tử C cạnh nhau

Khi có hai nhóm proton tương tác với nhau sẽ tạo ra hình vuông, hai đỉnh hình vuông nằm trên đường ch o, đó là vị trí hai tín hiệu của chúng còn hai đỉnh khác nằm phía ngoài đường ch o

Ví dụ phổ COSY của 2-clorobutan

CH3-CH2-CH(Cl)-CH3

Hình 1.5 Phổ COSY của 2 - Clorobutan

Trên phổ thấy H-1(CH3, t) tương tác với H-3(m) tín hiệu của chúng tạo thành hình vuông, H-2 (CH3, d) tương tác với H-4 (m) tín hiệu của chúng cũng tạo thành hình vuông và H-3 tương tác với H-4 tương tự như vậy

1.2 Phân tích hàm lƣợng các chất bằng HPLC [23]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao đôi khi còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High - Pressure) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường Chính vì thế mà các hợp chất không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút) Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC

Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược nói riêng

Hình 1.6 Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC

(1) Bình chứa pha ộng: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi

vào đầu bơm cao áp cho ph p chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100% Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dụng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha

hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các pic tạp trong quá trình phân tích

(2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ

các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy ra một số hiện

tượng có thể có như sau:

 Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi

 Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt động của cả hệ thống HPLC

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích

(3) Bơm cao p: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá

trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar

và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút

(4) Bộ phận iêm mẫ : Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể

tích bơm có thể thay đồi Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper)

(5) Cộ sắc ký: Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ

thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bằng th p không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0,3-5µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào loại cột và kiểu sắc ký

(6) Đầ dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và

cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn loại đầu dò phù hợp Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát

xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên cơ sở

đó, người ta sản xuất các loại đầu dò sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngoại 190-360nm để phát hiện UV

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang Đây là loại đầu dò thông dụng nhất

- Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang

- Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng qu t chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất

- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường

- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn

- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…

(7)Bộ phận ghi nhận ín hiệ : Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò

phát hiện Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

(8) In dữ liệ : Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy

in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo

và sản xuất thiết bị phân tích Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu

1.3 Đặc iểm thực vật cây gừng gió

Hình 1.7 Cây Gừng gió (Zingiber Zerssumbet Sm.)

Gừng gió là cây thảo mộc, cao 1 – 1,3 m Thân rễ dạng củ, phân nhánh, lúc non màu vàng và thơm, lúc già màu trắng và đắng, có mùi thơm Thân khí sinh khỏe, mọc đứng, nhẵn Lá không cuống mọc thành 2 dãy, hình mác thuôn dài, gốc hẹp dần, đầu nhọn, dài khoảng 20 cm, rộng 5cm mặt trên nhẵn, mặt dưới có lông rải rác Bẹ lá to nhẵn, lưỡi bẹ tròn dễ gãy Cụm hoa dạng trứng, đôi khi hình trụ, kích thước 6 – 14 x 4 – 5 cm, chóp

tù, mọc từ thân rễ trên một cán mập dài 20 – 30 cm phủ bởi những lá bắc xếp lớp; m p màu lục nhạt Đài hoa nhỏ, tràng hoa có ống loe thành thùy hẹp màu trắng; một nhị; bao phấn dài hơn trung đới, cánh môi rộng màu vàng nhạt Các thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có 3 thùy, thùy phía lưng lớn hơn, kích thước 2,5 x 2 cm; các thùy bên nhỏ kích thước 1,6 x 0,7 cm; môi dài 5 cm M p có răng tròn, màu trắng hoặc vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu 3 ô, quả nang hình bầu dục, chứa ít hạt màu đen Mùa hoa

nở từ tháng 7 đến tháng 9 [1,3,9,22]

1.4 Thành phần hóa học của Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm.)

Trong Gừng gió có nhiều tinh dầu, dầu b o và nhựa dầu Trong tinh

dầu có 13% các monoterpen và nhiều sesquiterpen, trong đó humulen 27%, monocyclic, sesquiterpen, xeton, zerumbon 37,5% Các monoterpen gồm

α - pinen, camphen, limonen, cineol, và camphor Zerumbon là thành phần chính của tinh dầu [22]

a)Thành phần hóa học của inh dầ củ Gừng gió

Tinh dầu cây Gừng gió chủ yếu tập trung ở bộ phận củ, tinh dầu củ

Gừng gió có mùi thơm nồng [9] Tinh dầu củ Gừng gió mọc ở Trị Thiên và Đắc Lắc – Việt Nam có các chỉ số hóa học được dẫn ra trong bảng 1.1 [9]

Bảng 1.1: Một số chỉ số hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

Vùng Chỉ số xà phòng hóa Chỉ số axit Chỉ số este

Thành phần hóa học chính của củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên – Việt Nam cũng được chỉ ra trong bảng sau [9,13]

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của tinh dầu củ Gừng gió

6 Caryophylen oxit 1,5 22 Terpinen-4-ol 0,1

b) Thành phần hóa học của inh dầ hân và l Gừng gió

Tinh dầu thân, lá và hoa Gừng gió đều có màu vàng xanh nhạt, phảng phất mùi thơm của tinh dầu hoa bưởi [9] Có khoảng 40 hợp chất tìm thấy trong tinh dầu thân, lá Gừng gió (chiếm hơn 84% và 82% tinh dầu) Năm

1995, Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu thân, lá Gừng gió vùng Bình Trị Thiên, kết quả được chỉ ra trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Thành phần hóa học của tinh dầu thân, lá Gừng gió

gió (%)

Lá Gừng gió (%)

Các chất chưa nhận biết được 15,5 17,7

c) Thành phần hóa học của inh dầ hoa Gừng gió [9,13]

Hơn 44 hợp chất được tìm thấy trong tinh dầu hoa Gừng gió sinh trưởng khu vực Huế (chiếm khoảng 85% tinh dầu) và được chỉ ra trong bảng 1.4

Bảng 1.4: Thành phần hóa học của tinh dầu hoa Gừng gió Huế

lượng (%)

lượng (%)

11 (E)-β-ocimen 1,3 33 Caryophylen oxit 2,2

13

2-metyl-6-metylen-1,7-octadien

16 Tecpinen-4-ol 0,1 38 Trans-phytol 1,8

20 Dihidroedulan I 0,1 42 Tetracosan 0,5

Kết quả phân tích định lượng và nhận dạng các thành phần hóa học của

tinh dầu củ, thân, lá và hoa của cây Gừng gió (Zingiber Zerumbet Sm.) cho

thấy thành phần chủ yếu của các loại tinh dầu này là các sesquitecpen và dẫn xuất chứa oxi của chúng được xây dựng trên hai khung cacbon cơ sở là humulan và caryophylan Trong tinh dầu củ chúng chiếm đến 83,6%, tinh dầu của thân và lá có thêm dẫn xuất oxi của khung farnezan chiếm một lượng khá lớn: trong thân là 16,8%, trong lá là 22,3%

Mối liên hệ giữa 4 loại tinh dầu này dựa trên 3 thành phần: zerumbon, humulen và caryophylen với tinh dầu của củ thì zerumbon là chủ yếu (72,3%), humulen và humulen oxit là 11,3%, caryophylen chiếm 1,5% Trong khi đó, tinh dầu của hoa thì zerumbon là 3,2%, humulen là 1,9% nhưng caryophylen lên đến 13,2%

Ở các vùng lãnh thổ khác nhau thì các thành phần này cũng khác nhau,

ví dụ như tinh dầu củ Gừng gió Việt Nam vùng Bình Trị Thiên zerumbon chiếm 72,3%, humulen chiếm 4,2% Trong khi đó, tinh dầu củ Gừng gió Philippin thì zerumbon chiếm 35,5% và humulen là 17,3% Trong cây Gừng gió thì hàm lượng tinh dầu trong củ là cao nhất Vì trong tinh dầu của củ Gừng gió zerumbon là thành phần có hàm lượng lớn nhất nên nói đến tinh dầu Gừng gió là nói đến zerumbon và hàm lượng của nó là tiêu chuẩn để đánh giá tinh dầu Gừng gió

1.5 C c ặc ƣng của ze mbon

1.5.1 Phân lập và chuyển hóa zerumbon

Zerumbon là thành phần chính được phân lập từ củ Gừng gió lần đầu tiên vào năm 1960 [11], được Damodaran.N.P và các cộng sự xác định cấu trúc phân tử vào năm 1965 Hiện nay zerumbon đang được ứng dụng trong lâm sàng làm thuốc điều trị ung thư ở giai đoạn III Do đó việc phân tích cấu trúc và xây dựng phương pháp hóa lý hiện đại để định lượng zerumon là rất có

ý nghĩa khoa học

Zerumbon còn có tên là 8-oxohumulen, tên khoa học là 2,6,9,9-tetrametylcycloundeca-2,6,10-trien-1-on, được phân lập chủ yếu từ tinh dầu Zermbon là tinh thể hình kim, nóng chảy ở 67-68oC và có nhiệt độ sôi (10 mmHg) là 165-167oC Ngoài ra, zerumbon đã được phân lập từ các

(E,E,E)-cây: Syringa pinnafolta; Zingiber zerumbet và một số cây thuộc chi gừng

Zerumbon là một xeton sesquitecpen đơn vòng, trong phân tử có nhóm

cacbonyl α,β không no, có ba liên kết đôi do đó khả năng chuyển hóa zerumbon

rất lớn: chuyển hóa ở các liên kết đôi (1, 2 hay cả 3 liên kết đôi) bằng các phản ứng khác nhau như cộng hợp, oxi hóa, đồng phân hóa Chuyển hóa nhóm cacbonyl bằng cách khử hóa theo các mức độ khác nhau, như khử thành ancol, khử thành metylen bằng các phương pháp khử khác nhau, bảo toàn và không bảo toàn liên kết đôi Chuyển hoá mở vòng thành các dẫn xuất oxi hay dẫn xuất khác

Zerumbon là một tác nhân chống ung thư [21], phòng ngừa ung thư [18], chống viêm, kháng các vi sinh vật [17] và chống virut HIV [12] Do đó, chuyển hóa zerumbon còn nhằm tạo ra các sản phẩm có hoạt tính sinh học tốt hơn zerumbon và tìm ra nhóm chức sinh học của phân tử zerumbon cũng là một hướng chuyển hóa rất được quan tâm: Khử hóa nhóm cacbonyl thành ancol để nghiên cứu phản ứng tổng hợp bất đối xứng của zerumbol và xác định cấu hình

tuyệt đối của nó [15] Cộng hợp vào liên kết đôi liên hợp α,β của nhóm

cacbonyl: các nghiên cứu cho thấy khi ở nhiệt độ phòng hay ở nhiệt độ

thấp hơn các amin bậc 1 và bậc 2 cộng hợp vào liên kết đôi α,β với nhóm

cacbonyl tạo ra các dẫn xuất amin của zerumbon [17]

1.5.2 Hoạt tính sinh học của gừng gió và zerumbon

Như phần trên đã trình bày hàm lượng zerumbon trong củ Gừng gió rất cao, đặc biệt trong tinh dầu (73,2%) [13] Nó là thành phần chính quyết định giá trị của tinh dầu Gừng gió cũng như cặn chiết của Gừng gió Do đó, nghiên cứu hoạt chất sinh học trong Gừng gió trước hết là nghiên cứu hoạt tính sinh học của zerumbon

Hoạt tính chống ung thư là hoạt tính nổi bật của zerumbon Điều này được Takahashi.S đề cập đến năm 1988 [16] và về sau có nhiều nghiên cứu khẳng định điều này Đặc biệt năm 2005, Huang.G.C và cộng sự nghiên

cứu tác dụng ức chế khối u của zerumbon trên tế bào P-388Dl invitro, invo

ở chuột và khẳng định ở nồng độ 5 mg/kg (thể trọng chuột) thì k o dài sự sống của chuột một cách rõ rệt [14] Zerumbon cũng ức chế sự phát triển tế bào ung thư máu trắng dòng HL 60 ở người, ở các nồng độ 22,29; 9,12 và 2,27 µg/ml trong 6, 12 và 18 giờ, tùy theo phương thức điều trị [25]

Ngoài nghiên cứu hoạt tính chống ung thư, người ta cũng rất quan tâm nghiên cứu hoạt tính phòng ngừa ung thư và nhóm chức sinh học của phân tử zerumbon Đây là một hướng nghiên cứu mới phát triển đầu thế kỉ này Để khảo sát hoạt tính phòng ngừa ung thư Murakami.A và cộng sự đã khảo sát hoạt tính ức chế của zerumbon đối với tác nhân gây ung thư TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-axetat) do hoạt động của virut Epstein-Barr tạo ra Kết quả cho thấy zerumbon là một tác nhân ức chế mạnh tác nhân gây ung thư TPA (IC50 = 0,14 µM) [18]

Các nghiên cứu sâu hơn vai trò của nhóm cacbonyl α, β không no trong phân tử zerumbon của Nakamura và cộng sự cho thấy zerumbon là một tác nhân hóa học phòng ngừa (chemopreventive agent) chống lại các bệnh ung thư ruột già và ung thư da nhờ nhóm cacbonyl α, β không no của

nó đã kích thích các enzym giải độc phase II của tế bào biểu mô nuôi cấy trên chuột Còn humulen và zerumbol không có các nhóm này nên không thể hiện một tác dụng nào Các tác giả còn cho rằng đặc tính ái điện tử của

nhóm cacbonyl α, β không no làm cho khả năng phản ứng ái nhân của các protein sunfuryl tốt hơn ở vị trí nhóm cacbonyl này, nhất là các tiol có phân

tử lượng thấp Đó là thực chất vai trò quan trọng của nhóm cacbonyl α,β

không no trong kích thích enzym giải độc phase II [20]

1.6 Mục tiêu của luận văn

Như đã phân tích ở trên zerumbone là một hoạt chất chính được phân lập từ cây gừng gió có hoạt tính chống ung thư mạnh, hiện nay đang được nghiên cứu ứng dụng trong lâm sàng giai đoạn 3 cho thử nghiệm làm thuốc điều trị nhiều loại bệnh ung thư Luận văn này tập trung vào việc phân tích cấu trúc của zerumbone bằng các phương pháp phổ hiện đại và phương pháp định lượng, xác định độ sạch của zerumbone bằng phương pháp HPLC Góp phần vào việc xây dựng các tiêu chuẩn cơ bản cho việc xác

định cấu trúc cũng như định lượng chất này

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Phương ph p nghiên cứu, nguyên liệu và thiết b

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

Các phương pháp phân lập các hợp chất hữu cơ thiên nhiên được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ – Hóa dược – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Nhằm mục đích chuẩn bị các mẫu nghiên cứu cho phân tích cấu trúc

2.1.2 Hóa chất và dung môi

Các hóa chất phục vụ cho việc tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ) Silicagel cho sắc ký cột là loại 100 - 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel là bản nhôm tráng sẵn Art 5554 DC - Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck)

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính các chất và hỗn hợp sản phẩm Thông thường các chất có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và

sự phát quang khác nhau Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất của các chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất

đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

b) Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR của các chất nghiên cứu được xác định trên máy FT-IR Spectrum Two Perkinelmer L160 tại phòng Hóa dược – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các mẫu nghiên cứu được đo ở dạng p viên với KBr rắn

c) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1

H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi thích hợp và TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.2.1 Chuẩn bị mẫu gừng gió

Gừng gió được thu hoạch vào tháng 10 năm 2017 tại Hải Dương, được

xác định tên khoa học là Zingiber zerumbet Sm Nguyên liệu tươi được rửa

sạch, loại bỏ phần hư hỏng, lấy khối lượng gừng là 1000g đem băm nhỏ thành các mảnh kích thước khoảng 1 mm,

2.2.2 Chưng cất tinh dầu gừng gió

Cho 1000g củ Gừng gió tươi đã được chuẩn bị ở trên vào nồi cất cuốn hơi nước, cho tiếp dung dịch nước muối NaCl 15% đến ngập nguyên liệu Sau đó đem cất lấy dịch dầu-nước, cất cho tới khi dịch dầu-nước có phản ứng âm tính với thuốc thử Bayers, mất khoảng 5h, thu được 6 lit dịch dầu-nước Lấy dịch dầu-nước bão hoà bằng NaCl tiếp theo chiết 5 lần bằng toluen mỗi lần 100 ml Gộp các dịch chiết này lại được 500 ml, làm khô bằng Na2SO4 khan, sau đó đem loại dung môi ở áp suất thấp thu được 6,0 gam tinh dầu, là một hỗn hợp gồm chất lỏng màu vàng sáng ở phía trên và

tinh thể màu trắng ở phía dưới, hỗn hợp có mùi thơm dễ chịu Hỗn hợp tinh dầu được làm lạnh ba lần mỗi lần 24h và được lọc thu lấy tinh thể thô Phần tinh thể thô là chất rắn màu trắng có khối lượng 4,5g, có khoảng chảy 60-

* Nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt

Cân 80 g silicagel (cỡ hạt 0,040-0,063 mm của hãng Merck) hòa với

200 ml n-hexan trong cốc thủy tinh dung tích 500 ml Khuấy đều cho đến

khi không còn bọt khí trong cốc Mở khóa cột và cho hỗn hợp silica gel trong dung môi n-hexan lên cột, dùng quả bóp cao su gõ nhẹ lên cột nhiều lần cho đến khi không còn bọt khí trong cột thì mới tiến hành nhồi cột Không để cột bị khô và sau khi nhồi xong phải để ổn định cột 12 giờ

* Tẩm mẫu

Cân 4 g TDZ hòa tan vừa hết bằng 20 ml n-hexan trong cốc 50 ml Sau

đó, thêm từ từ và khuấy đến khi hết 4,5 g silica gel Loại hết dung môi thu bột silica gel đã tẩm TDZ

* Tiến hành sắc kí cột

Mở khóa dưới cho dung môi n-hexan ra khỏi cột đến khi bề mặt dung

môi cách bề mặt silica gel 2 mm Cho toàn bộ mẫu đã chuẩn bị lên cột Bề mặt của lớp silica gel tẩm mẫu phía trên và silica gel nhồi cột phía dưới, phải được đảm bảo tạo thành một mặt phẳng ngang so với cột để trong quá trình rửa giải chất xuống đều và cho hiệu quả phân tách cao Rắc một lớp mỏng silica gel lên trên, sau đó phủ một lớp bông thủy tinh để tránh các khuếch tán ngược

Tiến hành rửa giải với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat tỉ lệ 95/5, v/v,

tốc độ rửa giải là 20 giọt trên phút Kết quả thu được 30 phân đoạn mỗi phân đoạn chứa 5 ml Phân đoạn chứa zerumbon được thu từ ống số 6 đến ống 25 Loại dung môi ở áp suất thu được zerumbon sạch 3,6g

1.3 Phân tích cấu trúc zerumbon bằng c c phương ph p phổ

2.2.1 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ IR

Cân 2 mg zerumbone được trộn với 100 mg KBr trong cối mã não,

trộn đều và được nghiền mịn thành hỗn hợp đồng nhất bằng chày của cối

mã não Hỗn hợp này được đưa vào thiết bị p viên thủy lực 50 tấn của hãng HP, sau đó mẫu được đo lần lượt trên trên máy FT-IR Spectrum Two Perkinelmer L160 tại phòng Hóa dược – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

IR (KBr) cm-1: 3026; 2963; 2943; 2920; 2897; 2856; 1655; 1456; 1387; 1364; 1299; 1263; 1212; 1183; 1104; 964; 907; 847; 827; 780; 696

2.2.2 Phân tích cấu trúc của zerumbon bằng phổ MS

Lấy 1 mg zerumbon hòa tan trong 1 ml dung môi axetonnitrile tạo

thành dung dịch đồng nhất Tiếp theo, lấy xi lanh bơm mẫu hút 1µ đung dịch trên đưa vào máy khối phổ LTQ Orbitrap XL tại Khoa hóa học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội MS (m/z):

219 [M+H]+, 241 [M+Na]+

25 mg zerumbone ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được

đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam với số lần scan là 16

25 mg zerumbone ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được

đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, với số lần scan là 256

13

C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ ppm: 204,3 (C-1); 160,7 (C-10);

148,8 3); 137,9 2); 136,2 6); 127,1 11); 125,0 7); 42,4 8); 39,4 (C-4); 37,8 (C-9); 29,4 (C-14); 24,4 (C-5); 24,2 (C-15); 15,2 (C-13); 11,7 (C-12)

(C-2.3 Phân tích cấu trúc của zerumbone bằng phổ 2D (HSQC, HMBC, NOESY)

35 mg zerumbone ở trên được cho vào trong ống NMR loại (tubes NMR của Aldrich) dài 20,3 mm, rộng 5 mm sau đó cho 0,8 ml CDCl3 và

lắc đều cho mẫu tan hết vào dung môi tạo thành hệ đồng nhất Mẫu được

đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với TMS là chất chuẩn, tại Trung tâm Phân tích cấu trúc - Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam Thời gian đo với HSQC là 3h, HMBC là 4h và NOESY là 6h

2.4 Phân ích ộ sạch của zerumbone bằng LC

Phân tích định lượng để xác định độ sạch của zerumbon bằng phương pháp LC được thực hiện trên máy LTQ Orbitrap XL tại Khoa hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Cân 2,5 mg mẫu phân tích được hòa trong MeOH sau đó lọc qua màng lọc 0,25

um sau đó tiêm vào hệ thống và phân tích với chương trình đo như sau:

- Pha động: axetylnitrin (A) và H2O chứa 0,1% focmic axit (B);

- Thể tích bơm: 3uL

- Tốc độ bơm 100uL/m

- Chương trình dung môi: 0-10 phút; 90% A và 10%B

- Detector: Iontrap, chế độ đo ESI ở cả mode âm và dương

- Pha tĩnh: cột Hypersil Gold C18, 5cmx 2,1mm x 1,9 um

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mục tiêu của ề tài

Như đã nghiên cứu trong phần tổng quan, gừng gió là cây thuốc quen thuộc của các dân tộc thiểu số ở miền núi phía Bắc Việt Nam, là loài thực vật phát triển mạnh mẽ và phân bố ở hầu hết các nước nhiệt đới nhất là tại các nước Đông Nam Á Kết quả nghiên cứu cho thấy zerumbone là thành phần chính có hàm lượng rất cao (73,2% trong tinh dầu củ) Do có cấu trúc phức tạp, hoạt tính sinh học mạnh nên được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Ngày nay, việc phân tích cấu trúc các hợp chất thiên nhiên phức tạp trở nên thuận tiện hơn nhờ các kỹ thuật phân tích phổ phát triển Trong nội dung của luận văn này, chúng tôi tập trung phân tích cấu trúc hóa học zerumbone bằng sự kết hợp nhiều phương pháp phổ hiện đại như

IR, MS, NMR 1D và 2D, đồng thời nghiên cứu xác định độ sạch của hợp chất phân lập được bằng phương pháp LC

3.2 Kết quả chuẩn b mẫu nghiên cứu

3.2.1 Phân tách tinh dầu

Mẫu gừng gió Zingiber zerumbet Sm được thu hoạch vào tháng 10 năm

2017 tại Hải Dương Nguyên liệu tươi được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng và được băm nhỏ thành các mảnh kích thước khoảng 1 mm Tinh dầu được tách bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước theo công bố trong tài liệu [22, 24] Tinh dầu chưng cất được làm lạnh cho tới khi xuất hiện tinh thể zerumbone thô kết tinh Phần tinh thể là chất rắn màu trắng có khối lượng 4,5g, có điểm chảy 60-68oC được ký hiệu là TDZ

3.2.2 Khảo sát điều kiện tách mẫu nghiên cứu

Để có các mẫu zerumbone cho nghiên cứu phân tích cấu trúc, đề tài tiến hành phân lập zerumbon từ tinh dầu gừng gió Sắc ký lớp mỏng phần

rắn TDZ với hệ dung môi n-hexan/etyl axetat 95/5 chúng tôi thu được 5