Định lượng đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat trong một số thuốc giảm đau, hạ sốt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV vis)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHẠM MINH KHA ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, CLOPHENINAMIN MALEAT TRONG MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU, HẠ SỐT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG H

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM MINH KHA

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL,

CLOPHENINAMIN MALEAT TRONG MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU, HẠ SỐT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-Vis)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

THÁI NGUYÊN - 2019

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHẠM MINH KHA

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL,

CLOPHENINAMIN MALEAT TRONG MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU, HẠ SỐT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-Vis)

Ngành: Hóa phân tích

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực Những kết luận của luận văn chưa công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019

Tác giả luận văn

Phạm Minh Kha

Xác nhận của Trưởng khoa Hóa học

PGS.TS Nguyễn Thị Hiền Lan

Xác nhận của Giáo viên hướng dẫn

PGS.TS Mai Xuân Trường

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tác giả đã nhận được nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn bè

và gia đình

Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Khoa Hóa học, Phòng đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Với khối lượng công việc lớn, thời gian nghiên cứu có hạn, khả năng nghiên cứu còn hạn chế, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy giáo, cô giáo và bạn đọc

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2019

Tác giả

Phạm Minh Kha

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN iv

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN v

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về paracetamol và clopheninamin maleat 2

1.1.1 Paracetamol 2

1.1.2 Clopheninamin maleat 4

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 6

1.2.1 Nguyên tắc của phương pháp phổ hấp thụ phân tử 6

1.2.2 Phương pháp lọc Kalman 6

1.2.3 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp phổ hấp thụ phân tử 6

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3.1 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí 10

1.4 Một số kết quả xác định PRC và CPM theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

Chương 2 THỰC NGHIỆM 19

2.1 Nội dung nghiên cứu 19

2.1.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 19

2.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 20

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 20

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 21

2.3.1 Giới hạn phát hiện 21

2.3.2 Giới hạn định lượng 21

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 21

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê 23

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 23

2.4.1 Thiết bị 23

2.4.2 Dụng cụ - Hóa chất 24

2.4.3 Chế phẩm thuốc 26

2.5 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu 27

2.6 Chuẩn bị dung dịch chuẩn cho phương pháp phổ hấp thụ phân tử 28

2.7 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 29

2.8 Chuẩn bị dung dịch thuốc cho phương pháp phổ hấp thụ phân tử 29

2.8.1 Dung dịch thuốc COBIMOL 29

2.8.2 Dung dịch thuốc DOZOLTAC 30

2.8.3 Dung dịch thuốc HAPACOL 150FLU 30

2.8.4 Dung dịch thuốc SACENDOL 30

2.9 Chuẩn bị dung dịch thuốc cho phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 31

2.9.1 Dung dịch thuốc COBIMOL 31

2.9.2 Dung dịch thuốc DOZOLTAC 31

2.9.3 Dung dịch thuốc HAPACOL 150FLU 31

2.9.4 Dung dịch thuốc SACENDOL 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 33

3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của paracetamol và clopheninamin maleat 33

3.1.2 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CPM vào pH 34

3.1.3 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo

thời gian 34

3.1.4 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo nhiệt độ 35

3.1.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe - Lambe - Bia của PRC và CPM Xác định chỉ số LOD và LOQ 36

3.1.6 Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha 40

3.1.7 Xác định hàm lượng PRC và CPM trong thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL 41

3.1.8 Xác định hàm lượng PRC và CPM trong thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL theo phương pháp thêm chuẩn 43

3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 45

3.2.1 Xác định điều kiện tối ưu cho phép xác định PRC và CPM bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 45

3.2.2 Đánh giá phương pháp định lượng 49

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

DANH MỤC VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

Tiếng việt Tiếng Anh Viết tắt

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN

Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của PRC và CPM ở các giá trị pH 34

Bảng 3.2 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo thời gian 35

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo nhiệt độ 36

Bảng 3.4 Độ hấp thụ quang của dung dịch PRC ở các giá trị nồng độ 36

Bảng 3.5 Kết quả xác định LOD và LOQ của PRC 38

Bảng 3.6 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của CPM theo nồng độ 38

Bảng 3.7 Kết quả tính LOD và LOQ của CPM 39

Bảng 3.8 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và CPM 40

Bảng 3.9 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và CPM trong hỗn hợp 41

Bảng 3.10 Kết quả tính nồng độ, sai số PRC và CPM trong mẫu thuốc 42

Bảng 3.11 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC và CPM trong mẫu thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL 44

Bảng 3.12 Giá trị các đại lượng đặc trưng 49

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát thời gian lưu 49

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát diện tích pic 49

Bảng 3.15 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC và CPM 50

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ lặp lại 52

Bảng 3.17 Kết quả phân tích hàm lượng PRC và CPM trong thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL 53

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN

Hình 1.1 Công thức cấu tạo paracetamol 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Clopheninamin maleat 4

Hình 2.1 Máy UV - Vis DR 5000 (Mỹ) 23

Hình 2.2 Máy UV - Vis Shimadzu 1700 (Nhật) 23

Hình 2.3 Máy sắc ký lỏng HPLC Agilent 1260 (Mỹ) 24

Hình 2.4 Thuốc COBIMOL 26

Hình 2.5 Thuốc DOZOLTAC 26

Hình 2.6 Thuốc HAPACOL 150FLU 27

Hình 2.7 Thuốc SASENDOL 27

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các dung dịch PRC và CPM 33

Hình 3.2 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của PRC 37

Hình 3.3 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ CPM 39

Hình 3.4 Sắc ký đồ của PRC (300 mg/L) 47

Hình 3.5 Sắc ký đồ của CPM (10 mg/L) 47

Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hợp mẫu giả PRC (300 mg/L), CPM (10 mg/L) 48

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC 51

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CPM 51

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe con người ngày càng được chú trọng Vì vậy trên thị trường ngày càng xuất hiện nhiều loại dược phẩm được phân phối rộng rãi Các loại thuốc tân dược ngày các phát triển mạnh và có nhiều công dụng khác nhau như kháng sinh, giảm đau, hạ sốt…

Việc xác định chính xác hàm lượng các loại thuốc này theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất cần tách riêng từng loại chất và định lượng chúng bằng các phương pháp khác nhau Do đó để đánh giá đúng chất lượng sản phẩm một cách nhanh chóng, chính xác, an toàn và hiệu quả thì công tác kiểm nghiệm để xác định các thành phần của thuốc bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao ngày càng được quan tâm Nhiều phương pháp có độ lặp và độ chính xác cao đã được ứng dụng Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy việc

sử dụng phương pháp HPLC, phương pháp UV-VIS dùng phổ toàn phần kết hợp với kỹ thuật tính toán và ứng dụng phần mềm máy tính đã được nghiên cứu

và cho nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ lặp, độ chính xác, độ tin cậy của phép

phân tích cao, phân tích nhanh, tiện lợi [Error! Reference source not found.,

10, 11, 14]

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: "Định lượng đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat trong một số thuốc giảm đau, hạ sốt bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis)"

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paracetamol và clopheninamin maleat

1.1.1 Paracetamol

Paracetamol (PRC) hay acetaminophen (tên được chấp nhận tại Hoa Kỳ)

là một thuốc có tác dụng hạ sốt và giảm đau, tuy nhiên không như aspirin nó không hoặc ít có tác dụng chống viêm

So với các thuốc chống viêm thì PRC có ít tác dụng phụ với liều điều trị,

cho nên được cung cấp không cần kê đơn ở đa số các nước

1.1.1.1 Giới thiệu chung

Hình 1.1 Công thức

cấu tạo paracetamol

- Tên quốc tế: Paracetamol

- Tên khác: Acetaminophen

- Công thức phân tử: C8H9O2N

- Khối lượng phân tử: 151,17g/mol

- Biệt dược: Panadol, Pradon, Pandol,

- PRC là chất bột, kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy: 169oC

- Độ tan trong nước: 0,1 - 0,5g/mL nước tại 22oC Ngoài ra còn có khả năng tan trong etanol, dung dịch kiềm, dung dịch axit,

- Chế phẩm ít tan trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, khó tan trong clorofom, ete, etanol và các dung dịch kiềm dung dịch bão hòa trong nước có

pH vào khoảng 5,3 - 5,6; pKa = 9,51

Nhóm -OH làm cho chế phẩm có tính axit và khi tác dụng với muối sắt (III) cho màu tím

Đun nóng với dung dịch HCl thì bị thủy phân, thêm nước thì không có kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit Thêm thuốc thử kali dicromat thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang màu đỏ

Quá trình chủ yếu là:

Đun nóng dung dịch trên với axit sunfuric có mùi axit axetic có thể dùng phản ứng này để định tính và định lượng PRC

Tổng hợp

Paracetamol được tổng hợp 4 bước từ nguyên liệu đầu là phenol:

1 Phenol được nitrat hóa bởi axit sunfuric và natri nitrat

2 Đồng phân para được tách ra khỏi đồng phân octo bằng phản ứng thủy phân (sẽ có một ít đồng phân meta, như OH là mạch thẳng octo và para)

3 Chất 4 nitrophenol được biến đổi thành 4 - aminophenol sử dụng một chất khử như natriborohydrit (NaBH4) trong môi trường kiềm cho ra para-aminophenol

4 Para- aminophenol phản ứng với anhidrit axetic cho ra paracetamol

Đem kết tinh lại paracetamol trong hỗn hợp etanol-nước

1.1.1.3 Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: Paracetamol, Panadol, Donodol…500mg

- Chế phẩm viên đạn: Efferalgan, Panadol80 mg, 150 mg, 300mg

- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan codein, Donodol, Panadol 500mg

- Chế phẩm gói bột: Pacemin, Efferalgan 80 mg

- Chế phẩm dạng bột tiêm: Pro-Dafalgan 2g proparacetamol tương đương 1g Paracetamol

- Chế phẩm dạng dung dịch uống

- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác

1.1.2 Clopheninamin maleat

1.1.2.1 Giới thiệu chung

Hình 1.2 Công thức cấu tạo

Clopheninamin maleat

- Tên quốc tế: Chlorpheniramine maleate

- Tên khác: Clorphenamin hoặc Chlorpheniramine propylamine, hoặc Chlorprophenpyridamine

- Công thức phân tử:

C16H19ClN2. C4H4O4

- Khối lượng phân tử: 390,87 g/mol

- Biệt dược: Codacmin, Pacemin, Panactol enfant, Tro-padol-Flu, Triam-Fort

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit

- Tên IUPAC: 3-(4-clorophenyl)- N, N -dimethyl- 3 - (4-clorophenyl) -

N, N-dimethyl- 3-pyridin-2-yl-propan-1-amine 3-pyridin-2-YL-propan-1-amin

Khối lượng mol phân tử: 390,87 (g/mol)

Clopheninamin maleat (CPM) thường bán trên thị trường là thế hệ đầu tiên alkylamin kháng histamin được sử dụng trong dự phòng các triệu chứng của dị ứng các điều kiện như viêm mũi và nổi mề đay Tác dụng an thần của nó là tương đối yếu so với các thuốc kháng histamin thế hệ đầu tiên CPM là một trong những thuốc kháng histamin thường được sử dụng trong thực tế Nói chung CPM không được chỉ định như một thuốc chống trầm cảm hoặc lo âu [15, 25]

Clopheninamin maleat là một phần của một loạt các thuốc kháng histamin bao gồm pheninamin (Naphcon) và các dẫn xuất halogen hóa của nó

và những chất khác bao gồm fluorpheninamin, dexclorpheninamin (Polaramin), brompheninamin (Dimetapp), dexbrompheninamin (Drixoral), descloxpheninamin, dipheninamin (còn gọi là triprolidin với tên thương mại Actifed) và iotpheninamin

Clopheninamin maleat là một kháng histamin có rất ít tác dụng an thần

Như hầu hết các kháng histamin khác, clopheninamin maleat cũng có tác dụng

phụ chống tiết acetylcholin, nhưng tác dụng này khác nhau nhiều giữa các cá thể Tác dụng kháng histamin của CPM thông qua phong bế cạnh tranh các thụ thể H1 của các tế bào tác động

1.1.2.2 Tính chất

Clopheninamin maleat là bột tinh thể trắng, không mùi Tan trong nước

pH = 4-5; etanol 96 %, cloroform; ít tan trong ete, benzen

- Nhiêt độ nóng chảy: 132-1350C

- Độ tan trong nước: 0,55 g/100 mL ở 200C

- Clopheninamin maleat chuyển hóa nhanh và nhiều Các chất chuyển

hóa gồm có desmethyl - didesmethyl- clopheninamin maleat và một số chất

chưa được xác định, một hoặc nhiều chất trong số đó có hoạt tính

1.1.2.3 Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: Codacmin, Panactol enfant, Tro-padol-Flu, Triam-Fort

- Chế phẩm viên đạn: Pacemin, Calmezin, Amecol C, Codacmin, Corypadol

- Chế phẩm siro: Dibigen

- Chế phẩm gói bột: ACE, Babyplex, Pamin

- Các chế phẩm kết hợp với thuốc khác [3,4]

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử là phương pháp phân tích định lượng dựa vào hiệu ứng hấp thụ xảy ra khi phân tử vật chất tương tác với bức

xạ điện từ Vùng bức xạ được sử dụng trong phương pháp này là vùng tử ngoại gần hay khả kiến ứng với bước sóng khoảng từ 200÷800nm Hiện tượng hấp thụ bức xạ điện từ tuân theo định luật Bouger - Lam bert - Beer Ứng dụng phương pháp phổ đo quang, người ta có thể xác định nhiều hợp chất trong phạm vi nồng độ khá rộng nhờ các cải tiến quan trọng trong thủ tục phân tích Đây là phương pháp phân tích được phát triển mạnh vì nó đơn giản, đáng tin cậy và được sử dụng nhiều trong kiểm tra sản xuất hoá học, luyện kim và trong nghiên cứu hoá sinh, môi trường và nhiều lĩnh vực khác [6]

1.2.1 Nguyên tắc của phương pháp phổ hấp thụ phân tử

Phổ hấp thụ là phổ hấp thụ của các chất tan ở trạng thái dung dịch đồng thể của một dung môi nhất định như: nước, metanol, benzen, toluen, clorofom…

Vì thế, muốn thực hiện phép đo phổ này ta phải:

- Hòa tan chất phân tích trong một dung môi phù hợp

- Chiếu vào dung dịch mẫu chứa hợp chất cần phân tích một chùm bức

xạ đơn sắc có năng lượng phù hợp để cho chất phân tích hay sản phẩm của nó hấp thụ bức xạ để tạo ra phổ hấp thụ của nó

- Đo cường độ của chùm sáng sau khi đã qua dung dịch mẫu nghiên cứu

1.2.2 Phương pháp lọc Kalman

Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được

của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực Trong thực tế, người ta

sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman Kết quả tính toán là

lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo

ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và

sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ

Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng

độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.

Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman

Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [8, 21, 22]

1.2.3 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp phổ hấp thụ phân tử

Trên thế giới nói chung và ở nước ta nói riêng, phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm

về dược và kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao [2,13,14,28]

Năm 2012, Siladitya Behera và các cộng sự xác định thành công

acetaminophen thuốc viên nén sử dụng phương pháp UV-Vis Điều kiện tối ưu

để xác định acetaminophen: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ

200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch acetaminophen λmax = 243 nm Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm

đo quang là trong khoảng 8 giờ, ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,00 đến 150,0 μg/mL, độ thu hồi của acetaminophen từ 98,54% đến 99,13% [28]

Năm 2014, Vũ Duy Long xác định thành công đồng thời acetaminophen, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong thuốc TIFFY Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời acetaminophen, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch acetaminophen λmax = 244 nm, clopheninamin maleat λmax = 264 nm và phenylephin hydroclorit λmax = 273 nm trong môi trường axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 20 đến 90 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của acetaminophen là 0,2 đến 30,0 μg/mL, clopheninamin maleat là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL và phenylephin hydroclorit là

từ 1,0 đến 40,0 μg/mL, độ thu hồi của acetaminophen từ 99,8% đến 100,2%, của phenylephin hydroclorit là từ 99,1% đến 99,6% và của clopheninamin maleat là từ 98,1% đến 100,7% [14]

Năm 2015 tác giả Nguyễn Thị Thùy Thương đã sử dụng phương pháp

UV - Vis để xác định đồng thời PRC và CPM trong các dược phẩm thuốc COLDACMIN và PACEMIN bằng cách sử dụng điều kiện tối ưu cho phép đo quang đối với các dung dịch hỗn hợp PRC và CPM, gồm: Bước sóng thích hợp

để quét phổ từ 210-290 nm, PRC (λmax = 243 nm)và CPM (λmax = 264 nm) trong môi trường axit HCl 0,1M Thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang

là từ 30 đến 40 phút sau khi pha; Khảo sát, xác định khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của PRC là 0,2 đến 30,0 μg/mL và CPM là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL Sử dụng phương pháp thêm chuẩn xác định PRC và CPM trong mẫu thuốc COLDACMIN với độ thu hồi của PRC từ 99,7% đến 100,2% và của CPM là từ 98,0% đến 100,66%, trong mẫu thuốc PACEMIN với độ thu hồi của PRC từ 99,8% đến 100,2% và của CPM là từ 98,1% đến 100,7% [18]

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời từ năm

1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [17]

1.3.1 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Trong quá trình sắc kí các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha Trong khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định, do cấu trúc tính chất của mỗi phân tử chất tan khác nhau cho nên tốc

độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc kí Khi ở trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất tan bị lưu giữ lại trong cột sắc kí Vì vậy trong quá trình sắc kí, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ, vì vậy thời gian lưu của các chất trong cột

là khác nhau

Dựa trên cơ sở đó người ta tách các chất ra khỏi nhau để xác định

Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

+ Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

- Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử

+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột phân tích, kết quả

là các chất A, B, C, sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột [17]

1.3.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí

CM: nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

1.3.2.2 Thời gian lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để chất đó di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detetor và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm mẫu đến khi xuất hiện đỉnh của pic)

t’R = tR - t0

Trong phép phân tích nếu thời gian lưu nhỏ quá thì sự tách kém, nếu thời gian lưu lớn quá (trên 20 phút) thì pic bị doãng và độ lặp lại kém Để thay đổi thời gian lưu, ta phải tìm cách thay đổi một hoặc các yếu tố sau:

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động

1.3.2.3 Hệ số dung lượng

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha và được tính theo sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan QS trong pha tĩnh (hoặc thể tích pha tĩnh VS) và lượng chất tan Qm trong pha động (hoặc thể tích pha tĩnh Vm) ở trong thời điểm cân bằng

Trong thực tế K’ từ 1 - 8 là tối ưu

1.3.2.4 Hệ số chọn lọc

Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A,

B có k’A, k’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc.Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có giá trị α khác nhau, hệ số chọn lọc α:

α = = = = (với điều kiện k’A > k’B)Trong đó: α: hệ số chọn lọc α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng

rõ (1,5 <  < 2 là tối ưu)

1.3.2.5 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết (N) là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là (H), lớp này có tính chất động (một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động, được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động)

Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:

N = 16×

hoặc N = 5,54×

Trong đó:

W: chiều rộng pic ở đáy pic

W1/2: chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công

thức: H =

N L

L: chiều cao cột sắc kí (với 2500 < N < 5500; giá trị tối thiểu là N =1000)

1.3.2.6 Độ phân giải

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc kí đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo các công thức sau:

Trong đó: R S : là độ phân giải

tRA, tRB: thời gian lưu tương ứng của chất

A, chất B

cao pic của chất A, chất B

WA, WB: Chiều rộng pic ở đáy pic

Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để hai pic tách tối thiểu

Năm 2005, tác giả Thái Duy Thìn và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC:

- Nghiên cứu định lượng acetaminophen, ibuprofen bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Richrosorb RP18 (250mm x 4mm; 10μm), pha động

là hỗn hợp axetonitril và dung dịch axit photphoric 0,1% (tỉ lệ 60: 40 về thể tích), tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector UV đặt ở bước sóng 214 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của ibuprofen và acetaminophen là 0,81% và 1,03%; độ thu hồi của ibuprofen và acetaminophen

là 98,4% và 98% [12]

- Định lượng acetaminophen, axit mefenamic bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250 mm x 4,6 mm; 10 μm) Pha động là hỗn hợp axetonitril- nước- tetrahydrofuran (tỉ lệ 3:8:9 về thể tích) Tốc độ dòng

là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, axit mefenamic là 0,51% và 1,42%; độ thu hồi của acetaminophen, axit mefenamic là 98,16% và 99,16% [12]

- Định lượng acetaminophen, cafein bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250mm x 4,6mm; 10μm) Pha động là hỗn hợp metanol- nước (tỉ lệ 35:65 về thể tích) Tốc độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, cafein là 0,54% và 1,07%; độ thu hồi của acetaminophen, cafein là 98,8% và 99,5% [12]

- Định lượng acetaminophen, quinin sunfat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (250mm x 4,6mm; 5μm) Pha động là hỗn hợp metanol- axit axetic- dietylamin (tỉ lệ 650:350:1 về thể tích) Tốc độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 235 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của acetaminophen, quinin sunfat là 1,16% và 1,887%; độ thu hồi của acetaminophen, quinin sunfat là 99,0% và 99,3% [11]

- Định lượng acetaminophen, phenylpropaolamin HCl, clorphenylamin maleat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) Pha động là hỗn hợp nước- axetonitril- trietylamin (tỉ lệ 968:30:2 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,2 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 216 nm đo

phenylpropaolamin HCl và clorphenylamin maleat 244 nm đo acetaminophen Thể tích tiêm mẫu 20 μL Nhiệt độ cột ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: sai

số tương đối của acetaminophen, phenylpropaolamin HCl và clophenylamin maleat là 0,47% và 0,67% và 1,19%; độ thu hồi dao động từ 99,61% đến 100,65% [12]

- Định lượng acetaminophen, ephedrin HCl, theophyllin, phenobarbital bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột lichrosorb RP18 (250mm x 4mm; 10μm) Pha động là hỗn hợp metanol-dung dịch đệm photphat pH 3,5 (tỉ lệ 38:62 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,0 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng

240 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được với diện tích pic, độ lặp lại

và độ đúng nằm trong giới hạn cho phép [12]

- Định lượng acetaminophen, bromhexin HCl, pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat và cafein bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột lichrosorb Si60 (250mm x 4mm; 5μm) Pha động là hỗn hợp metanol-dung dịch đệm amoninitrat pH 9,5 (tỉ lệ 45:6 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,5 mL/phút khi

đo pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat; 1,0 mL/phút khi đo cafein và bromhexin HCl; 1,0 mL/phút khi đo acetaminophen Detector UV đặt ở bước sóng 257 nm với pseudoephedry HCl, clorpheniramin maleat và acetaminophen;

298 nm với cafein và bromhexin HCl Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được với diện tích pic, độ lặp lại và độ đúng nằm trong giới hạn cho phép [12]

Năm 2009, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả Fegade và cộng sự đã định lượng đồng thời acetaminophen và piroxicam trong thuốc viên Sử dụng cột Eurosphere-100 C18 (250mm x 4,6 mm; 5 μm) với pha động là hỗn hợp metanol: nước (tỉ lệ 70:30 về thể tích) Tốc độ dòng 1,0 mL/phút và bước sóng đo quang ở 227 nm Thời gian lưu của piroxicam và acetaminophen tương ứng là 2,52 và 5,48 phút Phương pháp này đã có độ chính xác, độ tuyến tính, độ tin cậy, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo tiêu chuẩn ICH và USP Các nghiên cứu khảo nghiệm cho thấy độ thu hồi

acetaminophen và piroxicam trong phạm vi 99÷101% thu được ở các nồng độ khác nhau Phương pháp này được áp dụng thành công với việc xác định xác định đồng thời cả hai chất trong phòng thí nghiệm cũng như trong dược phẩm thương mại [24]

Năm 2011, Lohar V.R và các cộng sự đã định lượng thành công acetaminophen, cafein, pseudouphedrin HCl, dextromethophan HBr và loratadin trong thuốc viên bằng phương pháp RP-HPLC Phương pháp sử dụng pha động gồm dung dịch đệm natri heptan sunphonat và axetonitril (tỷ lệ 95: 5

về thể tích), tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút Hệ thống HPLC Shimadzu LC

2010 với cột Inertsil ODS 3V (5 cm x 4,6 mm; 3 μm), bước sóng đo quang là

205 nm Thời gian lưu của acetaminophen là 3,5 phút; caffein là 5,5 phút; pseudoephedrin HCl là 8 phút; dextromethophan HBr là 14 phút và loratadin là

15 phút Độ thu hồi của acetaminophen, caffein, pseudoephedrin HCl, dextromethophan HBr và loratadin nằm trong khoảng 98% đến 102% Đây là phương pháp đơn giản, chính xác, độ lặp lại cao do đó phù hợp cho phân tích thường xuyên các loại thuốc ở dạng bào chế viên nén [27]

Năm 2013, tác giả Nguyễn Thành Lộc đã định lượng đồng thời acetaminophen và ibuprofen bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột RP-

18 (220 mm x 4,4 mm; 5 µm) Pha động là hỗn hợp axetonitril : H3PO4 0,1 M (tỷ lệ 97:3 về thể tích) Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 224 nm Thể tích bơm mẫu là 20 µL Kết quả thu được: độ thu hồi của acetaminophen và ibuprofen là 96,03% và 94,48% [10]

Năm 2013 tác giả Vũ Duy Long đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định đồng thời acetaminophen, clopheniramin maleat và phenylephrin HCl trong các dược phẩm nói chung và thuốc TIFFY nói riêng bằng cách sử dụng pha động là hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05 M : axetonitril (tỉ

lệ 93:07 về thể tích); Thể tích bơm mẫu là 20 µL với tốc độ dòng chảy pha động là 1,5 mL/phút, sử dụng loại cột C18, bước sóng đo quang 215 nm và ở

nhiệt độ là 30oC Các chất acetaminophen, clopheniramin maleate và phenylephrin HCl trong thuốc TIFFY đã được xác định thành công với thời gian lưu của acetaminophen là 8,62 phút, thời gian lưu của clopheniramin maleat là 2,78 phút và thời gian lưu của phenylephrin HCl là 3,27 phút Độ thu hồi của acetaminophen là 99,7%; độ thu hồi của clopheniramin maleat là 99,5%; và độ thu hồi của phenylephrin HCl là 98,8% [9]

Năm 2013, Husen Al-Akraa và cộng sự đã định lượng đồng thời pseudoephedrin HCl, clopheniramin maleat, và dextromethophan HBr bằng phương pháp HPLC trong các chế phẩm dược có chứa thuốc thông mũi, thuốc

ho an thần và thuốc kháng histamin sử dụng clodiazepoxit, sử dụng đầu dò photo-diode tại bước sóng 203 nm, cột BDS Hypersil C18 (250 mm × 4,6 mm; 5 μm) Pha động gồm axetonitril : nước (tỉ lệ 60:40 về thể tích), nước có chứa sodium dodecyl sunfat và trietylamin hydroclorit, điều chỉnh pH = 2,5 với axit octhophotphoric 0.01M và kali dihydrophotphat 0.01M Tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút Phạm vi tuyến tính của nồng độ là 20÷2000; 6÷2400; 2÷160 và 15÷1200μg/mL với (R2>0,9991) tương ứng pseudoephedrin HCl, clopheniramin maleat, và dextromethophan HBr và độ thu hồi 97,0-102,4% Giới hạn phát hiện (LOD) 0,33; 0,09; 0,12 và 0,03μg/mL, và giới hạn định lượng (LOQ) 1,10; 0,30; 0,40 và 0,10 μg/mL tương ứng cho pseudoephedrin HCl, clopheniramin maleat và dextromethophan HBr Các phương pháp RP-HPLC đề xuất đã được áp dụng thành công cho việc xác định các hợp chất khác nhau trong các chế phẩm dược không bị ảnh hưởng bởi các tá dược [26]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được Hatice Caglar và cộng

sự dùng để xác định đồng thời pseudoephdrin HCl, pheniramin maleat, acetaminophen, guaifenisin, maleat pyrilamin, clorpheniramin maleat, triprolidin HCl, dextromethophan HBr, diphenhydramin HCl trong dược phẩm Sử dụng cột Nucleodur C18 cột (250 x 4,0 mm; 5μm) Pha động gồm metanol: hỗn hợp đệm (tỉ lệ 38:62 về thể tích) ở nhiệt độ phòng, với tốc độ dòng chảy là 0,75

mL/phút Bước sóng phát hiện ở 210 nm Tuyến tính trên một phạm vi nồng độ của 0,2÷250 μg/mL cho acetaminophen; 0,5÷250 μg/mL cho pseudoephdrin HCl

và pheniramin maleat, 1÷250 μg/mL cho guaifenisin; 2,5÷250 μg/mL cho clorpheniramin maleat và triprolidin HCl; 5÷250 μg/mL cho pyrilamin maleat và diphenhydramin HCl; 10÷20 μg/mL cho dextromethophan HBr với hệ số tương quan lớn hơn 0,9993 Độ lệch chuẩn tương đối đều nhỏ hơn 4% Phương pháp này đã được áp dụng thành công cho các chất trên trong nhiều thuốc ho khác nhau và các chế phẩm như xi rô và viên nén [25]

Phương pháp HPLC-UV được Alagar Raja ứng dụng để tách và định lượng acetaminophen, dextromethophan hydrobromit và doxylamin succinat trong dược phẩm Máy RP-HPLC sử dụng cột Waters C18 (250 mm x 4,6 mm; 5μm), pha động gồm dung dịch đệm kali dihydrophotphat, pH được điều chỉnh đến 3,5 ± 0,05 với axit o-photphoric (A) và axetonitril (B), A:B tỉ lệ là 85:15 về thể tích trong 15,0 phút đầu, và sau đó nó đã được duy trì ở tỉ lệ 70:30 cho mười phút tiếp theo và cuối cùng trong mười phút cuối cùng nó được duy trì ở mức 85:15; tốc độ dòng chảy là 1,2 mL/phút Cột nhiệt độ được đặt ở nhiệt độ môi trường, bước sóng UV-phát hiện cố định tại 270 nm Acetaminophen tuyến tính trên một khoảng 162,5 μg/mL đến 487,5 μg/mL và dextromethophan hydrobromit trong phạm vi 5÷15 μg/mL và doxylamin succinat trong phạm vi của 3,125÷9,375 μg/mL Phương pháp chính xác để xác định khảo nghiệm là dưới 2,0% RSD Độ thu hồi dao động từ 98%-102% Phương pháp này rất hữu ích trong việc kiểm soát chất lượng của dược phẩm [22]

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung nghiên cứu

Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân

tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC và CPM trong thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL trên thị trường

2.1.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại phù hợp khi quét phổ các dung dịch PRC và CPM

- Tiến hành khảo sát sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của PRC và CPM trong các dung môi có pH = 1 đến 11 để tìm dung môi thích hợp cho phép

đo quang

- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC và CPM theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thực hiện các phép đo quang

- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC và CPM từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Định lượng đồng thời PRC và CPM trong các mẫu tự pha để xác định các sai số khi tỷ lệ hàm lượng PRC và CPM khác nhau

- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL, từ đó đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua việc tính toán độ đúng và độ lặp lại của phép đo

- Định lượng đồng thời PRC và CPM trong mẫu thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL

Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác định độ thu hồi [7,8, 19]

2.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Lựa chọn các thông số của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phương pháp

Xác định đồng thời PRC và CPM trong thuốc COBIMOL, DOZOLTAC, HAPACOL 150FLU, SACENDOL theo phương pháp HPLC

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Nghiên cứu tài liệu trong và ngoài nước về xác định PRC và CPM trong hỗn hợp từ đó lựa chọn phương pháp xác định PRC và CPM phù hợp

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.2.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép đo quang PRC và CPM

- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong mẫu thuốc

- Sử dụng chương trình lọc Kalman để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp

- Xử lý thống kê các kết quả thu được [1, 7, 8, 12, 16, 20]

2.2.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép định lượng PRC và CPM:

- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong mẫu thuốc

- Xử lý thống kê các kết quả thu được [Error! Reference source not

found., 9, 10,12,18, 29]

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

2.3.1 Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể LOD được coi là nồng độ chất phân tích gây nên sự tăng tín hiệu đáp ứng 3 lần so với đáp ứng tín hiệu của mẫu trắng (S/N = 3)

Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:

3.SDLOD =

B (2.1)

Trong đó:

SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn

B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang

2.3.2 Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) được coi là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác phù hợp LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lần đáp ứng của mẫu trắng Trong phương pháp sắc ký độ nhiễu của đường nền có thể thay cho tín hiệu của mẫu trắng Thông thường người ta sử dụng công thức:

10.SDLOQ =

B (2.2)

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC và CPM tự

pha chế thông qua sai số tương đối RE Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng

độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:

Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử

C0 (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PRC và CPM trong hỗn hợp

Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:

a: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn PRC và CPM thêm vào mẫu (đã biết)

Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

 là giá trị nồng độ thực của mẫu;

C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định;

k là số bậc tự do

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê

Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:

P,k

t S

X ± ε = X ±

n (2.7) Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57); Xlà giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.5); n là số phép đo

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.4.1 Thiết bị

2.4.1.1 Máy UV - Vis DR 5000 (Mỹ)

Hình 2.1 Máy UV - Vis DR 5000 (Mỹ)

2.4.1.2 Máy UV - Vis Shimadzu 1700 (Nhật)

Hình 2.2 Máy UV - Vis Shimadzu 1700 (Nhật)

2.4.1.3 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 (Mỹ)

- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, đũa thuy tinh, bình tia, ống nghiệm

- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [7,19, 21]

Số lô thay thể

Hàm lượng Nhà sản xuất

Viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh

Viện kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh

Dùng cho

3 NaH2PO4

Merk KgaA Đức

Dùng cho

4 H3PO4

Merk KgaA Đức

Dùng cho

5 H2SO4

Merk KgaA Đức

Dùng cho

Merk KgaA Đức