Phân tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau Bảng 2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3 Các bước chạy điện di

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 3

1.1.1 Ung thư đại trực tràng là gì? 3

1.1.2 Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng 6

1.1.3 Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng 8

1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ 12

1.2.1 Chỉ thị sinh học đối với ung thư 12

1.2.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư 14

1.3 PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 16 1.3.1 Proteomic là gì? 16

1.3.2 Công cụ nghiên cứu proteomics 17

1.3.3 Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng 19

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 NGUYÊN LIỆU 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Hóa chất 28

2.1.3 Thiết bị 29

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.2.1 Xử lý mẫu mô đại trực tràng 29

2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 31

2.2.3 Điện di hai chiều 31

2.2.4 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều 33

2.2.5 Cắt và thủy phân spot 34

2.2.6 Phân tích khối phổ và nhận dạng protein 35

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG 37

3.2 PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 39

3.3 PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 40

3.4 XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS 43

3.5 ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT 52

3.5.1 Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis 56

3.5.2 Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể 58

3.5.3 Protein tham gia cấu trúc tế bào 60

3.5.4 Protein tham gia các quá trình trao đổi chất 61

3.5.5 Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau phiên mã, dịch mã 62

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 1 DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU i

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI SỬ DỤNG PHẦN MỀM MASCOT ii

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2-DE Điện di hai chiều (Two - Dimensional Electrophoresis)

AcCN Acetonitrile

AFAP Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial

Adenomatous Polypsis) APC Adenomatous Polyposis Coli

CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

CEA Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

FAP Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous

Polyposis) HCCS Suppressor of tumorigenicity 20 protein

HNPCC Hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp

(Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer) HSP Protein sốc nhiệt (Heat sock protein)

HUPO Tổ chức nghiên cứu hệ protein người

(Human Proteome Organisation)

IEF Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing)

IPG Gradient pH cố định (Immobilized pH gradient)

LC-MS/MS Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ

(Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry)

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

MS Khối phổ (Mass spectrometry)

PBS Đệm muối Photphat (Phosphate Buffer Saline)

PMF Đặc trƣng khối peptide (Peptide Mass Fingerprint)

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SELDI-TOF Surface-enhanced laser desorption/ionization time - of - flight Spot Điểm protein

TAA Kháng nguyên liên quan đến khối u (Tumor Associated Antigens) TFA Trifluoroacetic acid

TNM Tumor – Lympho node – Metastases

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh

khác nhau

Bảng 2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bảng 4 Số lượng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều

Bảng 5 Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai

chiều của 5 bệnh nhân

Bảng 6 Danh sách các protein được xác định bằng MALDI TOF-MS từ bản gel

mô ung thư so sánh với bản gel mô đại trực tràng bình thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Bảng 7 Tóm tắt chức năng chính của các protein đã được định danh biểu hiện

khác biệt giữa mô ung thư đại trực tràng so với mô đại trực tràng bình thường

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng

Hình 3 Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm

Phoretix

Hình 4 Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô đại trực tràng

bình thường và mô ung thư đại trực tràng trên cùng bản gel

polyacrylamide 10% có SDS

Hình 5 Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1

từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng

Hình 6 Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên

bản gel điện di hai chiều

Hình 7 Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thư so với

mô bình thường

Hình 8 Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều của

mẫu mô ung thư đại trực tràng so với mẫu mô đại trực tràng bình

thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng mã số 11781

Hình 9 Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein

T17B33 bằng enzyme trypsin

Hình 10 Kết quả nhận dạng protein bằng tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng

phần mềm Mascot

Hình 11 Các nhóm protein theo chức năng

Hình 12 Quá trình apoptosis trong tế bào

Hình 13 Sơ đồ trình diện kháng nguyên của phức hệ phù hợp tổ chức mô cho tế

bào lympho T

Hình 14 Cơ chế tác dụng của Zinc finger protein đối với quá trình phiên mã

MỞ ĐẦU

Ung thư đại trực tràng là một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất trên thế giới, nó đứng thứ ba chỉ sau ung thư phổi và ung thư vú Đây là căn bệnh có tỷ

lệ tử vong cao và tỷ lệ mắc bệnh có xu hướng ngày càng tăng Theo thống kê, năm

2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư Số ca tử vong do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008, bệnh viện có 306 ca bệnh ung thư đại trực tràng và con số này ngày càng gia tăng Tính đến tháng 9 năm

2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thư đại trực tràng tại đây [54] Tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55]

Việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư đại trực tràng có ý nghĩa rất quan trọng, giúp làm tăng hiệu quả điều trị bệnh, giảm tỷ lệ tử vong do loại ung thư này gây ra Thực tế cho thấy, nếu phát hiện khối u đại trực tràng ở giai đoạn đầu và chữa trị kịp thời thì tỷ lệ sống sót của bệnh nhân sau 5 năm sẽ là 80 – 100% Hiện nay, một số phương pháp xét nghiệm lâm sàng đang được áp dụng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng như chẩn đoán hình ảnh thông quan nội soi, sinh thiết, chụp X quang, xét nghiệm tìm máu trong phân, thăm khám trực tiếp, sử dụng chỉ thị CEA Nhược điểm của các phương pháp này là thường phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn, phương pháp nội soi thường gây khó chịu cho bệnh nhân, xét nghiệm máu trong phân cho nhiều kết quả dương tính và âm tính giả nên hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh không cao Vì vậy, nhu cầu đặt ra cho các nhà khoa học là làm thế nào để tìm ra được các chỉ thị sinh học đặc trưng để chẩn đoán, phát hiện ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm

Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng đang được các nhà khoa học quan tâm là sử dụng công cụ proteomics Bằng việc phân tích sự biến đổi trong thành phần, số lượng các protein có mặt trong huyết thanh, dịch cơ thể, mô ung thư của bệnh nhân ung thư, các nhà khoa học hi vọng tìm ra được các chỉ thị sinh học mới, dễ nhận biết để ứng dụng chẩn đoán ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm, nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị bệnh một cách hiệu quả

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân

tích proteomics mô ung thư của bệnh nhân ung thư đại trực tràng“ với mục

- Nhận dạng được một số protein biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa mô ung thư đại trực tràng và mô đại trực tràng bình thường

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Ung thư không chỉ là một bệnh mà bao gồm nhiều bệnh Hiện nay, có hơn

100 loại ung thư khác nhau Hầu hết ung thư được đặt tên theo cơ quan hoặc loại tế bào, nơi ung thư phát sinh Ví dụ ung thư phát sinh từ đại tràng được gọi là ung thư đại tràng, ung thư phát sinh từ gan được gọi là ung thư gan… [48]

Ung thư là một trong 8 nguyên nhân gây chết đối với nhân loại trên toàn thế giới Số lượng người tử vong do ung thư còn lớn hơn số lượng tử vong do nhiễm HIV, lao và sốt xuất huyết cộng lại Đối với các nước có nền kinh tế phát triển, ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Đối với các nước đang phát triển, ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai, sau bệnh tim mạch [45] Năm 2008, ước tính có khoảng 12,66 triệu người mắc ung thư và 7,56 triệu người chết do căn bệnh này Trong đó 4 loại ung thư là ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày và ung thư đại trực tràng chiếm 2/5 tổng số ca mắc ung thư trên thế giới [45]

Ung thư đại trực tràng là loại ung thư phổ biến nhất trong các loại ung thư đường tiêu hóa [28], bao gồm ung thư đại tràng và ung thư trực tràng được gọi theo tên của mô, nơi phát sinh ung thư Đại tràng và trực tràng là một phần của hệ tiêu hóa Đại trực tràng (hay còn gọi là ruột già) là phần cuối của ống tiêu hóa ở người, gồm có đại tràng (hay còn gọi là ruột kết) và trực tràng (hay còn gọi là ruột thẳng) Đại tràng chia ra làm nhiều phần: manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống và đại tràng sigma (Hình 1) Trực tràng nằm ngay trước hậu môn Ung thư xảy ra ở đại tràng gọi là ung thư đại tràng và ung thư xảy ra ở trực tràng gọi là

ung thư trực tràng Ung thư ở đại tràng xảy ra thường xuyên hơn ung thư ở trực

tràng [21Error! Reference source not found.]

Hình 1 Hình ảnh đại trực tràng [57]

Ung thư đại trực tràng xảy ra khi một số tế bào ở lớp lót trong (còn gọi là niêm mạc) của đại tràng hay trực tràng trở nên bất thường và phát triển một cách không kiểm soát được, tạo thành khối u (còn gọi là polyp) Các khối u này có thể là u lành tính hay u ác tính U lành tính thường không gây hại cho cơ thể, có thể cắt bỏ dễ dàng mà không tái phát trở lại, không xâm lấn các mô xung quanh, không di căn đến các bộ phận khác của cơ thể và khối u lành tính không phải là ung thư U ác tính là ung thư thường gây hại cho cơ thể, có thể cắt bỏ khối u ác tính nhưng đôi khi chúng sẽ tái phát trở lại Khối u ác tính thường xâm lấn và gây tổn thương các mô,

cơ quan xung quanh Các tế bào ung thư từ khối u ác tính có thể phát tán đến các bộ phận khác của cơ thể bằng cách đi vào máu hoặc hệ bạch huyết và gọi là di căn Khi ung thư đại trực tràng phát triển ra ngoài đại tràng và trực tràng, các tế bào ung thư thường di căn đến các hạch bạch huyết Khi các tế bào ung thư đến được hạch bạch huyết, chúng có thể phát tán đến các các hạch bạch huyết khác hay các cơ quan khác Các tế bào ung thư đại trực tràng thường phát tán đến gan [10]

Hầu hết các trường hợp ung thư đại trực tràng là ung thư biểu mô tuyến, chiếm

90 – 95% trong các loại ung thư đại trực tràng [21Error! Reference source not

found.] Điều này có nghĩa là tế bào ung thư được hình thành từ các tế bào biểu mô

tuyến bất thường ở bề mặt lớp lót bên trong của đại trực tràng Một số dạng ung thư đại trực tràng khác, ít gặp hơn là ung thư bắt đầu từ các tế bào lympho và các tế bào biểu mô vảy

Ung thư đại trực tràng là ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới chỉ sau ung thư phổi và ung thư vú Năm 2008 ước tính có khoảng 1,24 triệu người trên thế giới được chẩn đoán là mắc ung thư đại trực tràng, chiếm khoảng 10% trong số các loại ung thư Số ca tử vong do ung thư đại trực tràng trong năm 2008 là 610.000 ca trên toàn thế giới, chiếm khoảng 8% số lượng tử vong do ung thư [16, 45]

Ung thư đại trực tràng thường gặp ở các nước phát triển nhiều hơn các nước đang phát triển Năm 2008, 60% các ca được chẩn đoán ung thư đại trực tràng là ở các nước phát triển [16] Tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng cũng tăng lên

ở các khu công nghiệp và thành thị

Tỷ lệ ung thư đại trực tràng ở các nhóm tuổi khác nhau là khác nhau Số lượng người mắc ung thư đại trực tràng ở nhóm tuổi trên 75 tuổi là cao nhất (250/100.000/năm) Ung thư đại tràng ít xảy ra ở độ tuổi dưới 45 tuổi và tỷ lệ này là 2/100.000/năm Ở nhóm tuổi từ 45 đến 54, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là 20/100.000/năm Nhóm tuổi từ 55 đến 64, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng là

55/100.000/năm Nhóm tuổi từ 65 đến 74, tỷ lệ này là 150/100.000/năm [21Error!

Reference source not found., 30]

Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng là loại ung thư đứng thứ năm trong các loại ung thư thường gặp, sau ung thư dạ dày, phổi, vú, vòm họng và bệnh này có xu hướng ngày càng tăng cao Theo thống kê của Bệnh viện Ung Bướu TPHCM, năm

2007, bệnh viện có 218 ca bệnh ung thư đại trực tràng Năm 2008 con số này là 306

ca và tính đến tháng 9 năm 2009, đã có đến trên 220 bệnh nhân mới đến điều trị ung thư đại trực tràng [54] Theo thống kê của Bệnh viện K, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng

là 9% tổng số bệnh nhân ung thư [55] Theo một nghiên cứu được tiến hành tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ, độ tuổi mắc ung thư đại tràng trung bình của các bệnh nhân điều trị ung thư đại trực tràng ở đây là 54 tuổi, tỉ lệ mắc bệnh nam/nữ là 1,34 [3]

1.1.2 Nguyên nhân dẫn đến ung thư đại trực tràng

Nguyên nhân chính xác dẫn đến ung thư đại trực tràng vẫn chưa được chứng minh rõ ràng Tuy nhiên, các nghiên cứu về di truyền học, dịch tễ học cũng đã cho thấy một số yếu tố có khả năng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng, bao gồm yếu tố di truyền và yếu tố không di truyền

Yếu tố không di truyền

Theo một số nghiên cứu, số lượng người mắc ung thư đại trực tràng không liên quan đến các yếu tố di truyền chiếm 75 - 95% tổng số người mắc bệnh [41] Các yếu tố này bao gồm: lứa tuổi, giới tính, chế độ ăn uống, thuốc lá, chế độ vận động của cơ thể, các bệnh liên quan đến viêm đại tràng, polyp đại tràng…

Ung thư đại trực tràng thường gặp ở những người lớn tuổi Tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng ở nhóm tuổi trên 75 tuổi là cao nhất (250/100.000/năm) Tỷ lệ mắc ung thư đại trực tràng ở nam giới thường cao hơn nữ giới và tỷ lệ này là 1,4 : 1,0 [16] Chế độ ăn uống nhiều chất béo, thịt, uống nhiều rượu có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng tăng lên ở những người uống nhiều rượu [13] Ngoài ra, những người mắc bệnh béo phì cũng có nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cao hơn những người khác Chế độ ăn uống nhiều rau, hoa quả, bánh mỳ, ngũ cốc thô và duy trì chế độ ăn kiêng hợp lý có thể làm giảm nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng [41]

Nhiều nghiên cứu đã xem xét mối liên quan giữa hoạt động thể chất với nguy

cơ mắc ung thư đại trực tràng Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng lối sống ít vận động cũng làm tăng nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng Khoảng 10% các trường hợp mắc ung thư đại trực tràng được chỉ ra là có liên quan đến thói quen lười vận

động [22] Mức độ nguy cơ sẽ giảm trung bình là 40% đến 50% nếu cơ thể có một chế độ vận động hợp lý

Ngoài ra, nguy cơ mắc ung thư đại trực tràng cũng tăng lên ở những người hút thuốc Ở những bệnh nhân ung thư đại trực tràng sử dụng thuốc lá, nguy cơ tái phát ung thư đại trực tràng sau khi cắt bỏ polyp cũng tăng lên

Hầu hết ung thư đại trực tràng phát triển từ polyp đại trực tràng Do đó, việc loại bỏ các polyp lành tính là một biện pháp có thể phòng ngừa ung thư đại trực tràng Các polyp có thể phát triển thành ung thư khi có sự tổn thương nhiễm sắc thể xảy ra ở các tế bào tại niêm mạc của đại trực tràng Những tổn thương này tạo ra những tế bào bất thường Các tế bào khi đã tích lũy các tổn thương nhiễm sắc thể thì

sẽ phát triển không kiểm soát được hình thành ung thư Như vậy, polyp đại trực tràng ban đầu là lành tính, sau đó do sự tích lũy các tổn thương về nhiễm sắc thể nên phát triển thành ung thư

Các nghiên cứu chỉ ra rằng có mối liên hệ giữa ung thư đại tràng và chứng viêm đại tràng Nguy cơ mắc ung thư đại tràng tăng lên sau 8 – 10 năm bị viêm đại tràng Theo ước tính hiện nay, tỷ lệ mắc ung thư đại tràng có liên quan đến viêm loét đại tràng là 2,5% sau 10 năm, 7,6% sau 30 năm và 10,8% sau 50 năm Ngoài

ra, nguy cơ mắc ung thư đại tràng cũng phụ thuộc vào vị trí và mức độ viêm loét đại tràng [52]

Các yếu tố di truyền

Trường hợp ung thư đại trực tràng liên quan đến bệnh sử ung thư trong gia đình chỉ chiếm khoảng 20% trong tất cả các trường hợp mắc bệnh Trong đó, chỉ có 5% các trường hợp là do di truyền các gen gây ung thư từ bố, mẹ sang con cái Sự biến đổi gen dẫn đến sự hình thành polyp và sau đó hình thành ung thư Những đứa trẻ bị di truyền những gen gây ung thư từ bố mẹ có nguy cơ cao bị ung thư ở giai đoạn sớm của cuộc đời

Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous Polyposis – FAP)

là hội chứng mà các thành viên trong gia đình xuất hiện hàng trăm đến hàng nghìn

các polyp đại trực tràng ngay từ khi còn trẻ Trừ khi các polyp này được phát hiện

và điều trị sớm (bằng cách cắt bỏ đại tràng), bệnh nhân có hội chứng FAP có nguy

cơ mắc ung thư đại trực tràng là 100% khi đến tuổi 40 Nguyên nhân của hội chứng FAP là do có sự đột biến gen APC, một lại gen có vai trò ức chế sự hình thành của khối u tân sinh ở đại tràng Tỷ lệ người có hội chứng FAP tại Mỹ là 1/30.000 – 1/6.000 [49]

Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial Adenomatous Polypsis – AFAP) là hội chứng mà các thành viên trong gia đình thường có ít hơn

100 polyp đại trực tràng Tuy số lượng polyp ít hơn nhưng những người có hội chứng AFAP vẫn có nguy cơ cao mắc ung thư đại trực tràng khi còn trẻ

Hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer – HNPCC) còn gọi là hội chứng Lynch Hội chứng này chiếm khoảng 5% các trường hợp ung thư đại trực tràng Nguyên nhân của hội chứng này đã được xác định là do đột biến của một trong năm gen có chức năng sửa lỗi bắt cặp nhiễm sắc thể (Mismatch Repair Genes), bao gồm các gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2 Người có hội chứng HNPCC có nguy cơ mắc các bệnh lý ác tính của đại trực tràng chiếm 70-80% trong suốt cuộc đời Ngoài ra tỷ lệ mắc các bệnh lý liên quan đến nội mạc tử cung buồng trứng, dạ dày, ruột non, niệu quản, tuyến bã da chiếm 30-60% [49]

1.1.3 Các hệ thống phân loại giai đoạn ung thư đại trực tràng

Việc xác định giai đoạn của ung thư cho biết kích thước của khối u và mức

độ lan rộng của khối u khỏi vị trí ban đầu có ý nghĩa rất quan trọng, giúp cho bác sĩ quyết định liệu pháp phù hợp nhất để điều trị ung thư Hiện nay có một số hệ thống phân giai đoạn ung thư đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới, bao gồm phân loại theo Duke và phân loại TNM

Hệ thống phân loại theo Duke [12]

Năm 1932, Cuthbert E Dukes, một nhà giải phẫu người Anh đã đưa ra hệ thống phân loại giai đoạn cho ung thư trực tràng Theo hệ thống phân loại này, ung thư trực tràng được chia ra thành 4 giai đoạn:

Duke A: Khối u bị giới hạn ở thành của trực tràng

Duke B: Khối u xâm lấn qua thành của trực tràng nhưng chưa ảnh hưởng đến các hạch bạch huyết

Duke C: Khối u lan tới các hạch bạch huyết cạnh trực tràng

Duke D: Khối u di căn tới các bộ phận khác trên cơ thể như thận, gan, phổi…

Cho tới nay, trên thế giới xuất hiện một vài cải biến cho hệ thống phân loại Duke Tuy nhiên, hệ thống phân loại này gần như đang được thay thế bằng hệ thống phân loại chi tiết hơn, đó là hệ thống phân loại TNM

Hệ thống phân loại TNM

Hệ thống phân loại ung thư đại trực tràng TNM (Tumor – Lympho node – Metastases) là hệ thống được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, do Ủy ban Ung thư Hoa Kỳ sáng lập Hệ thống phân loại TNM phân giai đoạn ung thư đại trực tràng dựa vào kích thước khối u (T), mức độ lây lan của khối u tới các hạch bạch huyết (N) và mức độ di căn tới các cơ quan khác của cơ thể (M) Con số được thêm vào phía sau mỗi chữ cái cho biết kích thước hoặc phạm vi của khối u và mức độ di căn

T- Khối u nguyên phát (Primary Tumor)

 Tx: Không đánh giá được khối u nguyên phát

 T0: Không có bằng chứng về sự hiện diện của khối u nguyên phát

 Tis (Carcinoma in situ - CIS - ung thư tại chỗ): có sự hiện diện của các tế bào bất thường nhưng chúng không lan sang các mô lân cận Mặc dù không phải là ung thư nhưng CIS có thể trở thành ung thư và đôi khi nó được gọi là ung thư giai đoạn tiền xâm lấn

 T1, T2, T3, T4: Kích thước và/hoặc phạm vi của khối u nguyên phát

N- Hạch bạch huyết vùng (Regional Lympho Nodes)

 Nx: Không đánh giá được các hạch bạch huyết vùng

 N0: Không có hạch bạch huyết vùng liên quan

 N1, N2, N3: Có hạch bạch huyết vùng liên quan (số lượng hạch bạch huyết)

M - Di căn (Distant Metastasis)

 Mx: Không thể đánh giá được mức độ di căn xa

 M0: Không có di căn xa

 M1: Có di căn xa

Ở nhiều loại ung thư, các cách phối hợp TNM này tương ứng với một trong 5 giai đoạn (hình 2) Các loại ung thư khác nhau có những tiêu chuẩn phân giai đoạn khác nhau Chẳng hạn như ung thư bàng quang T3N0M0 được xếp vào giai đoạn III trong khi đó ung thư đại tràng T3N0M0 chỉ được xếp ở giai đoạn II

Hình 2 Các giai đoạn phát triển của ung thư đại trực tràng [50]

Bảng 1 mô tả các giai đoạn bệnh trong TNM và tỷ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh khác nhau

Bảng 1: Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các

giai đoạn bệnh khác nhau [47]

Khả năng sống sót sau 5 năm

lớp mô bên dưới lớp

niêm mạc của đại trực

quan niêm mạc, qua

lớp cơ của đại trực

Giai đoạn Mô tả Hình ảnh TNM

Khả năng sống sót sau 5 năm

cơ quan khác của cơ

thể thông qua máu và

1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƯ

Chỉ thị sinh học (Biomarker) được định nghĩa là các phần tử được tìm thấy trong máu, trong các loại dịch của cơ thể hoặc trong mô, đặc trưng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý Chỉ thị sinh học có thể được ứng dụng để xem xét đáp ứng của cơ thể trong quá trình điều trị bệnh hay trong những điều kiện cụ thể Chỉ thị sinh học còn được gọi là các chỉ thị phân tử và các phân tử tín hiệu [48]

1.2.1 Chỉ thị sinh học đối với ung thư

Chỉ thị sinh học là một trong các công cụ quan trọng được ứng dụng để phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm, xác định chính xác giai đoạn bệnh để áp dụng các biện pháp điều trị thích hợp, tiên lượng bệnh và theo dõi việc điều trị bệnh có hiệu quả hay không Chỉ thị sinh học ung thư là những phần tử có trong tế bào hoặc mô ung thư, trong máu hay dịch cơ thể khác Chỉ thị sinh học ung thư có thể bao gồm nhiều loại phần tử khác nhau như ADN, mARN, các yếu tố phiên mã, thụ thể trên

bề mặt tế bào hoặc các protein được tiết ra Chỉ thị sinh học gồm 2 loại chính là chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch Chỉ thị ung thư dạng tế bào bao gồm các kháng nguyên

bề mặt các tế bào, các thụ thể hormone và thụ thể yếu tố tăng trưởng, những biến

đổi ADN, mARN, yếu tố phiên mã của tế bào Chỉ thị ung thư dạng thể dịch bao gồm các chất được phát hiện ở nồng độ bất thường có mặt trong huyết thanh, nước tiểu và các loại dịch khác của cơ thể [2] Một chỉ thị ung thư lý tưởng là chỉ thị có thể dễ dàng xác định được, cho kết quả đáng tin cậy, các xét nghiệm sử dụng loại chỉ thị này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, chi phí thấp Ngoài ra, chỉ thị ung thư lý tưởng là loại chỉ thị xuất hiện với số lượng có thể định lượng được trong giai đoạn đầu hoặc giai đoạn tiền lâm sàng Hàm lượng của chỉ thị ung thư sẽ phản ánh mức

độ phát triển của ung thư [53]

Một trong những thách thức đặt ra là làm thế nào để xây dựng được mô hình xét nghiệm sử dụng chỉ thị ung thư một cách đơn giản, đảm bảo độ nhạy, độ đặc hiệu, chi phí thấp mà vẫn có giá trị lâm sàng Theo Hiệp hội phát triển và nghiên cứu chỉ thị ung thư Hoa Kỳ, chỉ thị sinh học đối với ung thư đại trực tràng có thể chia ra làm nhiều loại tuy theo mục đích ứng dụng như sau:

- Chỉ thị sinh học được sử dụng để đánh giá nguy cơ, dự đoán bệnh Chỉ thị này có thể được sử dụng để xác định những cá nhân hay quần thể có nguy cơ cao mắc bệnh Chỉ thị này có thể là các biến đổi di truyền hay đánh giá việc tiếp xúc với

cơ chất làm tăng mức độ nguy cơ Ví dụ về loại chỉ thị này là đột biến gen ức chế khối u APC (Adenomatous Polyposis Coli) được ứng dụng để chẩn đoán những người có hội chứng đa polyp tuyến di truyền (FAP)

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để sàng lọc và chẩn đoán ở giai đoạn sớm của bệnh Các chỉ thị này giúp hỗ trợ việc chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm, từ đó có thể xác định các biện pháp điều trị hiệu quả Ví dụ về loại chỉ thị này là thử nghiệm tìm máu trong phân của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để chẩn đoán bệnh Đây là các chỉ thị sinh học được sử dụng để xác định loại ung thư thông qua các xét nghiệm định lượng sự

có mặt của các chỉ thị này trong máu Chỉ thị này có thể sử dụng kết hợp với các kỹ thuật hình ảnh tiêu chuẩn trong chẩn đoán bệnh Ví dụ về loại chỉ thị chẩn đoán này

là kháng nguyên CEA (Carcinoembryonic antigen) ứng dụng trong chẩn đoán ung

thư đại trực tràng Ngoài ra, còn có các chỉ thị được ứng dụng để chẩn đoán các bệnh ung thư khác như kháng nguyên đặc hiệu PSA (Postate Specific Antigen) để chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt và kháng nguyên ung thư 125 (CA-125) thường được sử dụng trong chẩn đoán ung thư buồng trứng [15]

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng trong nghiên cứu tương tác thuốc Chỉ thị được ứng dụng để đánh giá dược động học của thuốc, đánh giá tính hiệu quả của thuốc tới đích tác dụng (như ức chế enzyme, gắn với thụ thể, kích hoạt quá trình apoptosis) hoặc phản ánh hiệu quả trong điều trị thuốc Ví dụ về loại chỉ thị sinh học này là gen mã hóa cho enzyme thiopurine methyltranferase (TMPT) và điều trị bằng azathioprine trong bệnh Crohn

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để dự đoán bệnh Chỉ thị này có thể sử dụng để dự đoán được những bệnh nhân có thể đáp ứng lại được với các liệu pháp điều trị Ví dụ về chỉ thị này là K-ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene) và thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì EGFR (Epidermal growth factor receptor) K-ras là một gen tiền ung thư, thường được tìm thấy đột biến ở 50% các trường hợp ung thư

đa u tuyến có kích thước lớn hơn 1 cm và khoảng 40-50% ung thư biểu mô đại trực tràng [20]

- Chỉ thị sinh học được ứng dụng để tiên lượng bệnh, dự đoán tiến trình phát triển của bệnh Các chỉ thị này sẽ phản ánh khả năng di căn, mức độ lan rộng của khối u Có nhiều loại chỉ thị sinh học được phát hiện và đề xuất ứng dụng trong tiên lượng ung thư nhưng các chỉ thị này đều chưa được thẩm định [29]

1.2.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng để nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thư

Hiê ̣n nay, đối với bê ̣nh ung thư đa ̣i trực tràng, nội soi trực tràng vẫn được coi

là phương pháp vàng trong chẩn đoán bệnh Tuy nhiên, đây là phương pháp thăm khám trực tiếp, có thể gây khó chịu cho bệnh nhân Một phương pháp khác hiện đang được sử dụng rộng rãi là xét nghiệm CEA Protein này thường được tìm thấy trong mô của bào thai phát triển trong tử cung Nồng độ trong máu của protein này

biến mất hoặc giảm xuống rất thấp sau khi sinh Ở người lớn, hàm lượng CEA tăng lên bất thường có thể được coi là chỉ thị sinh học của ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, phương pháp xét nghiệm để đánh giá hàm lượng CEA có trong máu có hạn chế là chỉ chẩn đoán được bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV) Hơn nữa, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này không cao và hàm lượng CEA cũng có thể tăng lên ở những người bị viêm loét đại tràng, viêm tụy, viêm gan, bệnh Crohn hoặc ở những người hay hút thuốc lá Do vậy, hiệu quả ứng dụng CEA trong chẩn đoán ung thư đại trực tràng là không cao và chi phí xét nghiệm tương đối tốn kém

Phương pháp xét nghiệm máu trong phân là phương pháp nhằm mục đích phát hiện có máu trong phân hay không Hiện tượng trong phân có máu là triệu chứng thường gặp của các ca ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, phương pháp này lại có một tỷ lệ các kết quả dương tính giả và âm tính giả rất cao

Như vậy, việc chẩn đoán và phát hiện sớm ung thư cho đến nay còn gặp rất nhiều khó khăn Hầu hết các trường hợp phát hiện ung thư là ở giai đoạn muộn, di căn hay biến chứng, điều trị gặp rất nhiều hạn chế Do đó, việc nghiên cứu để tìm ra các chỉ thị sinh học đặc trưng cho ung thư đại trực tràng đang là hướng nghiên cứu được nhiều các nhà khoa học quan tâm hiện nay

Hiện nay, có 3 kỹ thuật sinh học phân tử chính được ứng dụng trong nghiên cứu chỉ thị sinh học của ung thư bao gồm:

 Sử dụng kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng những biến đổi gen liên quan đến sự phát sinh ung thư Những biến đổi gen này có thể được coi như những chỉ thị sinh học cho ung thư Hạn chế của kỹ thuật genomics là không nghiên cứu được về mức độ biểu hiện của gen (cụ thể là các protein), không theo dõi được

sự thay đổi các quá trình sau dịch mã, mối tương tác protein – protein…

 Sử dụng kỹ thuật proteomics để xác định những biến đổi của các protein liên quan đến quá trình phát sinh, hình thành ung thư Ưu điểm của kỹ thuật proteomics là có khả năng nghiên cứu được mức độ biểu hiện của gen thông qua các phân tử protein tạo ra

 Sử dụng kỹ thuật metabolomics để nghiên cứu tất cả những chất chuyển hóa được tạo ra trong tế bào, trong mô Một số dạng ung thư tạo ra những biến đổi

về thành phần và hàm lượng các chất chuyển hóa trong tế bào Các chất chuyển hóa này có thể tìm thấy trong các mô ung thư, dịch cơ thể (đặc biệt là nước tiểu) [34]

1.3 PROTEOMICS TRONG NGHIÊN CỨU UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

1.3.1 Proteomic là gì?

Proteomics là môn khoa học nghiên cứu sản phẩm của hệ gen trong cơ thể hay chính là nghiên cứu các protein được biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể trong những điều kiện và thời gian xác định [1] Không chỉ dừng lại nghiên cứ

u sự tồn tại của protein của một tế bào nào đó, proteomics còn đi sâu nghiên cứu tất cả các dạng protein đã được cải biến, tương tác giữa các protein, cấu trúc không gian và các phức hệ cao hơn của protein

Nghiên cứu proteomics ra đời dựa trên một số thành tựu đã đạt được trong sinh học hiện đại ở những năm 90 của thế kỷ trước Ba bước phát triển quan trọng dẫn đến sự ra đời của proteomics bao gồm sự bùng nổ các nghiên cứu về gen tạo thành cơ sở dữ liệu về trình tự gen và cơ sở dữ liệu trình tự protein; sự ra đời của công cụ tin sinh học nhằm tìm kiếm các cơ sở dữ liệu sinh học; cuối cùng là kỹ thuật vi dãy phản ứng oligonucleotid (oligonucleotide microarray) có khả năng nghiên cứu biểu hiện của hàng ngàn gen Như vậy, kỹ thuật proteomics ra đời là một trong những bước phát triển mới trong nghiên cứu sinh học hiện đại, góp phần làm thay đổi bức tranh sinh học ở hiện tại và trong tương lai

Đối tượng nghiên cứu chủ yếu của proteomics là hệ protein Vậy vì sao phải nghiên cứu hệ protein? Việc giải mã hoàn chỉnh hệ gen người từ những năm 1999-

2001 là bước phát triển nhảy vọt của nền khoa học Tuy nhiên, một thực tế đặt ra là các thông tin di truyền trong hệ gen không cho biết một cách đầy đủ về chức năng của nó Do đó, các nghiên cứu về biểu hiện gen là rất cần thiết Nghiên cứu biểu hiện gen ở mức độ phiên mã mặc dù đã đạt được một số thành tựu đáng kể nhưng vẫn còn nhiều hạn chế Nguyên nhân là do sau dịch mã, đa số các protein bị biến

đổi hóa học bởi các quy trình cải biến như phosphoryl hóa, methyl hóa, glycosyl hóa, gắn thêm các gốc carbonhydrat hay các tương tác protein-protein… Những biến đổi này đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt chức năng của protein Kết quả là từ một gen ban đầu có thể tìm thấy sự đa dạng về biểu hiện, cấu trúc và chức năng của nhiều loại protein khác nhau Các nghiên cứu cho thấy, ở người có khoảng 25.000 gen đã được nhận diện nhưng có khoảng lớn hơn 500.000 protein đã

được tạo ra từ các gen đó [24Error! Reference source not found.] Do đó, để

nghiên cứu sự biểu hiện của gen không chỉ dựa vào các thông tin trong mã di truyền, các biến đổi sau dịch mã mà quan trọng hơn phải dựa trên những cải biến của phân tử protein Người ta coi protein là phân tử đầu tiên thực hiện chức năng trong tế bào Theo các kết quả nghiên cứu thì chỉ có khoảng 2% các bệnh tật đã biết được xác định là do các sai lệch về gen, còn 98% các bệnh còn lại cần làm sáng tỏ ở mức độ protein bao gồm biểu hiện protein, cấu trúc protein và tương tác giữa các protein Từ đó cho thấy, việc nghiên cứu hệ protein người là cần thiết

1.3.2 Công cụ nghiên cứu proteomics

Để phân tích cả hệ gồm nhiều protein, kỹ thuật proteomics cần có sự hỗ trợ của 4 công cụ phân tích sau:

Công cụ đầu tiên là cơ sở dữ liệu Các dữ liệu về protein, các trình tự biểu hiện được đánh dấu và trình tự genome hoàn chỉnh là một dữ liệu đầy đủ và chọn lọc cho tất cả các protein biểu hiện trong các cơ thể Ví dụ, khi phân tích các trình

tự mã hóa của ruồi giấm Drosophila, chúng ta đã biết rằng có 110 gen mã hóa cho

protein có domain EGF và 87 gen mã hóa cho protein có domain có hoạt tính

tyrosin kinase Vì vậy, khi phân tích proteomics đối với Drosophila, mặc dù phải

dựa trên một cơ sở dữ liệu lớn nhưng chúng ta vẫn dự đoán được các protein có thể

xuất hiện [24Error! Reference source not found.]

Công cụ thứ hai là khối phổ, đây là bộ phận trung tâm và cơ bản của phân tích proteomics Phương pháp khối phổ xuất hiện từ những năm đầu của thế kỷ XX

do Thomson và các nhà khoa học khác tìm ra từ năm 1912 Nó đóng vai trò quan

trọng trong việc xác định cấu trúc của những phân tử nhỏ Sau đó, phương pháp này cũng được cải tiến để ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, đặc biệt là xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein Proteomics dựa trên nguyên lý khối phổ đã trở thành một môn khoa học thật sự nhờ các dữ liệu về trình tự gen, trình tự protein cùng với nhiều thành tựu kỹ thuật vượt bậc trong nghiên cứu nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt phải kể đến sự phát triển của phương pháp ion hóa protein Các kỹ thuật này là những kỹ thuật không thể thiếu trong việc phân tích, nhận dạng những thông tin được mã hóa trong hệ gen

Trong những năm gần đây, khối phổ (MS) đã trở thành công cụ được lựa chọn để phân tích hệ protein Kỹ thuật này phân tích các protein hay các mảnh peptide theo tỷ số m/z (khối lượng/độ tích điện) Một cách đơn giản, các protein cần phân tích bị phân cắt thành các mảnh peptide có kích thước thích hợp Các mảnh peptide này bị ion hóa, nhờ đó tích điện và di chuyển tự do Để xác định khối lượng của các ion này, người ta gia tốc chúng trong một buồng chân không, để đo thời gian bay (Time of Flight – TOF) của chúng Như vậy, các ion sẽ được xác định theo khối lượng dựa vào thời gian bay trong buồng chân không và theo điện tích chúng mang Sản phẩm cuối cùng là một phổ khối lượng gồm nhiều đỉnh Phổ này sẽ là tín hiệu đặc trưng để nhận dạng các protein

Công cụ thiết yếu thứ ba là hệ thống phần mềm có thể so sánh, đối chiếu dữ liệu khối phổ với các trình tự protein đặc trưng trong cơ sở dữ liệu Việc xác định trình tự của một peptide từ các số liệu khối phổ là hoàn toàn có thể thực hiện được

Tuy nhiên, việc xác định trình tự de novo này là nhiệm vụ khá nặng nề và tốn thời

gian, không thể áp dụng để phân tích hàng trăm, hàng nghìn phổ Các phần mềm này cho phép điều tra tự động một lượng lớn dữ liệu khối phổ, đối chiếu với trình tự protein Người nghiên cứu có thể kiểm tra các kết quả và đánh giá chất lượng của

dữ liệu trong thời gian ngắn hơn và trên quy mô rộng hơn

Công cụ thiết yếu thứ tư trong nghiên cứu proteomic là các kỹ thuật phân tách protein Công việc phân tách protein nhằm hai mục đích chính Thứ nhất, nó

làm đơn giản các phức hệ protein phức tạp bằng cách phân tách chúng thành các phân tử hay nhóm nhỏ protein độc lập Thứ hai, việc phân tách này cho cái nhìn tổng quan về sự khác biệt của hệ protein giữa hai mẫu khác nhau, nhờ đó xác định được các protein đặc trưng để phân tích Ngày nay, hai dạng phân tích proteomics chủ đạo được sử dụng là: điện di hai chiều kết hợp với khối phổ và sắc ký hai chiều kết hợp với khối phổ

Điện di hai chiều là kỹ thuật tốt nhất cho việc phân tách các protein trong một mẫu phức tạp Kỹ thuật này phân tách các protein dựa vào hai thông số: điểm đẳng điện và khối lượng phân tử của protein, do đó có độ phân giải cao Bản điện di hai chiều trên gel polyacrylamide sẽ là bức tranh đầy đủ nhất của một mẫu protein phức tạp Hơn nữa, kỹ thuật điện di hai chiều cũng cho phép nghiên cứu biểu hiện protein của các dạng bệnh lý hay các giai đoạn khác nhau của quá trình phát triển

Ngoài ra, các kỹ thuật phân tách khác như điện di một chiều trên gel polyacrylamide có SDS, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE), điện di phân vùng đẳng điện (IEF) và sắc ký ái lực đều có thể trở thành công cụ hữu hiệu trong phân tích proteomics Tuy nhiên, có lẽ hiệu quả nhất vẫn là kỹ thuật sắc

ký lỏng đa chiều (Multidimentional Liquid Chromatography-MDLC) Sắc ký trao

đổi ion kết hợp vơi sắc ký pha đảo trong HPLC là một công cụ mạnh trong việc

phân tách hỗn hợp peptide [24Error! Reference source not found.]

1.3.3 Ứng dụng của proteomics trong nghiên cứu ung thư đại trực tràng

Trên thế giới, sự phát triển của nghiên cứu proteomics được đánh dấu bằng

sự ra đời của tổ chức nghiên cứu hệ protein người (Human Proteome Organisation– HUPO) tại Pháp năm 2002 Đây là tổ chức lớn nhất trên thế giới về nghiên cứu proteomics Bên cạnh đó còn có các tổ chức khu vực, trong đó có tổ chức AOHUPO (Asia Oceania Human Proteome Organisation) thuộc châu Á-châu Đại Dương

Một trong những ứng dụng quan trọng đầu tiên của proteomics là trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư Việc tìm ra những biến đổi trong hệ protein của bệnh nhân ung thư có thể giúp các nhà khoa học tìm hiểu rõ hơn về cơ chế phát sinh bệnh ở

mức độ phân tử Các protein biến đổi cũng có thể trở thành các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo dõi tiến triển của bệnh Ngoài ra, kỹ thuật proteomics còn được ứng dụng trong nghiên cứu đích tác dụng của thuốc điều trị, qua đó tìm ra các thuốc có hiệu quả điều trị tối ưu

Với những tính năng ưu việt, proteomics là công cụ được các nhà khoa học lựa chọn trong nghiên cứu ung thư nói chung và ung thư đại trực tràng nói riêng Đã

có rất nhiều nghiên cứu sử dụng công cụ proteomics được thực hiện trên thế giới nhằm tìm ra các chỉ thị sinh học đặc trưng cho ung thư đại trực tràng Hệ protein được phân tích trong các nghiên cứu này có thể là hệ protein mô ung thư đại trực tràng, hệ protein trong huyết tương, hệ protein từ dịch cơ thể như nước tiểu

Phân tích proteomics huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Huyết tương tách từ máu người là một hệ protein tuyệt vời cho phân tích proteomics Nó tập hợp các protein từ các mô khác nhau trong cơ thể Những hiểu biết về hệ protein huyết tương mang lại những thông tin quan trọng về nhiều quá trình sinh học diễn ra trong cơ thể Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng protein huyết tương có thể là các chỉ thị sinh học đáng tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 13-5), ung thư tuyến tiền liệt (PAP), ung thư gan (- fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-ractive protein) [14] Tuy nhiên, do trong huyết tương chứa hàm lượng lớn (55%) là albumin, nên trước khi tiến hành các kỹ thuật proteomics, chúng ta phải loại bỏ tối đa lượng albumin có trong mẫu huyết tương

Chỉ thị sinh học được tìm thấy trong huyết tương là chỉ thị lý tưởng cho chẩn đoán ung thư do rất dễ dàng thu thập mẫu huyết tương của bệnh nhân và việc chẩn đoán sẽ dễ dàng hơn Hiện nay, chỉ thị CEA có mặt trong máu đang được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên, sử dụng chỉ thị CEA chỉ có khả năng phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV) Hơn nữa, chi phí cho xét nghiệm CEA tương đối cao Vì vậy, việc nghiên cứu

để tìm thêm các chỉ thị sinh học trong máu để ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

ung thư đại trực tràng là hết sức cần thiết Nhiều nghiên cứu proteomics trong huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã được tiến hành nhằm tìm ra các chỉ thị sinh học mới cho loại ung thư này

Năm 2004, Yu và cs đã tiến hành phân tích proteomics huyết tương của 182 mẫu khác nhau gồm 55 mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 35 mẫu huyết tương của bệnh nhân u tuyến đại trực tràng và 92 mẫu huyết tương của người bình thường Bằng kỹ thuật SELDI-TOF MS kết hợp với công cụ tin sinh học, các nhà khoa học đã tìm ra 7 protein biểu hiện khác biệt giữa ung thư đại trực tràng và u tuyến đại trực tràng Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 83% và độ nhạy là 89% Nghiên cứu cũng chỉ ra 4 protein khác biệt giữa bệnh nhân ung thư đại trực tràng và người bình thường Các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học với độ đặc hiệu 92% và độ nhạy là 89% [39]

Năm 2005, với kỹ thuật SELDI-TOF/MS, Albrethsen và cs đã so sánh các protein có trong mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại tràng với huyết tương của người khỏe mạnh và protein có trong mô ung thư đại tràng với mô đại tràng bình thường Nghiên cứu này cho thấy hàm lượng các protein HNP- 1, HNP- 2 và HNP- 3, còn được gọi là α-defensin-1, α-defensin-2, α-defensin-3 tăng lên trong huyết tương của người bệnh và trong mô tại vị trí khối u Một phần của protein HNP 1-3 sẽ kết hợp với loại protein khối lượng lớn chưa xác định trong huyết tương Nhóm nghiên cứu đề xuất rằng HNP 1-3 có thể được coi như chỉ thị sinh học trong máu của bệnh nhân ung thư đại tràng Các protein HNP 1-3 có thể có tác động

lên quá trình phát triển khối u [4Error! Reference source not found.]

Việc tìm ra protein HNP 1-3 có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học trong máu có ý nghĩa quan trọng, có thể ứng dụng trong việc chẩn đoán bệnh Tuy nhiên, việc nghiên cứu biểu hiện khác biệt của loại protein này trong các giai đoạn phát triển bệnh khác nhau sẽ giúp dự đoán hiệu quả ứng dụng của protein này trong chẩn đoán (có thể chẩn đoán ở giai đoạn sớm hay giai đoạn muộn của bệnh), cũng như có thể giúp phát hiện chính xác giai đoạn ung thư Phát triển kết quả của các nghiên

cứu trước đó, năm 2006, Albrethsen và cs tiếp tục nghiên cứu mức độ biểu hiện của các protein HNP 1-3 trong huyết thanh và trong mô ung thư đối với các giai đoạn bệnh khác nhau (theo Duke) Hàm lượng HNP 1-3 trong huyết tương, trong mô ung thư và trong mô bình thường được định lượng bằng khối phổ Mức độ biểu hiện của HNP 1-3 trong huyết tương được xác định bằng kỹ thuật ELISA Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng HNP 1-3 tăng lên ở mô ung thư của bệnh nhân ở giai đoạn

từ Duke A đến Duke D so với mô thường Tuy nhiên, hàm lượng HNP 1-3 trong huyết tương của bệnh nhân chỉ cao hơn huyết tương của người khỏe mạnh khi bệnh nhân ở giai đoạn Duke D Nồng độ protein HNP 1-3 được xác định bằng kỹ thuật ELISA tăng lên ở giai đoạn Duke C và D, nhưng không có sự khác biệt ở giai đoạn

Duke A, B so với nồng độ HNP huyết tương của người khỏe mạnh [5Error!

Reference source not found.] Như vậy, việc ứng dụng protein HNP 1-3 trong

chẩn đoán ung thư đại trực tràng cũng còn hạn chế, do chỉ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn của bệnh

Ngoài các nghiên cứu nhằm tìm kiếm chỉ thị sinh học để chẩn đoán bệnh trong giai đoạn sớm, các nhà khoa học còn tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc trưng cho tình trạng di căn của ung thư đại trực tràng Năm 2010, Xue và cs đã tiến hành nghiên cứu với mục đích như vậy Bằng kỹ thuật LC-MS/MS, các nhà khoa học đã so sánh mức

độ thay đổi lượng các chất tiết vào trong máu từ các dòng tế bào ung thư ban đầu và dòng tế bào đã di căn được lấy trên cùng bệnh nhân ung thư đại trực tràng 6 protein khác biệt đặc trưng đã được xác nhận bằng kỹ thuật Western blot Trong đó, yếu tố trefoil 3 và yếu tố biệt hóa/sinh trưởng 15 là 2 protein có biểu hiện tăng ở các dòng tế bào đã di căn Sử dụng kỹ thuật ELISA bánh kẹp cũng chỉ ra rằng 2 protein này có mức độ biểu hiện tăng lên đáng kể trong huyết tương ở ung thư đại trực tràng đã di căn tới hạch bạch huyết Kết quả thu được từ nghiên cứu này có thể cho thấy trefoil 3

và yếu tố biệt hóa/sinh trưởng 15 có trong huyết tương có thể ứng dụng được để chẩn đoán ung thư đại trực tràng đã di căn [37]

Cũng trong năm 2010, Trịnh Hồng Thái và cs đã sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với phân tích khối phổ MALDI-TOF MS để phân tích biểu hiện

protein khác biệt trong mẫu huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng và người bình thường Phân tích 40 spot protein biểu hiện khác biệt, các nhà khoa học

đã nhận dạng được 35 protein, trong đó 31 protein đã được định danh và 4 protein giả thuyết Các protein được chia thành 4 nhóm chức năng: các protein tham gia quá trình miễn dịch (19,35%), protein liên quan đến chu trình tế bào (9,68%), các protein tham gia vào quá trình apoptosis (12,9%) và nhóm protein khác (58,7%) Trong các protein nhận dạng được, một số protein biểu hiện khác biệt đáng chú ý như Interleukin 6, Cyclin D1, Hsp 70 biểu hiện tăng ở huyết tương của bệnh nhân ung thư đại trực tràng so với người khỏe mạnh Đặc biệt, protein Hsp 70 và Interleukin 6 là hai protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng (số liê ̣u chưa công bố)

Kết quả từ các nghiên cứu proteomics đối với mẫu huyết thanh của bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã cho chúng ta thấy những protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học trong chẩn đoán ung thư đại trực tràng Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu proteomics đối với mẫu nước tiểu cũng đã được các nhà khoa học quan tâm Theo một nghiên cứu của Ward và cs, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật SELDI và MALDI để phân tích proteomics trên 67 mẫu nước tiểu của bệnh nhân ung thư đại trực tràng và 72 mẫu nước tiểu của người bình thường Kết quả nghiên cứu cho thấy có 19 đỉnh có mư ́ c độ khác biệt giữa mẫu bệnh và mẫu đối chứng Ứng dụng các protein này để nhận dạng ung thư đại trực tràng có độ nhạy là 78% và

độ đặc hiệu là 87% Tác giả cũng kết luận rằng sự thay đổi hệ protein trong mẫu nước tiểu cũng có thể hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại trực tràng ở giai đoạn sớm [40]

Phân tích proteomics mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng

Cùng với nghiên cứu proteomics huyết tương, để tìm hiểu một cách chính xác hơn về các protein đặc trưng liên quan đến bệnh, chúng ta cần phân tích trực tiếp protein tư ̀ các tế bào của khối u đại trực tràng Hơn nữa, hầu hết các chỉ thị sinh học cho ung thư được phát hiện bằng cách sử dụng chính những mô của căn bệnh này [14]

Với mục đích nghiên cứu, tìm kiếm chỉ thị sinh học cho ung thư đại trực tràng, năm 2005, Alfonso và cs đã tiến hành phân tích proteomics ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng nhờ kỹ thuật 2D-PAGE kết hợp MS Nghiên cứu được tiến hành với mẫu mô tại vị trí khối u và đối chứng là mẫu mô tại vị trí cận khối u của 7 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Nghiên cứu đã chỉ ra 72 protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư và mô bình thường Nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt bằng phân tích khối phổ đã xác định được 41 protein Các protein khác biệt liên quan đến quá trình điều hòa phiên mã, các protein tín hiệu (annexins IV và V, relaxin, APC), các protein tham gia tổ chức khung xương tế bào (vimentin, cytokeratins, beta actin) và các protein liên quan đến quá trình tổng hợp và cuộn gập protein (HSP 60, cathepsin D, RSP4, calreticulin) [ 6 ]

Nghiên cứu của Bai và cs sư ̉ du ̣ng kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với khối phổ, thư ̣c hiê ̣n trên mẫu mô tại vị trí khối u đại trực tràng (mẫu bệnh) và mẫu mô tại

vị trí gần khối u (mẫu đối chứng) trên cùng một bệnh nhân Mẫu mô đại trực tràng

từ 12 bệnh nhân đã được sử dụng cho nghiên cứu này Kết quả điện di 2 chiều cho thấy có 60 protein biểu hiện khác biệt (hàm lượng chênh lệch 1,5 lần) giữa mô ung thư và mô thường Tiếp tục tiến hành phân tích khối phổ để nhận dạng các protein biểu hiện khác biệt, 10 protein đã được nhận dạng, bao gồm 2 protein biểu hiện giảm và 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thư 2 protein biểu hiện giảm ở mô ung thư bao gồm carbonic anhydrase II và protein disulfide isomerase 8 protein biểu hiện tăng ở mô ung thư bao gồm APC-stimulated guanine nucleotide exchange factor, phosphoglycerate kinase 1, fumarate hydratase, aldolase A, activator protein 2B, glutathione S-transferase A3, Arginase và zinc finger protein 64 homolog Những protein biểu hiện khác biệt này được cho là có liên quan đến quá trình phát triển của khối u [8]

Phương thức chuyển hóa các chất trong tế bào ung thư đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành, phát triển ung thư Nhằm tìm hiểu sự thay đổi trong con đường chuyển hóa các chất của tế bào ung thư đại trực tràng, năm 2006, Xuezhi và cs đã tiến hành nghiên cứu nhằm tìm ra sự biến đổi trong thành phần

protein liên quan đến các con đường chuyển hóa các chất trong tế bào ung thư 7 cặp mô ung thư đại trực tràng và mô lân cận u (đối chứng) được sử dụng cho nghiên cứu Dịch chiết protein từ mô ung thư và mô bình thường được phân tách trên bản điện di hai chiều, pH 7-10 Khi so sánh sự biểu hiện của các spot protein trên bản gel mô ung thư và mô bình thường, các nhà khoa học xác định được 34 spot protein với mư ́ c độ biểu hiện khác biệt mang ý nghĩa thống kê 16 trong số 34 spot đã được nhận dạng bằng MALDI – TOF/TOF Sự biểu hiện tăng cường của các protein tham gia quá trình phân giải đường như aldolase A, anolase 1, GAPDH cho thấy có sự xuất hiện của tác động Warburg đối với ung thư đại trực tràng Trong khi đó, một protein quan trọng trong quá trình tổng hợp glucose lại có biểu hiện giảm, đó là protein phosphoenolpyruvate carboxykinase Sự biểu hiện giảm của 2 protein là UDP-glucose 6-de-hydrogenase (UGDH) và UDP-glucose pyrophosphorylase 2 có thể dẫn đến ức chế quá trình đồng hóa acid gluconic Kết quả nghiên cứu cũng đưa

ra sự biểu hiện giảm của các protein tham gia vào bước khởi đầu của chu trình tricarboxylic acid (aconitase và aconitate hydratase) và sự biểu hiện tăng lên của các enzyme tham gia vào bước cuối cùng của chu trình này (malate dehydrogenase), chứng tỏ có sự ức chế chu trình tricarboxylic acid trong tế bào ung thư đại trực tràng Từ những kết quả thu được chứng tỏ có sự biến đổi lớn trong con đường

chuyển hóa các chất đối với ung thư đại trực tràng [38Error! Reference source not

found.]

Ngoài việc tìm kiếm các chỉ thị sinh học nhằm ứng dụng trong chẩn đoán ung thư đại trực tràng, các nhà khoa học còn đi sâu tìm hiểu cơ chế tác dụng của các biện pháp điều trị ở mức độ phân tử Năm 2004, Allas và cs đã công bố kết quả nghiên cứu các protein liên quan đến tính chịu bức xạ của ung thư đại tràng, mục đích cuối cùng là dự đoán mức độ phản ứng của khối u với biện pháp xạ trị 17 bệnh nhân tham gia trong nghiên cứu đều được chẩn đoán mắc ung thư trực tràng Các khối u được sinh thiết trước khi tiến hành xạ trị Sau đó, tất cả các bệnh nhân được

xạ trị bằng 1 liều đầy đủ (tương đương với 50 Gray) Phẫu thuật được tiến hành 6 tuần sau đó và kết quả đáp ứng với bức xạ được đánh giá bằng giải phẫu mô học

Kết quả nghiên cứu cho thấy có 7 bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn, 7 bệnh nhân đáp ứng 1 phần và 3 bệnh nhân còn lại chưa được đánh giá Tiếp tục tiến hành phân tích proteomics đối với mẫu mô từ các khối u có đáp ứng với xạ trị khác nhau, sử dụng

kỹ thuật điện di 2 chiều kết hợp với phân tích MALDI – TOF MS đã xác định được một số protein liên quan đến khả năng chịu bức xạ của mô ung thư, bao gồm tropomodulin, heat shock protein 42, beta-tubulin, annexin V, calsenilin và một số protein liên quan đến tính nhạy bức xạ bao gồm keratin type I, notch 2 protein homolog và protein sửa chữa ADN RAD51L3 [7]

Hệ protein mô ung thư đại trực tràng trong các giai đoạn bệnh khác nhau sẽ

có mức độ biểu hiện khác nhau Nghiên cứu proteomics đối với các mẫu mô ung thư ở các giai đoạn bệnh khác nhau sẽ giúp tìm ra những chỉ thị sinh học ứng dụng cho chẩn đoán bệnh trong các giai đoạn khác nhau, làm tăng hiệu quả điều trị bệnh Năm 2012, Peng và cs đã tiến hành phân tích protemics trên các mẫu sinh thiết mô ung thư đại trực tràng ở các giai đoạn TNM khác nhau và mô bình thường, tập trung vào những biến đổi trong quá trình phát sinh ung thư và những mô hình biểu hiện chức năng của các protein giữa các giai đoạn bệnh khác nhau Phân tích khối phổ MALDI-TOF MS đã nhận dạng các protein liên quan chính đến quá trình trao đổi năng lượng, acetyl hóa và tham gia vào đường truyền tín hiệu Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch và hóa mô miễn dịch để kiểm chứng dữ liệu điện

di hai chiều Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra một số protein có tiềm năng trở thành chỉ thị để dự đoán bệnh ở các giai đoạn TNM khác nhau Các protein bao gồm Glucose- Regulated Protein precursor (GRP78), Fructose-bisphosphate Aldolase A (ALDOA), Carbonic Anhydrase I (CA1) và Peptidyl-prolyl cis–trans isomerase A

hoặc Cyclophilin A (PPIA) [31Error! Reference source not found.]

Năm 2012, Tan và cs thuộc trường Đại học quốc gia Singapore đã tiến hành nghiên cứu so sánh hệ protein của dòng tế bào ung thư đại trực tràng ban đầu (HCT- 116) và dòng tế bào ung thư đại trực tràng đã di căn (E1) bằng cách sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều Các nhà khoa học đã phát hiện ra 74 protein biểu hiện khác biệt, có vai trò chức năng trong nhiều quá trình như phiên mã, dịch mã, truyền tín

hiệu, cấu trúc bộ khung tế bào Đây là những quá trình cần thiết trong tế bào liên quan đến sự di căn của khối u Trong các protein này, protein stathmin-1 (STMN1)

có biểu hiện tăng lên rõ rệt ở dòng tế bào E1 so với dòng tế bào HCT-116 Protein này được lựa chọn để nghiên cứu chức năng sâu hơn Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng STMN1 biểu hiện tăng dẫn đến những thay đổi quan trọng trong quá trình di chuyển của tế bào, xâm lấn, sự bám dính và hình thành cụm tế bào Nghiên cứu sâu hơn đã chỉ ra rằng, biểu hiện khác biệt của STMN1 có liên quan đến khả năng di căn của tế bào Sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch, các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng STMN1 biểu hiện tăng cao trong các khối u đại trực tràng ban đầu và trong mô di căn khi so sánh với mô đại trực tràng bình thường ở vị trí lân cận u [36]

Ngoài hướng nghiên cứu proteomics đối với mẫu mô ung thư và mẫu huyết thanh, mẫu nước tiểu, hướng nghiên cứu proteomics trong bào quan ty thể đang được các nhà khoa học quan tâm Tiếp cận theo hướng phân tích này, năm 2010, Trịnh Hồng Thái và cs (số liê ̣u chưa công bố ) đã áp dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ MALDI TOF-MS để phân tích proteomics ty thể của bệnh nhân ung thư đại trực tràng Kết quả nghiên cứu đã xác định được 30 protein, trong

đó có 24 protein đã được định danh và 6 protein giả thiết Các protein đã được nhận dạng trong ty thể gồm các protein thuộc 6 nhóm: protein điều hòa chu trình tế bào,

sự tăng sinh tế bào, quá trình apoptosis (29,2%); protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau dịch mã (4,2%); protein liên quan tới quá trình trao đổi chất (41,6%); protein liên quan đến miễn dịch, bảo vệ cơ thể (8,3%); protein liên quan đến sự tổng hợp ATP (12,5%) và protein liên quan đến sự di căn của các

tế bào ung thư (4,2%) Đặc biệt trong đó, các protein Actin related protein 2/3 complex, ATP synthease subunit beta biểu hiện tăng, Cellular tumor antigen p53 biểu hiện giảm rõ rệt ở mô ung thư

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng được lấy tại

vị trí khối u và vị trí lân cận khối u (cách khối u khoảng 5 – 10 cm)

Mẫu mô sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào – Giải phẫu bệnh, bệnh viện K Tam Hiệp, Hà Nội và Khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội cung cấp Mẫu mô được đựng trong ống đựng mẫu, được bảo quản trong nitơ lỏng để vận chuyển từ bệnh viện về phòng thí nghiệm Các mẫu mô sau đó được bảo quản trong tủ âm sâu (- 80C) cho tới khi tiến hành những nghiên cứu tiếp theo

Danh sách bệnh nhân ung thư đại trực tràng tham gia trong nghiên cứu này được cung cấp tại Phụ lục 1

2.1.2 Hóa chất

Danh mục các loại hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được đề cập ở bảng 2

Bảng 2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

1 Bio–Lyte 4-7 ampholyte, Bio–Lyte 3-10 ampholyte GE Health Care, Mỹ

2 Các peptide chuẩn Insuline B (Mw = 3494,65 Da),

Angiotensine II (Mw = 1046,5423 Da) Sigma – Aldrich, Mỹ

3 Chất nền CHCA (α–Cyano–4- hydroxycinnamic

6 Agarose low melting, Glycine, Urea Sigma, Mỹ

7 SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia - Mỹ

Tất cả các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ sạch phân tích

2.1.3 Thiết bị

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các thiết bị, dụng cụ trong Phòng thí nghiệm Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein Các thiết bị chính bao gồm:

 Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức)

 Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad - Mỹ), Ettan IPGphor 3

(GE Healthcare, Mỹ)

 Thanh IPG strip pH 3-10, dài 17 cm (Biorad, Mỹ)

 Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thước 17cm và Mini-Protean

3 cell (Biorad - Mỹ) chạy các gel kích thước 7cm

 Nguồn điện di PowerPacTM

HC (Biorad - Mỹ)

 Hệ thống phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai

chiều Phoretix (Shimadzu - Nhật Bản)

 Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRFPLUS

(KRATOS - Anh)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xử lý mẫu mô đại trực tràng

Mẫu mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư được lấy ra từ tủ -80o

C, rã đông Cân 2 mẫu mô với lượng tương đương (khoảng 0,1g) cho vào hai cối sứ riêng biệt để trên đá Quy trình xử lý mẫu mô đại trực tràng được thực hiện như sau:

Bước 1 Thu các phân đoạn dịch chiết protein

 Mẫu mô được cắt nát bằng kéo cho đến khi mẫu nát nhỏ Bổ sung 100 µl đệm muối phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4 Chuyển toàn bộ mẫu mô đã cắt và dịch

đệm vào ống eppendorft để trong 30 phút, ở 4oC Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C để thu dịch nổi là phân đoạn PBS 1

 Cặn thu được sau ly tâm lần 1 được bổ sung 200µl đệm PBS 0,05M, pH 7,4

C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 1

 Cặn thu được sau ly tâm lần 3 được hòa tan bằng 100 µl đệm lysis, để ở 4o

C trong 30 phút Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 2

 Cặn thu được sau ly tâm lần 4 được hòa tan bằng 200 µl đệm lysis, để ở 4o

C trong 60 phút Ly tâm ống mẫu 15.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4o

C để thu dịch nổi là phân đoạn lysis 3

Bước 2 Loại mỡ trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được

Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu được (PBS 1, PBS 2, lysis 1, lysis

2 và lysis 3) ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC và hút loại lớp mỡ phía trên Bước loại mỡ được lặp lại ít nhất 2 lần để đảm bảo loại mỡ tối đa

Bước 3 Loại cặn tế bào, ADN, ARN trong các phân đoạn dịch chiết protein thu được

Ly tâm 5 phân đoạn dịch chiết protein thu được sau quá trình loại mỡ ở tốc

độ 60.000g trong 30 phút ở 4oC, thu dịch nổi phía trên, loại bỏ cặn Bước này được lặp lại 2 lần để đảm bảo loại cặn tối đa

Bước 4 Kiểm tra thành phần protein có trong các phân đoạn chiết và độ sạch của mẫu

Dịch chiết protein thu được từ các phân đoạn sẽ được điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành phần protein có trong mẫu và độ sạch của mẫu Các mẫu chưa đạt độ sạch sẽ được tủa bằng dung dịch acetone theo

tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch acetone 100%, để ở -20oC trong ít nhất 2 tiếng đến qua đêm Các protein lắng tủa được thu lại sau khi ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng/phút, ở 4o

C trong thời gian 10 phút sẽ được hòa tan lại bằng đệm lysis Kết quả làm sạch mẫu dịch protein bằng phương pháp tủa cũng được kiểm tra bằng cách điện di dung dịch sau khi hòa tủa trên gel polyacrylamide 10% có SDS Các dịch chiết của cùng một mẫu được trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều

2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

Để đảm bảo hàm lượng protein tổng số giữa các mẫu nghiên cứu là tương đương nhau, trước khi điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành định lượng protein trong mẫu dịch chiết protein từ mô ung thư và mô bình thường bằng phương pháp Bradford Phương pháp này giúp định lượng protein trong mẫu nghiên cứu dựa trên nguyên tắc so màu Các protein khi phản ứng với thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue sẽ hình thành một hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng

595nm Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein có trong dung dịch [26Error!

Reference source not found.] Chúng tôi sử dụng albumin huyết thanh bò với nồng

độ đã được biết trước để xây dựng đường chuẩn về độ hấp thụ ánh sáng ở các nồng

độ khác nhau Các mẫu sẽ lần lượt được tiến hành đo, xác định độ hấp thụ ánh sáng,

từ đó tính toán ra nồng độ protein có trong dung dịch

Sau khi đã xác định hàm lượng protein có trong mẫu, chúng tôi tiến hành tính toán sao cho hàm lượng protein có trong dung dịch sử dụng cho điện di hai chiều của mẫu bệnh và mẫu đối chứng là tương đương nhau

2.2.3 Điện di hai chiều

Kỹ thuật điện di hai chiều được sử dụng để phân tách các protein trong mẫu thành các điểm riêng rẽ, trong đó chiều điện di thứ nhất là điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách các protein theo điểm đẳng điện (pI) và chiều điện di thứ

hai là điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối lượng và hình dạng Quá trình này được bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip có gradient pH cố định bằng đệm trương gel có chứa protein Sau 1,5 giờ dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip Lượng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 3 - 10 dài 17cm có thể thấm được là 400µg

Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell hoặc Ettan

IPGphor3 để tập trung các phân tử protein vào vị trí tương ứng với pI của phân tử

đó trên thanh IPG strip Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 bước được trình bày trong bảng 3

Bảng 3 Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm

Bước Hiệu điện thế V Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng U

Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS Kết thúc điện di chiều hai, các protein được cố định 45 phút trong dung dịch chứa axít phosphoric 1,3%, methanol 20%, sau đó nhuộm bằng dung dịch Coomassie G250 qua đêm theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff